barley telomeres

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  • 8/7/2019 barley telomeres

    1/5

    P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 2 , p p . 9 5 5 5 - 9 5 5 9 , O c t o b e r 1 9 9 5G e n e t i c s

    B a r l e y t e l o m e r e s s h o r t e n d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n b u t grow i nc a l l u s c u l t u r eANDRZEJ K I L I A N * , CAROL S T I F F , A N D A N D R I S K L E I N H O F SD e p a r t m e n t s o f C r o p & S o i l S c i e n c e s a n d G e n e t i c s & C e l l B i o l o g y , W a s h i n g t o n S t a t e U n i v e r s i t y , P u l l m a n , WA 9 9 1 6 4 - 6 4 2 0C o m m u n i c a t e d b y D i t e r v o n W e t t s t e i n , C a r s l b e r g L a b o r a t o r y , C o p e n h a g e n , D e n m a r k , J u l y 1 2 , 1 9 9 5ABSTRACT E u k a r y o t i c c h r o m o s o m e s t e r m i n a t e w i t hl o n g s t r e t c h e s o f s h o r t , g u a n i n e - r i c h r e p e a t s . T h e s e r e p e a t sa r e a d d e d d e n o v o b y a s p e c i a l i z e d e n z y m e , t e l o m e r a s e . I nh u m a n s t e l o m e r e s s h o r t e n d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n , p r e s u m a b l yd u e t o t h e a b s e n c e o f t e l o m e r a s e a c t i v i t y i n s o m a t i c c e l l s . T h i sp h e n o m e n o n f o r m s t h e b a s i s f o r s e v e r a l m o d e l s o f t e l o m e r er o l e i n c e l l u l a r s e n e s c e n c e . B a r l e y ( H o r d e u m v u l g a r e L . ) t e l o -m e r e s c o n s i s t o f t h o u s a n d s o f TTTAGGG r e p e a t s , c l o s e l yr e s e m b l i n g o th er h i gh er e u k a r y o t e s . I n v i v o d i f f e r e n t i a t i o na n d a g i n g r e s u l t e d i n r e d u c t i o n o f t e r mi n a l r e s t r i c t i o n f r a g -m e n t l e n g t h p a r a l l e l e d b y a d e c r e a s e o f t e l o m e r e r e p e a tn u m b e r . D e d i f f e r e n t i a t i o n i n c a l l u s c u l t u r e r e s u l t e d i n a ni n c r e a s e o f t h e t e r m i n a l r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h a n d i n t h en u m b e r o f t e l o m e r e r e p e a t s . L o n g - t e r m c a l l u s c u l t u r e s h a dv e r y l o n g t e l o m e r e s . A b s o l ut e t e lo m er e l e n g t h s w e r e g e n o t y p ed e p e n d e n t , b u t t h e r e l a t i v e c h a n g e s d u e t o d i f f e r e n t i a t i o n ,d e d i f f e r e n t i a t i o n , a n d l o n g - t e r m c a l l u s c u l t u r e w e r e c o n s i s -t e n t among g e n o t y p e s . A m o d e l i s p r e s e n t e d t o d e s c r i b e t h ep o t e n t i a l r o l e o f t h e t e l o m e r e l e n g t h i n r e g u l a t i o n o f a c e l l ' sm i t o t i c a c t i v i t y a n d s e n e s c e n c e .T e l o m e r e s a r e e s s e n t i a l s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c o m p o n e n t so f e u k a r y o t i c c h r o m o s o m e s ( r e v i e w e d i n r e f s . 1 a n d 2 ) . T h em o s t t e r m i n a l f r a g m e n t o f t h e c h r o m o s o m e c o n s i s t s o f t a n d e ma r r a y s o f s h o r t , G - r i c h s e q u e n c e s r e f e r r e d t o a s t e l o m e r i cr e p e a t s ( T R s ) . T h e r e a r e s e v e r a l t o t h o u s a n d s o f TR s p e rc h r o m o s o m e e n d , a d d e d d e n o v o b y a s p e c i a l i z e d e n z y m e ,t e l o m e r a s e ( r e v i e w e d i n r e f . 1 ) . T e l o m e r a s e i s a r i b o n u c l e o -p r o t e i n p o l y m e r a s e t h a t c o n t a i n s i t s own RNA t e m p l a t ec o m p o n e n t , t h u s r e p r e s e n t i n g a u n i q u e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e .T e l o m e r a s e a c t i v i t y w a s f i r s t i d e n t i f i e d i n t h e u n i c e l l u l a rc i l i a t e T e t r a h y m e n a ( 3 ) . I t s a c t i v i t y h a s a l s o b e e n r e p o r t e d i ni m m o r t a l i z e d human ( 4 , 5 ) a n d m o u s e ( 6 ) c e l l l i n e s . R e c e n t l y ,t e l o m e r a s e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d t h r o u g h o u t o o g e n e s i s a n de m b r y o g e n e s i s i n X e n o p u s ( 7 ) . T e l o m e r a s e i s a p p a r e n t l y i n -a c t i v e i n d i f f e r e n t i a t e d h u m a n t i s s u e s ( 8 , 9 ) . D e v e l o p m e n t a li n a c t i v a t i o n o f t e l o m e r a s e w a s s u g g e s t e d a s t h e c a u s e o ft e l o m e r e s h o r t e n i n g i n h u m a n s o m a t i c t i s s u e s c o m p a r e d t o t h eg e r m l i n e ( 9 ) . T e l o m e r e s h o r t e n i n g w a s p r e d i c t e d b a s e d o n t h ec h a r a c t e r i s t i c s o f DNAp o l y m e r a s e s ( 1 0 , 1 1 ) a n d i n f e r r e d a s ap o t e n t i a l c a u s e o f c e l l u l a r s e n e s c e n c e ( 1 0 ) .T h e r o l e o f t e l o m e r e s h o r t e n i n g i n c e l l u l a r s e n e s c e n c e h a sa t t r a c t e d c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n a n d s e v e r a l s p e c u l a t i v e m o d -e l s h a v e b e e n p r o p o s e d t o e x p l a i n t h e r e l a t i o n s h i p ( 9 , 1 2 ) . A ni m p o r t a n t q u e s t i o n a b o u t t h e g e n e r a l i t y o f t h i s p h e n o m e n o nr e m a i n s . T e l o m e r e l e n g t h i s a p p a r e n t l y n o t r e l a t e d t o c e l l u l a rs e n e s c e n c e i n u n i c e l l u l a r e u k a r y o t e s l i k e y e a s t ( 1 3 ) a n d P a r -a m e c i u m ( 1 4 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t d u r i n g t h e e v o l u t i o n o fm u l t i c e l l u l a r e u k a r y o t e s t h e t e l o m e r e b e c a m e a m i t o t i c c l o c ki n d i f f e r e n t i a t i o n ( 9 ) . D a t a s u p p o r t i n g t h e h y p o t h e s i s t h a tt e l o m e r e l e n g t h h a s a r o l e i n c e l l u l a r a g i n g i s l i m i t e d t oh u m a n s . Mouse s o m a t i c c e l l s d o n o t s h o w a d e c r e a s e i nt e l o m e r e l e n g t h c o m p a r e d t o g e r m - l i n e c e l l s ( 1 5 , 1 6 ) .

    A l t h o u g h t h e f i r s t h i g h e r e u k a r y ot e t e l om e r e s e q u e n c e t o b ec l o n e d w a s f r o m a p l a n t , A r a b i d o p s i s t h a l i a n a ( 1 7 ) , n o t h i n g i sk n o w n a b o u t t h e d e v e l o p m e n t a l d y n a m i c s o f t e l o m e r e l e n g t h .i n t h e p l a n t k i n g d o m . I n t h i s r e p o r t t e l o m e r e l e n g t h w a sa n a l y z e d i n b a r l e y ( H o r d e u m v u l g a r e L . ) i n v i v o a n d i n t i s s u ec u l t u r e c e l l s . D i f f e r e n t i a t i o n a n d a g i n g r e s u l t e d i n r e d u c t i o n o ft e r m i n a l r e s t r i c t i o n f r a g m e n t ( T R F ) l e n g t h p a r a l l e l e d b y ad e c r e a s e i n t h e n u m b e r o f T R s . D e d i f f e r e n t i a t i o n i n c a l l u sc u l t u r e r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e i n t h e TR F l e n g t h a n d i n t h en u m b e r o f T R s . Am o d e l i s p r e s e n t e d t o d e s c r i b e t h e p o t e n t i a lr o l e o f t e l o m e r e l e n g t h i n r e g u l a t i o n o f a c e l l ' s m i t o t i c a c t i v i t ya n d s e n e s c e n c e .M A T E R I A L S AND METHODS

    P l a n t M a t e r i a l . P l a n t s u s e d f o r DNA e x t r a c t i o n w e r e k e p ti n g r o w t h c a b i n e t s a t 1 8 C , w i t h 1 6 h r o f l i g h t . I m m a t u r ee m b r y o s w e r e i s o l a t e d f r o m t w o o r t h r e e s p i k e s r e p r e s e n t i n ga s i m i l a r d e v e l o p m e n t a l s t a g e . T h e y o u n g e s t e m b r y o s a m e n a -b l e f o r a n a l y s i s w e r e

  • 8/7/2019 barley telomeres

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    P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 2 ( 1 9 9 5 )r e s t r i c t i o n e n z y m e a n d r e s o l v e d i n 1% a g a r o s e g e l u s i n g t h eCHEF DR I I I s y s t e m a n d t h e c o n d i t i o n s s u g g e s t e d b y t h em a n u f a c t u r e r f o r r e s o l v i n g a 5 - k b l a d d e r , w i t h t h e l e n g t h o f t h er u n r e d u c e d f r o m 1 1 t o 8 h r . A c o n c a t a m e r s a n d a H i n d l I ld i g e s t o f A DNA w e r e u s e d a s m a r k e r s . DNA i n t h e g e l w a ss t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , d e p u r i n a t e d b y a 2 0 - m i ni n c u b a t i o n i n 0 . 2 5 M H C I , w a s h e d w i t h d e i o n i ze d w a t e r , a n di n c u b a t e d f o r 2 0 m i n i n t r a n s f e r s o l u t i o n ( 0 . 4 M N a O H / 0 . 6 MN a C I ) . DNA f r a g m e n t s w e r e t r a n s f e r r e d t o G e n e S c r e e n P l u sn y l o n m e m b r a n e s ( N e w E n g l a n d N u c l e a r ) a n d h y b r i d i z e d w i t hl a b e l e d TR p r i m e r (CCCTAAA)4. T 4 p o ly n u cl e ot i d e k i n a s e( B R L ) w a s u s e d t o e n d - l a b e l 1 5 p m o l o f t h e p r i m e r w i t h 5 0 , u C io f [ ' y - 3 2 P ] A T P ( s p e c i f i c a c t i v i t y , 6 0 0 0 C i / m m o l ; 1 C i = 3 7 G B q ;N ew E n g l a n d N u c l e a r ) . P r e - a n d h y b r i d i z a t i o n b u f f e r s w e r e a sd e s c r i b e d ( 1 9 ) . H y b r i d i z a t i o n s a n d f i n a l w a s h e s w e r e a t 5 5 C .Two w a s he s w i t h 4x S S C / 1 % SDS w e r e f o l l o w e d b y t h e f i n a lw a s h w i t h 2x S S C / 1 % S D S . H y b r i d i z a t i o n s w i t h a l l o t h e rp r o b e s w e r e a c c o r d i n g t o p u b l i s h e d m e t h o d s ( 1 9 ) .F o r d o t b l o t a n a l y s i s , - 5 , u g o f b a r l e y DNAw a s d e n a t u r e di n 0 . 2 5 M N a O H / 0 . 5 M N a C l f o r 1 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e ,q u e n c h e d o n i c e f o r 1 0 m i n , a n d b l o t t e d o n t o G e n e S c r e e n P l u sm e m b r a n e s . P l a s m i d DNA f r o m c l o n e p T 5 6 c o n t a i n i n g 2 5b a r l e y TR s [ ( C C C T A A A ) 2 5 ] a s d e t e r m i n e d b y s e q u e n c i n g( d a t a n o t s h o w n ) i n pUC19 v e c t o r w a s i n c l u d e d o n e a c h b l o t .DNA f r o m p T 5 6 ( 0 , 1 , 5 , a n d 2 5 n g ) w a s m i x e d w i t h 5 , u g o fpUC19 p l a s m i d a n d p r o c e s s e d a s b a r l e y g e n o m i c D N A . H y -b r i d i z a t i o n s a n d w a s he s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d f o r S o u t h e r nb l o t s .D a t a A n a l y s i s . T h e m e m b r a n e s w e r e e x p o s e d t o x - r a y f i l ma n d s c a n n e d w i t h a n AMBIS r a d i o a n a l y t i c i m a g i n g s y s t e m .Q u a n t i t a t i o n o f t h e s i g n a l w a s o n AMBIS s c a n s u s i n g t h es o f t w a r e p r o v i d e d b y t h e m a n u f a c t u r e r .F o r TR F e s t i m a t i o n , t h e m i d d l e 50% o f e a c h S o u t h e r n b l o tl a n e ( t o a v o i d i n t e r f e r e n c e f r o m n e i g h b o r i n g l a n e s ) w a s q u a n -t i f i e d a n d me an t e l o m e r e l e n g t h w a s c a l c u l a t e d f r o m t h eo u t p u t a s d e s c r i b e d ( 2 0 ) . F o r q u a n t i t a t i o n o f d o t b l o t s , t h en u m b e r o f c o u n t s f o r pUC19 w i t h o u t p T 5 6 w a s u s e d a s t h eb a c k g r o u n d . To d e t e r m i n e t h e n u m b e r o f TR s p e r s a m p l e , t h es i g n a l o b t a i n e d w i t h TR p r i m e r wa s d i v i d e d b y t h e s i g n a l f o rt h e 5 - n g p T 5 6 s a m p l e a n d m u l t i p l i e d b y 3 . 8 x 1 0 1 0 ( n u m b e r o fc o p i e s o f t h e 7 - b p TR s e q u e n c e i n 5 - n g p T 5 6 s a m p l e ) . S i n c e 5A g o f b a r l e y DNAc o n t a i n s _ 1 0 6 c o p i e s o f t h e b a r l e y g e n o m e[ b a s e d o n g e n o m e s i z e o f 5 x 1 0 9 b p ( 2 1 ) a n d A v o g a d r o ' sn u m b e r ] , t h e n u m b e r o f TR s p e r h a p l o i d g e n o m e w a s o b t a i n e db y d i v i d i n g t h e n u m b e r o f TR s p e r s a m p l e b y 1 0 6 . T h e n u m b e ro f TR s p e r g e n o m e w a s c o n v e r t e d t o t e l o m e r e l e n g t h b ym u l t i p l y i n g t h e TR n u m b e r b y t h e r e p e a t l e n g t h ( 7 b p ) a n dd i v i d i n g b y t h e n u m b e r o f t e l o m e r e s ( 1 4 ) i n a h a p l o i d g e n o m e .A c o r r e c t i o n f a c t o r f o r t h e a m o u n t o f DNA l o a d e d w a sd e t e r mi n e d b y a v e r a g i n g t h e s i g n a l w i t h t o t a l g e n o m i c DNAp r o b e f r o m f i v e v e r y c a r e f u l l y q u a n t i t a t e d DNA s a m p l e s a n dd i v i d i n g t h e s i g n a l f o r e a c h s a m p l e b y t h i s v a l u e .

    T e l o m e r e l e n g t h e s t i m a t e s b a s e d o n TR F a n a l y s i s w e r eo f t e n m u c h s m a l l e r t h a n t h o s e b a s e d o n d o t b l o t a n a l y s i s ( i . e . ,7 5 k b v e r s u s > 2 0 0 k b f o r l o n g - t e r m K l a g e s c e l l c u l t u r e s ) . T h ed i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e e s t i m a t e s w a s s m a l l e r f o r s h o r t e rt e l o m e r e s - i . e . , l o n g - t e r m Morex c e l l c u l t u r e s ( 5 0 k b v e r s u s 6 0k b ) . Random s h e a r i n g d u r i n g DNA e x t r a c t i o n p r o b a b l y a c -c o u n t s f o r m o s t o f t h e d i f f e r e n c e s s i n c e t h e t e l o m e r e l e n g t he s t i m a t e d f r o m d o t b l o t s w a s s o m e t i m e s h i g h e r t h a n t h ea v e r a g e l e n g t h o f u n d i g e s t e d D N A . R e d u c e d S o u t h e r n t r a n s -f e r e f f i c i e n c y f o r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t DNA a s w e l l a s t a r g e tDNA q u a n t i t a t i o n f o r d o t b l o t s ( b o t h f o r b a r l e y g e n o m i c a n dp l a s m i d p T 5 6 ) m ay a l s o c o n t r i b u t e t o t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e nt h e e s t i m a t e s . We w a n t t o s t r e s s , h o w e v e r , t h a t i n s p i t e o f t h ed i f f e r e n c e s i n a b s o l u t e v a l u e s , b o t h m e t h o d s g a v e v e r y s i m i l a rr e l a t i v e v a l u e s f o r g e n o t y p e s / t i s s u e s c o m p a r e d .

    RESULTST e l o m e r e s S h o r t e n D u r i n g D i f f e r e n t i a t i o n . To d e t e r m i n e

    t h e f a t e o f t e l o m er e s d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n i n b a r l e y , e m b r y oa n d i n f l o r e s c e n c e t i s s u e s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f d e v e l o p m e n twere a n a l y z e d . S t r i c t l y m e r i s t e m a t i c t i s s u e s are n o t a v a i l a b l e i nb a r l e y i n s u f f i c i e n t amounts f o r r o u t i n e DNA e x t r a c t i o n .H o w e v e r , g r o w i n g e m b r y o s a n d i n f l o r e s c e n c e s a l l o w e d c l e a rs e p a r a t i o n o f v a r i o u s d e v e l o p m e n t a l s t a g e s b a s e d on s i z em e a s u r e m e n t s . B o t h TR F s i z e a n d t h e number o f TR s w e r ed e t e r m i n e d .TR F l e n g t h d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e d d i f f e r e n t i a t i o n a n da ge i n t h e c v . G o l d e n P r o m i s e e m b r y o s ( F i g . 1 A ) . Th e o l d e s te m b r y o t e l o m e r e s w e r e b e t w e e n 2 5 a n d 3 0 k b , = 2 0 k b s h o r t e rt h a n t h o s e f r o m t h e y o u n g e s t e m b r y o s . T e l o m e r e s o f t he o l d e s te m b r y o s w e r e s t i l l = 5 k b l o n g e r t h a n t h e t e lo m e r e s o f f u l l ye x p a n d e d l e a v e s t h a t h a d a mean TR F a r o u n d 2 3 k b ( F i g . 1 A ) .Th e q u a l i t y o f r e s t r i c t i o n d i g e s t a n d q u a n t i t y o f DNA l o a d e dp e r l a n e d i d n o t i n f l u e n c e t h e r e s u l t s s i g n i f i c a n t l y ( F i g . 1 B ) .

    A k b p 1 2 3 4150 >100

    50>23>9 >6 >

    B k b p2 >

    1 >

    C 2 0

    1 50xc: 1 0

    H0-0 5Ez

    0

    - 1 ' 1 - ' 1 I 1 ' 1 - - 1

    _ _ 0 C _ M 0 I

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

    1 0 0

    75nc0 )0At

    E02 5

    0T i s s u e

    F I G . 1 . T e l o m e r e s s h o r t e n d u r i n g b a r l e y e m b r y o d e v e l o p m e n t . ( A )TRFs w e r e r e s o l v e d a n d d e t e c t e d a s d e s c r i b e d f r o m c v . G o l d e nP r o m i s e i m m a t u r e e m b r y o s

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    3/5

    P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 2 ( 1 9 9 5 ) 9 5 5 7T h e d o t b l o t m e t h o d u s e d t o e s t i m a t e TR n u m b e r a l l o w e dg o o d q u a n t i t a t i o n o f t h e d y n a m i c s o f t e l o m e r e s h o r t e n i n g ,a l t h o u g h b e t w e e n - s a m p l e v a r i a t i o n w a s c o n s i d e r a b l e . Some o ft h i s v a r i a t i o n may b e d u e t o s i z e a n d s t a g e o f d e v e l o p m e n td i f f e r e n c e s a m o n g t h e e m b r y o s b u l k e d f o r a n a l y s e s . I n t h e c v .G o l d e n P r o m i s e , t h e n u m b e r o f TR s p e r 5 - p l g s a m p l e i n t h ey o u n g e s t e m b r y o s a n a l y z e d w a s - 1 6 x 1 0 1 0 , c o r r e s p o n d i n g t oa n a v e r a g e l e n g t h o f 8 0 k b f o r e a c h t e l o m e r e ( F i g . 1 C ) . I ns o m e w h a t o l d e r e m b r y o s , t h e TR n u m b e r d e c r e a s e d b y 25%t o 1 2 x 1 0 1 0 , o r " 6 0 k b p e r a v e r a g e c h r o m o s o m e e n d . T h eo l d e s t e m b r y o s a n a l y z e d h a d 9 x 1 0 1 0 T R s , r e p r e s e n t i n g 56%o f t h e y o u n g e s t e m b r y o v a l u e . DNA f r o m l e a v e s h a d 30%f e w e r TR s t h a n t h e o l d e s t e m b r y o s , ' 3 0 k b p e r a v e r a g ec h r o m o s o m e e n d .A n a l y s i s o f i m ma t u r e e m b r y o s a n d l e a v e s f r o m t w o o t h e rg e n o t y p e s , M o r e x a n d S t e p t o e , s h o w e d a s i m i l a r p a t t e r n o f TRn u m b e r r e d u c t i o n d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n ( F i g . 1 C ) . I n t e r e s t -i n g l y , t h e n u m b e r o f TR s i n a l l t i s s u e s o f t h e c u l t i v a r M o r e x w a ss i g n i f i c a n t l y s m a l l e r t h a n i n S t e p t o e , b u t i n b o t h g e n o t y p e s t h en u m b e r o f TR s i n l e a v e s w a s a b o u t h a l f t h a t o b s e r v e d i n v e r yy o u n g e m b r y o s .TR F l e n g t h a n d TR n u m b e r c h a n g e s d u r i n g d e v e l o p m e n t o fc v . G o l d e n P r o m i s e i n f l o r e s c e n c e s h o w e d a p a t t e r n s i m i l a r t ot h a t o b s e r v e d w i t h i m m a t u r e e m b r y o s . I n t h e y o u n g e s t i n f l o -r e s c e n c e a n a l y z e d ( 8 - 1 0 m m ) , me an TRFs w e r e 4 0 - 4 5 k b ( F i g .2 4 ) . I n t h e o l d e s t i n f l o r e s c e n c e ( 5 cm w i t h o u t a w n s ) , TRFsw e r e s h o r t e r b y " 2 0 k b , h a v i n g a l e n g t h s i m i l a r t o t h a t i n l e a v e s( - 2 3 k b ) . D o t b l o t e s t i m a t e s o f t he n u m b e r o f TR s a l s o s h o w e da s i m i l a r r e d u c t i o n w i t h d i f f e r e n t i a t i o n ( F i g . 2 C ) . T h e TRn u m b e r d e c r e a s e d b y n e a r l y 50% b e t w e e n t h e y o u n g e s t a n d

    A k b p15 0 >10 0 >5 0 >2 3 >

    B k b p2 >

    1 2 3 4

    2 . 4

    mld

    1 >

    C 1 4

    xcc

    0U).0E

    z

    2 3T i s s u e

    7 0

    6 0n

    5 0 - ,C:a )4 0 a )E0a )3 0

    2 0

    F I G . 2 . T e l o m e r e s s h o r t e n d u r i n g b a r l e y i n f l o r e s c e n c e d e v e l o p -m e n t . ( A ) TRFs ( s e e F i g . L A l e g e n d ) f r o m c v . G o l d e n P r o m i s ei n f l o r e s c e n c e s 8 - 1 0 mm l o n g ( l a n e 1 ) , " 3 0 mm l o n g ( l a n e 2 ) , 5 5 - 6 0mml o n g ( l a n e 3 ) , a n d l e a f t i s s u e ( l a n e 4 ) . ( B ) Same b l o t s t r i p p e d a n dh y b r i d i z e d w i t h b a r l e y A D P - g l u c o s e p y r o p h o s p h o r y l a s e s i n g l e cop yc l o n e b e s F 2 t o d e m o n s t r a t e r e s t r i c t i o n d i g e s t q u a l i t y a n d t o c o m p a r eDNAq u a n t i t y per l a n e . ( C ) TR n u m b e r a n d t e l o m e r e l e n g t h ( s e e F i g .1 C l e g e n d ) f o r t h e same s a m p l e s a s i n A .

    -xU )

    0-C D. 0Ez

    4 o 1 1 1 1 1 1 1 1 1 13 0 -

    2 0 -

    1 0

    0 I II II II1 2 3 4 5 6 7

    2 0 0

    1 5 0 5c0a0 0 < ,

    5 0 0

    0T i s s u e

    F I G . 3 . T e l o m e r e s g r o w i n b a r l e y c a l l u s c u l t u r e . TR n u m b e r a n dt e l o m e r e l e n g t h ( s e e F i g . 1 C l e g e n d ) f o r c v . G o l d e n P r o m i s e e x p l a n t( 1 . 5 - m m i m m a t u r e e m b r y o s ) ( s a m p l e 1 ) a n d c a l l u s 2 ( s a m p l e 2 ) , 4( s a m p l e 3 ) , 6 ( s a m p l e 4 ) , 8 ( s a m p l e 5 ) , a n d 1 6 ( s a m p l e 6 ) w e e k s , a n d>1 y e a r ( s a m p l e 7 ) i n c u l t u r e .t h e o l d e s t i n f l o r e s c e n c e s a n a l y z e d . L e a v e s h a d o n l y s l i g h t l yf e w e r TR s t h a n t h e o l d e s t i n f l o r e s c e n c e s s t u d i e d .

    T e l o m e r e s Grow i n B a r l e y C a l l u s C u l t u r e . To s t u d y t h ed y n a m i c s o f t e l om er e l e n g t h i n v i t r o , c a l l u s c u l t u r e s w e r ei n i t i a t e d f r o m c v . G o l d e n P r o m i s e i m m a t u r e e m b r y o s ( - 1 . 5m m ) . T h e n u m b e r o f TR s w a s e s t i m a t e d a t v a r i o u s t i m e p o i n t sa f t e r c u l t u r e i n i t i a t i o n . D u r i n g t h e f i r s t 4 w e e k s a s m a l ld e c r e a s e i n TR n u m b e r w a s o b s e r v e d ( F i g . 3 ) . L a t e r , t h e t r e n dr e v e r s e d a n d , i n t h e o l d e r c u l t u r e s , v e r y h i gh TR n u m b e r s w e r eo b s e r v e d . T h e a v e r a g e n u m b e r o f TR s i n a y e a r - O l d c u l t u r e w a s3 2 x 1 0 1 0 , a l m o s t 3 t i m e s t h e n u m b e r i n t h e e x p l a n t t i s s u e ( F i g .3 ) . V a r i a t i on o f t h e p a r a m e t e r s t u d i e d i n c r e a s e d a l o n g w i t h t h emean a n d t h e h i g h e s t v a l u e w a s >70 x 1 0 1 0 , r e p r e s e n t i n g - 3 5 0k b o f t e l o m e r e . T h e TR n u m b e r i n s h o o t s d i f f e r e n t i a t i n g f r o my o u n g c a l l i w a s a b o u t t h e s a m e a s i n n o r m a l l e a f t i s s u e s ( d a t an o t s h o w n ) .TR F l e n g t h a n d TR n u m b e r d e t e r m i n e d f o r c v . S t e p t o e ,M o r e x , a n d K l a g e s l o n g - t e r m c u l t u r e c a l l i s h o w e d a d r a m a t i ci n c r e a s e w h e n c o m p a r e d t o l e a f t i s s u e ( F i g . 4 A a n d C ) . T h i sw a s p a r t i c u l a r l y a p p a r e n t i n t h e TR n u m b e r ( F i g . 4 C ) f o r c v .K l a g e s . T h e s h o r t e s t t e l o m e r e s , b o t h TR F a n d TR a s s a y , w e r eo b s e r v e d f o r c v . M o r e x . T h i s w a s i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u so b s e r v a t i o n s f o r c v . M o r e x i m m a t u r e e m b r y o s ; h o w e v e r , t h ea v e r a g e TR n u m b e r i n c r e a s e w a s - 3 - f o l d c o m p a r e d t o l e a ft i s s u e , a s i n t h e o t h e r g e n o t y p e s .

    DISCUSSIONT e l o m e r e s C o n t r a c t D u r i n g D i f f e r e n t i a t i o n . TR F l e n g t ha n d TR n u m b e r d e c r e a s e d i n b a r l e y e m b r y o s a n d i n f l o r e s -c e n c e s d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n ( F i g s . 1 a n d 2 ) . H y b r i d i z a t i o n o ft h e b l o t s w i t h s e v e r a l b a r l e y t e l o m e r e - a s s o c i a t e d s e q u e n c e

    p r o b e s ( 2 2 ) d i d n o t d e t e c t d i f f e r e n c e s i n t h e p a t t e r n o ra b u n d a n c e o f T R - p r o x i m a l s e q u e n c e s i n a n y o f t h e t i s s u e sa n a l y z e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u p p o r t t h ec o n c l u s i o n t h a t t e l o m e r e s h o r t e n i n g i s d u e t o r e d u c t i o n o f TRn u m b e r a t t h e c h r o m o s o m e e n d s . I n c o m p l e t e r e p l i c a t i o n o fDNAm o l e c u l e s a t t h e e n d s o f t h e c h r o m o s o m e s , p r o b a b l y d u et o l i m i t e d t e l o m e r a s e a c t i v i t y , s e e m s t o b e t h e m o s t l i k e l ye x p l a n a t i o n f o r t h i s p h e n o m e n o n .P r e c i s e q u a n t i t a t i o n o f t e l o m e r e s h o r t e n i n g d y n a m i c s i sd i f f i c u l t b e c a u s e o f l a c k o f i n f o r m a t i o n o n t h e n u m b e r o f c e l ld i v i s i o n s s e p a r a t i n g t h e d e v e l o p m e n t a l s t a g e s a n a l y z e d . T h en u m b e r o f c e l l d i v i s i o n s b e t w e e n z y g o t e a n d f u l l y e x p a n d e dm a i z e l e a f w a s e s t i m a t e d t o b e " 5 0 ( 2 3 ) . O u r e s t i m a t e s f o rb a r l e y , b a s e d o n DNA y i e l d f r o m v a r i o u s s t a g e s / t i s s u e s , g a v ea s i m i l a r v a l u e , w i t h " 1 5 c e l l d i v i s i o n s f r o m t h e z y g o t e t o t h ey o u n g e s t e m b r y o a n a l y z e d a n d 3 5 f r o m t h e y o u n g e s t e m b r y o

    G e n e t i c s : K i l i a n e t a L

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    4/5

    P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 2 ( 1 9 9 5 )Akbp150>

    100>

    50>23>

    9>6>

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1

    B kbp2>

    1 >

    c

    xU r)cc

    e n

    Ez

    1 2 3 4 5 6 7Tissue

    n0)c

    E0

    F I G . 4 . L o n g - t e r m c a l l u s c u l t u r e s h a v e very l o n g t e l o m e r e s . ( A )TRFs ( s e e F i g . 1 A l e g e n d ) f r o m cv . K l a g e s l e a f ( l a n e 1 ) a n d c a l l u sc u l t u r e 6 m o n t h s ( l a n e 2 ) a n d 3 years ( l a n e 3 ) o l d , c v . G o l d e n P r o m i s el e a f ( l a n e 4 ) , c a l l u s c u l t u r e 9 m o n t h s ( l a n e 5 ) a n d 1 4 m o n t h s ( l a n e 6 )o l d , c v . S t e p t o e l e a f ( l a n e 7 ) a n d c a l l u s c u l t u r e s 4 m o n t h s ( l a n e 8 ) a n d6 m o n t h s ( l a n e 9 ) o l d , c v . Morex l e a f ( l a n e 1 0 ) a n d c a l l u s c u l t u r e 6m o n t h s ( l a n e 1 1 ) o l d . ( B ) Same b l o t s t r i p p e d a n d h y b r i d i z e d w i t hb a r l e y A D P - g l u c o s e p y r o p h o s p h o r y l a s e s i n g l e - c o p y c l o n e b e s F 2 t od e m o n s t r a t e r e s t r i c t i o n d i g e s t q u a l i t y . ( C ) TR n u m b e r a n d t e l o m e r el e n g t h ( s e e F i g . 1C l e g e n d ) f o r t h e s a m e s a m p l e s a s i n A .t o a f u l l y e x p a n d e d l e a f . S i n c e t he t e l o m e r e s o f t h e y o u n g e s te m b r y o w e r e 2 5 - 5 0 k b l o n g e r t h a n i n t h e f u l l y e x p a n d e d l e a fi n c v . G o l d e n P r o m i s e ( b a s e d on TR F a n d TR d a t a , respec-t i v e l y ) , t h e average r e d u c t i o n w a s e s t i m a t e d t o b e 7 0 0 - 1 4 0 0 b pp er chromosome e n d per c e l l d i v i s i o n . T h i s v a l u e i s muchh i g h e r t h a n t h e 4 0 - 2 0 0 b p r e p o r t e d f o r h u m a n t e l o m e r e s ( 2 0 ,2 4 ) . Th e r a t e o f t e lo m e r e s h o r t e n i n g i n h u m a n s w a s d e t e r -m i n e d b y u s i n g s o m a t i c c e l l l i n e s i n c u l t u r e , w h e r e e a c h c e l l h a sa s i m i l a r c h a n c e o f u n d e r g o i n g a m i t o t i c d i v i s i o n . I n p l a n t s ,w h e r e t h e m i t o t i c a c t i v i t y i s c o n c e n t r a t e d i n d i s c r e t e m e r i s t e m s( 2 5 ) , t h e a s s u m p t i o n o f e x p o n e n t i a l g r o w t h ( s y n c h r o n o u s c e l ld i v i s i o n s ) i s n o t f u l f i l l e d . As a r e s u l t , t h e c e l l c y c l e number i sp r o b a b l y u n d e r e s t i m a t e d .T e l o m e r e s Expand D u r i n g U n d i f f e r e n t i a t e d G r o w t h . TRnumber i n c r e a s e d i n b a r l e y c e l l s d u r i n g u n d i f f e r e n t i a t e dg r o w t h i n c e l l c u l t u r e ( F i g . 3 ) a n d l o n g - t e r m c u l t u r e s h a d v e r yl o n g TRFs a n d a l a r g e number o f TR s ( F i g . 4 ) . T h i s o b s e r v a -t i o n i s i n c o n t r a s t w i t h h u m a n c e l l c u l t u r e s ( 2 0 , 2 4 ) . H u m a nt e l o me r e s s h o r te n u n t i l t h e c u lt u re r e a c h e s a c r i s i s s t a g e , whenv e r y rare i m m o r t a l i z a t i o n e v e n t s may occur, u s u a l l y a s a r e s u l to f t r a n s f o r m a t i o n b y a DNA tumor v i r u s ( 9 , 2 6 ) . T e l o m e r a s ea c t i v a t i o n s e e m s t o b e i n v o l v e d i n i m m o r t a l i z a t i o n e v e n t s i nv i t r o ( 2 0 ) a n d i n m a l i g n a n t c e l l s ( 5 , 8 , 2 6 , 2 7 ) . T e l o m e r a s e mayb e a c t i v a t e d i n b a r l e y c e l l c u l t u r e , s i n c e t h e t e l o m e r e l e n g t hi n c r e a s e d s oo n a f t e r c a l l u s i n i t i a t i o n ( F i g . 3 ) . A l t e r n a t i v e l y , a

    s m a l l p o r t i o n o f c e l l s i n t h e e x p l a n t ( i m m a t u r e e m b r y o )e x p r e s s i n g t e l o m e r a s e m a y h a v e a s e l e c t i v e a d v a n t a g e l e a d i n gt o t h e i r p r e f e r e n t i a l g r o w t h i n t i s s u e c u l t u r e a n d a n a p p a r e n to v e r a l l t e l o m e r e l e n g t h i n c r e a s e .T h e r e a s o n f o r t h e v e r y l o n g t e lo me r e s i n l o n g - t e r m b a r l e yc a l l u s c u l t u r e c e l l s i s n o t c l e a r . I n t e r e s t i n g l y , a l l o f t h e l o n g -t e r m c u l t u r e s a n a l y z e d w e r e n o n m o r p h o g e n i c . T h e r e l a t i o n -s h i p b e t w e e n c h r o m o s o m e i n s t a b i l i t y a n d t h e l o s s o f r e g e n e r -a t i o n p o t e n t i a l i n l o n g - t e r m c a l l u s c u l t u r e s o f b a r l e y h a s b e e ne s t a b l i s h e d ( 2 8 , 2 9 ) . Tw o t y p e s o f c h r o m o s o m a l a b n o r m a l i t i e sh a v e b e e n r e p o r t e d t o b e p r e d o m i n a n t i n c a l l u s c e l l s , c h r o -m o s o m a l s t r u c t u r a l r e a r r a n g e m e n t s ( 2 8 ) a n d p o l y p l o i d y ( 2 8 ,2 9 ) . A n a p p a r e n t i n c r e a s e i n t e l o m e r e l e n g t h i n human c e l ll i n e s s t a b l y t r a n s f e c t e d w i t h p l a s m i d s c o n t a i n i n g TR s e q u e n c e sw a s a t t r i b u t e d t o c h r o m o s o m e t r u n c a t i o n a n d s e e d i n g o f n e wt e l o m e r e s ( 3 0 ) . I n y e a s t , a n i n c r e a s e i n t e l o m e r e l e n g t h w a sc a u s e d b y t r a n s f o r m a t i o n w i t h p l a s m i d s c o n t a i n i n g s t r e t c h e s o fTR s ( 3 1 ) . T h e i n c r e a s e o f t e l o m e r e l e n g t h was p r o p o r t i o n a l t op l a s m i d c o p y n u m b e r , s u g g e s t i n g a n a c t i v e r o l e o f TR b i n d i n gp r o t e i n ( s ) i n c o n t r o l l i n g t e l o m e r e l e n g t h ( 3 1 ) . P o l y p l o i d i z a t i o ni n b a r l e y c a l l u s c u l t u r e s may b e a n a l o g o u s t o y e a s t c e l l st r a n s f o r m e d w i t h T R - c o n t a i n i n g p l a s m i d s s i n c e t h e n u m b e r o ft e l o m e r e s ( a n d T R s ) p e r c e l l i n c r e a s e s w i t h t h e p l o i d y l e v e l . I ti s p o s s i b l e t h a t a n i n c r e a s e i n t i t r a t i o n o f t e l o m e r e b i n d i n gp r o t e i n ( s ) b y t h e i n c r e a s e d n u m b e r o f t e l o m e r e s ma y t r i g g e r ag r o w t h o f i n d i v i d u a l t e l o m e r e s i n b a r l e y a s s u g g e s t e d f o r y e a s t( 3 1 ) .T h e p o s s i b i l i t y o f p l o i d y c h a n g e s i n l o n g - t e r m c a l l u s c u l t u r e sm e a n s t h a t we c a n n o t c a l c u l a t e t h e TR n u m b e r p e r g e n o m e f o rt h e s e s a m p l e s . H o w e v e r , t h e n u m b e r ( a n d t h e l e n g t h ) o f TR sp e r c h r o m o s o m e e n d i s n o t a f f e c t e d b y t h e p l o i d y c h a n g e s s i n c et h e r e i s a f i x e d n u m b e r o f c h r o m o s o m e s ( a n d t e l o m e r e s ) i n ag i v e n a m o u n t o f DNA . A n i n c r e a s e i n TR n u m b e r c a n b e d u et o i n c r e a s e d t e l o m e r e l e n g t h o r a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o ft e l o m e r e s p e r u n i t o f D N A . T h e l a t t e r s i t u a t i o n w o u l d o c c u ro n l y i f t h e c h r o m o s o m e s b e c a m e f r a g m e n t e d . T h i s i s n o t t h eu s u a l p h e n o m e n o n i n b a r l e y c a l l u s c u l t u r e . T h e p r e s e n c e o fm a n y s h o r t t e l o m e r e s v e r s u s a f e w l o n g t e l o m e r e s i n t h el o n g - t e r m b a r l e y c a l l u s c u l t u r e s i s a l s o e x c l u d e d b y t h e TR Fl e n g t h m e a s u r e m e n t s , w h i c h p a r a l l e l t h e t e l o m e r e l e n g t he s t i m a t e s b a s e d on TR n u m b e r .M o d e l f o r T R - B a s e d M i t o t i c C l o c k T e l o m e r e s h o r t e n i n gd u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n i n b a r l e y i s s i m i l a r t o p r o c e s s e s o b s e r v e di n h u m a n s ( 9 , 2 0 , 3 2 ) . T h e p h e n o m e n o n o f t e l o m e r e s h o r t e n -i n g i s p r e s u m e d t o b e d u e t o t h e a b s e n c e o f t e lo me r a s e a c t i v i t ya n d f o r m s t h e b a s i s f o r a m o d e l o f c e l l u l a r s e n e s c e n c e ( 9 , 1 2 ) .D e l e t i o n o f c r i t i c a l g e n e s i n t h e c o u r s e o f t e l o m e r e s h o r t e n i n g ,l i m i t i n g t h e p r o l i f e r a t i v e c a p a c i t y o f human s o m a t i c c e l l s , w a so r i g i n a l l y p r o p o s e d a s t h e r e a s o n f o r t h e s e n e s c e n c e ( 9 ) .R e v e r s i b i l i t y o f c e l l m o r t a l i t y i n c u l t u r e p r o m p t e d a n e wm o d e l , i n w h i c h t e l o m e r e p o s i t i o n a l e f f e c t s r e g u l a t e c e l l u l a rs e n e s c e n c e ( 1 2 ) . I n t h i s m o d e l , g e n e s r e p r e s s i n g c e l l u l a r s e -n e s c e n c e a r e p r e s u m e d t o b e l o c a t e d i n t h e t e l o m e r i c r e g i o n so f c h r o m o s o m e s a n d i n a c t i v a t e d b y t e l o m e r e s h o r t e n i n g . R e -c e n t i n f o r m a t i o n r a i s e s q u e s t i o n s a b o u t t h i s m o d e l . F i r s t ,l o n g e r TR t r a c t s i n y e a s t w e r e s h o w n t o i n c r e a s e r a t h e r t h a nd e c r e a s e t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n a t t h e t e l o m e r e ( 3 3 ) . S e c -o n d , t e l o m e r e l e n g t h d i d n o t a f f e c t e x p r e s s i o n o f t h e S V n e og e n e i n human a n d mouse c e l l l i n e s i n s p i t e o f a v e r y s m a l lp h y s i c a l d i s t a n c e b e t w e e n t h i s g e n e a n d t h e TR ( 3 0 ) . T h i r d ,t e l o m e r e - a s s o c i a t e d s e q u e n c e s j u s t p r o x i m a l t o TR s a r e o f t e nh i g h l y r e p e t i t i v e a n d b e l i e v e d t o f o r m a g e n e - p o o r " b u f f e r i n gz o n e " f o r h i g h l y r e c o m b i n o g e n i c c h r o m o s o m a l e n d s ( r e v i e w e di n r e f s . 2 a n d 3 4 ) . L o c a t i o n o f a d e v e l o p m e n t a l l y i m p o r t a n tg e n e i n s u c h a " r i s k y " e n v i r o n m e n t w o u l d s e e m t o b e s e l e c -t i v e l y d i s a d v a n t a g e o u s .H e r e we p r o p o s e a n a l t e r n a t i v e m o d e l b a s e d on t h e r o l e o ft e l o m e r e b i n d i n g p r o t e i n ( s ) i n r e p r e s s i o n / a c t i v a t i o n o f g e n e sc o n t r o l l i n g m i t o t i c a n d m e t a b o l i c a c t i v i t y o f t h e c e l l . Twos c e n a r i o s c a n b e p u t f o r w a r d . T h e f i r s t o n e i n v o k e s t h e g e n e

    9 5 5 8 G e n e t i c s : K i l i a n e t a l .

  • 8/7/2019 barley telomeres

    5/5

    P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 2 ( 1 9 9 5 ) 9 5 5 9c o d i n g f o r t h e t e l o m e r e b i n d i n g p r o t e i n t h a t i s p o s i t i v e l ya u t o r e g u l a t e d . I n t h e g e r m l i n e ( l o n g t e l o m e r e s ) a l a r g ep r o p o r t i o n o f t h e p r o t e i n i s b o u n d t o c h r o m o s o m a l t e r m i n i .T h i s r e d u c e s t h e i n t e r a c t i o n o f t h e h y p o t h e t i c a l p r o t e i n w i t ho t h e r p r o t e i n s a n d / o r T R - l i k e s e q u e n c e s e l s e w h e r e i n t h eg e n o m e , i n c l u d i n g t h e p r o m o t e r o f i t s own g e n e . D u r i n gt e l o m e r e s h o r t e n i n g , more a n d more p r o t e i n i s l i b e r a t e d ,i n c r e a s i n g t h e l e v e l o f i t s own e x p r e s s i o n . T h i s p o s i t i v e f e e d -b a c k r e s u l t s i n a h i g h p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n d i f f e r e n t i a t e dc e l l s ( s h o r t t e l o m e r e s ) . A b o v e a t h r e s h o l d l e v e l t h e p r o t e i ni n d uc e s g e n e s f o r a n t i m i t o t i c p r o t e i n s a n d / o r r e p r e s s e s g e n e si n v o l v e d i n m i t o t i c p r o c e s s e s . Tumor s u p p r e s s o r g e n e s e n c o d -i n g p 5 3 a n d Rb may b e t a r g e t s f o r t h e h y p o t h e t i c a l p r o t e i n i na human s y s t e m ( 3 5 ) .T h e s e c o n d s c e n a r i o i s b a s e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t t e l o -m e r a s e d o w n r e g u l a t e s a g e n e f o r t e l o m e r e b i n d i n g p r o t e i n o rs u p p r e s s e s t h e h y p o t h e t i c a l p r o t e i n ' s a c t i v i t y . O n c e t e l o m e r a s ei s r e p r e s s e d b y t h e c e l l ' s e n t r y i n t o a d i f f e r e n t i a t i o n p r o c e s s ,c o n c e n t r a t i o n a n d / o r a c t i v i t y o f t h e TR b i n d i n g p r o t e i n m a yi n c r e a s e w i t h s u c c e s s i v e c e l l d i v i s i o n s u p t o a t h r e s h o l d l e v e l .T h i s , a g a i n , m ay l e a d t o t h e i n d u c t i o n o f a n t i m i t o t i c p r o t e i n s 'g e n e s .T h e s e t w o s c e n a r i o s a r e n o t m u t u a l l y e x c l u s i v e b u t d i f f e r i nt h e w a y t h e a m o u n t / a c t i v i t y o f t h e p r o t e i n r e l a t e s t o t e l o m e r el e n g t h i n t h e c e l l s w i t h a d i f f e r e n t " m i t o t i c h i s t o r y . " I n t h e f i r s ts c e n a r i o , t e l o m e r e l e n g t h h a s a n a c t i v e r o l e i n t h e s e n e s c e n c ep r o c e s s ; i n t h e s e c o n d , t h e t e l o m e r e s h o r t e n i n g i s m e r e l y t h er e s u l t o f t e l o m e r a s e r e p r e s s i o n a n d i n c o m p l e t e DNA r e p l i c a -t i o n . B o t h s c e n a r i o s c o u l d b e u s e d a s a p o s s i b l e m o r t a l i t y s t a g e1 ( M l ) m e c h a n i s m i n t h e m o d e l o f r e v e r s i b l e c e l l u l a r s e n e s -c e n c e d e v e l o p e d f o r m a m m a l i a n i n v i t r o s y s t e m s ( 2 6 ) . A l s o ,b o t h s c e n a r i o s c o u l d b e v e r i f i e d w h e n t h e TR b i n d i n g p r o t e i n sa r e i d e n t i f i e d i n o r g a n i s m s t h a t e x h i b i t t e l o m e r e s h o r t e n i n gd u r i n g t h e d i f f e r e n t i a t i o n p r o c e s s .A n u m b e r o f TR b i n d i n g p r o t e i n s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d( r e v i e w e d i n r e f . 2 ) . Th e m o s t r e l e v a n t t o o u r m o d e l i s R AP1p r o t e i n , a v e r y a b u n d a n t ( a t l e a s t f o r a s e q u e n c e - s p e c i f i cD N A - b i n d i n g p r o t e i n ) r e p r e s s o r / a c t i v a t o r w i th n u m e r o u sf u n c t i o n s i n t h e y e a s t c e l l ( r e v i e w e d i n r e f . 3 6 ) . T h e RAP1p r o t e i n b i n d i n g s i t e s a r e f o u n d u p s t r e a m o f n u m e r o u s g e n e se n c o d i n g t h e c o m p o n e n t s o f p r o t e i n s y n t h e s i s a n d g l y c o l y t i ce n z y m e s . I n t e r e s t i n g l y , t h e R AP1 b i n d i n g s i t e w a s i d e n t i f i e d i nt h e p r o m o t e r o f i t s g e n e , s u g g e s t i v e o f a u t o r e g u l a t i o n o f R a p l( 3 7 ) . RAP1 p r o t e i n a p p e a r s t o b e a k e y e l em e n t o r c h e s t r a t i n gt r a n s c r i p t i o n o f g e n e s r e g u l a t e d b y g r o w t h r a t e , p r o b a b l y v i aa r a s p a t h w a y t h r o u g h p r o t e i n k i n a s e A ( 3 8 ) . A p a r t f r o ma c t i v a t i n g a n d r e p r e s s i n g m e t a b o l i c a l l y i m p o r t a n t g e n e s ,RAP1 f u n c t i o n s a s a m a j o r t e l o m e r e b i n d i n g p r o t e i n t h a t ma yb e i n v o l v e d i n r e g u l a t i o n o f TR n u m b e r ( 3 9 , 4 0 ) , t e l o m e r ep o s i t i o n a l e f f e c t s ( 3 3 ) , o r a t t a c h i n g t e l o m e r e s t o t h e n u c l e a re n v e l o p e ( 4 1 ) .A h i g h e r e u k a r y o t e e q u i v a l e n t o f t h e y e a s t RAP1 p r o t e i nr e m a i n s t o b e i d e n t i f i e d , b u t t e l o m e r e r e p e a t - l i k e s e q u e n c e s( t e l o b o x e s ) h a v e b e e n f o u n d i n t h e 5 ' r e g i o n s o f some A .t h a l i a n a g e n e s ( 4 2 ) . F o u r A . t h a l i a n a a n d o n e t o m a t o g e n ee n c o d i n g t h e t r a n s l a t i o n e l o n g a t i o n f a c t o r E F - l a c o n t a i n at e l o b o x a t t h e s a m e l o c a t i o n w i t h i n t h e p r o m o t o r ( 4 2 ) , w h i l et h e y e a s t g e n e f o r t h e s a m e p r o t e i n h a s a RAPI b i n d i n g s i t ei n i t s p r o m o t e r ( 4 3 , 4 4 ) . F u n c t i o n a l i m p o r t a n c e o f t h e t e l o -b o x e s i n p l a n t g e n e s r e m a i n s t o b e e s t a b l i s h e d , b u t i t i st e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t o n e ( o r m o r e ) t e l o m e r e b i n d i n gp r o t e i n m ay c o n t r o l m e t a b o l i c a c t i v i t y i n h i g h e r e u k a r y o t i cc e l l s l i k e t h e R AP1 p r o t e i n d o e s i n y e a s t c e l l s . C l o n i n g o f t h ec o m p o n e n t s o f t h e s y s t e m a n d r e c o n s t i t u t i o n i n v i t r o w i l l b en e c e s s a r y f o r t e s t i n g t h i s h y p o t h e s i s .We t h a n k P e g g y Lemaux a n d P h i l B r e g i t z e r f o r t h e l o n g - t e r m c a l l u sl i n e s . T h i s i s s c i e n t i f i c p a p e r 9 5 0 6 - 1 9 , C o l l e g e o f A g r i c u l t u r e a n dHome E c o n o m i c s R e s e a r c h C e n t e r , W a s h i n g t o n S t a t e U n i v e r s i t y ,

    P u l l m a n , WA , P r o j e c t 0 9 5 1 . T h i s s t u d y w a s s u pp o r t e d b y U . S . D e -p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e - C o o p e r a t i v e S t a t e R e s e a r c h S e r v i c e S p e c i a lG r a n t A g r e e m e n t 9 0 - 3 4 2 1 3 - 5 1 9 0 t o t h e N o r t h A m e r i c a n B a r l e y G e -n o m e M a p p i n g P r o j e c t a n d U . S . D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e -C o o p e r a t i v e S t a t e R e s e a r c h S e r v i c e C om p e t i ti v e G r a n t 9 3 - 3 7 3 0 0 -8 8 6 0 .1 . B l a c k b u r n , E . H . ( 1 9 9 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 0 , 5 6 9 - 5 7 3 .2 . B i e s s m a n n , H . & M a s o n , J . M . ( 1 9 9 2 ) A d v . G e n e t . 3 0 , 1 8 5 - 2 4 9 .3 . G r ei d e r , C . W. & B l a c k b u r n , E . H . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 3 , 4 0 5 - 4 1 3 .4 . M o r i n , G . B . ( 1 9 8 9 ) C e l l 5 9 , 5 2 1 - 5 2 9 .5 . C o u n t e r , C . M . , A v i l i o n , A . A . , L e F e u v r e , C . E . , S t e w a r t , N . G . ,

    G r e i d e r , C . W . , H a r l e y , C . B . & B a c c h e t t i , S . ( 1 9 9 2 ) EMBO J . 1 1 ,1 9 2 1 - 1 9 2 9 .

    6 . P r o w s e , K . R . , A v i l i o n , A . A . & G r e i d e r , C . W. ( 1 9 9 3 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 9 0 , 1 4 9 3 - 1 4 9 7 .7 . M a n t e l , L . L . & G r ei d er , C . W. ( 1 9 9 4 ) EMBO J . 1 3 , 3 2 1 1 - 3 2 1 7 .8 . K i m , N . W . , P i a t y s z e k , M. A . , P r o w s e , K . R . , H a r l e y , C . B . , W e s t ,M . D . , H o , P . L . C . , C o v i e l l o , G . M . , W r i g ht , W. E . , W e i n r i c h , S . L . &

    S h a y , J . W. ( 1 9 9 4 ) S c i e n c e 2 6 6 , 2 0 1 1 - 2 0 1 5 .9 . H a r l e y , C . B . ( 1 9 9 1 ) M u t a t . R e s . 2 5 6 , 2 7 1 - 2 8 2 .1 0 . O l o v n i k o v , A . M . ( 1 9 7 3 ) J . T h e o r . B i o l . 4 1 , 1 8 1 - 1 9 0 .1 1 . W a t s o n , J . D . ( 1 9 7 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 3 9 , 1 9 7 - 2 0 1 .1 2 . W r i g h t , W. E . & S h a y , J . W. ( 1 9 9 2 ) T r en d s G e n e t 8 , 1 9 3 - 1 9 7 .1 3 . D ' M e l l o , N . P . & J a z w i n s k i , S . M . ( 1 9 9 1 ) J . B a c t e r i o l . 1 7 3 , 6 7 0 9 - 6 7 1 3 .1 4 . G i l l e y , D . & B l a c k b u r n , E . H . ( 1 9 9 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ,1 9 5 5 - 1 9 5 8 .1 5 . K i p l i n g , D . & C o o k e , H . J . ( 1 9 9 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 4 7 , 4 0 0 - 4 0 2 .1 6 . S t a r l i n g , J . A . , M a u l e , J . , H a s t i e , N . D . & A l l s h i r e , R . C . ( 1 9 9 0 )N u c l e i c A c i d s R e s . 1 8 , 6 8 8 1 - 6 8 8 8 .1 7 . R i c h a r d s , E . J . & A u s u b e l , F . M . ( 1 9 8 8 ) C e l l 5 3 , 1 2 7 - 1 3 6 .1 8 . M u r a s h i g e , T . & S k o o g , F . ( 1 9 6 2 ) P h y s i o l . P l a n t . 1 5 , 4 7 3 - 4 9 7 .1 9 . K l e i n h o f s , A . , K i l i a n , A . , S a g h a i - M a r o o f , M. A . , B i y a s h e w , R . M . ,H a y e s , P . , e t a l . ( 1 9 9 3 ) T h e o r . A p p l . G e n e t . 8 6 , 7 0 5 - 7 1 2 .2 0 . H a r l e y , C . B . , F u t c h e r , A . B . & G r e i d e r , C . W. ( 1 9 9 0 ) N a t u r e ( L o n -d o n ) 3 4 5 , 4 5 8 - 4 6 0 .2 1 . A r a m u g a n a t h a n , K . & E a r l e , E . D . ( 1 9 9 1 ) P l a n t M o l . B i o l . R e p . 9 ,2 0 8 - 2 1 8 .2 2 . K i l i a n , A . & K l e i n h o f s , A . ( 1 9 9 2 ) M o l . G e n . G e n e t . 2 3 5 , 1 5 3 - 1 5 6 .2 3 . B u r r , B . , B u r r , F . A . , M a t z , E . C . & R o m e r o - S e v e r s o n , J . ( 1 9 9 2 ) P l a n tC e l l 4 , 9 5 3 - 9 6 0 .2 4 . A l l s o p p , R . C . , V a z i r i , H . , P a t t e r s o n , C . , G o l d s t e i n , S . , Y o u n g l a i ,E . V . , F u t c h e r , A . B . , G r e i d e r , C . W. & H a r l e y , C . B . ( 1 9 9 2 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 , 1 0 1 1 4 - 1 0 1 1 8 .2 5 . J a c o b s , T . ( 1 9 9 2 ) D e v . B i o l . 1 5 3 , 1 - 1 5 .2 6 . W r i g h t , W. E . , P e r e i r a - S m i t h , 0 . M . & S h a y , J . W. ( 1 9 8 9 ) M o l . C e l l .B i o l . 9 , 3 0 8 8 - 3 0 9 2 .2 7 . C o u n t e r , C . M . , H i r t e , H . W . , B a c c h e t t i , S . & H a r l e y , C . W. ( 1 9 9 4 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 , 2 9 0 0 - 2 9 0 4 .2 8 . S i n g h , R . J . ( 1 9 8 6 ) T h e o r . A p p l . G e n e t . 7 2 , 7 1 0 - 7 1 6 .2 9 . G a p o n e n k o , A . K . , P e t r o v a , T . F . , I s k a k o w , A . R . & S o z i n o v , A . A .( 1 9 8 8 ) T h e o r . A p p l . G e n e t . 7 5 , 9 0 5 - 9 1 1 .3 0 . B a r n e t t , M . A . , B u c k l e , V . J . , E v a n s , E . P . , P o r t e r , A . C . G . , R o u t , D . ,S m i t h , A . G . & B r o w n , W. R . A . ( 1 9 9 3 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 2 1 , 2 7 - 3 6 .3 1 . R u n g e , K . W. & Z a k i a n , V . A . ( 1 9 8 9 ) M o l . C e l l . B i o l . 9 , 1 4 8 8 - 1 4 9 7 .3 2 . H a s t i e , N . D . , D e m p s t e r , M . , D u n l o p , M. G . , T h o m p s o n , A . M . ,G r e e n , D . K . & A l l s h i r e , R . C . ( 1 9 9 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 4 6 , 8 6 6 - 8 6 8 .3 3 . K y r i o n , G . , L i u , K . , L i u , C . & L u s t i g , A . J . ( 1 9 9 3 ) G e n e s D e v . 7 ,1 1 4 6 - 1 1 5 9 .

    3 4 . Z a k i a n , V . A . ( 1 9 8 9 ) A n n u . R e v . G e n e t . 2 3 , 5 7 9 - 6 0 4 .3 5 . S h a y , J . W . , P e r e i r a - S m i t h , 0 . M . & W r i g h t , W. E . ( 1 9 9 1 ) E r p . C e l lR e s . 1 9 6 , 3 3 - 3 9 .3 6 . S h o r e , D . ( 1 9 9 4 ) T r e n d s G e n e t . 1 0 , 4 0 8 - 4 1 2 .3 7 . G r a h a m , I . R . & C h a m b e r s , A . ( 1 9 9 3 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 2 2 , 1 2 4 - 1 3 0 .3 8 . K l e i n , C . & S t r u h l , K . ( 1 9 9 4 ) MoL C e l l . B i o l . 1 4 , 1 9 2 0 - 1 9 2 8 .3 9 . C o n r a d , M . N . , W r i g h t , J . H . , W o l f , A . J . & Z a k i a n , V . A . ( 1 9 9 0 ) C e l l6 3 , 7 3 9 - 7 5 0 .4 0 . L u s t i g , A . J . , K u r t z , S . & S h o r e , D . ( 1 9 9 0 ) S c i e n c e 2 5 0 , 5 4 9 - 5 5 3 .4 1 . P a l l a d i n o , F . , L a r o c h e , T . , G i l s o n , E . , A x e l r o d , A . & P i l l u s , L . ( 1 9 9 3 )C e l l 7 5 , 5 4 3 - 5 5 5 .4 2 . R e g a d , F . , L e b a s , M . & L e s c u r e , B . ( 1 9 9 4 ) J . M o l . B i o l . 2 3 9 , 1 6 3 - 1 6 9 .4 3 . H u e t , J . , C o t t r e l l e , P . , C o o l , M . , V i g n a i s , M . L . , T h i e l e , D . , M a r k , C . ,B u h l e r , J . M . , S e n t e n a c , A . & F r o m a g e o t , P . ( 1 9 8 5 ) E M B O J . 4 ,3 5 3 9 - 3 5 4 7 .4 4 . L e e r , R . J . , Van R a a m s d o n k - D u i n , M . C . , M a g e r , W . H . & P l a n t a ,R . J . ( 1 9 8 5 ) C u r r . G e n e t . 9 , 2 7 3 - 2 7 7 .

    G e n e t i c s : K i l i a n e t a l .