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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen

Nationalbibliografie;

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet ber http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2012

2012 by Verlag: Deutsche Veterinrmedizinische Gesellschaft Service GmbH,

Gieen

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-0

Verlag: DVG Service GmbH

Friedrichstrae 17

35392 Gieen

0641/24466

[email protected]

www.dvg.net

75-5

Tierrztliche Hochschule Hannover

Zur Bedeutung von Peroxisomen im Metabolismus von

degenerativen und neoplastischen Lebererkrankungen beim Hund

INAUGURAL DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinrmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Julia Schttler

geb. Borchert

Bad Kreuznach

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup

Deutsches Primatenzentrum, Gttingen

Abteilung Infektionspathologie

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup

Tierrztliche Hochschule Hannover

Deutsches Primatenzentrum, Gttingen

2. Gutachterin: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein

Tierrztliche Hochschule Hannover

Institut fr Pathologie

Tag der mndlichen Prfung: 27.04.2012

Meinem Vater, meiner Mutter

und Raimund

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ...................................................................................................... 11

2 Literaturbersicht .......................................................................................... 14

2.1 Das Peroxisom.............................................................................................. 14

2.1.1 Morphologie .................................................................................................. 15

2.1.2 Funktion ........................................................................................................ 18

2.1.3 Interaktion mit Mitochondrien ........................................................................ 29

2.2 Kontrolle der Peroxisomenzahl ..................................................................... 30

2.2.1 Biogenese und Proliferation .......................................................................... 31

2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie ...................................... 37

2.3 Hepatopathien des Hundes .......................................................................... 39

2.3.1 Hepatozellulre Degeneration ...................................................................... 42

2.3.2 Verhalten der Peroxisomen bei degenerativen Vernderungen der

Hepatozyten .................................................................................................. 48

2.3.3 Hepatitiden .................................................................................................... 49

2.3.4 Lebertumoren ............................................................................................... 51

3 Eigene Untersuchungen ............................................................................... 57

3.1 Material und Methoden ................................................................................. 57

3.1.1 Einleitung ...................................................................................................... 57

3.1.2 Patienten ....................................................................................................... 57

3.1.3 Lichtmikroskopische Untersuchung .............................................................. 63

3.1.4 Prparation fr die Transmissionselektronenmikroskopie ............................. 63

3.1.5 Auswertung und Dokumentation ................................................................... 65

3.1.6 Statistik ......................................................................................................... 68

3.2 Ergebnisse .................................................................................................... 68

3.2.1 Zusammensetzung der Patientengruppen .................................................... 69

3.2.2 Vernderungen der labordiagnostischen Leberwerte ................................... 72

3.2.3 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse ........................................... 76

Inhaltsverzeichnis

3.2.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungsergebnisse .................................. 95

4 Diskussion .................................................................................................. 123

4.1 Lichtmikroskopische Untersuchungen ........................................................ 123

4.2 Elektronenmikroskopische Untersuchung ................................................... 127

4.2.1 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Flche ...................... 128

4.2.2 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Flche/Alter ............. 133

4.2.3 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Flche/Rasse........... 133

4.2.4 Morphologische Untersuchungen ............................................................... 134

4.3 Beeinflussung der Peroxisomenzahl durch Medikamente .......................... 140

5 Zusammenfassung ..................................................................................... 142

6 Summary .................................................................................................... 145

7 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 148

8 Abbildungsverzeichnis ................................................................................ 166

9 Tabellenverzeichnis .................................................................................... 172

10 Anhang ....................................................................................................... 174

10.1 Protokolle fr die Histologie ........................................................................ 174

10.1.1 Fixierlsungen............................................................................................. 174

10.1.2 Frbungen .................................................................................................. 176

10.1.3 Laborprotokolle fr Einbettungen ................................................................ 181

10.2 Anhangstabellen ......................................................................................... 182

Abkrzungsverzeichnis

Abkrzungsverzeichnis

ALT Alaninaminotransferase

ALKP Alkalische Phosphatase

AST Aspartataminotransferase

ATG autophagy-related genes

-Oxidation Beta-Oxidation

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CuZn SOD Kupfer-Zink Superoxiddismutase

d Tag

DNA Desoxyribonucleic acid

Elmi Elektronenmikroskopie

ggr. geringgradig

GLDH Glutamatdehydrogenase

GS Gallensuren

HWZ Halbwertzeit

h Stunde

H2O2 Wasserstoffperoxid

hgr. hochgradig

IBD Inflammatory bowel disease

IL Interleukin

IFN Interferon gamma

Abkrzungsverzeichnis

JRT Jack Russel Terrier

KGW Krpergewicht

m/mk mnnlich/mnnlich kastriert

MDV Mitochondria derived vesicles

MAPL Mitochondria-anchored protein ligase

mgr. mittelgradig

M. Morbus

NASH non alcoholic steatohepatitis

nm Nanometer

NO Stickstoff

PD/PU Polydipsie/Polyurie

PEX Peroxin

PTS Peroxisomal targeting signal

PPO Peroxisomenproliferatoren

PPARs Peroxisome proliferator activated receptors

Px Peroxisom

rER raues (rough) Endoplasmatisches Retikulum

RHT Rauhaardackel

ROS Reactive oxygen species

sER glattes (smooth) Endoplasmatisches Retikulum

s Sekunde

SOD Superoxiddismutase

TGF Transforming growth factor

Abkrzungsverzeichnis

TNF Tumor necrosis factor alpha

vak. vakuolr

VLDL Very long density lipoprotein

WHWT Westhighland White Terrier

w/wk weiblich/weiblich kastriert

m Quadratmikrometer

1 Einleitung 11

1 Einleitung

Peroxisomen haben eine auerordentliche Bedeutung erlangt, da sie Gegenstand

zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen in der Humanmedizin sind. Die

Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die Peroxisomen an zahlreichen humanen

kongenitalen Erkrankungen beteiligt sind. Lorenzos oil ist der Titel eines Filmes,

der sehr eindrcklich das Leben eines Jungen erzhlt, der an einer unerklrlichen

Erkrankung leidet. Gleichgewichtsstrungen und letztlich schwere Hirnschdigungen

sind Folgen dieser Erkrankung, bei der es sich um die Adrenoleukodystrophie

handelt. Intensive wissenschaftliche Untersuchungen der letzten Jahrzehnte fhrten

zu der Erkenntnis, dass kleine Zellorganellen, Peroxisomen, die Ursache dieser

Erkrankung sind. Das Zellweger Syndrom und die Refsum disease sind weitere

kongenitale peroxisomale Erkrankungen. Durch die Entdeckung der Peroxisomen

1954 durch RHODIN und die weiteren wissenschaftlichen Untersuchungen des

belgischen Wissenschaftlers DE DUVE (1966) erlangte diese kleine Organelle eine

immer grere Bedeutung. Ihre Beteiligung innerhalb komplexer physiologischer

Vorgnge, wie Einbindung in den Wasserstoffperoxidstoffwechsel, die -Oxidation

langer bis sehr langer Fettsuren, die Synthese komplexer Substrate wie

Cholesterine, Plasmalogene und Gallensuren, sowie die Fhigkeit sich in

Anwesenheit sogenannter Peroxisomenproliferatoren zu vermehren, machten sie zu

einem spannenden Forschungsgebiet, vor allem in der Humanmedizin. Whrend sich

die ersten Arbeiten mit den kongenitalen Erkrankungen der Peroxisomen befassten,

folgten durch DE CRAEMER (1995) wissenschaftliche Untersuchungen zum

Verhalten der Peroxisomen bei erworbenen Erkrankungen, wie Steatose, Hepatitis

und Zirrhose, hervorgerufen durch verschiedene Noxen wie Alkohol, Viren und

diverse Medikamente. Weitere Untersuchungen folgten zum Verhalten der

Peroxisomen bei cholestatischen Prozessen der Leber, Hepatomen und

extrahepatischen Tumoren mit oder ohne Lebermetastasen.

Die wissenschaftlichen Erkenntnisse ber Peroxisomen in der Veterinrmedizin sind

bis dato sehr gering. LAGING et al. (1988) untersuchten vergleichend das Verhalten

12 1 Einleitung

der Peroxisomen in Leber und Niere von Hunden der Rasse Beagle und Dalmatiner

bei purinreicher und purinarmer Ernhrung. Sie kamen zu der Erkenntnis, dass

Dalmatiner unabhngig von der Ernhrung grere und zahlreichere Peroxisomen

haben als Beagle. Eine weitere Untersuchung von CENTER und Mitarbeitern (1993)

befasste sich mit dem Verhalten der hepatischen Peroxisomen in an Lipidose

erkrankten Katzen. CENTER et al. (1993) vermuteten dabei, dass eine Abnahme der

Peroxisomen mit dem Krankheitsbild der hepatischen Lipidose einhergeht. Die ersten

elektronenmikroskopischen Daten zur Morphometrie der hepatozellulren

Peroxisomen des Hundes wurden 1973 erhoben. Dies erschien notwendig, da der

Hund immer hufiger fr pharmakologische und toxikologische Studien als Modell fr

humane Lebererkrankungen herangezogen wurde (HESS et al. 1973).

Elektronenmikroskopische und biochemische Untersuchungen aus der

Humanmedizin zum Verhalten von Peroxisomen bei tumorsen und degenerativen

Erkrankungen der Leber (HRUBAN 1979; DE CRAEMER et al. 1993) ergaben, dass

bei degenerativen Erkrankungen, z.B. aufgrund von hepatischer Lipidose/Steatose

und entzndlichen Prozessen, im Rahmen eines erhhten oxidativen Stresses fr die

Hepatozyten, die Zahl der Peroxisomen ansteigt. Tumorse Vernderungen der

Leber, seien sie nun primren oder sekundren Ursprunges, fhrten dagegen in der

Mehrzahl der Flle zu einer Verminderung der Peroxisomen. Weiterhin haben

Untersuchungen gezeigt, dass unter dem Einfluss des Tumornekrosefaktors die

Bildung von Radikalen erheblich ansteigt. In einem solchen Fall ist die

Kapazittsgrenze der Peroxisomen erreicht, und es kommt zu einem Abbau dieser

Organelle infolge zunehmender Zellzerstrung (YASMINEH et al. 1991). Es kann

deshalb vermutet werden, dass die Anzahl der Peroxisomen in einem Verhltnis zum

Grad der Malignitt zu sehen ist. Weiterhin kann vermutet werden, dass

therapeutische Manahmen, welche zu einer Peroxisomenvervielfltigung fhren

ber eine Beeinflussung des oxidativen Stresses und Vernderungen bei der

Energiegewinnung einen Einfluss auf die Leberzelle haben knnten. Angesichts

dieser Informationen aus der Humanmedizin ist es Ziel dieser Arbeit, das Verhalten

der hepatozellulren Peroxisomen im Metabolismus von Lebererkrankungen des

Hundes elektronenmikroskopisch zu untersuchen. Dabei wurde insbesondere auf

1 Einleitung 13

quantitative und qualitative Unterschiede zwischen degenerativen und entzndlichen

Vernderungen einerseits und malignen Tumoren der Leber andererseits

eingegangen, um zu berprfen, ob die von CRAEMER et al. (1993) bzw. HRUBAN

(1979) gewonnenen Erkenntnisse auch auf den Hund bertragbar sind.

14 2 Literaturbersicht

2 Literaturbersicht

2.1 Das Peroxisom

Peroxisomen kommen sowohl im Pflanzen- als auch im Tierreich vor. Es wurde von

ihrem Vorkommen in Amphibien, Insekten, Schnecken, Wrmern und Protozoen

berichtet (MASTERS u. CRANE 1995).

Die Peroxisomen wurden erstmals 1954 durch RHODIN in Nierentubuluszellen von

Ratten entdeckt, er gab diesen Zellorganellen zunchst den Namen Microbodies

(RHODIN 1954). Im Jahre 1956 wurden Zellorganellen, die den bereits

beschriebenen Microbodies der Niere sehr hnlich waren, in Hepatozyten von

Rattenlebern gefunden (Abbildung 2-1) (LAZAROW u. FUJIKI 1985).

Weitere Aufklrung haben in den 60iger Jahren die biomedizinischen Experimente

von DE DUVE und BAUDHUIN (1966) erbracht, in denen Peroxisomen von

Rattenlebern isoliert und deren enzymatische Ausstattung nher differenziert wurde.

Diese biochemischen Erkenntnisse fhrten dazu, dass der morphologisch geprgte

Name Microbody der funktionellen Bezeichnung Peroxisom wich.

Die Isolierung der Peroxisomen und die anschlieende zentrifugale Fraktionierung

ihrer einzelnen Komponenten, wie das peroxisomale Core oder Nukleoid, die

peroxisomale Matrix und die peroxisomale Membran, ermglichten eine detaillierte

Aufschlsselung der enzymatischen Ausstattung der Peroxisomen. Darber hinaus

diente die Elektronenmikroskopie, insbesondere die zytochemische Frbung und die

immunhistochemische Elektronenmikroskopie, der Aufklrung der Funktion, der Art

und der Lokalisation der einzelnen peroxisomalen Enzyme und der Aufklrung der

verschiedenartigen morphologischen Erscheinungsbilder (MASTERS u. CRANE

1995).

Im Folgenden wird vor allem auf den Aufbau der Peroxisomen und deren

enzymatische Ausstattung im Hinblick auf die verschiedenen Funktionen

eingegangen. Auerdem wird kurz das Peroxisom im Zusammenspiel mit anderen

2 Literaturbersicht 15

Zellorganellen betrachtet. Im Anschluss werden die Mechanismen zur Regulation der

Peroxisomenzahl in der Zelle besprochen, bevor ein allgemeiner berblick zu den

Hepatopathien des Hundes folgt.

Abbildung 2-1 Aufbau einer idealisierten tierischen Zelle (LFFLER et al. 2007)

2.1.1 Morphologie

Peroxisomen sind dynamische Organellen, die in Gre und Aussehen variieren

knnen. Darber hinaus sind sie in der Lage, ihre rumliche Position in der Zelle

entlang des Zytoskelettes zu verndern (SCHRADER et al. 2003). Im Gegensatz zu

den Lysosomen, die sich eher perikanalikulr aufhalten, folgt die Lage der

Peroxisomen im Leberlppchen keinem festgelegten Muster (NOVIKOFF u.

16 2 Literaturbersicht

GOLDFISCHER 1969). In gesunden Hepatozyten liegen die Peroxisomen homogen

im Hepatozyten verteilt vor und das Auftreten von Peroxisomen in Gruppen ist blich

(ROELS et al. 1983).

Peroxisomen knnen eine sphrische bis lngliche Gestalt haben (Abbildung 2-2),

sich aber auch in Form eines tubulr-retikulren Netzwerkes darstellen, welches

hufig mit Fetttropfen assoziiert ist (SCHRADER 2001).

Abbildung 2-2 Elektronenmikroskopische Darstellung eines Peroxisoms (Pfeil) mit Marginalplatte und Nukleoid. (P596-07/K1979), Ultradnnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gertevergr. 16.000x).

Peroxisomen besitzen im Zentrum einen dunklen homogenen Kern, der kristalline

Strukturen enthlt (BERNHARD u. ROUILLER 1956) und nach BAUDHUIN et al.

(1965) als Kern mit amorpher und fein granulrer Struktur beschrieben wird. Der

Kern, auch Nukleoid genannt, ist in Abhngigkeit zur Schnittebene des

elektronenmikroskopischen Prparates nicht in allen Peroxisomen der Leber

sichtbar. Ebenso abhngig von der Schnittebene ist das Erscheinungsbild des

Nukleoids: feingranulr oder polytubulr (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Im

2 Literaturbersicht 17

Lngsschnitt haben die Nukleoide eine lngliche rechteckige Gestalt, whrend sie im

Querschnitt rund erscheinen. Sie liegen frei in der Matrix der Peroxisomen. Der

Umfang der Nukleoide betrgt 0,69-0,74 m (LAGING et al. 1988). Allgemein ist das

Auftreten der Nukleoide in Leber und Nieren verbunden mit der Anwesenheit von

Uratoxidase, so dass Organismen ohne Nukleoide auch nicht ber das Enzym

Uratoxidase verfgen. Es gibt aber Abweichungen davon, so dass Nieren von Ratten

und Hepatozyten des Menschen keine Uratoxidaseaktivitt zeigen, jedoch ber

Nukleoide verfgen und einige Nichtvertebraten, groe Mengen an Uratoxidase

beherbergen, aber keine entsprechend hohe Anzahl an Nukleoiden aufweisen

(MASTERS u. CRANE 1995).

Die Membran der Peroxisomen besteht aus einer trilamellren Struktur, die eine

Dicke von 4,5 bis 8 nm aufweist (HRUBAN et al. 1966). Damit ist sie deutlich dnner

als die Membran von Lysosomen (MASTERS u. CRANE 1995).

Die Peroxisomen des Hundes sind 0,3-0,9 m im Diameter und somit etwas kleiner

als die Peroxisomen der Ratte. Die Peroxisomen in der Leber von Dalmatinern sind

im Vergleich mit denen von Beagle deutlich grer und weisen eine hhere Dichte

auf (LAGING et al. 1988). Peroxisomen des Hundes enthalten kristalloide Nukleoide,

die aus 3-8 parallel verlaufenden Linien bestehen (SHNITKA 1966). Das Nukleoid

des Peroxisoms beim Hund ist Sitz der Urikase (BAUDHUIN et al. 1965; HAYASHI et

al. 1976; CHEVILLE 1994a). Peroxisomen in Zellen der kaninen Perianaldrse

(KUHN 1968) sowie der Leber und der Niere (HRUBAN u. RECHCIGL 1969)

besitzen eine Marginalplatte, in Form einer elektronendichten Verdickung unter der

Membran, die durchschnittlich 0,25-0,39 m lang ist (LAGING et al. 1988). In diesem

Teil des Peroxisoms ist die L-alpha-Hydroxysureoxidase B lokalisiert (ZAAR 1992).

Die Peroxisomen des Hundes nehmen nur ca. 3,9 % des Zytoplasmas ein, obwohl

ca. doppelt so viele in einer Zelle vorhanden sind wie Mitochondrien, die 24 % des

zytoplasmatischen Volumens ausmachen (HESS et al. 1973).

Aufgrund ihrer charakteristischen morphologischen Eigenschaften sollen

Peroxisomen auch ohne spezielle Frbung eindeutig von den hufig rumlich

benachbarten Mitochondrien zu unterscheiden sein (BERNHARD u. ROUILLER

18 2 Literaturbersicht

1956). Eine Abgrenzung von Lysosomen ist ebenfalls mglich, da Peroxisomen

kleiner sind, ein homogeneres Erscheinungsbild besitzen, hufig zentral ein Nukleoid

aufweisen und eng mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziiert sind (SHNITKA

1966). Darberhinaus sind Lysosomen in der Lage Substrate zu inkorporieren, eine

Eigenschaft, die den Peroxisomen fehlt (SHNITKA 1966).

Im Rahmen eines schnellen Zellwachstums knnen die Peroxisomen sehr

verschiedenartige und komplexe Formen annehmen. Dieses Phnomen kann

beispielsweise durch eine partielle Hepatektomie, Stimulation mit

Wachstumsfaktoren, Zugabe freier Fettsuren oder freier Radikale provoziert werden

(SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999).

2.1.2 Funktion

Die Peroxisomen sind in ein groes Spektrum an Aufgaben und Funktionen in der

eukaryontischen Zelle involviert (PLATTA u. ERDMANN 2007). Sie sind besonders

an Oxidations- und Detoxifikationsvorgngen beteiligt (CHEVILLE 1994e). Die

Aufgaben der Peroxisomen variieren je nach Organismus, Gewebe und der

Umgebung, in der sie sich befinden. Daher verfgen sie in den einzelnen Geweben

ber unterschiedliche Enzymausstattungen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN

1992) mit ber 50 verschiedenen Enzymen (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Davon

sind die meisten ausschlielich in Peroxisomen lokalisiert, whrend einige auerdem

in Mitochondrien vorkommen (WANDERS u. WATERHAM 2006). Trotz der groen

enzymatischen Variation gilt jedoch das Auftreten von Oxidase und Katalase in den

Peroxisomen als konstant und dient somit ihrer Charakterisierung und Identifizierung

(MASTERS u. CRANE 1995).

Mehr als siebzig Prozent der peroxisomalen Enzyme befinden sich in der Matrix.

Einige wenige Enzyme sind im Nukleoid lokalisiert und der verbleibende Anteil ist in

der einfachen Membran der Peroxisomen angesiedelt (MANNAERTS u. VAN

VELDHOVEN 1992).

Das Aufgabenspektrum ist sehr komplex und umfasst den Peroxidmetabolismus, die

-Oxidation sowie die Biosynthese von Etherphospholipiden (Plasmalogene), welche

2 Literaturbersicht 19

besonders im Nervensystem zu finden sind. Die Synthese von Cholesterol,

Gallensuren, Leukotrienen, Prostaglandinen und der Metabolismus von Xenobiotika

obliegt ebenfalls den Peroxisomen. Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil von

Membranen und dient als Komponente von Lipoproteinen. Darber hinaus ist es an

der Synthese von Gallensuren und Steroiden beteiligt (MASTERS u. CRANE 1995).

Da Peroxisomen auch am Abbau insbesondere von sehr langkettigen Fettsuren

beteiligt sind, haben ihre Abwesenheit oder das Fehlen eines ihrer Enzyme, wie

Katalase oder Oxidase, metabolische Konsequenzen. Zahlreiche angeborene

Erkrankungen, darunter das Zellweger Syndrom, lassen Peroxisomen in den

Krperzellen missen und fhren dadurch zu schweren krperlichen Anomalien, die

mit einem berleben ber das Suglingsalter hinaus nicht vereinbar sind. Ein

anderes Beispiel ist der Urikasedefekt des Dalmatiners, bei dem das dunkle Zentrum

des Peroxisomes, als Sitz der Urikase definiert, beim Dalmatiner deutlich kleiner

ausgeprgt ist als bei anderen Hunderassen. Das klinische Bild ist durch deutlich

erhhte Harnsureaussscheidung charakterisiert mit der Gefahr der Uratsteinbildung

in den harnbildenden und ableitenden Wegen (CHEVILLE 1994a).

Im Folgenden werden die wichtigsten Funktionen und Aufgaben der Peroxisomen

nher erlutert.

2.1.2.1 Peroxidmetabolismus

Eine der wichtigsten Funktionen der Peroxisomen ist die Neutralisierung von freien

Radikalen mit Hilfe enzymatischer Mechanismen, die im Folgenden besprochen

werden.

Oxidativer Stress ist ein Zustand der Imbalanz zwischen prooxidativ wirkenden

Komponenten (Oxidantien) und antioxidativ wirkenden Abwehrmechanismen

(Antioxidantien), der durch einen berschuss an freien Radikalen gekennzeichnet ist

(DJORDJEVIC 2004). Der Redox Status ist dabei ein bergeordneter Begriff, der

beide Mechanismen zusammenfasst (WEBB u. TWEDT 2008).

20 2 Literaturbersicht

Freie Radikale wirken prooxidativ, da sie ein oder mehrere ungepaarte Elektronen

aufweisen (WEBB u. TWEDT 2008). Zu dieser Gruppe gehren das Superoxid-

Radikal O2-, das Hydrogen Radikal H, das Hydroxyl Radikal OH und das Hydrogen

Peroxid Radikal H2O2 (DJORDJEVIC 2004). Diese sind in der Lage, unterschiedliche

Biomolekle wie Lipide, Proteine und Nukleinsuren (DJORDJEVIC 2004)

anzugreifen und in ihrer Funktion schwer zu beeintrchtigen (LFFLER et al. 2007).

Die meisten freien Radikale stammen vom Sauerstoff ab, dann bezeichnet man sie

auch als reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS=reactive oxygen species). Die

Radikalbildung ist unweigerlich an die mitochondriale Energieproduktion gekoppelt

(GEROK 1995; MANDELKER 2008; WEBB u. TWEDT 2008). Die Reduktion des

Sauerstoffes whrend der mitochondrialen Atmungskette erzeugt freie Radikale wie

das Superoxidradikal (MANDELKER 2008). Die zweite Gruppe der Radikale stammt

von Stickstoff ab und wird als Gruppe reaktiver Nitrogenverbindungen (RNS)

bezeichnet (MANDELKER 2008). Der gesunde Organismus wandelt ein Viertel des

eingeatmeten Sauerstoffes zu Radikalen um. Bei Krankheit werden sogar drei Viertel

des inspiratorischen Sauerstoffes in Radikale umgesetzt (DJORDJEVIC 2004).

Freie Radikale sind an der Pathogenese von zahlreichen Krankheitsprozessen

beteiligt, beeinflussen das Immunsystem negativ und beschleunigen den

Alterungsprozess der Zelle (DJORDJEVIC 2004; MANDELKER 2008; CAMOES et

al. 2009). So knnen zahlreiche unterschiedliche Ursachen wie Toxmien,

Infektionen, hypoxisch-ischmische Zustnde, Hyperglykmien, die Verstoff-

wechslung von Xenobiotika, Hyperlipidmien, Hyperproteinmien, Neoplasien,

Entzndungen sowie Immunreaktionen und erhhte metabolische Raten oxidativen

Stress auslsen. Vor allem bei alternden Geweben kann ein zu niedriger ATP

Gehalt, bedingt durch eine ungengende mitochondriale Produktion, zu erhhtem

oxidativen Stress fhren (MANDELKER 2008). Auerdem entstehen freie Radikale

bei Absorption von Strahlung, dem Metabolismus von Ethanol in Hepatozyten und

Lipidperoxidation von ungesttigten Fettsuren (DJORDJEVIC 2004). Der Vorgang

der Lipidperoxidation wird dabei selbst auch durch freie Radikale in Gang gesetzt

und dann durch sekundr gebildete Radikale aufrecht erhalten, welche das

umliegende Gewebe schdigen und so eine Kettenreaktion auslsen. Von der

2 Literaturbersicht 21

Lipidperoxidation sind besonders die sehr empfindlichen, mehrfach ungesttigten

Fettsuren als Bestandteil von Zellmembranen und intrazellulren Organellen

betroffen (DJORDJEVIC 2004).

Die Folge der Lipidperoxidation ist eine Zunahme der Membranpermeabiltt, so dass

die Integritt von Zellorganellen wie Peroxisomen, Mitochondrien und Lysosomen

herabgesetzt wird. Darber hinaus werden Enzyme und Rezeptoren inaktiviert.

Letztlich kann die Peroxidation zur Zerstrung aller Lipidmembranen fhren

(HARMAN 1956). Mit der Zerstrung von Zellorganellen, wie z.B. den Mitochondrien,

beginnt der Alterungsprozess der Zelle, da die Energieproduktion abnimmt, vermehrt

freie Radikale anfallen und der oxidative Stress zunimmt, was wiederum zu einer

weiteren Zellschdigung fhrt (WALLACE 2001). Zusammenfassend kann also der

oxidative Schaden, verursacht durch freie Radikale, entweder die Ursache aber auch

die Folge mitochondrialer Dysfunktion sein (MANDELKER 2008).

Der Entstehung von Tumoren liegen Mutationen und unkontrollierte

Zellproliferationen zu Grunde. Die chronische Exposition durch oxidativen Stress

kann Mutationen der DNA zur Folge haben, die zur Expression modifizierter Gene

fhren und somit das Wachstum von Tumoren untersttzen. Daher wird dem

oxidativen Stress auch eine Beteiligung an der Karzinogenese zugesprochen

(DJORDJEVIC 2004; KLAUNIG u. KAMENDULIS 2004).

Antioxidantien

Antioxidative Mechanismen wirken den freien Radikalen entgegen und knnen in

enzymatische und nicht enzymatische Prozesse eingeteilt werden. Im Folgenden

werden nur die enzymatischen Antioxidantien besprochen, da diese in Peroxisomen

vorkommen. Zu dieser Gruppe gehren die Katalase, als ein Bestandteil der

Peroxisomen, die Glutathionperoxidase und die Superoxiddismutase (SOD) (GEROK

1995; SCHRADER u. FAHIMI 2004). Glutathionperoxidasen sind wichtige

Bestandteile des antioxidativen Schutzsystems aller Zellen, kommen aber auch im

Extrazellularraum vor (LFFLER et al. 2007). Das Enzym ist in der Matrix und in den

Mitochondrien lokalisiert und kann als ein alternatives Enzym zur Katalase betrachtet

werden. Es ist in der Lage, organische Peroxide, wie Lipidperoxide (CHEVILLE

22 2 Literaturbersicht

1994b; DJORDJEVIC 2004; LFFLER et al. 2007) oder Wasserstoffperoxide

abzubauen, wenn die Katalaseaktivitt ausgeschaltet ist, wie z.B. im Falle einer

Endotoxmie oder des Ischmie-Reperfusionssyndroms (SINGH et al. 1994).

Die Superoxiddismutase (SOD) existiert in verschiedenen Varianten mit

unterschiedlichen Metallionen im aktiven Bereich des Enzyms. CuZn SOD findet sich

im Zytoplasma, im Kern und in Peroxisomen von Sugetieren (DJORDJEVIC 2004).

Weiterhin existiert eine SOD im Serum und anderen extrazellulren Flssigkeiten

(MARKLUND 1980). Eine erhhte Aktivitt der SOD wird ber Zytokine wie IFN

induziert, whrend eine verminderte Aktivitt ber TNF und TGF eingeleitet wird

(MARKLUND 1992). Die SOD untersttzt die Beseitigung von Superoxidanion- und

Hydroxyperoxidradikalen, indem das weniger reaktionsfhige Wasserstoffperoxid

und molekularer Sauerstoff entsteht (GEROK 1995). Das Wasserstoffperoxid dient

dann wiederum der Katalase als Substrat (MASTERS u. CRANE 1995;

ANGERMULLER et al. 2009).

Peroxisomen verfgen sowohl ber Oxidasen, die Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid

reduzieren knnen, als auch ber Katalasen, die Wasserstoffperoxid zu Wasser

reduzieren (BAUDHUIN et al. 1965; DE DUVE u. BAUDHUIN 1966; SHNITKA 1966).

Die Enzyme Katalase und einige Oxidasen sind in der Matrix lokalisiert (BAUDHUIN

et al. 1965). Es existieren verschiedene Oxidasen, die ein spezielles Endprodukt und

zustzlich Wasserstoffperoxid produzieren. Zu den peroxisomalen Oxidasen gehren

die L--Hydroxyacid-Oxidasen A und B. Hydroxyacid-Oxidase A ist in der Matrix und

Hydroxyacid-Oxidase B ist in der Marginalplatte lokalisiert. Beide Enzyme finden sich

insbesondere in Leber und Niere. Eine weitere Oxidase, die D-Aminoacid-Oxidase,

ist auer in den Peroxisomen auch frei im Zytosol der Zelle vorhanden (MASTERS u.

CRANE 1995).

Die Produktion und Reduktion der Wasserstoffperoxide mittels Katalase sowie die

Entgiftung anderer reaktiver Sauerstoffradikale schtzt Zellen vor oxidativen

Schdigungen (TERLECKY et al. 2006). Die Katalase ist ein ubiquitres Enzym

(SHARMA et al. 1989), das 40 % des peroxisomalen Proteins ausmacht (DE DUVE

u. BAUDHUIN 1966) und eine besonders hohe Aktivitt in der Leber aufweist. Auer

2 Literaturbersicht 23

in Peroxisomen ist das Enzym auch in Mitochondrien lokalisiert, eine fr die Zelle

gnstige Lage, da hier viele Wasserstoffperoxid produzierende Enzyme ansssig

sind (SHARMA et al. 1989).

Die Katalase untersttzt sowohl katalytische als auch peroxidative Reaktionen.

Beide Reaktionen bentigen Wasserstoffperoxid. Im katalytischen Fall kommt ein

zweites Wasserstoffperoxid zur Reaktion dazu und es entsteht Wasser und

Sauerstoff. In der peroxidativen Reaktion reagiert Wasserstoff mit weiteren

Wasserstoffdonatoren, wie Alkoholen, Phenolen, Nitriten, Formaldehyd und primren

Aminen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; GEROK 1995; MASTERS u.

CRANE 1995).

Katalytische Reaktion: H2O2 + H2O 2H2O + O2

Peroxidative Reaktion: H2O2 + RH2 2H2O + R

Peroxiosmen verfgen ber zahlreiche weitere Enzyme. Eine umfassende bersicht

bieten Kapitel 2 (Enzymology) und Kapitel 3 (Intraparticulate organization of

peroxisomal proteins-methodology and topology) des Buches The peroxisome: a

vital organelle von Colin Masters und Denis Crane (MASTERS u. CRANE 1995).

Rolle der Mitochondrien bei oxidativem Stress

Mitochondrien werden urschlich durch Hypoxie, freie Radikale und Toxinbelastung

geschdigt (VIEIRA u. KROEMER 1999).

Neben den vielseitigen, fr die Zelle ntzlichen Aufgaben, tragen die Mitochondrien

aber auch selbst zur Radikalbildung bei (ROTH 1997). O2- und H2O2 reagieren hufig

mit Eisen, das sich in den Mitochondrien befindet. Dadurch kann die mitochondriale

DNA geschdigt werden. Die Folge dieser Schdigung ist eine Verstrkung des

oxidativen Stresses aufgrund Expression vernderter Proteine, die verantwortlich fr

die Elektronentransportkette sind. Es entsteht ein Circulus vitiosus mit verstrkter

24 2 Literaturbersicht

Radikalbildung (LEE u. WEI 1997) Unter physiologischen Bedingungen werden die

Radikale durch Antioxidantien neutralisiert (ROTH 1997). Das wichtigste Antioxidans

zum Schutz der Mitochondrien ist Glutathion (MANDELKER 2008). Bei

Krankheitszustnden, z.B. Sepsis, reichen diese Mechanismen jedoch nicht aus und

erschpfen (ROTH 1997). Oxidativer Stress der Mitochondrien kann zu einer

Aktivierung der Mitochondrienexpression fhren und damit zu Erhhung der

Organellenanzahl (MANDELKER 2008). Neben dem Enzym Glutathion schtzen

erhhte peroxisomale Katalasekonzentrationen die Mitochondrien vor Fehl-

funktionen, whrend niedrige Konzentrationen zu einer mitochondrialen Dysfunktion

fhren knnen (KOEPKE et al. 2008).

2.1.2.2 -Oxidation

In der Pilz- und Pflanzenzelle ist dieser biochemische Vorgang ausschlielich in den

Peroxisomen lokalisiert. In eukaryontischen Zellen findet die -Oxidation sowohl in

Mitochondrien als auch in Peroxisomen statt, mit dem Ziel, die Lipidhomostase

aufrechtzuerhalten (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).

Das peroxisomale -Oxidationssystem dient ber etwa fnf hintereinander

ablaufende -Oxidationszyklen der Verkrzung von sehr langen und toxischen

Fettsuren (REDDY u. MANNAERTS 1994; MASTERS u. CRANE 1995;

HASHIMOTO 1999). Kurze Fettsuren (

2 Literaturbersicht 25

Energiegewinnung um das zweifache effektiver ist als die peroxisomale -Oxidation

der Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).

Die Enzyme zur peroxisomalen -Oxidation befinden sich in der Matrix. Dabei

unterliegt die peroxisomale Enzymausstattung einer Dynamik, die von dem Gewebe,

der Spezies und den Rahmenbedingungen sowie dem Einfluss von Umweltfaktoren

oder Xenobiotika abhngt (MASTERS u. CRANE 1995).

Die eigentliche -Oxidation gesttigter Fettsuren verluft in vier Schritten

(Abbildung 2-3):

1) Acyl-CoA wird mittels Acyl-CoA-Dehydrogenase zu 2-trans-Enoyl-CoA

oxidiert, dabei entsteht Wasserstoffperoxid.

2) Hydratationsschritt mittels Enoyl-CoA-Hydratase mit Zwischenprodukt L-

Hydroxyl-CoA.

3) Oxidationsschritt mittels L-3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase mit dem

Zwischenprodukt 3-Ketoacyl-CoA

4) Aus 3-Ketoacyl-CoA entsteht durch das Enzym -Ketoacyl-CoA-Thiolase,

mittels der thiolytischen Spaltung des Ketoacyl-CoAs, ein Acetyl-CoA und eine

um zwei C-Atome verkrzte aktivierte Fettsure, die wieder in den -

Oxidationszyklus einflieen kann (LAZAROW 1978; HASHIMOTO 1987)

26 2 Literaturbersicht

Abbildung 2-3 Abbau geradzahliger Fettsuren durch -Oxidation (LFFLER et al. 2007)

Der Vorgang der -Oxidation beginnt mit der Aktivierung der Fettsure. Die

peroxisomale Membran besitzt zwei Acyl-CoA-Synthetasen, die an der Aktivierung

von langen (C14-C20) und sehr langen Fettsuren (>C20) beteiligt sind (MANNAERTS

et al. 1982; SINGH u. POULOS 1988; LAZO et al. 1990; LAGEWEG et al. 1991). Zur

Aktivierung werden ATP und Coenzyme A bentigt (MASTERS u. CRANE 1995). Da

in Peroxisomen vor allem die Oxidation sehr langer Fettsuren stattfindet, zeigen

Patienten mit Peroxisomenmangel eine erhhte intrazellulre Anhufung von sehr

langen Fettsuren (MASTERS u. CRANE 1995).

Im Folgenden werden die wichtigsten Unterschiede zwischen peroxisomaler und

mitochondrialer -Oxidation in tabellarischer Form aufgezeigt:

2 Literaturbersicht 27

Tabelle 2-1 Unterschiede peroxisomaler und mitochondrialer -Oxidation

Funktion

-Oxidation

(Peroxisom)

-Oxidation

(Mitochondrien)

Fettsuretransport in die Organelle

(MANNAERTS et al. 1979; MASTERS u.

CRANE 1995)

membranstndiges Transportsystem,

Carnithin unabhngig

Carnithin abhngig

Energieweiterverarbeitung (LAZAROW u.

DE DUVE 1976; MANNAERTS et al.

1979)

Abgabe von Wrme

Verknpfung mit oxidativer

Phosphorylierung/Elektronentransportkette

Ablauf der -Oxidation (LAZAROW 1978) unvollstndig,

lediglich Verkrzung von Fettsuren

vollstndig

Funktion der -Oxidation

(LAZAROW 1987; HAYASHI u. MIWA

1989; HAYASHI u. TAKAHATA 1991;

OSMUNDSEN et al. 1991)

Substratbereitstellung fr anabole

Vorgnge (Cholesterin- u. Gallen-

suresynthese, Phospholipide)

Eliminierung schlecht

verstoffwechselbarer Verbindungen

Bereitstellung von Energie fr zellulre

Ablufe

Enzymatische Ausstattung

(MASTERS u. CRANE 1995) 3 Enzyme

4 Enzyme

Energiestatus der Zelle

(MASTERS u. CRANE 1995) ATP unabhngig

ATP abhngig

steigt mit sinkendem ATP Gehalt

2.1.2.3 Weitere Funktionen der Peroxisomen

Synthese der Plasmalogene

Die Peroxisomen verfgen ber eine enzymatische Ausstattung zur Synthese von

Plasmalogenen. Diese werden auer in den Peroxisomen auch im

Endoplasmatischen Retikulum hergestellt (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN

1992). Im menschlichen Organismus bilden die Plasmalogene 18 % der gesamten

Phospholipide (WANDERS u. WATERHAM 2006) und machen mehr als 80 % des

Phospholipidgehaltes der weien Substanz im Gehirn aus (WANDERS 2004a).

Cholesterinsynthese

Auerdem enthalten Peroxisomen Anteile der enzymatischen Ausstattung zur

Bildung des Cholesterols (WANDERS u. WATERHAM 2006). Die Menge des in den

Peroxisomen produzierten Cholesterols ist jedoch im Vergleich zur Cholesterol-

synthese des Endoplasmatischen Retikulums sehr klein. Die physiologische Rolle

28 2 Literaturbersicht

der peroxisomalen Cholesterolsynthese ist bis jetzt unklar (MANNAERTS u. VAN

VELDHOVEN 1992).

Harnsurestoffwechsel

Das Enzym Uratoxidase oder auch Urikase ist am Purinkatabolismus beteiligt und

findet sich in den meisten Sugetierperoxisomen (USUDA et al. 1988). Dort ist es,

wie auch die Xanthinoxidase bevorzugt, im Nukleoid lokalisiert. Es gibt jedoch auch

Vertebraten, die eine nennenswerte peroxisomale Aktivitt dieses Enzyms

aufweisen, ohne Nukleoide zu besitzen (MASTERS u. CRANE 1995). Die

Xanthinoxidase verstoffwechselt Xanthin zu Harnsure, whrend die Uratoxidase die

Oxidation von Urat mit Hilfe von molekularem Sauerstoff zu Allantoin katalysiert

(MASTERS u. CRANE 1995). Bei einigen Neuweltaffen und dem Menschen fehlt die

Uratoxidase in hepatozellulren Peroxisomen, sodass bei diesen Spezies Harnsure

als Endprodukt des Purinkatabolismus ausgeschieden wird (USUDA et al. 1988;

MASTERS u. CRANE 1995). Primaten verfgen dagegen ber eine gewisse

Leberuratoxidaseaktivitt und zeigen daher nur niedrige Harnsurespiegel

(MASTERS u. CRANE 1995).

Die Gicht des Menschen ist eine Erkrankung in Folge des Mangels an Uratoxidase

(MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; HAYASHI et al. 2000). Es ist das einzige

peroxisomale Enzym, das in der veterinrmedizinischen Literatur fr den Hund

beschrieben ist und befindet sich in den hepatozellulren Peroxisomen im Nukleoid

(LAGING et al. 1988). Der Dalmatiner besitzt im Vergleich zum Beagle eine hhere

Anzahl und auch grere Peroxisomen. Es handelt sich hier um einen

kompensatorischen Mechanismus, um einer erhhten Harnsurekonzentration im

Blut vorzubeugen. Die Unfhigkeit der Hepatozyten des Dalmatiners, aus Harnsure

mittels der in den Peroxisomen lokalisierten Urikase Allantoin zu synthetisieren, liegt

jedoch nicht an dem bei dieser Rasse vorherrschenden Urikasemangel, sondern

aufgrund eines Transportdefektes, an einer verminderten Fhigkeit der Hepatozyten,

die Harnsure in die Hepatozyten hineinzutransportieren (GIESECKE et al. 1985;

LAGING et al. 1988).

2 Literaturbersicht 29

2.1.3 Interaktion mit Mitochondrien

Peroxisomen sind Organellen, die nicht isoliert im Zytoplasma liegen, sondern

aufgrund metabolischer Zusammenhnge mit anderen subzellulren Strukturen, wie

den Mitochondrien, dem Endoplasmatischen Retikulum, Fetttropfen und dem Zytosol

assoziiert sind (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).

Wie bereits beschrieben, ist die -Oxidation ein grundlegender Mechanismus, der

ebenso wie die Thermogenese sowohl in Peroxisomen als auch in Mitochondrien

stattfindet (REDDY u. MANNAERTS 1994; WANDERS 2000, 2004b). Darber

hinaus teilen sie sich Komponenten in der Zelle, die zur Organellenteilung notwendig

sind (SCHRADER 2006; SCHRADER u. YOON 2007). Vor kurzem wurde ein

Transportmechanismus zwischen Mitochondrium und Peroxisom entdeckt

(NEUSPIEL et al. 2008), der dazu dienen knnte, Metabolite, Lipide oder Proteine

zwischen den beiden Organellen auszutauschen (KOCH et al. 2005). Dazu befindet

sich an der ueren mitochondrialen Membran eine Ligase MAPL (mitochondria-

anchored protein ligase), welche ein RING-Finger Motiv umfasst und die

Morphologie der Mitochondrien reguliert. Diese MAPL Struktur kann dann in Form

von Vesikeln (MDV=mitochondria derived vesicles) von Mitochondrien abschnren

und spter mit Peroxisomen verschmelzen. Somit teilen sich Mitochondrium und

Peroxisom nicht nur wichtige Regularien zur Teilung, sondern sind auch ber

metabolische Funktionen eng miteinander verknpft (NEUSPIEL et al. 2008). Eine

andere Funktion der MDVs knnte der Rcktransport von zu den Mitochondrien

fehlgeleiteten peroxisomalen Membranproteinen sein, was hufig unter

experimentellen Bedingungen beobachtet wird (SACKSTEDER et al. 2000).

30 2 Literaturbersicht

2.2 Kontrolle der Peroxisomenzahl

Die Zelle hat die Fhigkeit auf metabolischen oder umgebungsbedingten Stress zu

reagieren, indem sie die Zahl der Peroxisomen erhht, bei Bedarf jedoch auch

berschssige oder geschdigte Organellen entfernt (YAN et al. 2005).

Peroxisomen sind Zellorganellen, die sich sowohl ber Wachstum und Teilung

vermehren, als auch aufgrund ihrer engen Assoziation mit dem Endoplasmatischen

Retikulum neu gebildet werden knnen (GRABENBAUER et al. 2000; SCHRADER

u. FAHIMI 2006).

Die Peroxisomen sind sehr stark in Hepatozyten vertreten. In einem Hepatozyten

finden sich bis zu 1000 Peroxisomen in enger Verbindung zum Endoplasmatischen

Retikulum (CHEVILLE 1994e). Weiterhin findet man sie in groer Zahl in renalen

Tubuluszellen und in steroidsynthetisierenden Zellen (CHEVILLE 1994e).

Die Verteilung von Peroxisomen innerhalb einer Zelle bzw. im Zellverband bedarf der

Bewegung einzelner Organellen. Fr diesen Zweck bentigen die Peroxisomen der

Sugetiere auf Mikrotubuli basierende Filamente (SCHRADER et al. 2003). Die

Motilitt der Organelle dient dazu, eine gleichmige Verteilung innerhalb der Zelle

aufrechtzuerhalten, mit anderen Peroxisomen oder anderen Zellorganellen in Kontakt

zu treten oder auch Zellkompartimente zu erreichen, die aufgrund der metabolischen

Situation Peroxisomen bentigen (SCHRADER et al. 2003). Es knnen zwei

Bewegungsarten unterschieden werden. Die erste Variante beinhaltet eine

langsame, nicht gerichtete Bewegung, der sich ca. 95 % der Peroxisomen bedienen.

Sie bentigt keine Mikrotubuli und ist energieunabhngig. Die zweite Mglichkeit der

Bewegung ist eine energieverbrauchende, schnelle, gerichtete Motilitt, die an

Mikrotubuli gekoppelt ist (WIEMER et al. 1997). Weitere Untersuchungen der

Peroxisomenmotilitt an kultivierten Zellen ergaben, dass sich elongierte oder

retikulr ausgerichtete Peroxisomen langsamer und ohne Mikrotubuli bewegen,

whrend sphrische Peroxisomen deutlich schneller entlang des Mikrotubulisystems

ihre Lokalisation verndern knnen (SCHRADER 2001).

2 Literaturbersicht 31

In eukaryontischen Zellen gibt es drei verschiedene Wege, die die Anzahl der

Peroxisomen in der Zelle beeinflussen knnen (YAN et al. 2005).

Einer der drei Mechanismen umfasst die Peroxisomenteilung im Rahmen der

Zellteilung mit Aufteilung der Organellen auf die Tochterzellen (VEENHUIS et al.

2003). Der zweite Mechanismus beinhaltet die Autophagie von berflssigen oder

geschdigten Peroxisomen (FARRE u. SUBRAMANI 2004; YAN et al. 2005). Der

letzte Vorgang umfasst die bermige starke numerische Zunahme von

Peroxisomen in kurzer Zeit unabhngig vom Zellzyklus; dieser Vorgang wird

allgemein als Peroxisomenproliferation bezeichnet (YAN et al. 2005).

2.2.1 Biogenese und Proliferation

Die Neuentstehung der Peroxisomen war und ist ein stndiger Diskussionspunkt

(PLATTA u. ERDMANN 2007) und seit ihrer Entdeckung 1954 gibt es dazu viele

Theorien (BERNHARD u. ROUILLER 1956).

Die ersten Untersuchungen, die zur Aufklrung der Biogenese von Peroxisomen in

eukaryontischen Zellen beitrugen, wurden an Hefen und Pflanzen durchgefhrt und

die daraus gewonnenen Erkenntnisse auf die Sugetierzelle bertragen (GOULD u.

VALLE 2000). Dabei zeigte sich, dass die Regulation und Transkription bestimmter

Gene, sogenannter PEX-Gene, und die daraus hervorgehenden Proteine, die

sogenannten Peroxine, mageblich an der Entstehung von Peroxisomen beteiligt

sind.

Bis heute sind 32 PEX Gene bekannt, die an drei verschiedenen Schlsselpositionen

der Peroxisomentwicklung involviert sind (VAN DER ZAND et al. 2006): an der

Bildung der peroxisomalen Membran, der Peroxisomenproliferation und der

Bereitstellung und Positionierung von peroxisomalen Matrixproteinen (PLATTA u.

ERDMANN 2007).

Peroxisomenteilung

Hierbei knnen zwei grundlegende Teilungsvorgnge unterschieden werden. Zum

einen findet whrend der Zellteilung eine Teilung der vorhandenen Peroxisomen

32 2 Literaturbersicht

statt, um eine gleichbleibende Anzahl an Peroxisomen in den Tochterzellen zu

gewhrleisten. Es handelt sich dann um eine konstitutive Teilung.

Zum anderen kann durch extrazellulre Stimuli eine intrazellulre Teilung der

Peroxisomen provoziert werden, die eine starke Vermehrung (Proliferation) zur Folge

hat. Diese Peroxisomenproliferation ist charakterisiert durch eine numerische

Zunahme, erhhte Volumendichte, zunehmende Gre und gegebenenfalls eine

vermehrte Bereitstellung von peroxisomalen Enzymen. Dadurch wird erhhten

metabolischen Anforderungen Rechnung getragen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).

Peroxisomen enthalten keine DNA. Die Informationen zur Herstellung von

peroxisomalen Proteinen ist in nukleren Genen verschlsselt (LAZAROW u. FUJIKI

1985). Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Proteine der

Membran und der Peroxisomenmatrix an freien, im Zytosol befindlichen

Polyribosomen produziert und posttranslational in bereits bestehende Peroxisomen

transportiert werden. Hierauf begrndet sich die Theorie, dass die Peroxisomen

Organellen sind, die sich wie Mitochondrien und Chloroplasten ber Wachstum und

Teilung vermehren (LAZAROW u. FUJIKI 1985). Das Wachstum von Peroxisomen

wird dabei durch den Import von Membran- und Matrixproteinen gewhrleistet. Bei

entsprechender Gre kommt es zur Aufteilung der Matrix und der peroxisomalen

Membran in mindestens zwei neue Peroxisomen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).

Neuere Untersuchungen am Beispiel von Saccharomyces cerevisiae zeigen, dass

peroxisomale Bausteine aus dem Endoplasmatischen Retikulum hervorgehen,

insbesondere die peroxisomalen Membranteile, die bei der de-novo Synthese von

Peroxisomen bentigt werden (HOEPFNER et al. 2005; VAN DER ZAND et al.

2006).

Ausgehend vom Stadium des reifen Peroxisoms werden fr eine Verdopplung

folgende Stadien durchlaufen (Abbildung 2-4) :

1) Verlngerung und Abschnrung

2) Teilung und Gruppenbildung

3) Trennung der Peroxisomen

2 Literaturbersicht 33

4) Wachstum der neu entstandenen Peroxisomen,

Wachstum und Reifung durch Matrixproteinimport

Verlngerung/ Abschnrung

Teilung/Gruppenbildung

Trennung

Wachstum/Reifung durch Matrixproteinimport

Reifes Peroxisom

1

2

3

4

Abbildung 2-4 Modell fr die Teilung und Proliferation von Peroxisomen (modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007)

Wachstum und Reifung der Peroxisomen

Das Verfahren zur Proteinherstellung gilt sowohl fr Matrixproteine als auch fr

peroxisomale Membranproteine. Die im Endoplasmatischen Retikulum produzierten

peroxisomalen Membranproteine werden in das neu entstehende Peroxisom

eingebaut. Dadurch findet ein Wachstums- und Reifungsprozess statt, bis es

aufgrund der maximalen Gre erneut zu einer Teilung kommt. Damit die neu

synthetisierten Proteine die Peroxisomen erreichen, verfgen diese ber

peroxisomale targeting Signale (PTS). Zwei dieser Zielsignale sind bekannt unter

den Abkrzungen PTS1 und PTS2 (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u. ERDMANN

2007).

34 2 Literaturbersicht

Zum besseren Verstndnis des peroxisomalen Wachstums kann der gesamte

Prozess in wenige wichtige Schritte unterteilt werden (Abbildung 2-5).

Der erste Schritt umfasst die Bindung eines neu synthetisierten, gefalteten Proteins

an den PTS1/Pex5-Rezeptor oder den lslichen Pex7-Rezeptor (1). Der

berwiegende Anteil der gefalteten Proteine wird ber PTS1/Pex5-Rezeptor in das

peroxisomale Lumen transportiert, indem der Rezeptor zunchst das Protein zur

peroxisomalen Membran leitet (2). Anschlieend erfolgt der bertritt des Rezeptor-

Proteinkomplexes auf die luminale Seite der Peroxisomenmembran (3). Daraufhin

trennen sich Rezeptor und Protein (4). Das Protein verbleibt im Peroxisom, whrend

der Rezeptor in das Zytosol zurckkehrt, um fr weitere peroxisomale

Matrixproteinimporte zur Verfgung zu stehen (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u.

ERDMANN 2007). Der Export des Rezeptors aus dem peroxisomalen Lumen zurck

ins Zytosol ist ein energieverbrauchender Prozess (OLIVEIRA et al. 2003) und auch

das Einschleusen der Proteine ist ATP abhngig. Zuerst werden die

Membranproteine synthetisiert, anschlieend erfolgt die Synthese der Matrixproteine

(MASTERS u. CRANE 1995).

2 Literaturbersicht 35

Neues Protein

Neues Protein

Neues ProteinNeues

Protein

PTS1/Pex5 Rezeptor

1 2

PTS1/Pex5 Rezeptor

PTS1/Pex5 oder Lsl. Pex7 Rezeptor

3

Neues Protein

4

oder Zytosol

peroxisomaleMatrix

Lslicher Pex7

Rezeptor

PTS1/Pex5 Rezeptor

peroxisomaleMembran

Abbildung 2-5 Translokation von Proteinen zum Wachstum der Peroxisomen (modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007)

Auslsende Faktoren der Peroxisomenproliferation

Es gibt extrinsische und intrinsische Faktoren, die eine Peroxisomenproliferation

induzieren knnen (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Eine Regeneration der Leber

nach einer partiellen Hepatektomie fhrt zu einer Peroxisomenproliferation in den

Hepatozyten (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Auch zahlreiche Chemikalien,

Medikamente und Weichmacher, allgemein als Peroxisomenproliferatoren (PPO)

bezeichnet, knnen eine Vermehrung der Zellorganelle bewirken (LAZAROW u. DE

DUVE 1976; FAHIMI et al. 1982). Weichmacher, die sich z.B. in Plastikverpackungen

von Lebensmitteln befinden, haben in tierexperimentellen Studien gezeigt, dass sie

eine Peroxisomenproliferation auslsen knnen (MASTERS u. CRANE 1995).

Langzeitftterungsversuche mit Ratten fhrten darberhinaus zu der Entwicklung von

hepatozellulren Karzinomen (MASTERS u. CRANE 1995). Auch Medikamente, wie

Azetylsalizylsure, anabole Steroide, Clofibrate, Trimethoprim Sulfonamide,

Spironolacton und orale Kontrazeptiva fhren zu einer Erhhung der

36 2 Literaturbersicht

Peroxisomenzahl (DE CRAEMER 1995). Die Verabreichung von

Schilddrsenhormonen geht beispielsweise mit einer verminderten Katalaseaktivitt

bei gleichzeitiger Erhhung der Peroxisomenzahl von verminderter Gre einher

(JUST u. HARTL 1983; KERCKAERT et al. 1989). Die Stimulation von kultivierten

humanen Hepatozyten mit mehrfach ungesttigten Fettsuren oder

Sauerstoffradikalen kann ebenfalls eine Peroxisomenproliferation auslsen

(SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999). Zahlreiche Untersuchungen

haben gezeigt, dass es etwa 60 Xenobiotika gibt, die zu einer

Peroxisomenproliferation fhren (MOODY et al. 1991). Darber hinaus knnen

fettreiche Diten, Hungerperioden, Vitamin E Mangel, Hyperthyreoidismus und

Anpassung an Klte zu einer Proliferation der Peroxisomen fhren (MASTERS u.

CRANE 1995). Die Peroxisomenproliferation, herbeigefhrt durch PPO, fllt je nach

Lokalisation im Leberlppchen sehr variabel aus. In periportalen Hepatozyten finden

sich sehr viele elongierte Peroxisomen, whrend im perizentralen Bereich eher

rundliche Peroxisomen vorkommen (FAHIMI et al. 1996). Elongierte Peroxisomen

sind ein Zeichen fr eine peroxisomale Proliferation und geben somit einen wichtigen

Hinweis auf eine stattgefundene Teilungsaktivitt der Peroxisomen (SCHRADER et

al. 1996; SCHRADER et al. 1998b; KOCH et al. 2004). Vergleicht man diese

Beobachtung mit der Proliferation von hepatischen Stammzellen von periportal nach

perizentral (ARBER et al. 1988), kann daraus gefolgert werden, dass die

Peroxisomen dieser Proliferationsrichtung folgen (SCHRADER u. FAHIMI 2006). Bei

Proliferationsvorgngen wird auch eine perinuklere Verteilung der Peroxisomen

beobachtet (ROELS et al. 1983; DE CRAEMER et al. 1993).

Regulation der Peroxisomenproliferation

Die Regulation der Peroxisomenproliferation im Sugetierorganismus erfolgt ber

nuklere Transkriptionsfaktoren. Diese Transkriptionsfaktoren gehren zur groen

Familie der Steroid-, Thyroid- und Retinoidrezeptoren und werden als Peroxisome

proliferator activated receptors (PPARs) bezeichnet (ISSEMANN u. GREEN 1990).

Es werden drei Typen unterschieden: PPAR , PPAR und PPAR

(SCHOONJANS et al. 1996).

2 Literaturbersicht 37

PPAR ist in den Lipidstoffwechsel, die Lipoproteinsynthese und den Ablauf von

Entzndungsreaktionen involviert (FEIGE et al. 2006). PPAR wird stark in der

Leber exprimiert (KLAUNIG et al. 2003) und wird besonders bei Nagern durch

Lipidsenker sowie mehrfach ungesttigte Fettsuren aktiviert (BEIER et al. 1992,

1997). PPAR fungiert als Sensor fr den Lipidgehalt der Hepatozyten und reguliert

die Genexpression fr die mitochondriale und peroxisomale -Oxidation

(HASHIMOTO et al. 2000). Ein entscheidender Punkt in der Karzinogenese ist die

Aktivierung von PPAR (GONZALEZ et al. 1998). PPAR bestimmt das Ma des

Fettmetabolismus in Skelettmuskeln und Fettgewebe (LUQUET et al. 2005). Die

Bedeutung von PPAR liegt in der Regulation der Proliferation und

Ausdifferenzierung von Fettzellen (LUQUET et al. 2005).

2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie

Im Folgenden wird auf die Abnahme der Peroxisomenzahl in der Zelle eingegangen,

was insbesondere ber Autophagie reguliert wird.

Autophagische Prozesse sind katabole intrazellulre Ablufe, die letztendlich in

einen lysosomalen Abbau von Zellorganellen mnden. Die Autophagie nimmt eine

wichtige Stellung ein, zum Beispiel in Hepatozyten, indem die nicht mehr bentigten

Zellorganellen abgebaut werden und die Abbauprodukte der Zelle als Nhrstoffe

wieder zur Verfgung stehen (CUERVO 2004a; MIZUSHIMA 2005).

Es gibt drei verschiedene Formen der Autophagie, die alle hnliche Funktionen

erfllen: die Makroautophagie, die Mikroautophagie und die Chaperon-mediierte

Autophagie (CUERVO 2004a). Diese drei Mechanismen kommen alle in

Sugetierzellen vor (CUERVO 2004a).

Bei der Makroautophagie werden die zu entsorgenden Komponenten in eine

Doppellamelle, dem Autophagosom, verpackt, welches dann mit dem Lysosom

verschmilzt und durch Hydrolasen abgebaut wird (SAKAI et al. 2006). Die

Membranen des lysosomalen Systems sowie die lysosomalen Proteine werden im

glatten Endoplasmatischen Retikulum (sER) synthetisiert (LFFLER et al. 2007).

38 2 Literaturbersicht

Im Rahmen der Mikroautophagie wird das zu entsorgende Material von der

lysosomalen Membran direkt umschlossen, als sogenanntes Microautophagic body,

und mittels Hydrolasen abgebaut (SAKAI et al. 1998; LFFLER et al. 2007).

Der Prozess der Chaperon mediierten Autophagie beinhaltet die Bindung eines

Rezeptors an das zu eliminierende Substrat im Zytosol. Dieser Komplex bindet nun

an einen an der lysosomalen Membran befindlichen Rezeptor. Daraufhin erfolgt der

bertritt des Substrates in das lysosomale Lumen, in dem die Degradierung durch

Hydrolasen stattfindet (CUERVO 2004b).

Funktion

Der Vorgang der Makroautophagie ist sowohl bei pathologischen, als auch

physiologischen Ablufen, wie der Beseitigung von apoptotischen Zellen, whrend

der Embryogenese, der Wiederverwertung von Nhrstoffen und der Beseitigung von

fehlgefalteten Proteinen, intrazellulren Bakterien und geschdigten Zellorganellen

beteiligt (CUERVO 2004a; LEVINE u. KLIONSKY 2004). Es wird angenommen, dass

es sich in erster Linie um einen protektiven Mechanismus handelt (LEMASTERS et

al. 2002; CUERVO 2004a).

Auch zur Vermeidung von Neoplasien besitzt die Autophagie eine wichtige

Schutzfunktion. Durch die Beseitigung von geschdigten Mitochondrien und der

Reduktion des oxidativen und metabolischen Stresses wird auch die DNA vor

Angriffen durch Radikale geschtzt, was Mutationen verhindert und die Stabilitt des

Genoms wahrt (NELSON et al. 2004; KARANTZA-WADSWORTH et al. 2007;

MATHEW et al. 2007). Eine gestrt ablaufende Autophagie fhrt jedoch zu einer

Genamplifikation, die letztlich ein Hauptmechanismus in der Onkogenaktivierung

darstellt (LITTLE u. CHARTRAND 2004).

Regulation

Der bedeutendste Faktor, der den Prozess der Autophagie in der Leber einleitet ist

Hungern. Hierbei wird in den ersten 48h bei Ratten und Musen 25-45 % des

zelleigenen Proteins abgebaut (ADDIS et al. 1936). Autophagie scheint dabei einen

wichtigen Mechanismus zur alternativen Energieversorgung darzustellen, um

2 Literaturbersicht 39

whrend Hungerperioden durch Recyling von Zellbestandteilen einen normalen

Metabolismus zu gewhrleisten (JIN u. WHITE 2007). Autophagie trgt dadurch zur

Energieversorgung von Zellen in Hungerperioden bei und ist somit an der

Aufrechterhaltung der zellulren Homostase beteiligt (NELSON et al. 2004).

Autophagie ist ein energieverbrauchender Prozess, der bei ATP Mangel zum

Erliegen kommt (MEIJER u. CODOGNO 2004). Auch Insulin bt einen

inhibitorischen Effekt aus (PFEIFER 1977), whrend Glukagon Autophagieprozesse

frdert (DETER et al. 1967). Die alimentre Aufnahme von langen und sehr langen

Fettsuren, die den Peroxisomen als Substrat dienen, fhrt ebenfalls zu einem

Abbruch der Pexophagie (LUIKEN et al. 1992).

2.3 Hepatopathien des Hundes

In der Humanmedizin existieren 17 erblich bedingte peroxisomale Erkrankungen, die

vor allem auf einer Biogenese- oder Funktionsstrung der Peroxisomen beruhen

(WANDERS 2004a). Fr den Hund sind weder angeborene noch erworbene

peroxisomale Erkrankungen beschrieben. Um jedoch herauszufinden, ob

Peroxisomen bei bestimmten degenerativen bzw. neoplastischen Lebererkrankungen

eine Rolle spielen, wurden in der vorliegenden Arbeit Hunde mit Hepatopathien

untersucht, die im Folgenden hinsichtlich ihres makroskopischen und

mikroskopischen Erscheinungsbildes nher erlutert werden sollen.

Die Leber befindet sich zentral im kranialen Abdomen, dem Zwerchfell direkt

anliegend. Die Oberflche ist glatt, da sie von einer sersen Kapsel berzogen ist.

Das Leberparenchym erscheint rotbraun, ist von fragiler Konsistenz und beim Hund

in zahlreiche Leberlappen unterteilt, deren Enden im gesunden Zustand scharf

konturiert sind (CULLEN 2007a).

Es knnen zwei Einteilungen hinsichtlich der architektonischen Bauweise der Leber

unterschieden werden: Die klassische Einteilung der Leber mit dem Leberlppchen

als kleinste anatomische Einheit. Das Leberlppchen bildet eine mehr oder weniger

sechseckige Struktur mit der in der Mitte befindlichen Zentralvene, die das Blut der

40 2 Literaturbersicht

Lebervene zufhrt. An den Ecken des Sechseckes befinden sich die Portalfelder , die

auch als Glisson Trias bezeichnet bezeichnet werden. Sie schlieen Gallengnge,

Zweige der Portalvene, der Leberarterie, Nervenfasern und Lymphgefe ein,

gesttzt von einem feinen retikulren Bindegewebe (Abbildung 2-6 A). Das Blut wird

aus der Leberarterie und Portalvene in die Sinusoide geleitet, wo es sich vermischt

und eng an den Hepatozyten vorbeifliet, bevor es ber die Zentralvene in die V.

hepatica abgefhrt wird (CULLEN 2007a).

Bei der funktionalen Einteilung der Leber nach RAPPAPORT (1980) stellt das

Portalgebiet den zentralen Punkt des sogenannten Leberazinus dar, da dort das

sauerstoffreiche Blut ber die Arterie ankommt und zu den in der Peripherie

gelegenen Lebervenen abgefhrt wird. Dabei nimmt der Sauerstoffgehalt von Zone 1

(periportal oder zentroazinr) ber Zone 2 (mittzonal) nach Zone 3 (periazinr)

kontinuierlich ab (Abbildung 2-6 B) (CULLEN 2007a).

2 Literaturbersicht 41

Abbildung 2-6 Schematische Darstellung der funktionellen Organisation der Leber (CULLEN 2007a)

Die Hepatozyten sind in einschichtigen Zellreihen angeordnet und radir zur

Zentralvene ausgerichtet. Die Zellreihen werden durch besondere Kapillaren, die

sogenannten Sinusoide, getrennt. Sie besitzen keine typische Basalmembran und

sind durch ein diskontinuierliches Endothel ausgekleidet. Hier befinden sich auch die

Lebermakrophagen (Kupffer-Sternzellen), die der Kontrolle des sinusoidalen Blutes

dienen (CULLEN 2007a).

42 2 Literaturbersicht

Die Hepatozyten besitzen zu der das Lumen der Sinusoide begrenzenden Seite

zahlreiche Mikrovilli, die der Oberflchenvergrerung, der Aufnahme von

Substanzen aus dem Plasma und der Sekretion von Produkten dienen. An den

basolateralen Seiten der Hepatozyten befinden sich Gallekanlchen, die sich aus

den modifizierten Zellmembranen zweier benachbarter Hepatozyten ergeben. Der

Disse Raum ist eine besondere anatomische Struktur zwischen den Hepatozyten

und den Endothelzellen der Lebersinusoide. Hier findet ein Austausch von Stoffen

zwischen Plasma und den mit Mikrovilli besetzten Hepatozyten statt. Eine

Schdigung dieser Zone beeintrchtigt die Leberfunktion erheblich. In diesem Raum

befinden sich auch fettspeichernde Zellen, sogenannte Ito-Zellen, die unter anderem

der Vitamin A-Speicherung dienen. Bei Leberschdigungen sinkt ihr Vitamin A-

Gehalt und sie bilden Kollagen, das die Entstehung einer Leberfibrose frdert

(CULLEN 2007a).

2.3.1 Hepatozellulre Degeneration

Die hepatozellulre Degeneration, frher als Hepatose bezeichnet, umfasst nicht

primr entzndlich bedingte Vernderungen der Hepatozyten, beispielsweise durch

Sauerstoffmangel oder Stoffwechselstrungen. Die Vernderungen knnen folgenlos

bleiben, in ein von Entzndungsprozessen begleitetes chronisches Stadium

bergehen oder in einer chronischen Zerstrung von Lebergewebe mit vergeblichen

bindegewebigen Umbau- und Regenerationsprozessen (Zirrhose) enden (KUFER-

WEISS 2007).

Das Verteilungsmuster der auftretenden degenerativen Vernderungen gibt

Aufschluss ber die mglichen Ursachen. So wird unterschieden, ob Leberzellen im

gesamten Parenchym (diffus), zufllig verteilt (multifokal) oder in bestimmten Zonen

(1-3) des Leberazinus geschdigt sind (ROTH u. MEYER 1995).

Hydropische Degeneration

Hepatozyten reagieren bei Strung ihrer Homostase immer in hnlicher Weise.

Dabei werden im allgemeinen die Elektrolytkonzentration und der Flssigkeits-

haushalt derart gestrt, dass es zu einem Wassereinstrom kommt und die Zelle

2 Literaturbersicht 43

anschwillt (CULLEN et al. 2006). Diesen Vorgang nennt man daher auch

hydropische Degeneration (CULLEN 2007b).

Mikroskopisch kann sich das zunchst in Form einer trben Schwellung des

Hepatozyten darstellen. Dabei kommt es zu einer Schdigung der Mitochondrien

z. B. durch exogene Gifte, Hypoxie und/oder Stoffwechselentgleisungen, was zu

einer unspezifischen Leistungsschwche der Hepatozyten fhrt (KUFER-WEISS

2007). Die ebenfalls durch Wassereinstrom vergrerten Mitochondrien knnen

lichtmikroskopisch als gleichmig in der Leberzelle verteilte Krnchen

wahrgenommen werden (KUFER-WEISS 2007).

Abbildung 2-7 Hydropische Degeneration von Hepatozyten im Bereich der Zentralvene (Z=Zentralvene; Rind, Paraffinschnitt, H.E.) (CULLEN 2007a)

Bei fortschreitender hydropischer Schwellung zeigen die Zellen eine sogenannte

ballonierende Degeneration. Dabei nimmt der Einstrom von Wasser und Natrium

stetig zu. Die Konsequenz ist eine massive Schwellung der gesamten Zelle und

deren Organellen, insbesondere der Mitochondrien, der Lysosomen und des

Endoplasmatischen Retikulums (KUFER-WEISS 2007; STALKER u. HAYES 2007).

44 2 Literaturbersicht

Eine Zellschwellung kann reversibel sein, wenn das Ausma und die Dauer der

schdigenden Noxe begrenzt sind (Abbildung 2-8). Wird dabei jedoch ein kritischer

Punkt berschritten, so kommt es in der Folge zum irreversiblen Zelluntergang

(CULLEN 2007b)

Abbildung 2-8 Physiologische Zelle und Vernderungen bei reversibler und irreversibler Zellschdigung (CULLEN 2007b)

Auslser einer hydropischen Degeneration ist im Prinzip immer eine gestrte

Zellatmung aufgrund hypoxischer Zustnde, die entweder den gesamten

Organismus betreffen knnen oder nur lokal wirken. Eine Vergiftung oder

Blockierung mitochondrialer Enzyme fhrt ebenfalls zu einer gestrten Zellatmung

(KUFER-WEISS 2007). Daher ist die hydropische Degeneration eine relativ

unspezifische Zellvernderung, der viele Ursachen zugrunde liegen knnen

(CULLEN 2009). So knnen bei Jungtieren, die vom Wachstumsverhalten der

Wurfgeschwister abweichen, angeborene Erkrankungen, wie z. B. primre

2 Literaturbersicht 45

Speicherkrankheiten der Leber eine tiologische Rolle spielen (CULLEN 2009),

whrend bei lteren Tieren zahlreiche erworbene Erkrankungen (z. B. chronische

Vergiftungen, hohe Blutkortisolspiegel, Herzinsuffizienz, Adipositas) eine

hepatozellulre Degeneration auslsen knnen. Im Rahmen einer hepatozellulren

Degeneration kommt es hufig zu Einlagerungen bestimmter Substanzen, da der

Hepatozyt nicht mehr in der Lage ist, diese angemessen zu verstoffwechseln. Dabei

handelt es sich am hufigsten um Fett oder Glykogen (STALKER u. HAYES 2007;

CULLEN 2009).

Glykogenose

Eine bermige hepatozellulre Glykogeneinlagerung (Glykogenose) tritt im

Rahmen einer steroidinduzierten Hepatopathie auf und ist induziert durch endogene

oder exogene Glukokortikoide bzw. in seltenen Fllen durch Steroidhormone

(Progesteron, Aldosteron) (CULLEN et al. 2006; SEPESY et al. 2006). SEPESY et

al. (2006) gehen davon aus, dass auch eine stressinduzierte Hyperkortisolmie bei

akuten oder chronischen Erkrankungen an der Entstehung einer Glykogenose

beteiligt ist. Weiterhin beobachten sie auerdem Glykogeneinlagerungen im

Zusammenhang mit hepatischen und nicht hepatischen Neoplasien, auch wenn die

Hunde keine exogen zugefhrten Glukokortikoide erhielten. Glukokortikoide fhren

zu einer Anordnung der Peroxisomen um Glykogentropfen, wobei insgesamt die

Anzahl der Peroxisomen vermindert ist (PHILLIPS et al. 1987).

Im Falle einer steroidinduzierten Hepatopathie ist die Leber vergrert und weist eine

blassbraune Farbe auf (CULLEN 2007a). Das Bild einer hepatozellulren

Glykogeneinlagerung zeigt sich als intrazytoplasmatische Vakuolisierung von

Hepatozyten mit berwiegend kleinen verwaschenen Vakuolen. Der Nukleus befindet

sich dabei zunchst noch in zentraler Position (CULLEN et al. 2006). Bei

zunehmender Glykogeneinlagerung kann es zu einer zwei bis zehnfachen

Vergrerung der Hepatozyten mit Verdrngung des Kernes in die Peripherie

kommen. Die Vernderungen beginnen am hufigsten in der Zone 2 (intermedire

Zone) des Azinus, knnen sich jedoch im weiteren Krankheitsverlauf zunehmend

ausbreiten. Im fortgeschrittenen Stadium gehren Zelluntergnge (Nekrosen), sowie

46 2 Literaturbersicht

neutrophile Entzndungszellinfiltrate als Reaktion auf den Gewebsuntergang zum

histologischen Bild. Die PAS-Frbung (periodic acid Schiff reaction) gibt Aufschluss

ber den intrahepatozellulren Gehalt an Glykogen. Klinisch sind deutlich erhhte

enzymatische Aktivitten der ALT und der ALKP zu erwarten (STALKER u. HAYES

2007). Das Erkrankungsbild findet sich hufig bei Hunden. Auch angeborene

Glykogenspeicherkrankheiten fhren zu hnlichen Vernderungen der Hepatozyten

(STALKER u. HAYES 2007).

Lipidose

Der Lipidmetabolismus in der Leber wird sehr eng reguliert. Fettsuren werden

oxidiert, um dem Energiebedarf zu decken; sie werden zu Triglyzeriden verestert, die

an VLDL (very long density lipoprotein) gebunden in die Fettdepots transportiert oder

in den Hepatozyten gespeichert werden (RAO u. REDDY 2004).

Bei der Anreicherung von Fetttropfen in Hepatozyten spricht man von einer

hepatischen Lipidose oder hepatozellulren Steatose, die im Extremfall zu einer

Leberverfettung fhren kann (DE CRAEMER 1995; KUFER-WEISS 2007;

STALKER u. HAYES 2007). Dies beinhaltet eine absolute Erhhung des

Fettgehaltes der Leberzellen (CULLEN et al. 2006; SCHRADER u. FAHIMI 2008).

Akute Lipidosen zeigen sich makroskopisch als vergrerte blasse Lebern mit

brchiger bis fettiger Konsistenz ohne Vernderung der Leberarchitektur.

Makroskopisch erscheinen die Rnder abgerundet (STALKER u. HAYES 2007).

Vorangeschrittene toxische Schdigungen von Hepatozyten fhren zur

Verschmelzung von kleinen Lipidtropfen zu einem groen Tropfen, der den Kern aus

seiner zentralen Stellung verdrngt und zur Konturvernderung der Zelle fhrt. Die

Sinusoide werden komprimiert und vermindert durchblutet (STALKER u. HAYES

2007).

Eine Ansammlung von Triglyzeriden in Form von Fetttropfen kann sich histologisch

mikrovesikulr oder makrovesikulr darstellen (RAO u. REDDY 2004; STALKER u.

HAYES 2007). Die mikrovesikulre Steatose beschreibt intrazellulre, berwiegend

perinukler angeordnete Lipidtropfen, die kleiner sind als der Kern, whrend bei einer

2 Literaturbersicht 47

makrovesikulren Steatose, die Lipidtropfen mindestens so gro wie der Kern oder

grer sind und den Nukleus nach peripher verdrngen (CULLEN et al. 2006).

Eine mikrovesikulre Lipidose beginnt meistens zentrolobulr (Zone 3) im

Leberlppchen und kommt vor allem bei erhhter Mobilisation von Fetten z. B. bei

Diabetes mellitus und juveniler Hypoglykmie von Toy Rassen (CULLEN et al. 2006)

und nicht selten bei toxisch bedingten Hepatopathien vor (STALKER u. HAYES

2007). Die mikrovesikulre Lipidose tritt hufig im Zusammenhang mit Schdigungen

der Mitochondrien auf und ist hinsichtlich des Zellschadens als schwerwiegender

einzuordnen als die makrovesikulre Lipidose (CULLEN 2009).

Bereits degenerierte Hepatozyten zeigen in besonderem Mae eine hepatische

Lipidose, da der Durchsatz von Fettsuren und Triglyzeriden durch die Blockade an

entscheidenden Punkten im Lipidstoffwechsel und der Sekretion von VLDL

betrchtlich eingeschrnkt ist. Das Fett, das als Substrat der -Oxidation dient,

sammelt sich somit im Hepatozyten (DE CRAEMER et al. 1995). Eine krankhafte

Verfettung der Leber kann demnach durch vielfltige alimentre, metabolische,

toxische und hypoxische Ursachen eintreten (STALKER u. HAYES 2007). Die

hepatische Steatose kann, wie die hydropische Degeneration reversibel verlaufen.

Bei persistierender oder sehr heftiger Noxe im Zusammenhang mit ROS,

Endotoxinen, Tumornekrosefaktor alpha und unter dem Einfluss von bestimmten

Zytokinen kann sie sich zu einer Steatohepatitis ausweiten (DAY u. JAMES 1998).

Zu den verschiedenen Ursachen und Mechanismen, die eine Lipidansammlung in

Hepatozyten auslsen knnen, gehren:

prhepatische Ursachen: vermehrte Anfuhr und damit Aufnahme von

Fettsuren (z. B. Mobilisation bei Laktation, Hunger, endokrine Strungen,

Trchtigkeit) (CULLEN 2007a; STALKER u. HAYES 2007)

intrahepatische Ursachen: abnorme Hepatozytenfunktion und Energie-

mangelzustnde mit herabgesetztem Lipidstoffwechsel (CULLEN 2007a),

toxische und hypoxische Ursachen (CULLEN 2007a), Reduktion der Enzyme

zur -Oxidation in den Peroxisomen (FAN et al. 1998).

48 2 Literaturbersicht

posthepatische Ursachen: verminderte Apoproteinsynthese mit reduzierter

Bildung und Export von Lipoproteinen aus den Hepatozyten (CULLEN 2007a)

Lngerfristig bestehende Lipidosen ziehen meist weitere Schdigungen nach sich.

So kommt es bei chronischen Zustnden zu Fibrose, Pigmentablagerungen und

nodulren Hyperplasien. Diese Vernderungen werden durch fortschreitende

peroxidative Schdigung und Aktivierung von Ito-Zellen hervorgerufen. Das erhhte

Auftreten von Lipidtropfen erhht auch den oxidativen Stress der Zelle, der zur

Verstrkung der Lipidperoxidation von Membranen beitrgt (STALKER u. HAYES

2007). In der Humanmedizin wird histologisch die Steatose auch mit Auftreten von

inflammatorischen Vernderungen, ballonierender Degeneration, Apoptose und

Entzndung beobachtet (RAO u. REDDY 2004).

2.3.2 Verhalten der Peroxisomen bei degenerativen

Vernderungen der Hepatozyten

Die ultrastrukturellen Vernderungen bei der hydropischen Leberzelldegeneration

umfassen Plasmamembranvernderungen wie Blebbing, Zerreiung von Mikrovilli,

Bildung von Myelinfiguren und der Verlust von Zellkontakten. Vernderungen der

Mitochondrien in Form von Schwellung und das Auftreten von amorphen

Einlagerungen sind hufig sowie die Dilatation des Endoplasmatischen Retikulums

und die Ablsung der Ribosomen (CULLEN et al. 2006).

Beim Menschen zeigen Peroxisomen der Hepatozyten im Rahmen einer Steatose

eine variable Katalaseaktivitt, werden kleiner und proliferieren, wobei sie

unterschiedliche Erscheinungsformen wie angulre, gebogene oder irregulre

Konturen mit Protrusionen und Membranschleifen (Gastruloid cisternae) annehmen

knnen. Das peroxisomale Nukleoid verschwindet dabei (DE CRAEMER et al. 1995).

Die Mitochondrien der steatotisch vernderten humanen Leber nehmen beachtlich

an Gre zu und werden als Megamitochondrien bezeichnet. Dabei zeigen sie

parakristalline Einschlsse und parallel arrangierte Cristae (DE CRAEMER et al.

2 Literaturbersicht 49

1995). Das Endoplasmatische Retikulum einer Fettleber ist dilatiert und zeigt

Vesikelbildung (DE CRAEMER et al. 1995).

In nahezu allen geschdigten Zellen, besonders in Hepatozyten, die zu den

metabolisch aktiven Zellen zhlen, kommt es im Rahmen von degenerativen

Vernderungen zu einem Anstieg der Peroxisomenzahl. Die sehr pleomorphen

Peroxisomen lagern sich dabei im Bereich der Schdigung, z.B. in der Nhe von

Mitochondrien, gruppenweise an. Insgesamt erscheint die Peroxisomenproliferation

zentrolobulr ausgeprgter als perilobulr (CHEVILLE 1994c).

2.3.3 Hepatitiden

Entzndliche Lebervernderungen knnen in akute und chronische sowie in

spezifische infektis bedingte und unspezifische reaktive Formen eingeteilt werden.

Das Verteilungsmuster ist dabei abhngig von der Entzndungsursache, der

Eintrittspforte, dem Infektionserreger bzw. dessen Zelltropismus innerhalb der Leber

(CULLEN 2007a; STALKER u. HAYES 2007).

Hmatogene Infektionen verursachen z. B. ein eher zufllig verteiltes, multifokales

Verteilungsmuster, whrend ber die Gallenwege aszendierende Infektionen vor

allem in Portalbereichen ihre Manifestation finden, wobei schwerwiegende

Infektionen das gesamte Portalfeld und ber dessen Grenzen hinaus

Entzndungsprozesse mit einbeziehen knnen (CULLEN 2007a).

Akute Hepatitis

Die akute Hepatitis ist durch das Auftreten von Entzndungserscheinungen mit

Infiltration von neutrophilen Granulozyten, Aktivierung von Kupffer-Zellen, Nekrosen

und Apoptosevorgngen von Hepatozyten charakterisiert. Die Zellpopulationen, die

an der Entzndungsreaktion beteiligt sind, variieren stark in Abhngigkeit von der

Ursache, der Wirtsantwort und dem Stadium der Lsion. Meist dominieren

neutrophile Granulozyten bei bakteriell bedingten Infektionen und

Protozoeninfektionen. Virale Infektionen fhren in erster Linie zum Auftreten von

Nekrosen, Apoptosen einzelner Zellen und hufig nur minimalen

50 2 Literaturbersicht

Entzndungszellinfiltraten, meist dominiert von Lymphozyten (CULLEN 2007a).

Kupffer-Zellen spielen auerdem eine wichtige Rolle bei akuten

Entzndungsprozessen, da sie durch ihre Phagozytosefhigkeit zur Beseitigung von

pathogenen Noxen, wie z. B. Bakterien, beitragen. Im Zuge einer Aktivierung zu

sekretorisch aktiven Histiozyten schtten sie neben Zytokinen weitere Mediatoren

aus, die an hypertrophen und proliferativen Prozessen der Hepatozyten, der Ito-

Zellen und Endothelien beteiligt sind (STALKER u. HAYES 2007). Bakterielle

Leberentzndungen knnen beim Hund durch Leptospiren verschiedener Serovare

(L. grippothyphosa, L. pomona, L. bratislava, L. canicola, L. icterohaemorrhagiae),

bei Jungtieren durch Clostridium piliforme oder auch nach disseminierter Ausbreitung

im Organismus durch Nocardia asteroides verursacht werden. Ursache viraler

Hepatitiden sind das canine Adenovirus 1 und das canine Herpesvirus 1 (KUFER-

WEISS 2007).

Chronische Hepatitis

Bei immer wiederkehrenden Noxen oder unvollstndiger Ausheilung akuter

Hepatitiden kommt es zur Entwicklung einer chronischen Hepatitis. Sie ist in erster

Linie gekennzeichnet durch eine Fibrose neben Infiltrationen von mononukleren

Entzndungszellen, wie Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen.

Regenerationsprozesse in Form von proliferierenden Kntchen sind ebenfalls hufig

zu finden (CULLEN 2007a). Die Diagnose sollte die Dauer und den Grad der

Erkrankung einbeziehen. Die Aktivitt einer Hepatitis wird durch den Grad der

Entzndungsreaktion und das Ausma von Apoptose und Nekrose bestimmt

(CULLEN et al. 2006). Beim Hund finden sich variable Mengen neutrophiler

Granulozyten. Dies weist daraufhin, dass ein akuter Entzndungsreiz bestehen bleibt

bzw. wiederholt auftritt (CULLEN 2007a).

Es knnen verschiedene Formen von chronischen Hepatitiden unterschieden werden

(CULLEN 2007a):

granulomatse Hepatitis (Bildung einzelner Granulome; Auftreten fokal oder

disseminiert, Entzndungsgeschehen wird dominiert durch Makrophagen und

2 Literaturbersicht 51

auerdem mehrkernigen Riesenzellen, wenigen Lymphozyten und

Plasmazellen)

chronisch-eitrige Hepatitis (Abszesse: einzeln oder multifokal auftretend, gut

bindegewebig abgegrenzt/eingekapselte Prozesse)

idiopathische chronische Hepatitis (frhere Bezeichnung: chronisch aktive

Hepatitis)

o persistierende Entzndung der Leber mit gemischtzelligen

Entzndungszellinfiltraten

o Fibrose der Portalfelder

o Nodulre Parenchymregeneration

o Portale und periportale mononuklere Zellinfiltration

o Cholestase

Weiterhin sind zwei Subtypen der chronischen Hepatitis fr Hunde beschrieben:

progressive chronische Hepatitis (rassebedingte Kupfervergiftung bei

Dalmatiner, Bedlington und West Highland White Terrier, Pudel)

familire chronische Hepatitis (weibliche Hunde der Rasse Dobermann,

Skye Terrier, Cocker Spaniel und Labrador Retriever)

2.3.4 Lebertumoren

Lebertumoren knnen primr oder sekundr auftreten. Primre Tumore des Leber-

und des Gallengangsystems haben ihren Ursprung in epithelialen Zellen, wie den

Hepatozyten, dem Gallengangsepithel sowie dem Epithel der Gallenblase oder

entstehen aus mesenchymalem Gewebe, wie Bindegewebe oder Zellen der

Blutgefe. Sekundre Tumore der Leber sind sehr hufig und stellen den grten

Anteil der Lebertumore aufgrund ausgeprgter Metastasierung in dieses Organ dar.

Am hufigsten metastasieren in die Leber maligne Lymphome, darber hinaus

Melanome und Hmangiosarkome (CULLEN 2007a).

52 2 Literaturbersicht

Virale Erreger, Chemikalien, Mykotoxine und Medikamente spielen bei der

Entstehung von Tumoren der Haussugetiere entgegen den Erkenntnissen der

Humanmedizin eine eher untergeordnete Rolle. Tumoren der Leber und der

Gallengnge stehen, soweit bekannt, in der Veterinrmedizin nicht in direktem

Zusammenhang mit vorangegangenen Lebererkrankungen (STALKER u. HAYES

2007).

Tabelle 2-2 bersicht der Lebertumoren (CULLEN 2007a)

Die epithelialen Tumoren der Leber gehen entweder von Hepatozyten, von

Gallengangsepithelien oder deren gemeinsamen undifferenzierten Vorluferzellen

(oval cells) hervor. Hepatozellulre Adenome kommen vor allem bei lteren Hunden

sowohl in gesundem Gewebe als auch in zirrhotisch umgebautem Parenchym vor

(KUFER-WEISS 2007). Sie unterscheiden sich makroskopisch kaum von nodulren

Hyperplasien oder von Leberzellkarzinomen und treten normalerweise als einzelne

Tumoren auf (STALKER u. HAYES 2007).

Hepatozellulre Karzinome kommen selten aber mit einer gewissen Regelmigkeit

bei Hunden vor (CULLEN 2007a). Sie treten als einzelne oder multinodulre

Umfangsvermehrungen auf (STALKER u. HAYES 2007), zeigen ein infiltratives

Wachstum und neigen nach Einbruch in das Pfortadersystem zur weiteren

Ausbreitung in der Leber (KUFER-WEISS 2007). Hmatogene Metastasen ber die

Lebertumoren epithelial mesenchymal

Neuroendokriner

Ursprung

Sonstige

Benigne

Hepatozellulres

Adenom

Adenom der

Gallenwege

Hmangiom

Maligne

Hepatozellulres

Karzinom

Gallengangskarzinom

Hepatocholangio-

karzinom

Hepatoblastom

Hmangiosarkom

Hepatisches

Karzinoid

Lymphom

Myeloide Neoplasie

Mastzelltumor

2 Literaturbersicht 53

Vena hepatica finden sich meist zuerst in der Lunge (HEAD et al. 2003; STALKER u.

HAYES 2007). Histologisch werden trabekulre, adenoide und solide Formen der

Karzinome unterschieden (STALKER u. HAYES 2007), wobei mehr als eine

histologische Variante in einem Tumor auftreten kann (HEAD et al. 2003). Mitosen

kommen hufig vor (STALKER u. HAYES 2007). Die zellulren Eigenschaften der

Hepatozyten in hepatozellulren Karzinomen variieren je nach Differenzierungsgrad.

Gut differenzierte hepatozellulre Karzinome zeigen Leberzellen, die normalen

Hepatozyten gleichen, mit rundem zentralen Kern und eosinophilem Zytoplasma.

Das Zytoplasma kann auch blass sein, vakuolisiert und gefllt mit Glykogen oder

Lipiden. Schlecht differenzierte Karzinome weisen dagegen Hepatozyten auf, die

sehr pleomorph sind. Diese Tumorzellen zeigen eine Anisokaryose und nur wenig

basophiles Zytoplasma. Die Nukleoli sind deutlich vergrert. Eine Sonderform des

hepatozellulren Karzinoms stellt das Klarzellkarzinom dar, das vollstndig aus

ballonierten Zellen zusammengesetzt ist (HEAD et al. 2003).

Bei den Tumoren, die vom Gallengangsepithel ausgehen, werden das Cholangiom

und das Cholangiokarzinom unterschieden. Das Cholangiom findet sich vor allem in

Lebern lterer Hunde. Cholangiome treten intrahepatisch auf, selten extrahepatisch

und erscheinen als solide oder zystische Tumore (STALKER u. HAYES 2007). Das

Wachstumsverhalten der Gallengangskarzinome ist solide oder multinodulr

(STALKER u. HAYES 2007) und besitzt hufig ein ausgeprgtes fibrses Stroma

(CULLEN 2007a). Hmatogene Metastasen sind selten, Metastasen in regionale

Lymphknoten dagegen hufig. Das Wachstumsverhalten ist sehr invasiv. Die

Abgrenzung zu anderen metastatischen Adenokarzinomen ist mitunter sehr

schwierig. (STALKER u. HAYES 2007).

Das Hepatoblastom ist ein Tumor ausgehend von pluripotenten Vorluferzellen,

welcher sowohl bei alten als auch bei jungen Hunden vorkommt (STALKER u.

HAYES 2007).

Tumoren, die aus neuroendokrinen Zellen der Leber oder der Gallengnge

hervorgehen, nennt man hepatische Karzinoide. Diese sind gekennzeichnet durch

ein besonders aggressives Wachstumsverhalten in Form von stark infiltrativem

54 2 Literaturbersicht

Wachstum und Metastasenbildung in lokale Lymphknoten und das Peritoneum.

Typischerweise sind die Tumorzellen nesterartig arrangiert, durchzogen von

Bindegewebssepten (HEAD et al. 2003; STALKER u. HAYES 2007). Hepatische

Karzinoide mssen von metastatischen Tumoren des Nebennierenmarkes

abgegrenzt werden (HEAD et al. 2003).

Primre mesenchymale Tumoren der Leber knnen von Bindegewebe der glatten

Muskulatur oder den Endothelzellen ausgehen. Sowohl gutartige Leiomyome als

auch maligne Leimyosarkome und Fibrosarkome treten auf. Hmangiome und

Hmang