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BD, the BD Logo and all other trademarks are trademarks of Becton, Dickinson and Company or its affiliates. © 2020 BD. All rights reserved.

日本ベクトン・ディッキンソン（株）

バイオサイエンス事業部

2020年2月

BD Horizon™ Dri Tumor & Tissue Dissociation Reagent (TTDR)を用いた細胞分離時の回収率、生存率及び蛍光強度への影響に関する検証

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BD, the BD Logo and all other trademarks are trademarks of Becton, Dickinson and Company or its affiliates. © 2020 BD. All rights reserved. 2

Objective医学・生物学的研究においては、個体・組織レベルでの研究に加えて細胞レベルでの解析が非常に重要である。

同じ組織内の細胞であっても、遺伝子・タンパク質発現プロファイルはそれぞれで異なっており、シングルセルレベ

ルでの解析の必要性が高まっている。

TTDRは組織から細胞を単離するための試薬であり医学・生物学的研究の一助をなすものと期待されているが、

他の細胞分散試薬に対するメリットを示すデータは少なかった。

本稿では、これまで細胞分散試薬としてグローバルスタンダードのように使用されているコラゲナーゼ (CLS) 、お

よび細胞分散時に細胞へのダメージを低減させることのできるAccuMaxとの比較を行った。

細胞分散試薬の有用性を示す指標には①細胞回収率、②単離した細胞の生存率、③細胞へのダメージ、の3

つが考えられる。そこで、本試験ではこの3つの指標についてTTDRを含む3種類の細胞分散試薬を用いて比較検

証実験を行った。

2


3

ReagentsTTDR: DMEM 5 mLをVialに添加し2xTTDR調製 (組織反応前の20-30分間は37oC温浴処理)

Collagenase Type I (WOR): 2xCLS1 (200 units/mL) になるようにDMEMを用いて調製

AccuMax (ICT): 1xAccuMax (水浴にて解凍後使用)

Wash Buffer: DPBS+2mM EDTA+0.5% BSA (氷冷したものを使用)

Animals & TissuesC57BL/6J male 7-8-wk-old

Lung (approx. 0.05 g)、Liver (approx. 0.25 g)、Intestine (approx. 0.23 g)

Materials & Methods


4

Procedure (操作は各試薬のStandard Protocolに基本的に従った)

TTDR、CLS1 AccuMax

1. マウスを頸椎脱臼した後、心採血して脱血

2. 肺、肝臓、小腸を摘出し氷冷DPBSで洗浄、小腸はハサミで開口し内部を5回以上洗浄

3. 各組織を秤量し記録

4. DMEM 2.5 mL (3.5cm dish) 中で組織をMince (氷上)

5. 先切ブルーチップで50 mLチューブに分注

6. 50 mLチューブに2xTTDRまたは2xCLS1を2.5 mL添加

7. インキュベーション (30 min. 37oC. Approx 50 rpm agitation)

4. DPBS 2.5 mL (3.5cm dish) 中で組織をMince (氷上)

5. 先切ブルーチップで50 mLチューブに分注

6. 遠心 (5 min. 4oC)

上清除去、5 mL AccuMax添加

7. インキュベーション (30 min. RT. Approx 50 rpm agitation)

8. Wash Buffer 12.5 mL 添加し、新たな50 mLチューブに70 µm Cells trainerをセットしてフィルトレーション

9. フィルターに5 mL Wash bufferを添加してFilterを洗浄


5

Procedure (続き)

Notice• 組織に応じて遠心する際の回転数 (g) の変更を推奨する。本検証実験でも肝臓においては100 x g、他の組織は

200 x gで設定。

• Lysing Bufferの反応時間も組織に応じた変更を推奨。必要以上に反応させると細胞にダメージをあたえる可能性が高まる。

10. 遠心 (8 min. 4oC)、上清除去した後Lysing BufferをVortexしながら2 mL添加しインキュベーション (∼10 min. 遮光下、RT)

11. Wash Buffer 15 mL添加して軽くVortexしたあと遠心 (8 min. 4oC)、上清除去

12. 11を繰り返す (Debrisの量に応じた回数の変更を推奨)

13. Stain Buffer 2 mLに再懸濁

14. Cell countの後、PE-Anti-Ms CD45、FITC-Anti-Ms CD3、Alexa Fluor 647-Anti-Ms CD45/B220で染色

※ Cell Countの結果AccuMaxで単離した細胞数が他の試薬で単離した細胞数に比べて著しく少なかったためVolumeを基準として他の試

薬で単離した細胞懸濁液の倍量を使用した

15. 染色後に細胞を洗浄してBD TrucountTM Tubesに移し、7-AADで染色したあとBD FACSCanto™ II フローサイトメー

ターで測定


6

Results(Lung)


7

Results (TTDR)

33.7%

24.7%

90.9% 96.8%


8

Results (CLS1)

32.5%

21.8%

84.4% 95.5%


9

Results (AccuMax)

33.3%

17.5%

93.8% 94.1%


10

TTDRでは他の2種類の試薬に比べて多数の細胞を単離できる

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

TTDR CLS1 AccuMax

Num

ber o

f T c

ells

Number of T cells/0.1 g Lung＊＊

＊＊

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

TTDR CLS1 AccuMax

Num

ber o

f B c

ells

Number of B cells/0.1 g Lung＊＊

＊

組織重量当たりの単離細胞数＊；P < 0.05、＊＊；P < 0.01 (Using Scheffe’s F Test、n = 5)


11

0

20

40

60

80

100

120

TTDR CLS1 AccuMax

%Viability (B cell)

0

20

40

60

80

100

120

TTDR CLS1 AccuMax

%

Viability (T cell)

TTDRと他の2種類の試薬間で細胞生存率に差はない

単離した細胞の生存率(Using Scheffe’s F Test、n = 5)


12

0

20

40

60

80

100

120

140

TTDR CLS1 AccuMax

%Relative MFI (CD45+/B220+)

＊

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

TTDR CLS1 AccuMax

%

Relative MFI (CD3+)

TTDRと他の２種類の試薬間でMFIに差はない

CD45/B220とCD3細胞表面マーカーのMFIの比較＊；P < 0.05 (Using Scheffe’s F Test、n = 5)


13

Results(Liver)


14

Results (TTDR)

39.8%

20.8%

99.2% 94.5%


15

Results (CLS1)

39.4%

17.2%

99.2% 95.9%


16

Results (AccuMax)

28.2%

34.1%

98.2% 96.4%


17

TTDRでは他の２種類の試薬に比べて多数の細胞を単離できる

組織重量当たりの単離細胞数＊；P < 0.05、＊＊；P < 0.01 (Using Scheffe’s F Test、 n = 5)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

TTDR CLS1 AccuMax

Num

ber o

f B c

ells

Number of B cells/0.1 g Liver＊＊

＊

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

TTDR CLS1 AccuMax

Num

ber o

f B c

ells

Number of T cells/0.1 g Liver＊＊


18

TTDRと他の２種類の試薬間で細胞生存率に差はない


0

20

40

60

80

100

120

TTDR CLS1 AccuMax

%Viability (B cell)

0

20

40

60

80

100

120

TTDR CLS1 AccuMax

%

Viability (T cell)


19

TTDRと他の2種類の試薬間でMFIに差はない

CD45/B220とCD3細胞表面マーカーのMFIの比較(Using Scheffe’s F Test、n = 5)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

TTDR CLS1 AccuMax


0

20

40

60

80

100

120

TTDR CLS1 AccuMax

%

Relative MFI (CD3+)


20

Results(Intestine)


21

Results (TTDR)

27.6%

25.3%

94.3% 85.7%


22

Results (CLS1)

35.7%

15.6%

80.2% 90.9%


23

Results (AccuMax)

30.7%

24.9%

92.9% 89.6%


24

TTDRと他の2種類の試薬で単離細胞数に差はない

組織重量当たりの単離細胞数(Using Scheffe’s F Test、n = 5)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

TTDR CLS1 AccuMax

Num

ber o

f B c

ells

Number of B cells/0.1 g Intestine

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

TTDR CLS1 AccuMax

Num

ber o

f B c

ells

Number of T cells/0.1 g Intestine


25

TTDRと他の２種類の試薬間で細胞生存率に差はない


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TTDR CLS1 AccuMax

%Viability (B cell)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TTDR CLS1 AccuMax

%

Viability (T cell)


26

TTDRと他の２種類の試薬間でMFIに差はない

CD45/B220とCD3細胞表面マーカーのMFIの比較(Using Scheffe’s F Test、n = 5)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

TTDR CLS1 AccuMax


0

20

40

60

80

100

120

140

TTDR CLS1 AccuMax

%

Relative MFI (CD3+)


• 他の2種類の試薬に比べ、組織によっては、多くの細胞を単離することが可能

• 生存率の低下は認められない

• 細胞表面マーカーへのダメージも他の試薬と変わらない

27

デブリが多い傾向にあるので以下を推奨する

• TTDR Incubation後の洗浄回数を2-3回にしたほうが望ましい

• FSC vs SSCでの解析の前にHoechstなどで有核細胞だけをゲーティングしたり、解析対象が免疫細胞であれば本検証のようにCD45でゲーティングしておくと比較的きれいにデータをだせる

使用上の注意点

Summary


28

Appendix(Cell surface maker MFI in Lung)


29

Results (CD4)

TTDR

CLS1

Accu

Max


30

Results (CD8)

TTDR

CLS1

Accu

Max


31

Results (CD11b)

TTDR

CLS1

Accu

Max


32

Results (CD11c)

TTDR

CLS1

Accu

Max


33

Results (CD25)

TTDR

CLS1

Accu

Max

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