Institutionen för fysik, kemi och biologi

Examenarbete

Bestämning av syntetiska cannabinoider med

gaskromatografi-masspektrometri

Sandra Pettersson

2011-06-07

LITH-IFM-G-EX--11/2475--SE

Linköpings universitet Institutionen för fysik, kemi och biologi

581 83 Linköping

Institutionen för fysik, kemi och biologi

Bestämning av syntetiska cannabinoider

med gaskromatografi-masspektrometri

Sandra Pettersson

Examensarbetet utfört vid Klinisk kemi,

Sahlgrenska universitetssjukhuset, Göteborg

2011-06-07

Handledare

Henrik Ryberg

Examinator

Roger Sävenhed

Avdelning, institution Division, Department

Chemistry

Department of Physics, Chemistry and Biology

Linköping University

URL för elektronisk version

ISBN

ISRN: LITH-IFM-G-EX--11/2475--SE _________________________________________________________________

Serietitel och serienummer ISSN Title of series, numbering ______________________________

Språk Language

Svenska/Swedish

Engelska/English

________________

Rapporttyp Report category

Licentiatavhandling

Examensarbete

C-uppsats

D-uppsats

Övrig rapport

_____________

Titel

Title

Bestämning av syntetiska cannabinoider med gaskromatografi-masspektrometri

(Determination of synthetic cannabinoids by gas chromatography-mass spectrometry)

Författare Author

Sandra Pettersson

Nyckelord Keyword

Syntetiska cannabinoider, Spice, JWH-018, JWH-073, GC-MS

(Synthetic cannabinoids, Spice, JWH-018, JWH-073, GC-MS)

Sammanfattning Abstract

This thesis has been performed at Clinical Chemistry at Sahlgrenska University Hospital in Gothenburg. The purpose of the project was to investigate new and alternative ways to determinate synthetic cannabinoids by gas chromatography-mass

spectrometry. Currently, the possibilities to quantify synthetic cannabinoids are very limited. This can lead to an increased

use of synthetic cannabinoids as the risk of detection is low, which may be known by drug users. The synthetic cannabinoids are sold mixed with different herbs and have varying names like Spice Gold, Spice Silver, K2, Smoke and Pot-pourri.

The synthetic cannabinoids analyzed were JWH-018 and JWH-073, which are commonly found in seized Spice material. At intake of these drugs, usually through smoking, cannabis-like effects arise. This is because they bind to cannabinoid

receptors in a similar way as THC does, which is the primary active cannabinoid of cannabis.

For urine samples an analytical method would probably be the most sensitive if the major metabolite could be analyzed, as it is expected to be present in high concentrations in this sample type. Since information regarding the metabolism of synthetic

cannabinoids is very limited there may be reasons to analyze the mother substance in urine. Further, in plasma and serum

samples the mother substance is expected in high concentrations. Thus different ways to detect JWH-018 and JWH-073 directly were investigated in this project.

Derivatization of JWH-018 and JWH-073 was the first step to get more selective and sensitive GC-MS analysis. Different derivatization-reagents were investigated, for example BSTFA and TFAA. The results show that the derivatization of JWH-

018 with BSTFA after reduction and extraction was successful. To achieve this, samples had to be heated at 115°C for 1-3

hours, but still the samples were not completely derivatized. The results indicate that JWH-substances are difficult to derivatized, but they are possible to derivatize with BSTFA. This

could mean that a GC-MS-method maybe could be established for these substances, preferably trough TFAA-derivatization.

Datum

Date

2011-06-07

Sammanfattning Detta examensarbete har utförts på Klinisk Kemi på Sahlgrenska universitetssjukhuset i

Göteborg. Syftet var att undersöka nya och alternativa sätt för att bestämma syntetiska

cannabinoider med gaskromatografi-massepktrometri. För närvarande saknas möjligheter att

kvantifiera dessa ämnen. Detta kan leda till en ökad användning då risken för upptäckt är

mindre, vilket till viss del är känt inom missbrukskretsar. De syntetiska cannabinoiderna säljs

som ”örtblandningar” och har varierande namn som bland annat Spice Gold, Spice Silver, K2,

Smoke och Pot-pourri.

De syntetiska cannabinoiderna som har analyserats var JWH-018 och JWH-073, vilka är

vanligt förekommande i beslagtaget Spice-material. Vid intag av dessa cannabinoider, som

oftast sker genom rökning, uppnås cannabisliknande effekter. Detta på grund av att de binder

till cannabinoidreceptorerna likt THC, som är den primära aktiva substansen i cannabis.

För urinprover skulle en mätmetod antagligen bli känsligast om huvudmetaboliten kunde

analyseras, då denna förväntas förekomma i högst koncentrationer. Med tanke på att

informationen om metabolisering av syntetiska cannabinoider är mycket begränsad så kan det

finnas anledning att även mäta modersubstansen i urin. I provtyper som plasma och serum

förväntas däremot modersubstansen förekomma i högst koncentrationer. I detta arbete

försökte därför olika sätt utvecklas för att detektera modersubstanser för syntetiska

cannabinoider.

Derivatisering av JWH-018 och JWH-073 var ett första steg att gå till väga för att få

substanserna mer selektiva och känsliga för GC-MS. Olika derivatiseringsreagens testades, till

exempel BSTFA och TFAA. Resultaten visade att derivatisering med hjälp av BSTFA för

JWH-018 efter reducering och fasseparering lyckades. Detta om proverna stod 1-3 timmar i

värmeugnen och temperaturen höjdes upp till 115 °C, dock gav det ingen fullständig

derivatisering. Temperaturen var den faktorn som påverkade mer än vad tiden i värmeugnen

gjorde.

Utifrån resultaten visade det sig att JWH-substanserna är svårderivatiserade, men att det går

att derivatisera med BSTFA och i en förlängning skulle kanske en GC-MS-metod kunna

etableras för dessa substanser, främst med TFAA-derivatisering.

Abstract

This thesis has been performed at Clinical Chemistry at Sahlgrenska University Hospital in

Gothenburg. The purpose of the project was to investigate new and alternative ways to

determinate synthetic cannabinoids by gas chromatography-mass spectrometry. Currently, the

possibilities to quantify synthetic cannabinoids are very limited. This can lead to an increased

use of synthetic cannabinoids as the risk of detection is low, which may be known by drug

users. The synthetic cannabinoids are sold mixed with different herbs and have varying names

like Spice Gold, Spice Silver, K2, Smoke and Pot-pourri.

The synthetic cannabinoids analyzed were JWH-018 and JWH-073, which are commonly

found in seized Spice material. At intake of these drugs, usually through smoking, cannabis-

like effects arise. This is because they bind to cannabinoid receptors in a similar way as THC

does, which is the primary active cannabinoid of cannabis.

For urine samples an analytical method would probably be the most sensitive if the major

metabolite could be analyzed, as it is expected to be present in high concentrations in this

sample type. Since information regarding the metabolism of synthetic cannabinoids is very

limited there may be reasons to analyze the mother substance in urine. Further, in plasma and

serum samples the mother substance is expected in high concentrations. Thus different ways

to detect JWH-018 and JWH-073 directly were investigated in this project.

Derivatization of JWH-018 and JWH-073 was the first step to get more selective and sensitive

GC-MS analysis. Different derivatization-reagents were investigated, for example BSTFA

and TFAA. The results show that the derivatization of JWH-018 with BSTFA after reduction

and extraction was successful. To achieve this, samples had to be heated at 115 °C for 1-3

hours, but still the samples were not completely derivatized.

The results indicate that JWH-substances are difficult to derivatized, but they are possible to

derivatize with BSTFA. This could mean that a GC-MS-method maybe could be established

for these substances, preferably trough TFAA-derivatization.

Förord

Denna rapport är ett examensarbete som omfattar 16 hp. Det är den avslutande delen för

högskoleingenjörsprogrammet i kemisk analysteknik vid Linköpings universitet.

Jag vill tacka min handledare Henrik Ryberg för att jag har fått möjlighet att utföra mitt

examensarbete på Sahlgrenska universitetssjukhuset.

Jag vill även ge ett stort tack till Roger Sävenhed som tog sig tid att vara min examinator och

som har inspirerat och hjälpt till på många sätt under min studietid på LiU.

Till sist tack till min familj och vänner som har varit ett stort stöd under studietiden.

Linköping, 2011-05-24

Sandra Pettersson

Förkortningar GC-MS gaskromatografi-masspektrometri

CP47,497-C6 5-(1,1-dimetylhexyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol

CP47,497-C7 5-(1,1-dimetylheptyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol

CP47,497-C8 5-(1,1-dimetyloktyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol

CP47,497-C9 5-(1,1-dimetylnonyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol

JWH-018 naftalen-1-yl-(1-pentylindol-3-yl)-metanon

JWH-073 naftalen-1-yl-(1-butylindol-3-yl)-metanon

HU-210 (6aR,10aR)- 9-(hydroxymetyl)- 6,6-dimetyl- 3-(2-metyloktan-2-

yl)- 6a,7,10,10a-tetrahydrobenso[c]kromen- 1-ol

JWH-250 2-(2-metoxyfenyl)-1-(1-pentylindol-3-yl)-etanon

THC ∆-9-tetrahydrocannabinol

CB1/ CB2 cannabinoidreceptor-1/cannabinoidreceptor-2

EI elektronimpaktjonisering

NCI negativ kemisk jonisering

PCI positiv kemisk jonisering

BSTFA bis-(trimetylsilyl)-trifluoroacetamid

TFAA trifluorättiksyraanhydrid

NaBH4 natriumborhydrid

MeOH metanol

HOX hydroxylaminhydroklorid

MOX metoxylaminhydroklorid

Innehållsförteckning

1 Introduktion ........................................................................................................................ 1

1.1 Syfte ............................................................................................................................. 1

1.2 Metod .......................................................................................................................... 1

1.3 Begränsningar ............................................................................................................ 1 2 Bakgrund ............................................................................................................................ 2

2.1 Cannabis ...................................................................................................................... 2

2.2 Syntetiska cannabinoider .......................................................................................... 3

2.3 Cannabinoidernas farmakologi ................................................................................. 5

2.3.1 Cannabinoidreceptorer ...................................................................................... 5

2.3.2 Cannabis-metaboliter ......................................................................................... 6

2.3.3 Metaboliter av JWH-018 och JWH-073 ............................................................. 6

2.4 Laboratorieanalyser för att påvisa cannabinoider .................................................. 7 3 Generell beskrivning av använda metoder ......................................................................... 8

3.1 Gaskromatografi ......................................................................................................... 8

3.1.1 Kolonnen ............................................................................................................. 8

3.1.2 Mobilfasen ........................................................................................................... 9

3.1.3 Injiceringsteknik – On-column .......................................................................... 9

3.2 Masspektrometer som detektor vid GC-analys ..................................................... 10

3.2.1 Joniseringstekniker .......................................................................................... 11

3.3 Derivatisering ........................................................................................................... 12

4 Experimentellt .................................................................................................................. 14

4.1 Lösningar .................................................................................................................. 14

4.2 Instrumentella betingelser ...................................................................................... 14

4.2.1 GC-MS system .................................................................................................... 14

4.3 Metod ........................................................................................................................ 14 5 Resultat ............................................................................................................................. 17

6 Diskussion ........................................................................................................................ 22

7 Slutsats och vidareutveckling ........................................................................................... 24

Referenser ................................................................................................................................. 25

Bilaga 1. Strukturformler för derivatiseringsreagens som huvudsakligen använts i projektet 28

Bilaga 2. Resultat av oderivatiserat JWH-073 ......................................................................... 29

Bilaga 3. Resultat av oderivatiserat JWH-018 ......................................................................... 30

1

1 Introduktion

1.1 Syfte Att kunna detektera syntetiska cannabinoider i prover så som urin och plasma är av stor

betydelse inom missbruksvården. För nuvarande saknas möjligheter att kvantifiera dessa

ämnen på ett tillfredsställande sätt, vilket till viss del är känt inom missbrukskretsar. Man kan

därför förvänta en ökad användning av sådana droger eftersom risken för upptäckt är mindre.

Syftet med examensarbetet var att undersöka nya och alternativa sätt för att detektera

syntetiska cannabinoider i biologiska prov med hjälp av gaskromatografi-masspektrometri. I

en förlängning skulle detta kunna innebära nya analysmetoder för syntetiska cannabinoider i

urin och plasma.

1.2 Metod Efter att ha gjort en preliminär projektplan inleddes projektet med litteratursökning.

Information om cannabinoider och syntetiska cannabinoider söktes samt provupparbetnings-

och analysmetoder. För att få önskvärd selektivitet och känslighet provas olika

derivatiseringsreagens och joniseringstekniker för substanserna.

För att få en inblick i hur det laborativa arbetet för en analysmetod fungerar studerades en

urinanalys-metod för cannabis som används på Klinisk Kemi på Sahlgrenska

univeristetssjukhuset. De initierande försöken för de syntetiska cannabinoiderna utgick från

deras cannabis-metod och modifierades efter hand. Rapporten skrevs kontinuerligt under

arbetets gång.

1.3 Begränsningar Tre olika substanser valdes ursprungligen ut, cannabicyklohexanol (CP47,497-C8), JWH-018

och JWH-073, då dessa syntetiska cannabinoider har visat sig vara vanligt förekommande i

beslagtaget Spice-material (1). Men på grund av ändrad lagstiftning i Kanada så försenades

leveransen av cannabicyklohexanol och denna substans uteslöts därför vidare ur

utvecklingsarbetet.

I urin kan man förvänta sig att metaboliter av JWH-018 och JWH-073 finns i högre

koncentrationer än ursprungssubstanserna, men när detta projekt startade var kunskapen om

metaboliseringen av de flesta syntetiska cannabinoider väldigt begränsad. Därför begränsades

projektet till att endast omfatta de ometaboliserade modersubstanserna.

2

2 Bakgrund

2.1 Cannabis Cannabis utvinns ur växten Cannabis sativa (figur 1). Plantan kan bli 5-6 meter hög och trivs

bäst i subtropiskt torrt klimat. Cannabis har tidigare odlats legalt i många västländer, främst

för framställning av hampfibrer till rep. EU kan tillåta odling av speciell hampa, ”fiberhampa”,

som får användas för framställning av fibrer för bland annat textil. Odling av cannabis får

endast ske under mycket sträng kontroll och privat odling för drogframställning är straffbart

(2).

Cannabinoiderna brukar delas in i tre olika huvudgrupper: örtcannabinoider som man enbart

finner i cannabisplantan, endogena cannabinoider som produceras naturligt i kroppen och

syntetiska cannabinoider som tillverkas på laboratorium. Fler än 61 olika cannabinoider har

identifierats i cannabisplantan. ∆-9-tetrahydrocannabinol, cannabinol och cannabidiol är de

vanligast förekommande cannabinoiderna. Den primära aktiva cannabinoiden som ger upphov

till ett psykotiskt rus är ∆-9-tetrahydrocannabinol, kallad THC (3). Ur cannabis framställs tre

huvudtyper av drogberedningar, marijuana, haschisch (hasch) samt cannabisextrakt.

Marijuana förekommer i växtform där plantan efter skördning torkas för att sedan

söndersmulas eller malas ner. Det intas främst genom rökning i ren form eller blandat med

tobak i cigaretter, så kallade joints. Haschisch (hasch) förekommer i kådform där kådan kan

pressas till kakor som kan ätas eller rökas. Kvaliteten, det vill säga THC-halten, varierar

beroende på vilken teknik som används vid framställningen. Haschkakorna är ibland

stämplade med tillverkarens märke. Hasch i pulverform kan också påträffas men är ovanlig i

Sverige. Pulvret sväljs direkt eller blandas i drinkar. Cannabisextrakt framställs genom att

växtdelar läggs i lösningsmedel för att laka ur THC-innehållet. Efter filtrering indunstas

lösningsmedlet och man får en sirapsliknande lösning med obehaglig lukt. Cannabisextraktet

kan intas genom att det droppas på tobak och därefter röks. Cannabisextrakt är ganska

ovanliga på den illegala narkotikamarknaden (2).

Figur 1. Cannabis sativa

3

Effekterna börjar märkas inom ett par minuter vid rökning och vid oralt intag kan det ta upp

till ett par timmar. Ruseffekten liknar eufori (lyckorus) och avkoppling, och varar några

timmar. Det kan även ge muntorrhet, röda ögon, pratsamhet, sömnrubbningar,

koncentrationsproblem och försämrat när- och långtidsminne. Effekterna varierar med dosen,

administrationssättet, miljön och individens personlighet (4) (5). Vid långvarigt missbruk

förvärras effekterna genom att missbrukaren då kan få abstinenssymptom i form av

depression, hallucinationer, verklighetsuppfattningsstörning och psykoser. Även

sinnesintrycken förvrängs och syn- och hörselupplevelserna påverkas, särskilt upplevelsen av

musik och rytm, färg och form (2).

2.2 Syntetiska cannabinoider Syntetiska cannabinoider, även ”Spice”, är syntetiska substanser som aktiverar

cannabinoidreceptorer (läs mer i avsnitt 2.3.1 om cannabinoidreceptorer) och ger därmed ett

cannabisliknande rus. Dessa verkar alltså på ett liknande sätt som det i cannabis naturligt

förekommande THC. Ett vanligt tillvägagångssätt är att syntetiska cannabinoider blandas med

ett lösningsmedel och sprayas på örter och säljs som ”örtblandning” eller ”rökelse” med

varierande namn som till exempel Spice Gold, Spice Silver, Spice Diamond, Smoke, Ocean

Blue, Genie, Pot-pourri och K2 där styrkan sägs vara skillnaden (6) (7). I beslagtagna

blandningar har ett stort antal olika syntetiska cannabinoider identifierats. De vanligast

förekommande är JWH-018, JWH-073 och CP47,497 (8). Ett företag från Frankfurt i

Tyskland, THC-Pharma GmbH, var bland de första att identifiera JWH-018 som en primär

psykoaktiv komponent i Spice och efter det har många andra laboratorier bekräftat

förekomsten av syntetsika cannabinoider i Spice-blandningar (9). Syntetiska cannabinoider är

eftertraktade av både unga personer som är nyfikna på droger och vana cannabismissbrukare.

Att det används av cannbismissbrukare kan bero på att de vill undgå att bli testade positiv, då

syntetiska cannabinoider inte kan påvisas vid rutin-drogtester. På grund av eftersläpande

lagstiftning och skillnader i lagstiftning mellan olika länder kan en del syntetiska

cannabinoider fortfarande vara legala. Efter förslag från Statens Folkhälsoinstitut har

regeringen beslutat att klassificera vissa substanser som narkotika eller som hälsofarlig vara,

detta på grund av snabb spridning och ökat missbruk av Spice. Den 15 september 2009

klassades sju olika Spice-substanser som olagliga i Sverige: CP47,497-C6, CP47,497-C7,

CP47,497-C8, CP47,497-C9, JWH-018, JWH-073 och HU-210 (10). Ett år senare klassades

ytterligare åtta substanser som olagliga (11). Efter lagstiftningen krävs tillstånd från

Läkemedelsverket för att få importera, tillverka, exportera, handla eller inneha substanserna

för vetenskapligt ändamål (10). Det syntetiska alternativet till cannabis har relativ stor

spridning, de är åtkomliga på Internet och det är inga eller bara ett fåtal kontroller på

webbsidorna. Dessa cannabinoider kan betraktas som nya ”designer drugs”. Tillverkarna

fortsätter producera nya substanser och ligger alltid ett steg före lagen (12).

Nedan följer en tabell över huvudsubstanserna som har identifierats i Spice inklusive THC,

vilka, förutom CP47,497, även är de substanser som analyserats i detta projekt.

THC och de syntetiska cannabinoiderna är CB1 och CB2 agonister och är fettlösliga, opolära

och små molkeyler med ungefär 20-26 kolatomer. De är rätt flyktiga och därmed rökbara (13).

4

Tabell 1. Information om THC, CP47,497, JWH-018 och JWH-073

THC

Systematiskt namn: ∆-9-tetrahydrocannabinol

Kemisk formel: C21H30O2

Molvikt: 314,45 g/mol

Ki-värde: (bindnings-affiniteten): 10,2 nM (för CB1)

(13)

THC kallas även Δ-9-tetrahydrocannabinol och är det

huvudsakliga aktiva ämnet i cannabis. THC är fettlösligt

och tas upp och lagras i små mängder i fettvävnader i

kroppen. Det är en partiell agonist till CB1.

CP47,497

Systematiskt namn:

2-[(1R, 3S)-3-hydroxycyklohexyl]-5-(2-

metyloktan-2-yl)fenol

Kemisk formel: C21H34O2

Molvikt: 318,492 g/mol

Ki-värde: 9,54 nM (13)

CP47,497 är en cyklohexylfenol och identifierades

kort efter JWH-018 (12) och är jämförbar eller mer

potent än THC (14). Det är en potent och selektiv

CB1-agonist.

JWH-018

Systematiskt namn:

Naftalen-1-yl-(1-pentylindol-3-yl)metanon

Kemisk formel: C24H23NO

Molvikt: 341,45 g/mol

Ki-värde: 9 nM för CB1 (13)

JWH-018 är den första substansen som

rapporterades som aktiv substans i Spice, 2008 i

Tyskland (12). Substansen tillhör gruppen

aminoalkylindol. Den är potent och selektiv CB2-

agonist och en potent CB1-agonist.

JWH-073

Systematiskt namn:

Naftalen-1-yl-(1-butylindol-3-yl)metanon

Kemisk formel: C23H21NO

Molvikt: 327,42 g/mol

Ki-värde: 8,9 nM (13)

JWH-073 är också en aminoalkylidol (en alkyl-

homolog av JWH-018) och agerar som en agonist

för både CB1 och CB2. Den binder med högre

affinitet till CB1 än vad THC gör.

5

2.3 Cannabinoidernas farmakologi

2.3.1 Cannabinoidreceptorer

En receptor är en proteinmolekyl som binder en specifik signalsubstans, kallad ligand, och

vidarebefordrar signaler. Det finns specifika receptorer för cannabinoider. Det är de tre

huvudgrupperna av cannabinoider, örtcannabinoider, endogena (kroppsegna) cannabinoider och syntetiska cannabinoider, som aktiverar cannbinoidreceptorerna. När dessa binder till

receptorerna ger det upphov till farmakologiska effekter. Två huvudtyper av

cannabinoidreceptorer har identifierats, CB1 och CB2 där CB1 finns i hjärnan och orsakar de

psykiska effekterna och CB2 huvudsakligen i immunsystemet (15). Både CB1 och CB2 är G-

proteinkopplade receptorer, som är den största familjen av receptorer. När G-

proteinreceptorerna aktiveras av THC leder det till att nervcellens aktivitet dämpas vilket ger

upphov till cannabiseffekterna (16). THC är en partiell agonist för CB1- och CB2-receptorer.

En partiell agonist aktiverar en receptor men det medför inget maximalt svar medan en full

agonist utlöser ett maximalt svar (17).

Figur 2. Aktiva substanser i cannabis som föreställer nycklar passande i nyckelhålen som ska föreställa

cannabinoidreceptorerna, där CB1 främst finns i hjärnan och CB2 i immunsystemet.

* Cannabidol passar inte direkt till CB1 och CB2 men har indirekta effekter som fortfarande studeras.

Man kan säga att cannabidiol är en indirekt antagonist för cannabinoid agonister.

Man började förstå att endocannabinoider måste finnas då man visste om existensen av

cannabinoidreceptorerna i hjärnan. De två främsta kroppsegna cannabinoiderna, vilka

identifierades efter örtcannabinoiderna, är anandamid och 2-arakidonoylglycerol (figur 3) (18).

Endocannabinoider är lipider. Anandamid metaboliseras lätt och har därför inte samma

påverkningar på hjärnan som THC. Anandamid är en partiell agonist och 2-

arakidonoylglycerol är en full agonist för både CB1 och CB2. Dessa finns inte lagrade i

kroppen utan produceras och frisätts vid behov (19).

6

Figur 3. Kemisk struktur för (A) Anandamide och (B) 2-arakidonoylglycerol

2.3.2 Cannabis-metaboliter

Efter intag sprids THC i kroppen. Det är fettlösligt och går snabbt över till hjärnan och

distribueras främst till fettvävnader där det lagras. På grund av fettlösligheten sker

omsättningen långsammare än för till exempel alkohol. Cannabis metaboliseras i levern.

Successivt släpps substansen ut från fettvävnaderna och THC oxideras först till dess aktiva

metabolit 11-OH-THC och sedan vidare till THC-COOH (11-nor-∆-9-karboxylsyra), se figur

4. Därefter konjugeras THC-COOH med en glukuronidgrupp för att få substansen vattenlöslig

och möjliggöra utsöndring via urin (20). THC metaboliterna frigörs långsamt från vävnaderna

och därför kan urinprover vara positiva under lång tid efter intag utan att ge upphov till

ruseffekter (4).

Figur 4. Strukturformler för (A) THC som vid metabolisering oxideras först till

(B) 11-OH-THC och sedan vidare till (C) THC-COOH

2.3.3 Metaboliter av JWH-018 och JWH-073

Både JWH-018 och JWH-073 metaboliseras via oxidation och glukoronid-konjugering (21).

Det finns lite information och redovisning om identifiering av hydroxylerade/konjugerade

metaboliter av aminoalkylindoler. Ur en artikel från 20 april 2011 publicerad av American

Chemical Society har resultat visat att efter intag av JWH-018 har glukuronerade konjugat av

7

5-(3-(1-naftoyl)-1H-indol-1-yl)-pentansyra och (1-(5-hydroxypentyl)-1H-indol-3-yl)(naftalen-

1-yl)-metanon utsöndras. Metabolit-profilerna som genererades då en person konsumerade en

blandning av JWH-018 och JWH-073 gav liknande profil som när endast JWH-018 intogs.

Oxiderade metaboliter av JWH-018 och JWH-073 gav samma mönster men JWH-018

metaboliterna utsöndrades vid lägre koncentration. Bristen på referenssubstanser för

metaboliter av syntetiska cannabinoider har hindrat utvecklingen av standardiserade

analysmetoder för kliniska och kriminaltekniska laboratorier (9).

2.4 Laboratorieanalyser för att påvisa cannabinoider Att med laboratorieanalys påvisa droger är arbetskrävande, relativt kostsamt och kräver oftast

specialiserad utrustning såsom masspektrometri. Ett vanligt förfarande är därför att använda

en billigare, enklare och mindre selektiv metod för att sålla ut prover. En sådan metod kallas

vanligen för screening, men även begreppet sållning används. För cannabis baseras

sållningsmetoden på immunologiska metoder där antikroppar identifierar THC-COOH. Den

efterföljande kvantifieringen kallas verifiering, vilken oftast utförs med hjälp av GC-MS. Till

verifiering går de positiva screeningresultaten (4). GC-MS (mer generell beskrivning om GC-

MS beskrivs i avsnitt 3) är en analytisk teknik för separation, kvantifiering och identifiering

av till exempel droganalyter, speciellt vid låga koncentrationer. Denna bestämning har hög

selektivitet och känslighet. Syftet med verifieringen är att man vill minimera antalet falskt

positiva prover, ge ytterligare information om identitet och försäkran om identiteten för det

detekterade provet (22). GC-MS har visat sig vara en mycket känslig och reproducerbar

metod och är på många laboratorier det huvudsakliga verktyget för verifiering av droger i urin.

De flesta föreningarna i urin är konjugerade och ej flyktiga och måste därför dels hydrolyseras

och dessutom derivatiseras innan analys med GC (23).

Drogtester för detektion av syntetiska cannabinoider i urin är för närvarande inte helt

utvecklat, utan dessa passerar vanligtvis oupptäckta vid missbruksanalyser. Det vanligaste för

droger när de analyseras i urin är att modersubstansen förekommer i lägre koncentrationer än

många metaboliter och då kan man förlita sig på att mäta den metaboliserade varianten av

drogen som förekommer i högst koncentrationer, den så kallade huvudmetaboliten.

Kunskapen om hur syntetiska cannabinoider metaboliseras är fortfarande inte så välutvecklad,

men föreslagna hydroxylerade och karboxylerade metaboliter av JWH-018 och JWH-073

finns (21). I vissa laboratorium finns metoder för detektion av syntetiska cannabinoider i blod

(24).

Redwood Toxicology Laboratory har gjort analyser för syntetiska cannabinoider i urin och i

oral vätska. För syntetiska cannabinoider i urin har de inga cut-off nivåer, så för JWH-018 och

JWH-073 redovisas resultat som ”detekterad” eller ”inte detekterad”. I oral vätska har

kvantitativa tester redovisats och cut-off nivån där är 0,5 ng/mL för JWH-018, JWH-073 och

JWH-250. De har även redovisat att metaboliter av JWH-018 och JWH-073 i urin kan

detekteras upp till 72 timmar efter intag av enstaka låg dos. Huvudsubstanser i oral vätska går

att detektera 24-48 timmar efter intag (21).

8

3 Generell beskrivning av använda metoder

3.1 Gaskromatografi Gaskromatografi är en kromatografisk metod som separerar i huvudsak olika lågmolekylära

föreningar som färdas med olika hastighet genom en kolonn beroende på deras fysikaliska

egenskaper såsom kokpunkt och polaritet. En gaskromatograf (se figur 5) består av en

injektionsport där prov som är i vätskefas injiceras genom ett septum in till en varm port och

förångas för att sedan kunna transporteras i kolonnen med hjälp av en mobilfas. Förångningen

kan ske med olika tekniker, där provet injiceras med split, splitless eller on-column teknik (i

detta projekt användes on-column som beskrivs närmare i avsnitt 3.1.3). Provet separeras och

detekteras i en detektor och ett kromatogram uppkommer på en dataskärm. För att föreningar

ska kunna anlyseras med GC måste de vara flyktiga och termiskt stabila (24).

Figur 5. Schematisk figur över en gaskromatograf (25).

3.1.1 Kolonnen

Det finns två typer av kolonner, packad kolonn och kapillärkolonn. Vanligast är att man har

en kapillärkolonn, där en tunn vätskefilm, den så kallade stationärfasen, ligger belagd på

väggarna på kolonnens insida. Stationärfasen utgörs av en kiselpolymer, vanligen kiseloxid

(SiO2) som har olika funktionella grupper som metyl, fenyl och cyanopropyl. Kolonnen sitter

i en ugn med en inställd temperatur vilket gör att analyterna förångas under transporten

genom kolonnen och interagerar med den stationära fasen. Ju mer analyterna interagerar med

stationärfasen desto längre tid kommer de att spendera i kolonnen och därmed ge separation

av analyterna. Temperaturen kan ställas in i en temperaturgradient, där temperaturen höjs

vartefter, vilket medför att alla analyter med kokpunkter inom temperaturintervallet förångas

och separeras. Ju mer polär analyterna man vill separera är desto mer polär vill man att

stationärfasen är och har man opolära analyter vill man ha en opolär stationärfas. Mängd och

polaritet på stationärfasen, temperaturen på kolonnen och mobilfasens flödeshastighet är de

huvudsakliga faktorerna för att få två analyter separerade från varandra. Kolonnens längd kan

variera från 15-100 m, där 30 m är den vanligaste längden, och dess innerdiameter är 0,2-0,8

9

mm (26). Fördelar med kapillärkolonn är att de ger högre upplösning, kortare analystid och

större sensitivitet än packade kolonner men nackdelen är att de har mindre provkapacitet (27).

3.1.2 Mobilfasen

Gaskromatografen har en rörlig mobilfas, även kallad bärgas i form av en inert gas. Vanligast

är helium, kvävgas eller vätgas, som transporterar analyterna från injektorn genom kolonnen

till detektorn. Vid val av mobilfas vill man ha så liten teoretisk botten (plate height, H) som

möjligt. Vid låg teoretisk botten kan fler jämvikter ställa in sig under separationen och det

leder till en bättre separation och smalare toppar. Van Deemterkurvan (figur 6), visar hur H

beror på flödeshastigheten (û) och valet av mobilfas. Snabbast separation sker med vätgas

men är inte kompatibel med masspektrometrar som använder vakuumpump med olja då

vätgasen bryter ner oljan. Det finns även oljefria lamell-vakuumpumpar men de är dyrare och

är inte så vanliga. Vätgas är även olämpligt att använda på grund av risk för knallgasexplosion

även om denna risk är liten. Kvävgas ger lägst H men endast vid låg flödeshastighet (27).

Figur 6. Van Deemterkurva, där y-axeln är H (plate height) i mm och x-axeln flödeshastigheten av

bärgasen i cm/s (28).

3.1.3 Injiceringsteknik – On-column

De olika injiceringsteknikerna som finns är split, split-less och on-column injektion. Vid on-

column injektion, som har använts vid projektets analyser, injiceras provet direkt i kolonnen,

till skillnad mot split och split-less där provet injiceras in i en injektor först. On-column

injektion kan vara att föredra vid kvantitativa analyser, då denna ofta ger en känsligare metod.

Det är även en bra injektionsteknik då man har prover som sönderfaller vid temperaturer som

är högre än deras kokpunkt. Temperaturen på kolonnen är tillräckligt låg för att kondensera

provet i ett smalt lösningsmedelsband i början av kolonnen. Uppvärmning av kolonnen

initierar till kromatografi (27).

10

Figur 7. On-column injektion (29).

3.2 Masspektrometer som detektor vid GC-analys Analyterna går vidare från gaskromatografen in i masspektrometern genom en ”transfer line”.

Masspektrometern är en känslig detektor som ger både kvalitativ och kvantitativ information.

Med denna teknik går det att studera molekylers massa och fragmentering, vilket kan ge

information om molekylens identitet och struktur. De gasformiga analyterna joniseras,

jonerna accelereras i ett elektriskt fält för att sedan separeras utifrån deras förhållande mellan

massa (m) och laddning (z).

En typ av massanalysator som är populär inom analytisk kemi är kvadrupolinstrument.

Kvadrupolen består av fyra metallstavar som sitter parallellt med varandra där en

växelspänning har lagts på mellan stavarna (se figur 8). Det är kvadrupolen som filtrerar och

separerar jonerna. När jonerna når kvadrupolen får de en vågrörelse och beroende på jonernas

masstal blir vågrörelsen olika för de lika jonerna. Joner som färdas genom kvadrupolen med

rätt m/z uppnår en jämn vågrörelse och når detektorn medan resterande joner kolliderar med

stavarna och neutraliseras och når aldrig detektorn. Genom att spänningen varieras kan olika

masstal nå detektorn.

Figur 8. Kvadrupolinstrument med fyra metallstavar och växelspänning (30).

11

Efter att jonerna har separerats i massanalysatorn träffar de detektorn som ger utslag med en

intensitet som är proportionell mot hur mycket av varje jonslag som förekommer. Alla

masspektrometrar är utrustade med ett vakuumsystem eftersom separation och detektering av

joner kräver att de accelereras i ett elektromagnetiskt fält. Kollisionen med luftmolekyler

skulle annars innebära att jonerna aldrig skulle kunna nå detektorn. Detektorn mäter

intensiteten av jonerna och skickar informationen till ett dataprogram som samlar in datan. Ett

vanligt sätt att återge masspektrometrisk data är i ett masspektrum.

Ett masspektrum visas i figur 9. På ett masspektrum är kvoten m/z avsatt på x-axeln. Eftersom

z ofta är 1 så är värdet på x-axeln lika som jonens massa, m. På y-axeln är den relativa

jonintensiteten avsatt. Vilket betyder att den mest förekommande jonen bestäms till ett värde

av 100 och de andra detekterade jonerna får ett värde som är relativt till detta. Man brukar

använda sig av ett referensbibliotek för att tyda ett masspektrum.

Figur 9. Masspektrum för bensoesyra. 122 motsvarar molvikten för bensoesyra. 105 visar att det finns en

hydroxylgrupp, 77 visar att det finns en bensenring och 28 visar att det finns en karbonylgrupp i

strukturen (31).

Två av de vanligaste teknikerna för att samla in joner är fullscan och SIM. Fullscanning av

joner ger registrering av ett intervall av joner inom de parametrar som angetts, till exampel

50-600 m/z. Kvadrupolen scannar över det valda masstalsintervallet så att alla joner

registreras och hela spektra upptas. Att kvantifiera en förening vid fullscanning kan vara svårt

då många föreningar har samma massa. Med SIM (selected ion monitoring) mäts endast en

eller ett antal utvalda massor. Kvadrupolen ”hoppar” mellan masstalen för de utvalda jonerna

och dessa joner mäts under en längre tid jämfört med fullscanning, vilket ger ett enklare

kromatogram och signalintensiteten blir högre för SIM än vad som observeras för

fullscanning (27).

3.2.1 Joniseringstekniker

För GC-MS är de vanligaste joniseringsteknikerna elektronimpaktjonisering och kemisk

jonisering som kan vara inställd på positive mode där positiva joner mäts eller negative mode

där negativa joner mäts.

12

Elektronimpaktjonisering (EI)

Molekyler går in i jonkällan och bombarderas av elektroner som accelereras genom ett

elektriskt fält på 70 eV. Så gott som alla stabila molekyler har ett jämnt antal elektroner och

när en elektron lossnar kallas den resulterande katjonen (positivt laddad) med en oparad

elektron för molekyljon och betecknas M+˙. Efter joniseringen har M

+˙ vanligtvis tillräckligt

med inre energi kvar för att brytas ner till fragment (27). Alla molekyler kan fragmenteras

med elektronimpaktjonisering vilket gör masspektrometri till en lämplig detektor vid

gaskromatografi (32).

Kemisk jonisering (CI)

Kemisk jonisering ger normalt mindre fragmentering än EI, detta på grund av att lägre energi

används vid processen. Jonkällan är fylld med reagensgas som vanligtvis är metan, men

isobutan eller ammoniak används också. Joner produceras genom kollision av analyt med

joner av reagensgasen.

Negativ kemisk jonisering (NCI) väljer ut negativa joner. Om man har en analyt som joniseras

väl under NCI så erhålls vanligen en högre känslighet än vid positiv jonisering, såsom

elektronimpakt jonisering och positiv kemisk jonisering. Orsaken till detta är att de flesta

molekyler generar mer positiva joner än negativa och bakgrundsbruset blir därför lägre vid

negativ jonisering. Negativ jonisering fungerar ofta väl för föreningar med en elektronaffinitet

högre än 0,5 eV, som till exempel halogenerade föreningar (33).

3.3 Derivatisering Alla analyter kromatograferar inte lika bra i GC så för att få analyterna i rätt kemisk form som

är mer kompatibel för GC-miljö används derivatisering. Derivatisering ökar flyktigheten,

stabiliteten och separationsselektiviteten hos analyten. De blir mindre polära så att de inte ska

adsorberas till den stationära fasen vilket ger mer symmetriska och separerade toppar på

kromatogrammet (34). Derivatiseringstiden varierar för de olika analyterna att bli fullständigt

derivatiserade. Många analyter reagerar så fort reagenset har lösts medan andra analyter med

sämre löslighet kräver uppvärmning, ca 70° C 20-30 minuter. Vid extrema förhållanden kan

det krävas upp till 16 timmar för att driva hela reaktionen. Om inte derivatiseringen blir

fullständig kan man tillsätta katalysator, höja värmeugnen till högre temperatur, låta proven

stå under längre tid och/eller ha högre koncentration på reagenset (35).

Beroende på vilka funktionella grupper som man vill derivatisera så finns olika

derivatiseringsreagens att tillgå, vilka kan derivatiseras med hjälp av olika reaktioner.

Silylering är en vanlig reaktion för GC-analyser och används för att skydda alkoholer,

karboxylsyror, fenoler, aminer och amider. Vid silylering byts det aktiva vätet ut mot en

alkylsilyl grupp, ofta trimetylsilyl (TMS, Si(CH3)3) (35). Se figur 10 nedan, reaktion för

silylering.

13

Figur 10. Reaktionsmeaknism för silylering

Två andra vanliga metoder för derivatisering är acylering och alkylering.

Vid acylering används ofta perfluorerade reagens som ger stabila och flyktiga derivat med

alkoholer, aminer och fenoler. Trietymamin (TEA) och trimetylamin (TMA) är baser som ofta

tillsätts för att främja reaktionen. Önskvärt är också att katalysatorn har förmågan att sänka

halten av syror som bildas som biprodukter vid derivatiseringsreaktionen, dels hjälper detta

till att driva reaktionen fullständigt och dels förhindras att den analytiska kolonnen skadas.

TFAA (trifluoroättiksyraanhydrid) är det reagens som är mest reaktiv och mest flyktigt vid

acylering. Inga biproduker bildas vid derivatisering med TFAA. Aminosyror och steroider är

analyter som är vanligast vid derivatisering med TFAA.

Andra perfluorerade reagens som PFPA (pentafluorpropionsyraanhydrid), PFBCl

(pentafluorobensoylklorid) och HFBA (heptafluorobutylsyraanhydrid) används för alkoholer,

aminer och fenoler. Derivaten kräver låg analystemperatur (36).

Vid alkylering byts det aktiva vätet ut på karboxylsyror, alkoholer, tioler och aminer mot en

alkylgrupp (37).

Oximering är en typ av derivatisering som används för ketogrupper där hydroxylamin-

substanser, till exempel metoxylaminhydroklorid (MOX). Hydroxylaminerna används med

fördel tillsammans med en bas, som till exempel pyridin, för att hydroxylaminen inte ska vara

i salt-form. Ketogruppen omvandlas till ett MO-TMS derivat efter tillsats av MOX som

oximeringsreagens följt av silylering med TMS (38). Analyten är då termostabil och lämplig

för GC-analys. Figur 11 nedan visar reaktionen för oximering.

Figur 11. Reaktionsmekanism för oximering

I bilaga 1 visas strukturformel för de derivatiseringsreagens som huvudsakligen användes

under projektet.

14

4 Experimentellt

4.1 Lösningar De syntetiska cannabinoidsubstanserna JWH-018 och JWH-073 beställdes som Cerilliant-

ampuller ifrån LGC Standards, Borås. Koncentrationen var 100 µg/mL.

CP47,497 var tänkt att användas och beställdes även den ifrån LGC Standards, men kunde

inte levereras inom projektets tidsram.

Bensofenon, derivatiseringsreagens och övriga kemikalier fanns tillgängliga på laboratoriet på

Sahlgrenska universitetssjukhuset.

BSTFA derivatiseringsreagens innehöll: N,O-Bis(trimetylsilyl)-trifluoroacetamid, med tillsats

av 1% Trimetylklorsilan som hjälper att driva silyleringen.

JWH-018

Stam 1: 100 µg/mL

Stam 2: Stam 1 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 1,0 µg/mL

JWH-073

Stam 1: 100 µg/mL

Stam 2: Stam 1 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 1,0 µg/mL

Bensofenon

Stam 1: 22 mg/mL

Stam 2: Stam 1 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 220 µg/mL

Stam 3: Stam 2 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 2,20 µg/mL

4.2 Instrumentella betingelser

4.2.1 GC-MS system

Analyserna utfördes på en TRACE GC Ultra gaskromatograf och en DSQ II Single quadrupol

masspektrometer, båda ifrån Thermo Scientific (Waltham, Ma, USA).

GC:n var utrustad med en J&W Scientific kolonn (Agilent, Santa Clara, CA, USA), HP5 MS

30 m×0,250 mm×0,25 µm, med en opolär 5% fenyl stationärfas. Som bärgas användes helium,

1,5 mL/minut.

Injektionsvolymen var 1 µL och on-column injektion användes för alla analyser.

Initialtemperatur för GC:n var 40 °C i 1 minut därefter ökning med 20 °C/minut till 190 °C

där den låg i 0 minuter och nästa ökning var på 15 °C/minut till 295 °C där den låg i 20

minuter. Mängd injicerat prov i autoinjektorn var 1 µL. Temperatur för transfer line var

280 °C och jonkällans temperatur var 230 °C.

Om inte annat nämns så användes EI-jonisering för masspektrometern. All data samlades in

fullscan-mode med massintervallet 50,0-650,0 m/z och bearbetades med hjälp av Xcalibur-

programvara (Thermo Scientific).

4.3 Metod Här beskrivs utförande vid försökens gång. All EtAc som använts är torkad genom tillsats av

natriumsulfat, ca 100 g/L, om inte annat anges.

15

Olika derivatiseringsreagens testades för att få tillräcklig bra känslighet och selektivitet för

substanserna. JWH-073 och JWH-018 har båda en liknande struktur på molekylen med en

ketogrupp, vilken är den enda tillgängliga gruppen för derivatisering. Initialt så testades

silylering och oximering för att derivatisera JWH-018 och JWH-073 substanserna. Då

molekylen är något steriskt hindrad är det svårare att hitta ett derivatiseringsreagens som

reagerar fullständigt med substansen. För att öka reaktiviteten hos substanserna provades

reducering av ketogruppen till en hydroxylgrupp.

Provupparbetning med silylering och oximering

Referenssubstans späddes med MeOH 1:100 = stam 1. Stam 1 av referenssubstansen

överfördes till provrör och indunstades till torrhet med vakuum i en SpeedVac. Olika volym

referenssubstans av stam 1 överfördes till provrör, men vanligaste volymen var 200 µL.

Derivatiseringsreagens tillsattes, både BSTFA, MOX och HOX testades. Därefter värmdes

provet i en värmeugn där olika temperaturer och tider valdes mellan försökens gång. Efter

derivatiseringen med BSTFA späddes provet cirka 1:5 med etylacetat. För övriga

derivatiseringsreagens indunstades provet igen till torrhet under vakuum i en SpeedVac och

löstes därefter upp i ett organiskt lösningsmedel lämpligt för injektion på GC:n, vanligtvis

EtAc eller isooktan. Till sist sattes provet i autosamplern för analys med GC-MS

Provupparbetning med reducering av ketonen

Då varken BSTFA, MOX eller HOX gav bra resultat i de första försöken testades reducering

med NaBH4, där ketonen omvandlas till en hydroxygrupp, för att sedan derivatisera

hydroxygruppen med BSTFA, PFBCl eller TFAA.

Vid reducering tillsattes först reduceringsreagens, NaBH4, till referenssubstansen stam 1 som

fick stå i ca 5 min. Därefter indunstades provet till torrhet och sedan fortsatte samma

upparbetningsmetod som innan (provupparbetning med silylering och oximering).

Provupparbetning med fasseparering

Då inte derivatisering av reducerat bensofenon fungerade så testades fasseparering för att bli

av med överblivet reduceringsmedel och biprodukter som eventuellt kan interferera med

derivatiseringen. Detta utfördes genom att lika volym av avjoniserat vatten och EtAc tillsattes

efter reducering med NaBH4. Provet skakades och fick stå i ett par minuter varvid två olika

faser skiktades i provröret. Organ-fasen överfördes till nytt provrör och indunstades till torrhet

i en SpeedVac. Därefter tillsattes derivatiseringsreagens och provet värmdes i värmeugn vid

olika temperaturer och tidsperioder. Varpå provet indunstades igen och löstes upp i ett

organiskt lösningsmedel lämpligt för injektion på GC:n, vanligtvis EtAc eller isooktan. Till

sist sattes provet i autosamplern för analys.

Olika derivatiseringsreagens testades även här, BSTFA, PFBCl och TFAA.

Bensofenon användes som en kontroll på att derivatiseringen fungerade och derivatiserades

parallellt med de syntetiska cannabinoiderna när olika derivatiseringsreagens testades.

Provupparbetningen gick till på samma sätt med reducering och fasseparering. Bensofenon

har en ketogrupp som har en struktur liknande JWH-018 och JWH-073.

16

O

Figur 12. Strukturformel för bensofenon, molvikt: 182 g/mol

Efter ett par försök ändrades provupparbetningen genom att provet löstes upp i isooktan efter

fassepareringen och indunstningen. En blandning med isooktan och trietylamin tillsattes till

provet. Därefter tillsattes derivatiseringsregens och provet värmdes i en värmeugn vid olika

temperatur och tidsperioder. Därefter tillsattes 5 %-ig ammoniaklösning och provet skakades

tills vit rök hade försvunnit. Provet centrifugerades så två tydliga faser bildades. Isooktan-

fasen överfördes till en vial och sattes sedan i autosamplern för analys med GC-MS.

Försöket gav ett lyckat resultat, därför har försök med JWH-substanserna därefter testats.

Provupparbetningen gick där till på samma sätt med BSTFA och TFAA som

derivatiseringsreagens och där temperatur i värmeugnen höjdes och tiden i ugnen förlängdes

till 1-3 timmar. Nedan visas fullständig försöksgång för provupparbetning som gav resultat

för derivatiserade JWH-substanser.

200 µL JWH-018 stam 2 överfördes till provrör. Ca 10 mg NaBH4 tillsattes och provet stod i ca 5 min. Provet tvåfasextraherades med hjälp av 1 mL etylacetat och 2 mL dH2O. Provet

skakades och stod sedan i 5 min. EtAc-fasen överfördes till ett nytt provrör. EtAc-fasen indunstades vid 35°C i 15 min. För TFAA derivatisering löstes provet upp i 0,5 mL isooktan och 50 µL av 5 %

trietylamin i isooktan tillsattes, varefter 20 µL TFAA adderades. För BSTFA derivatisering tillsattes 20-100 µL BSTFA till provet. Provet värmdes i värmeugn där temperatur från 70-115°C testades samt tiden

varierade mellan 1-3 timmar. Efter uppvärmningen så späddes BSTFA-proverna ca 1:5 med EtAc innan de

sattes i autosamplern för analys med GC-MS. Till TFAA-proven tillsattes 1 ml 5 % ammoniaklösning. Provet skakades tills all

vit rök hade försvunnit. Provet centrifugerades ner så att två tydliga faser bildades och isooktan-fasen

överfördes till en vial som sattes i autosamplern för analys med GC-MS.

17

5 Resultat Resultat på TIC-kromatogram och masspektran från olika derivatiseringsförsök visas i detta

avsnitt.

Försöken att derivatisera ketogruppen direkt med hjälp av BSTFA eller med

oximeringsreagens resulterade inte i några detekterbara derivat. Därför övergick metoden till

att försöka reducera ketogruppen kemiskt med hjälp av NaBH4. Som en kontroll på att

reducering och derivatiseringsbetingelserna var gynnsamma användes bensofenon parallellt

med JWH-substanserna. Genom detta förfarande sågs att kvarvarande reduceringsmedel eller

biprodukter ifrån reduceringen störde derivatiseringen och en tvåfasextrahering infördes.

Resultat för oderivatiserad JWH-073 och JWH-018 visas i bilaga 2 och 3.

RT: 12.00 - 17.00

12 13 14 15 16 17

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

15.55

15.8115.29 15.8515.2015.07 15.9114.80 16.1714.74 16.2714.69

16.5514.5114.4414.35

14.1414.11

12.25 12.54 13.8612.84

NL:3.75E7

m/z= 180.39-186.25 MS Der_BF_110418_henriks

Figur 13. TIC-kromatogram av reducerat bensofenon, benshydrol

Resultatet i figur 13 visar att reducering med NaBH4 av bensofenon fungerade bra.

18

RT: 6.00 - 12.00

6 7 8 9 10 11 12

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

9.53

6.43

6.60

7.027.09

7.187.25 7.99 8.06

8.22 8.38 8.48

9.66 10.02 10.13 10.51

NL:2.91E8

TIC MS Der_BF_110418_henriks_1_100

OSi

CH3

CH3CH3

Der_BF_110418_henriks_1_100 #355-358 RT: 9.52-9.56 AV: 4 SB: 149 7.17-9.06 NL: 2.87E7T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

167.10

165.08

73.01

256.17179.11

152.07

241.14

74.07 257.19139.05115.04104.07

63.02 181.11 258.18211.12286.11

OSi

CH3

CH3CH3

Der_BF_110418_henriks_1_100 #355-358 RT: 9.52-9.56 AV: 4 SB: 149 7.17-9.06 NL: 2.87E7T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

167.10

165.08

73.01

256.17179.11

152.07

241.14

74.07 257.19139.05115.04104.07

63.02 181.11 258.18211.12286.11

Figur 14. Resultat av reducerat bensofenon derivatiserat med BSTFA

Figur 14 visar kromatogram och spektrum från experiment där bensofenon reducerats till

benshydrol och derivatiserats med BSTFA. Tydliga joner kan ses vid 256 m/z (183+73) som

är benshydrol+TMS, vid 167 m/z (183-16) som är benshydrol–O, och vid 165 m/z (183-18)

som är benshydrol– H2O.

19

RT: 5.00 - 10.00

5 6 7 8 9 10

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

6.81

9.61

9.578.70 9.48

7.748.548.457.636.72 7.48

6.656.156.10

NL:1.06E7

TIC MS BF_TFAA_110509_sp01_bf_tfaa

BF_TFAA_110509_sp01_bf_tfaa #142-145 RT: 6.80-6.84 AV: 4 SB: 69 5.08-5.94 NL: 8.38E5T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bun

dance

165.08

152.11

77.09

280.05

168.1682.18 105.02

115.07 139.0989.11 183.07128.09 281.06

207.04 267.11221.08 253.57

O O F

F

F

O

BF_TFAA_110509_sp01_bf_tfaa #142-145 RT: 6.80-6.84 AV: 4 SB: 69 5.08-5.94 NL: 8.38E5T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bun

dance

165.08

152.11

77.09

280.05

168.1682.18 105.02

115.07 139.0989.11 183.07128.09 281.06

207.04 267.11221.08 253.57

BF_TFAA_110509_sp01_bf_tfaa #142-145 RT: 6.80-6.84 AV: 4 SB: 69 5.08-5.94 NL: 8.38E5T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250

m/z

BF_TFAA_110509_sp01_bf_tfaa #142-145 RT: 6.80-6.84 AV: 4 SB: 69 5.08-5.94 NL: 8.38E5T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bun

dance

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bun

dance

165.08

152.11

77.09

280.05

168.1682.18 105.02

115.07 139.0989.11 183.07128.09 281.06

207.04 267.11221.08 253.57

O O F

F

F

O

O O F

F

F

O

Figur 15. Resultat av reducerat bensofenon derivatiserat med TFAA

Liknande förfarande användes sedan för derivatisera med hjälp av TFAA. Figur 15 visar

kromatogram och spektrum ifrån ett experiment där bensofenon reducerats till benshydrol och

derivatiserats med TFAA. Tydliga joner kan ses vid 280 m/z (183+97) som är

benshydrol+TFA, vid 167 m/z (183-16) som är benshydrol–O, och vid 165 m/z (183-18) som

är benshydrol–H2O.

20

RT: 12.00 - 20.00

12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

17.27

15.7915.0614.3212.70 16.5913.54 17.3618.8016.2412.85 19.6113.60

NL:3.93E6

m/z= 287.70-288.70+325.70-326.70+414.70-415.70 MS Test_JWH_BSTFA_3

Test_JWH_BSTFA_3 #909-913 RT: 17.26-17.31 AV: 5 SB: 22 16.77-17.04 NL: 1.19E6T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 200 300 400 500 600

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

73.05288.17

75.04

415.20

77.03 326.18

254.06

170.02120.02

192.06

358.10390.42 504.09439.52 551.18 593.18

Figur 16. Resultat av JWH-018 derivatiserat med BSTFA vid 115 °C i 3 timmar

Att överföra resultaten ifrån bensofenon till JWH-substanserna visade sig svårare än förutsett.

Derivatisering med BSTFA av reducerat JWH-073 eller JWH-018 vid 70 °C gav inget resultat.

Därför provades derivatisering med TFAA och under olika förhållanden och med antingen

pyridin eller trietylamin som katalysatorer. Dessa experiment gav heller inga noterbara derivat.

Nästa steg var därför att prova mer extrema förhållanden. Derivatisering av reducerat JWH-

018 med BSTFA vid 115 °C gav ett TMS-derivat. Figur 16 visar kromatogram och spektrum

ifrån ett experiment där JWH-018 reducerats och derivatiserats med BSTFA. Tydliga joner

kan ses vid 415 m/z som är JWH-018+TFA, vid 326 m/z (415-73-16) som är JWH-018–O.

O

N

CH3

Si

CH3

CH3

CH3

21

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50MA: 47289502SN: 904RMS

RT: 17.28MA: 17604879SN: 406RMS

16.61 17.58 18.79 20.7720.32 21.1019.0417.83

NL: 7.47E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS Test_JWH_BSTFA_115_1h

B

1 h, 115 °C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50MA: 47289502SN: 904RMS

RT: 17.28MA: 17604879SN: 406RMS

16.61 17.58 18.79 20.7720.32 21.1019.0417.83

NL: 7.47E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS Test_JWH_BSTFA_115_1h

B

1 h, 115 °C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50AA: 30961340SN: 493RMS

RT: 17.28AA: 6943540SN: 141RMS

16.61 17.58 18.8020.36 20.78 21.2818.9917.79

NL: 4.83E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS ICIS Test_JWH_BSTFA_3

C

3 h, 115°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50AA: 30961340SN: 493RMS

RT: 17.28AA: 6943540SN: 141RMS

16.61 17.58 18.8020.36 20.78 21.2818.9917.79

NL: 4.83E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS ICIS Test_JWH_BSTFA_3

C

3 h, 115°C

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

A

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

A

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50MA: 47289502SN: 904RMS

RT: 17.28MA: 17604879SN: 406RMS

16.61 17.58 18.79 20.7720.32 21.1019.0417.83

NL: 7.47E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS Test_JWH_BSTFA_115_1h

B

1 h, 115 °C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50MA: 47289502SN: 904RMS

RT: 17.28MA: 17604879SN: 406RMS

16.61 17.58 18.79 20.7720.32 21.1019.0417.83

NL: 7.47E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS Test_JWH_BSTFA_115_1h

B

1 h, 115 °C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50AA: 30961340SN: 493RMS

RT: 17.28AA: 6943540SN: 141RMS

16.61 17.58 18.8020.36 20.78 21.2818.9917.79

NL: 4.83E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS ICIS Test_JWH_BSTFA_3

C

3 h, 115°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

nd

an

ce

RT: 20.50AA: 30961340SN: 493RMS

RT: 17.28AA: 6943540SN: 141RMS

16.61 17.58 18.8020.36 20.78 21.2818.9917.79

NL: 4.83E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS ICIS Test_JWH_BSTFA_3

C

3 h, 115°C

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

A

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

A

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

A

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

A

1 h, 70°C

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

RT: 16.00 - 22.00 SM: 7B

16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive A

bundance

RT: 20.49MA: 33703901SN: 561RMS

RT: 17.28MA: 2557643SN: 43RMS16.59

18.80 20.3420.7917.70 21.2718.94 20.19

NL: 5.75E6

m/z= 283.70-284.70+287.70-288.80+340.70-341.70+414.70-415.70 MS

A

Figur 17. Kromatogram ifrån derivatiseringsförsök (A) 1 timme vid 70 °C, (B) 1 timme vid 115 °C, och (C)

i 3 timmar vid 115 °C

Olika derivatiseringstider och temperaturer testades för JWH-018 och jämfördes.

Oderivatiserad JWH-018 analyserades också för att kunna beräkna utbytet för

derivatiseringen. Figur 17 sammanfattar försöket. Baserat på förhållandet mellan areor för

derivatiserat JWH-018-TMS, retentionstid=17,28, och oderivatiserat JWH-018,

retentionstid=20,5, räknades utbytet ut. Maximalt utbyte vid detta försök erhölls när vid

derivatisering i 1 timme vid 115 °C och blev cirka 27 %.

Försöken visar att derivatisering av JWH-018 är möjligt efter kemisk reducering med hjälp av

NaBH4, dock resulterade det aldrig för en fullständig derivatisering utan ungefär en fjärdedel

av JWH-018 derivatiserades. Försöket som sammanfattas i figur 17 tyder på att man kan få

bättre utbyte om man höjer temperaturen, men att längre derivatiseringstid inte automatiskt

betyder bättre derivatisering.

22

6 Diskussion Olika strategier för att detektera syntetiska cannabinoider i biologiska prov är tänkbara. En

möjlighet är att försöka detektera olika metaboliter av dessa i urin, vilka vanligtvis finns i

högre koncentrationer än själva modersubstansen. Känsligast metod kan alltså oftast fås då

man analyserar huvudmetaboliten. Dock kräver detta någon form av kunskap om

metaboliseringen. När detta projekt startade var kunskapen om metaboliseringen av de flesta

syntetiska cannabinoider väldigt begränsad. Därför var ett första steg att se om det är möjligt

att etablera en tillräckligt känslig metod för att detektera modersubstanser för syntetiska

cannabinoider i urin. En sådan metod skulle också kunna vara applicerbar på plasma/serum, i

vilka modersubstansen ofta finns oförändrad i höga koncentrationer i förhållande till

metaboliter, eller för analys av beslagtaget material innehållande syntetiska cannbinoider.

En risk man tar om man bara letar efter huvudsubstansen i urin är att man kan få många falskt

negativa svar (39). Å andra sidan, på grund av det stora antalet syntetiska cannabinoider så

kommer det ta väldigt lång tid innan kunskapen om deras metaboliter blir helt kartlagd. Man

riskerar alltså att nya syntetiska cannabinoider kommer ut på marknaden i snabbare takt än

man kartlägger dem. En tänkbar strategi är därför att man etablerar en så pass känslig metod,

till exempel NCI-GC-MS, att man även kan se huvudsubstansen i urin, eller att man i stället

analyserar plasma/serum eller annan typ av prov där metboliseringsgraden är lägre än för urin.

Första steget för detta projekt var att derivatisera de syntetiska cannabinoiderna för att få en

önskvärd känslighet och selektivitet. Molekylerna är stora och något steriskt hindrade vilket

gör det svårare att få en fullständig reaktion. Litteratursökning gjordes för att se hur tidigare

analyser har gått till. Försök modifierades från publicerade artiklar och metoder som används

på Sahlgrenska universitetssjukhuset.

Derivatiseringsreagens

Olika derivatiseringsreagens testades och bäst resultat gavs av BSTFA och TFAA.

Till en början när substanserna derivatiserades med BSTFA värmdes proverna i 70 °C i olika

tidsperioder, från 15 minuter till 1 timme. Detta resulterade inte i någon lyckad derivatisering.

Då BSTFA som är en ganska stor molekyl inte fungerade testades bland annat TFAA. TFAA

är en mindre molekyl som eventuellt kan reagera lättare med ketogruppen som blivit

reducerad till en alkohol. Detta resulterade inte heller i något lyckat derivatiseringsförsök.

Dock är storleksskillnaden mellan TMS- och TFA-grupperna inte så stora vilket kanske kan

förklara att det inte gav bättre resultat med TFAA-derivatisering. Därför ville jag testa mer

extrema temperaturförhållanden och valde att prova med BSTFA som är lättarbetad och

temperaturtålig. Nya försök gjordes och derivatiseringstiden förlängdes till 1-3 timmar och

temperaturen varierades från 70-115 °C. Det visade sig att vid extremare förhållande för

derivatiseringen (högre temperatur och längre tid i värmeugnen) resulterade det i lyckade

derivatiseringsförsök.

Bensofenon som kontroll på att derivatiseringen fungerade

Bensofenon användes som kontroll för att se om derivatisering fungerade för en liknande

molekyl där ketogruppen är helt tillgänglig. Ingen derivatisering för bensofenon skulle tyda på

fel derivatiseringsbetingelser. Detta förfarande kunde också ge information om det var något

problem med instrumenteringen (problem med GC:n diskuteras längre ner i diskussionen).

Lyckade försök med bensofenon som derivatiserades med hjälp av TFAA analyserades och

därefter försöktes JWH-substanserna derivatiseras på samma sätt.

23

Problem med GC-MS:en

GC-MS:en har varit ett problem under vissa analyser. Känsligheten har vissa gånger blivit

lägre och lägre. Delar i GC-MS:en rengjordes, så som jonkällan. Kolonn byttes ifall den

skulle ha blivit smutsig eller förstörd. Det kan lätt hända att kolonnen blir dålig då man

analyserar prover som man inte riktigt vet vad det innehåller. Eftersom känsligheten var dålig

under vissa analyser var det svår att avgöra vad som inte fungerade, om det var

derivatiseringen eller om det var GC:n som inte var helt okej.

Till sist upptäcktes ett problem med autosamplern, sprutan vid injicering var tilltäppt, vilket

har gjort att provet inte kunnat injiceras på ett normalt sätt. Detta upptäcktes rätt sent men

några nya analyser hann göras, vilka då gav mycket bättre kromatogram med lyckade resultat.

Tidsplanen

Eftersom första steget med derivatiseringen var svårt, rubbades tidsplanen rätt tidigt. Jag hann

tyvärr inte komma längre än till första steget med analyserna, som var att få derivatiseringen

att fungera. Det var till en början svårt att avgöra hur stort projektet var och hur mycket tid

som behövde avsättas för att få något resultat att gå vidare med metodutvecklingen. Detta

projekt visade sig vara för stort för att hinna med fler steg för metodutvecklingen. Nästa steg

skulle ha varit att optimera derivatisering med TFAA för JWH-substanserna för att sedan testa

NCI som joniseringsteknik för att få bättre känslighet.

24

7 Slutsats och vidareutveckling Utifrån mina resultat har det visat sig att JWH-substanserna är svårderivatiserade, men att det

går att få TMS-derivat. I förlängningen kan man kanske etablera en GC-MS-metod för dessa

substanser. Ett alternativ skulle kunna vara att använda LC-MS/MS, vilket bör vara den bästa

strategin för plasma och serum där modersubstansen bör finnas i ometaboliserad form.

Analys av JWH-substanser med GC-MS är tänkbar även utan derivatisering, då de

kromatograferar ganska väl. Dock kommer man inte få tillräcklig känslighet för de flesta

provtyper. Därför måste man få till en derivatisering med ett reagens som till exempel TFAA.

Resultaten ifrån försök med BSTFA visar dock att temperaturen vid derivatiseringen är kritisk

och därför är det tänkbart att man kan få bättre TFAA-derivatisering om man testar mer

extrema temperaturer.

I takt med att information angående metaboliseringen av olika substanser blir tillgänglig så

kan man etablera LC-MS/MS-metoder för huvudmetaboliterna i urin. För plasma och serum

kan man försöka etablera metoder för att analysera modersubstanserna.

25

Referenser

1. Brady K. Atwood, Donghoon Lee. CP47,497-C8 and JWH073, commonly found in „Spice‟

herbal blends, are potent and efficacious CB1 cannabinoid receptor agonists. 2011.

2. Jonas Hartelius. Narkotika, dopningsmedel och hälsofarliga varor. I: Svenska carnegie

institutet och Svenska narkotikapolisföreningen; 2009.

3. Wayne Hall, Nadia Solowij. Adverse effects of cannabis. 1998:1611.

4. Pierre Lafolie och ConTemp, red. Knarkanalyser i urin . Pierre Lafolie och ConTemp;

1992.

5. C. HEATHER ASHTON. Pharmacology and effects of cannabis: a brief review. 2001.

6. Huffman JW, Zengin G, Ming-Jung W, Lu J. Analytical Specification. 2005.

7. REDWOOD TOXICOLOGY LABORATORY. synthetic cannabinoid drug testing. 2010.

8. Dariusz Zuba, Bogumila Byrska, Martyna Maciow. Comparison of “herbal highs”

composition. 2011.

9. Cindy L Moran, Vi-Huyen Le. Quantitative Measurement of JWH-018 and JWH-073

Metabolites Excreted in Human Urine. 2011.

10. Läkemedelsverket. Sju nya substanser narkotikaklassade. 2009 [läst 110502]. Tillgänglig:

http://www.lakemedelsverket.se/Alla-nyheter/NYHETER-2009/Sju-nya-substanser-

narkotikaklassade/.

11. Statens folkhälsoinstitut. Syntetiska cannabinoider klassade som narkotika. 2010 [läst

110510]. Tillgänglig: http://www.fhi.se/Aktuellt/Nyheter/Syntetiska-cannabinoider-klassade-

som-narkotika/.

12. Rainer Lindigkeit, Anja Boehme, Ina Eiserloh, Maike Luebbecke, Marion Wiggermann,

Ludger Ernst, et al. Spice: A never ending story? 2009.

13. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA). Understanding

the „Spice‟ phenomenon. 2009.

14. I. Vardakou C. Spice drugs as a new trend: Mode of action, identification and legislation.

2010.

15. Nationalencyklopedin. Cannabis : Nationalencyklopedin; 2011. [läst 110328].

Tillgänglig: http://www.ne.se/lang/cannabis/140872.

16. Maria Ellgren. Cannabis och hjärnans belöningssystem. 2007.

17. RG Pertwee. The diverse CB1 and CB2 receptor pharmacology of three plant

cannabinoids: D9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and D9-tetrahydrocannabivarin. 2007.

26

18. William E. Greineisen, Helen Turner. Immunoactive effects of cannabinoids:

Considerations for the therapeutic use of cannabinoid receptor agonists and antagonists.

2010.

19. K. Smita, V. Sushil Kumar. Anandamide: an update. 2006.

20. Eugene W. Schwilke, David M. Schwope. $9-Tetrahydrocannabinol (THC), 11-Hydroxy-

THC, and 11-Nor-9-carboxy-THC Plasma Pharmacokinetics during and after Continuous

High-Dose Oral THC. 2009.

21. Redwood Toxicology Laboratory. Synthetic Cannabinoid Testing (urine & oral fluid).

2011.

22. Clinical and Laboratory Standards 24 Institute. Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Confirmation of Drugs; Approved Guideline—Second Edition. 2009.

23. Qi Zhang, Guangji Wang. GC/MS analysis of the rat urine for metabonomic research.

2007.

24. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA). Synthetic

cannabinoids and 'Spice': European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction

(EMCDDA); 2010-11-24. Tillgänglig: http://www.emcdda.europa.eu/publications/drug-

profiles/synthetic-cannabinoids#analysis.

25. Figur Gaskromatograf: Utbildningsstyrelssen [läst 2011-05-06]. Tillgänglig:

http://www.edu.fi/laboratorieanalyser/analysmetoder/2_5_gaskromatografi.

26. L. G. Wade J. Separating and Identifying Mixtures by Gas Chromatography. 1997.

27. Daniel C. Harris. Quantitative Chemical Analysis. 7ed uppl. 2007.

28. Figur van Deemterkurva. 2011-05-06: State Hygienic Laboratory. Tillgänglig:

http://www.uhl.uiowa.edu/publications/archive/hotline/1997/1997_07/labcert.xml?type=print.

29. Figur On-column injektion: UC Davis ChemWiki [läst 2011-05-06]. Tillgänglig:

http://chemwiki.ucdavis.edu/Analytical_Chemistry/Instrumental_Analysis/Gas_Chromatogra

phy.

30. Figur Singel kvadrupol: Brian M [läst 2011-05-06]. Tillgänglig:

http://www.files.chem.vt.edu/chem-ed/ms/quadrupo.html.

31. Figur Masspektrum: Utbildningsburken & Magnus Ehinger [läst 2011-05-06]. Tillgänglig:

http://www.ehinger.nu/undervisning/index.php/kurser/kemi-b/lektioner/analytisk-kemi/758-

spektrometri.html.

32. Harry F. Prest. Ionization Methods in Gas Phase Mass Spectrometry; Operating Modes of

the 5973Network Series MSDs. 1999.

33. Narine P. Gurprasad, N. A. Haidar, T. G. Manners. Applications of negative ion chemical

ionization mass spectrometry technique in environmental analysis. 2002;33.

27

34. Dong-Liang Lin, Sheng-Meng Wang. Chemical Derivatization for the Analysis of Drugs

by GC-MS — A Conceptual Review. 2007;16.

35. SUPELCO. BSTFA- Product Specification. 1997.

36. Supelco. Perfluoro Acid Anhydrides - Product Specification. 1997.

37. Sigma-Aldrich. Alkylation and Esterfication; 2011. [läst 2011-05-11]. Tillgänglig:

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analytical-reagents/derivatization-

reagents/alkylation-esterfication.html.

38. Fang Kai, PAN Xue-Jun. Progress on Keto Groups Derivatization of Steroid Hormones in

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. 2010;38(5).

39. Redwood Toxicology Laboratory. Redwood Toxicology Laboratory Announces Urine Test

for Marijuana Mimics: Synthetic Cannabinoids JWH-018 and JWH-073 Metabolites. 2010.

28

Bilaga 1. Strukturformler för derivatiseringsreagens som huvudsakligen använts i projektet

Vid derivatisering med BSTFA bildas en TMS-grupp (trimetylsilyl) som sammankopplas med

en hydroy-, amin- eller ketogrupp.

Vid derivatiseringen med TFAA bildas TFA som sammankopplas med hydroxygruppen, som

bildats efter reducering.

Figur 15. Strukturformel för

TFAA, molvikt = 183 g/mol

Figur 16. Vid derivatisering med

TFAA bildas TFA (M=97) som

reagerar med hydroxygruppen

Figur 13. Strukturformel för

BSTFA, molvikt = 257 g/mol Figur 14. Vid derivatisering med BSTFA

bildas TMS som reagerar med ketogruppen

29

Bilaga 2. Resultat av oderivatiserat JWH-073 RT: 12.00 - 22.00

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.18

20.9721.06

18.0016.9419.33

16.8416.7016.62

16.0015.92

12.03 15.1815.0812.08

NL:6.66E8

TIC MS jwh-073_110331_sp02_1

jwh-073_110331_sp02_1 #797-815 RT: 20.16-20.39 AV: 19 SB: 185 17.26-19.61 NL: 3.54E7T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250 300 350

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

327.10

284.02

310.08200.04

144.00127.09

270.03

167.02254.05

241.05116.02

101.05 213.03172.0688.03 337.55

30

Bilaga 3. Resultat av oderivatiserat JWH-018 RT: 18.00 - 28.00

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

20.49

20.6420.83 20.91

22.5718.62 19.68 22.65 25.06 26.8426.19 27.47

NL:1.54E8

TIC MS spice_serie_jwh018_110519_sp05_10

spice_serie_jwh018_110519_sp05_10 #1397-1402 RT: 20.47-20.52 AV: 6 SB: 7 20.35-20.41 NL:T: + c Full ms [50.00-650.00]

100 150 200 250 300 350

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

341.25

284.17

214.17

127.10

144.09 324.25

270.16155.10

167.09

254.16116.07

102.08 186.1889.07322.24

75.09