bernard charley les interf©rons

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A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T

Etude des cellules productrices d’interféronde type I dans la lymphe drainant les muqueuses

oro-nasales ou la peau chez le mouton

Bernard CHARLEYINRA, Virologie et immunologie moléculaires, Jouy-en-Josas

Acad. Vét. Fr.

06/05/10




Les interférons

! 1ère cytokine décrite : 1957!

! plus de 100 000 publications!

! Famille de protéines capables d’induire dans les cellulessensibles un état de résistance à un large spectre devirus

! IFN de type I : !, ", #, $,%, &

! IFN de type II (IFN '), de type III

! récepteurs, effets biologiques, usages thérapeutiques

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IFNs et infections virales

! en majorité IFN-!/", produits par les leucocytes, eten moindre part l’IFN –" produit par les cellules infectées(épithéliales etc…)

! marqueur précoce d’infection (quelques heures)

( valeur diagnostique du dosage d’interféron sérique

! propriétés antivirales: in vitro et in vivo

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Mécanismes viraux inducteurs d’IFN-!

- acides nucléiques

ARN et ADN viraux, ou analogues oligonucléotidessynthétiques («ODN»), par liaison aux récepteurs cellulaires(TLR, …)

- glycoprotéines virales

ex. glycoprotéine M du coronavirus GET

- complexes immuns

ex. complexe poliovirus + Ig

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Cellules productrices IFN-!

! macrophages, cellules dendritiques

! cellules dendritiques plasmacytoïdes (PDC; homme,souris: 1999): très fortes productrices d’IFN (1000 fois plus queles autres)

" faible fréquence (<0,1%)

" ni T, ni B, ni NK, ni monocyte; CMH classe II+,présentatrices d’antigènes

" morphologie « plasmacytoïde »

" sang, organes lymphoïdes, + peau, muqueuses




PDC in vivo

! Homme, souris: étude des PDC dans le sang, la rate

! MAIS: les infections virales débutent au niveau desmuqueuses (aéro-digestives, uro-génitales, …) ou de lapeau (morsure, piqure)

( Besoin de modèles d’étude des phases précoces deproduction d’IFN au site initial de l’infection

! intérêt des modèles animaux domestiques (taille,approche chirurgicale, …)

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Etude des cellules productrices d’IFN-!

in vivo: modèle entérite virale

coronavirus porc

! forte production IFN-! quelques heures p.i.

! présence séquentielle de cellules productrices d’IFN-!dans le tube digestif (site primaire de réplication virale):villosités, puis plaques de Peyer et ganglionsmésentériques

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1.1. Villosités Villosités jejunumjejunum

(Riffault et al, 2001)

6h 6h p.ip.i..

2. Ganglion mésentérique2. Ganglion mésentérique

18h 18h p.ip.i..

((interfolliculaireinterfolliculaire))

=> Hypothèse: migration du tissu versganglion drainant par voie lymphatique

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Hypothèse: migration des cellules dendritiques plasmacytoïdes,productrices d’IFN-!, du site d’induction (ex. muqueuse) vers les

ganglions drainants

! démarche expérimentale: canulation lymphatique afférentemouton, induction in vivo d’IFN-!, suivi cinétique

! canulation « pseudo-afférente » pour collecte et suivi en temps réel

des cellules en migration des tissus vers les ganglions drainants

" canulation cervicale = muqueuses de la face

" canulation prescapulaire = territoire cutané




Résection ganglionnaire 2 mois Canulation

lymphe

canal

trachéal

parotidien

rétropharyngien

latéralmandibulaire

anastomosesrétropharyngien

médian

• 2 mois; 5-15 ml/h; 4-14x106 /ml

• 60% CD4; 11% CD8; 13% B; 1,3% CD

Accès aux cellules migrant des muqueuses de la face vers les ganglions drainants:

canulation cervicale (Isabelle Schwartz-Cornil et Michel Bonneau, INRA Jouy)

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SC,ID, IM

CpG ODN, 4mg/animal/2ml

0.1ml/point

Lymphe collectée > 3 jours

• surnageants –> détection IFN

• cellules cultivées -> détection IFN

Le modèle expérimental:

injection oro-nasale ou cutanée d’ODN (D32); recherche IFN etcellules productrices, dans lymphe cervicale ou pré-scapulaire




! oligonucléotide (ODN) synthétique inducteur d’IFN-!: D32 (de type A;BioSource Int.)

20 nucléotides, un motif CpG non méthylé

! titrage biologique IFN: effet antiviral sur cellules MDBK+VSV

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Présence précoce d’IFN dans la lymphe afférente

1. Après administration oro-nasale d’ODN: cinétique IFN dans lymphe cervicale

0

50

100

150

200

250

300

350

O O-4 4-19 19-26 26-44 44-52 52-66

0

100

200

300

400

500

600

700

0 0-4 4-18 18-26 26-44 44-92

IFN

(U

/ml)




IFN

(U

/ml)

(Résultats représentatifs de 8 expériences)

C0

20

40

60

80

100

120

0 0-5 5-20 20-28 28-44 44-48 48-53 53-69

2. Après administration cutanée d’ODN: cinétique IFN dans lymphe prescapulaire

! Production précoce d’IFN (5h pi), détectable pendant 2-3 jours,dans la lymphe drainant le site d’injection => recherche des cellulesproductrices dans la lymphe

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Cellules productrices d’IFN dans la lymphe afférente

• mise en culture des cellules de lymphe; mesure de l’IFN secrété

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0

20

40

60

80

100

120

0 0-4 4-19 19-26 26-44 44-52 52-66

n.d.

" cellules productricesd’IFN dans la lymphecervicale aprèsinjection mucosaled’ODN

" cellules productricesd’IFN dans la lympheprescapulaire aprèsinjection cutanéed’ODN

n.d.




! Validation de notre hypothèse: après administration d’un

agent inducteur d’IFN, la production d’IFN débute au site

d’injection (muqueuse, peau), les cellules productrices

quittent ce site et migrent par voie lymphatique vers les

ganglions

(Pascale et al, 2008)

! Quelles sont ces cellules?

! Tris de cellules lymphatiques, puis induction in vitro par ODN

et mesure de l’IFN produit

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Tris immunomagnétiques et production d’IFN in vitro

LympheGradient de densité

(enrichissement en DC)

+ anticorps (CD11c,

CD45RB, CD14, anti B …),

et tris immunomagnétiques

Induction in vitro

avec ODN

Titrage

biologique IFN :effet antiviral -

+




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IFN

U/m

l

0

100

200

300

CD11c

- +

DEC205 B cell

1000

10000

- + - + - +

CD14 CD45RB

100000

- +

Lymphe

- +

Sang

Après tri immunomagnétique, les cellules productrices d’IFN setrouvent dans les fractions CD11cneg, DEC205neg (= pas DCclassique), non B, CD14neg (= non monocyte), mais CD45RBpos

(marqueur PDC souris)

-

10




Cellules productrices d’IFN de la lymphe

! de faible densité, CD11cneg, DEC205neg, non B,

CD14neg, CD45RBpos

! après tri CD11cneg, Bneg, CD45RBpos (<1% des cellules):

" CD3neg

" expression des ARNm TLR7 et 9 (détecteurs d’ac.

nucléiques) et IRF7 (transcription des IFN)

" morphologie « plasmacytoïde »

( Ce sont des cellules dendritiques plasmacytoïdes

(Pascale et al , 2008)

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Conclusions

! Phase précoce de production d’IFN et localisation des cellulesproductrices: muqueuses ou peau, sites primaires d’infection virale

! Migration par voie lymphatique des cellules productrices, cellulesdendritiques plasmacytoïdes, du site d’induction vers les ganglionsdrainants

( effet sur les effecteurs des réponses immunes antivirales (CTL,Th, Ac)

( Ciblage des PDC en vaccination?

! Première caractérisation des PDC ovines

! Première démonstration de la capacité des PDC à migrer par voielymphatique (contraire aux résultats publiés chez les rongeurs: Yrlid etal, 2006)

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Perspectives

Travaux en cours sur le rôle de ces cellules dans

la pathogénèse de la fièvre catarrhale ovine

(insecte piqueur): production IFN chez moutons

infectés; mécanismes d’induction (I. Schwartz-

Cornil, B. Charley et collaborateurs)

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Remerciements aux membres de l’équipe «!Immunobiologie des

viroses!» (unité VIM, INRA, Jouy-en-Josas),

notamment Isabelle Schwartz-Cornil et Florentina Pascale,

au centre de recherche en imagerie interventionnelle (Michel Bonneau)

et à l’unité commune d’expérimentation animale (INRA, Jouy)

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