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Bestimmung der Molekularen Masse
von Makromolekülen
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GrößenausschlußchromatographieGelfiltration,
SEC=size exclusion chromatography
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GrößenausschlußchromatographieGelfiltration,
SEC=size exclusion chromatography
10log
MW
[kD
a]Elutionsvolumen [ml]
Carboanhydrase
BSA
Lysozym
Aprotinin
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Größenausschlußchromatographie
Vorteile:Sehr oft ist Gelfiltration ein Schritt bei der Isolation des Proteins. Somit istdie Information über die native Größe schon vorhanden. Genauigkeit: +/- 10% im optimalen Fall bis zu +/-50% Abweichung
Nachteile:Das Elutionsvolumen kann durch die Form des Proteins oder auch durchInteraktionen des Proteins mit der Säulenmatrix stark beeinflusst werden.Schwache Komplexe zerfallen auf Gelfiltration.
Protein
Hydrodynamischer Radius
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Massenspektrometrie
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Massenspektrometrie
• Hauptmethoden:
ESI = Electrospray Ionisation
MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
•Prinzip: Moleküle werden ionisiert und im elektrischen Feld beschleunigt
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Massenspektrometrie• Detektion der ionisierten Moleküle z.B. mittels TOF = Time Of Flight
• PrinzipAlle Moleküle haben nach der Beschleunigung im el. Feld diegleiche kinetische Energie = E = ½ mv2. Es gilt
Ekin (Molekül 1) = Ekin (Molekül 2) ½ m1v1
2 = ½ m2v22
Ist nun die Masse m1 größer als die Masse m2
ist also die Geschwindigkeit v1 entsprechend kleiner als v2
d.h. das “leichtere” Molekül 2 kommen zuerst an.
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Massenspektrometrie• Latest: Detektion der ionisierten Moleküle
Orbitrap
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MassenspektrometrieVorteile:Sehr wenig Probe wird benötigt. Sehr präzise Messungen.Genauigkeit bis +/- 0.1 Da
Nachteile:Da die Proteien ionisiert werden müssen, kommt es oft zurDeanturierung der Proteine; d.h. Multimere oder Komplexe zerfallen sehroft bei der Ionisation und können nicht detektiert werden.
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Dynamische Lichtstreuung• DLS, Dynmaic Light Scattering auch “quasi-
elastische” Streuung genannt.
• Grundprinzip:Ist das Molekül sehr viel größer als die Wellenlänge des eintreffende Lichts, werdendie Photonen elastisch - d.h. ohne ÄnderungWellenlänge - gestreut (Rayleigh Scattering).
(Analogie zum elastischen Stoß, bei dem ein Partikel, dersehr viel kleiner als der Stoßpartner ist, zwar eine andereRichtung erhält aber die Geschwindigkeit vollständigerhalten bleibt)
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Dynamische Lichtstreuung
Moleküle in Bewegung
Einfallendes Licht
Gestreutes Licht
Moleküle in Lösung
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Dynamische Lichtstreuung
Einfallendes Laserlicht Auslöschung
Verstärkung
Detektion
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Dynamische Lichtstreuung
Einfallendes Laserlicht Auslöschung
Verstärkung
Änderung der Inensität
in Abhängigkeit von
der Bewegung
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Dynamische Lichtstreuung
Brown’sche Molekülbewegung abhängig von Diffusionskoeffizient
Diffussionskoeffizient
kB = Boltzmann KonstanteT= Temperaturη = ViskositätR0= Hydrodynamischer Radius des diffundierenden Teilchens
Änderung der Lichtintensität gibt Rückssschlüsseauf Bewegung der Moleküleund über den Diffusionskoeffizienten auf die Größe der Moleküe.
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Dynamische LichtstreuungVorteile:Wenig Probenvolumen, in der Regel geringe ProteinkonzentrationBenötigte Proteinkonzentration von der Größe des Proteins abhängig.
Nachteile:Methode extrem anfällig auf Partikel, wie z.B. aggregiertes Protein,Staub, etc, geringe Präzision.
Achtung bei Glycerin oder andere Substanzen im puffer, die Viskosität stark ändern.
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Analytische Ultrazentrifugation
• Grundprinzip:
Bewegung der Moleküle während Sedimentation oder
Sedimentationsgleichgewicht wird gemessen =>
Rückschlüsse auf Größe.
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Analytische Ultrazentrifugation
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Analytische Ultrazentrifugation
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Analytische Ultrazentrifugation
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Analytische Ultrazentrifugation
t=0
t=x
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Analytische UltrazentrifugationSedimentation
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Analytische Ultrazentrifugation
Lamm Gleichung
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Analytische Ultrazentrifugation
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Analytische Ultrazentrifugation