MƠ  ĐÂU

GIƠI THIÊU MÔT SÔ VÂN ĐÊ LIÊN QUAN ĐÊN HƯƠNG NGHIÊN CƯU CUA ĐÊ TAI

Trên thế  giới, hướng nghiên cứu áp dụng Công nghệ Nano vào lĩnh vực Y- Sinh-Dược như chẩn đoán, chữa trị các bệnh hiểm nghèo, bào chế thuốc và  các sản phẩm y dược khác là một trong những hướng nghiên cứu mũi nhọn, thu hút được sự quan tâm của đông đảo các nhà khoa học hàng đầu trong các lĩnh vực liên ngành (Vật liệu, Hoá học, Sinh học phân tử, Điện tử...) với sự đầu tư mạnh mẽ của các Viện nghiên cứu, phòng thí nghiệm, các hãng sản xuất. Tại Việt Nam, công nghệ Nano là  một lĩnh vực còn rất mới mẻ nhưng đã thu hút  được sự quan tâm cuả rất nhiều nhà khoa học và đã đạt được một số thành tựu trong các ngành vật liệu điện tử, quang điện tử, vật liệu từ... Tuy vậy, ứng dụng trong lĩnh vực Sinh học và Y học, công nghệ Nano hầu như chưa  được quan tâm nghiên cứu và các sản phẩm từ  chúng vẫn chưa được áp dụng trong thực tế. 

Như chúng ta đã biết, phần lớn các loại thuốc hiện nay đã và  đang được sản xuất là các thuốc có phân tử  lượng thấp, chỉ có một phần rất nhỏ tồn tại dưới dạng cao phân tử. Các thuốc có phân tử  lượng thấp dễ bị đào thải ra khỏi cơ  thể, do vậy nồng độ thuốc trong máu giảm nhanh nên chúng chỉ có tác dụng trong một thời gian ngắn. Muốn  đảm bảo hiệu lực liên tục của thuốc ta phải dùng nhiều lần, nhiều ngày trong một liệu trình điều trị. Hơn thế, các thuốc phân tử lượng thấp thường gây ra một số tác dụng phụ do chúng dễ bị  phân huỷ bởi các enzym trong cơ thể tạo ra các dẫn xuất khác có hoạt tính không mong muốn. Ví  dụ Artemisin và các dẫn xuất là các hoạt chất rất triển vọng trong điều trị sốt rét, đặc biệt với các chủng kháng thuốc. Hiện nay một số  dẫn xuất như artemether, arteether và artesunate đã  được sử dụng rộng rãi, có hiệu quả cao trong điều trị sốt rét ở Trung Quốc, Việt  Nam và nhiều nước khác. Tuy nhiên, các dẫn xuất này còn có một số nhược điểm, đáng kể nhất là thời gian tác dụng của thuốc ngắn dẫn đến khả năng tái phát cao. Nguyên nhân chủ yếu là do nhóm axetal trong các dẫn xuất này không bền vững trong cơ thể. Một trong những chuyển hoá chính của artemether trong cơ thể là quá trình monohydroxylation dưới tác dụng của men cytochrome P450, sau đó oxy hoá thành dihydroartemisinin (DHA), một dẫn xuất có hoạt tính cao song độc đối với hệ thần kinh và có thời gian bán phân huỷ ngắn.

Nhằm kéo dài hiệu lực của thuốc và hạn chế các tác dụng phụ do thuốc gây ra, người ta có nhiều giải pháp khác nhau, trong đó giải pháp gắn thuốc vào polime là giải pháp mà hiện nay đang được quan tâm nhiều. Đây là một hướng nghiên cứu được phát triển mạnh tại nhiều phòng thí nghiệm của Pháp, Nhật, Mỹ, Tây Ban Nha trong khoảng 1-2 thập kỷ gần đây. Các polime được tập trung nghiên cứu nhiều là PLA (poly(lactic acid)), PLG (poly(DL-glycolide)), PLGA (poly(D,L-lactide-co-glycolide)), PCA (poly(cyanoacrylate)).

Việc gắn thuốc vào chất mang polime sẽ cho các ưu  điểm sau:

- Có  khả năng vận chuyển chọn lọc đi khắp cơ  thể, đến các tế bào mang bệnh.

- Đôi khi làm xuất hiện những tác dụng sinh học mới so với thuốc ban đầu.

- Tăng thời gian bán thải của thuốc do vậy giảm số lần sử dụng thuốc.

Thuốc polime có ý nghĩa đặc biệt quan trọng cho những bệnh mãn tính, bệnh cấp tính phải điều trị  dài ngày hoặc phải đảm bảo ổn định nồng độ thuốc trong máu. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải của hầu hết các loại thuốc polime là khả năng hoà tan của chúng trong máu dẫn đến khả năng dẫn thuốc đến các tế bào mang bệnh bị  hạn chế. Để giải quyết vấn đề này, các nhà  khoa học đang quan tâm điều chế các thuốc polime có kích thước nano bởi những đặc tính ưu việt của dạng vật liệu này. Các hạt nano là các hạt keo rắn có kích thước từ 10 nm đến 1000 nm. Chúng bao gồm những vật liệu đại phân tử trong đó nhân tố chủ động (active principle) (sinh học hay dược phẩm) được hoà tan, bao vỏ, kết bám hay đính kèm vào hạt nano. Các hạt nano này có đặc tính quý  như độ bền cao, khả năng cho phép thay đổi các  đặc

tính bề mặt của chúng một cách dễ dàng. Về dược lực học, các hạt nano khi mang thuốc có  khả năng xúc tiến sự tiếp xúc sinh học, do đó tăng cường hiệu quả của thuốc, hơn thế chúng còn khả năng thấm vào tế bào thông qua bộ  phận tiếp nhận của tế bào (receptor) hoặc đi vào các mô sau đó nhả thuốc vào đúng tế  bào đích mà không cần các thiết bị truyền dẫn cồng kềnh.

Chitosan là  một loại polime có tính tương thích sinh học tốt, đã được tổ chức y tế thế giới (WHO) đánh giá  rất cao về các ứng dụng sinh học của nó. Qui trình tổng hợp chitosan từ chitin (polyacetylglucosamin, 1 polysaccharide phổ biến thứ hai sau xenlulo, là  chất có rất nhiều trong vỏ các loài thuỷ  sản như tôm cua, mai mực) là tương đối dễ  dàng. Với  ưu thế về vị trí địa lý của một nước đứng thứ ba thế giới về sản lượng đánh bắt hải sản (sau Hoa kỳ, Nhật bản), chúng ta có một tiềm năng rất lớn để sản xuất chitosan.  Chính vì các lý do đó, trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi đặt ra mục tiêu chế tạo thuốc nano trên cơ sở Chitosan dạng nano, được sử dụng dùng làm vector dẫn chuyển (chất mang) các hợp chất có hoạt tính sinh học  được chiết xuất từ các loại cây đặc thù  Việt nam như thuốc chữa sốt rét, thuốc chữa bệnh tim mạch, thần kinh  v.v. 

Việc nghiên cứu chế tạo thuốc nano trên cơ sở Chitosan dạng nano, kết hợp với nguồn tài nguyên thực vật với các hợp chất có hoạt tính sinh học vô cùng phong phú, được chiết xuất từ các loại cây đặc thù Việt nam sẽ đem lại những giá trị to lớn cho công nghiệp dược phẩm. Chúng tôi hy vọng rằng, song song với những nghiên cứu cơ bản, những kết quả nghiên cứu triển khai sẽ đem lại những giá trị to lớn cho công nghiệp dược phẩm trong tương lai.

I. Muc tiêu cua đê tai

1. Nghiên cứu chế tạo polime phân huỷ sinh học Chitosan dạng nano ứng dụng làm vector dẫn truyền (chất mang) dẫn xuất Artesunat và Paclitaxel làm thuốc nhả chậm.

2. Tiến hành các nghiên cứu cơ bản về cơ chế dẫn chuyển và nhả chậm của hệ dẫn thuốc trên cơ sở chất mang nano chitosan.

3. Trên cơ sở đó sẽ mở rộng phạm vi ứng dụng làm các loại thuốc khác được chiết xuất từ các loại cây đặc thù Việt nam như thuốc chữa bệnh tim mạch, cầm máu từ Rutin (nụ hòe), thuốc chữa bệnh thần kinh, an thần từ Rotundin (chiết xuất từ một số loài bình vôi), thuốc giải độc từ Apigenin (vỏ hạt đậu xanh) thuốc chữa tim từ Strychnin (hạt mã tiền) v.v...

 

Mục tiêu 1

TỔNG HỢP HAT NANO CHITOSAN

1. Tổng hợp và đặc trưng của chất mang nano chitosan 1. Đặc trưng vật liệu chitosan

Chitosan được tổng hợp từ chitin có nguồn gốc từ  vỏ tôm, chitin sau quá trình deacetyl hóa thu được chitosan

Nguyên liệu chitosan được đo khối lượng phân tử và  đo độ deacetyl hóa đạt tiêu chuẩn:

1.1.1 Khối lượng phân tử chitosan

  Từ thực nghiệm tính toán được

h 0=213ml/g

k =0,136.10

690,1= a

M =  450 000.           

Kết quả:      M =  450 000

2. Độ deacetyl hóa

                        Được xác định bằng phương pháp chuẩn độ điện thế

Trong đó : W: KL ciủa CS

D= (NA.VA – NB.VB)/1000

NA, VA là nồng độ và thể tích Hcl

NB,VB là  nồng độ thể tích của NaOH

DA = 72%

2. Tổng hợp vật liệu nano chitosan

1.2.1.  Tổng hợp hạt nano chitosan theo phương pháp biến tính kỵ  nước glycolchitosan với cholesterol

a). Khảo sát phổ IR của hạt nano

So sánh phổ IR của hạt nano với nguyên liệu glycolchitosan

                     

a)       b)

Hình 1: phổ IR của a)  glycol chitosan      b) sản phẩm GC

Nhận xét: 

b). Xác định kích thước hạt bằng phương pháp FESEM

Nhận xét: cấu trúc dạng hạt, hình cầu tương đối đồng đều, hạt có kích thước từ 20 -50nm

Thử  khả năng load thuốc nano lên hạt bằng cách sử  dụng tác nhân curcumin, khảo 

1.1.2. Tổng hợp hạt nano bằng phương pháp sử  dụng tác nhân crosslinking

Một số  tác nhân crosslinking đã sử dụng: STPP, gossypol... các tác nhân này là các polyanion đa acid hoặc đa andehyde, có khả năng phản ứng amid hóa với nhóm amin linh động. Kết quả nối mạch chitosan tạo hạt có  cấu trúc lõi vỏ

a) Sử dụng tác nhân STPP

Công thức cấu tạo hạt CS-TPP được nhận định như sau: 

Hình : công thức cấu tạo sản phẩm CS-TPP

Kết quả:

khảo sát đặc trưng vật liệu thông qua phổ  IR

Hình: phổ IR đặc trưng của CS-TPP

Nhận xét: 

b) Khảo sát bằng phương pháp phân tích nhiệt

c) khảo sát bằng phương pháp Xray

d) xác  định phân bố kích thước hạt   

e) Xác  định thế zeta của hệ  CS – TPP

Độ lớn và dấu của điện tích bề mặt hạt CS- TPP có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định tính bền của hệ. Sử dụng phương pháp điện di để đo thế zeta của hệ chúng tôi xác định được các giá trị tương ứng sau:

tỷ  lệ CS:STPP Thế zeta

2:1 + 25,774

2,5:1 +27.369

3: 1 +29.768

4: 1 +33.546Nhận xét: tất cả các hệ keo có bề mặt mang điện tích dương, chứng tỏ trên bề mặt chứa các điện tích dương tự do, khi tăng tỷ lệ  chitosan và STPP điện tích dương tăng lên điều này có thể giải thích do sự tăng của các nhóm NH3+ trên bề mặt của các hạt nano, điều này có ý nghĩa đối với việc mang các thuốc vì  điện tich dương trên bề mặt hạt nano có thể  là yếu tố hấp phụ thuốc nếu thuốc và  dễ dàng liên kết hóa học với các liên kết petid của tế bào...

b) sử dụng tác nhân acid citric 

Hình:  sản phẩm CS-CT

Khảo sát đặc trưng vật liệu:

phổ cộng hưởng từ hạt nhân

 

hình:

2. xác định kích thước hạt qua phương pháp điện tử truyền qua TEM

 

hình:

Nhận xét: cấu trúc hạt được hình thành và có  kích thước tương đối đồng đều khoảng 100nm 

c) Sử dụng tác nhân  gossypol

Do gossypol là tác nhân crosslinking vừa là tác nhân có  tác dụng điều trị ung thư nên chúng tôi sử  dụng gossypol vừa để tạo cấu trúc hạt nano mang thuốc vừa để tạo thuốc 

Công thức hạt nano chitosanj – gossypol được chúng tôi nhận  định như sau:

Chứng tỏ sự hình thành cấu trúc lõi vỏ của hạt:

hình: công thức cấu tạo hạt GCS

Đặc trưng vật liệu được khảo sát thông qua: khảo sát phổ IR, hình ảnh FESEM, và khả năng phát quang của vật liệu

Đặc trưng phổ IR của vật liệu

Hình : phổ IR của vật liệu

2. Xác định kích thước hạt thông qua điện tử truyền qua FESEM

Hình : hình ảnh FESEM của hạt GCS

Nhận xét: hạt hình cầu kích thước tương đối đồng đều sắp xếp từ 20 -50nm

3. Khảo sát khả năng phát huỳnh quang của sản chất mag thuốc

Hình : khả năng hấp thụ và phát quang của hạt nano

Hạt nano có khả năng phát quang là một phát hiện thú  vị cho phép quan sát cơ chế dẫn truyền cũng như điều trị của thuốc được mang trong đó.   

              

 

Mục tiêu 2

CÁC SẢN PHẨM ƯNG DỤNG NANO CHITOSAN LAM CHÂT MANG THUÔC 

Khả năng gắn curcumin lên các chất mang nano

1.1. Khả năng mang hạt curcumin lên hạt GC

Khảo sát kích thước hạt sau load cucurmin bằng chụp điện tử truyền qua FESEM 

a)                                               b)                                                              c)

Hình: sản phẩm sau khi gắn curcumin lên hạt nano thuốc

a) hạt GC-Cur, b) Hạt GCC-Cur, c) Hạt GCS-Cur

Sau khi load curcumin hạt có kích thước không thay đổi nhiều, và  kích thước hạt tương đối đồng nhất. Chứng tỏ  khả năng mang curcumin của hạt nano...

b) xác  định kích thước hạt thông qua điện tử truyền qua TEM

hạt nano mang thuốc có cấu trúc được chứng minh thêm thông qua điện tử truyền qua TEM càng cho thấy rõ hạt nano chitosan có khả năng mang thuốc curcumin và  sau khi mang thuốc hạt vẫn có cấu trúc dạng hạt và  kích thước hạt <100nm 

hình : Hình ảnh TEM của hạt nano GCC-Cur

c) Xác  định khả năng phát huỳnh quang của sản phẩm GCS

  

Hình : khả năng phát huỳnh quang của sản phẩm GCS-Cur

Nhận xét: curcumin và gossypol đều có khả năng phát huỳnh quang

2. Khả năng mang thuốc artesunat của hạt nano chitosan

      Artesunate được gắn với hạt CS-TPP, khả năng gắn cũng như  các đặc trưng hóa lý của sản phẩm thông qua chụp điện tử truyền qua TEM khảo sát phân bố  kích thước hạt 

Hình: phân bố kích thước hạt 

Từ đường phân bố kích thước hạt cho thấy kích thước hạt phân bố từ 100 – 300nm

Kết luận:   

Mục tiêu  III

TỔNG HỢP VA ĐẶC TRƯNG HAT NANO CHƯA ARTERSUNAT TRÊN CƠ SỞ  NANO CHITOSAN

1. Tổng hợp hạt nano chitosan chứa artesunat

Sử  dụng hạt CS-TPP làm chất mang thuốc có kích thước nano để gắn artesunat, quá trình gắn artesunat lên hạt CS-TPP thu được sản phẩm ART-CS-TPP có kích thước nano. Cấu trúc hạt được đề nghị như  sau:

 

Đặc trưng hạt nano được khảo sát thông qua phổ IR, phân bố kích thước hạt

1.1. Phổ  IR của sản phẩm

    

    

Hình: Phổ IR của sản phẩm

Sự  xuất hiện peak tại bước sóng 942 và 879 cm đặc trưng cho liên kết -O-O của ARTS 

1.2.  Phân bố  kích thước sản phẩm ART-CS-TPP

  

Hình: phân bố kích thước hạt 

Từ đường phân bố kích thước hạt cho thấy kích thước hạt phân bố từ 100 – 300nm

3. Khảo sát khả năng nhả chậm của sản phẩm

     

Hình : Quá  trình nhả chậm ARTS từ  CS-TP-ARTS

trong  SGF  (trái)  dịch dạ dày pH = 2

  trong SIF ( phải) dịch ruột pH = 8

Kết luận:  

Mục tiêu 4:

THỬ HOAT TÍNH INVITRO VA INVIVO CUA SẢN PHẨM 

1. Thử độc tính va thử hoạt tính

Quá trình thử độc tính trên dòng tế bào ung thư đánh giá các chỉ số IC50 và MIC.

Tiến hành thử độc tính trên chuột nhắt trắng để xác  định giá trị LD50

2. Kết quả

Khả  năng nhả chậm

Quá  trình nhả chậm ARTS từ  CS-TP-ARTS

trong  SGF  (trái)  dịch dạ  dày pH = 2

trong SIF ( phải) dịch ruột pH = 8

Thời gian bán thải của sản phẩm có thể đạt 20h. Một viên Artesunat thông thường khi dùng đường

uống có  thời gian bán hủy t1/2 = 2h

Trong khi đó  ở dạng bọc bằng chitosan chế phẩm ARTS –  CS- STPP có thời gian bán thải t1/2 = 20h

Mở ra một ứng dụng mới cho chế phẩm ARTS – CS- TPP làm nguyên liệu tốt trong tương lai để sản xuất thuốc chống sốt rét có tác dụng kéo dài

Ưu điểm do kích thước cỡ nano thì giảm thiểu lượng thuốc đưa vào cơ thể

Thử  độc tính và hoạt tính

Các giá  trị IC50 và MIC độc tính với KST sốt rét  P. falciparum của hạt nano CS – TPP – ARTS

MIC : nồng độ ức chế tối thiểu KST sốt rét

Kết quả:  MIC = 64000ng/ml

                IC50:  nồng độ ức chế 50% số KST sốt rét

Được tính toán từ thực nghiệm và xử lý số liệu trên máy tính

Kết quả  : IC50 = 50000ng/ml

Gía trị  LD50 của hạt nano CS – TPP – ARTS 

     

Nhóm Số chuột Liều dùng (g/kg) Số chuột chết Tỷ lệ chuột chết/chuột sống

1 12 0,5 0

2 12 0,6 0

3 12 0,7 1 1/11

4 12 0,8 2 2/10

5 12 0,9 3 3/9

6 12 1,0 4 4/8

7 12 1,1 4 4/8

8 12 1,2 5 5/7

9 12 1,4 5 5/7 

KÊT LUẬN:        

      

Mục tiêu 5

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUÂT THỬ NGHIÊM NANO CHITOSAN VA THUÔC NANO