bilimteknik protein 072007

7/31/2019 BilimTeknik Protein 072007

1/4

25 Nisan 1953te Nature dergisin-de, Watson ve Crick imzal bir makaleyaymland. Nkleik Asitlerin Mole-kler Yaps: Deoksiriboz Nkleik Asitin Bir Yap bafllkl ve 128 satrdanoluflan bu metnin ieriinde DNAnn,yani yaflamn flifresinin molekler ya-ps aklanyordu. Bilim tarihinde birdnm noktas olan bu alflmayladnyadaki yaflamn flifresi, bir hcreli-den memelilere kadar tm canllarnhcrelerinde yer alan DNAnn yaps

aklanyordu; ki, biz insanlar yaflam-mz ve salmz biimlendiren buanahtar ele geirdikten sonra sraylabaflka bilinmeyenleri de zmledik.

Ardndan genler zerinde bir devrimgereklefltirdik. nsan hcresinde bu-lunan ve DNA zerinde yer alan gen-leri tanmladk. Bylece, samznrengi, burnumuzun grnm, elleri-mizin biimi, ksaca bizi fiziksel olaraktanmlayan elerimiz yansra doufl-tan ileri gelen ya da sonradan ortayakan hastalklar da hep bu genlerinmarifetiyle, ifllevselliiyle gereklefli-yor bilgisine sahip olduk. Bize ait26.000 genin tanmnn yaplmas, in-

san gen haritasnn belirlenmesi de-mekti. Ancak salt genleri tanmlamak,hastalklarn nlenmesinde, teflhisindeve tedavisinde yeterli gelmedi. Asl

nemli ksm, canl tanmna anlamnveren molekllerin, yani proteinlerintanmnn yaplmasyd; ki, hcre iin-de, hcreler arasnda gerekleflen kim-yasal tepkimeler anlafllabilsin. Hcre-lerin canllklarn nasl koruduklar-nn, birbirleriyle nasl haberlefltikleri-nin, hcre yapsnn nasl gelifltiinin,hcre eflitliliinin nasl saland-nn, ksaca yaflamn temelinin aklan-masnda proteinlerin daha derinleme-sine anlafllmasyla bir baflka devrimin

kaps araland. Proteomik arafltrma-lar iin proteom analizi alflmalarbafllatld ve yepyeni bir arafltrma ala-n daha dodu.

ProteinAnalizi

Prof. Dr. Adil Denizli Anlatyor

66 Temmuz 2007BLM veTEKNK

Bilimsel devrimlerin ard arkaskesilmiyor. ok deil, bundan 3-4 yl

ncesine kadar biliminsanlar genlerinifllevlerini ortaya karacak diyedflndkleri genomik uygulamalar iinsalk alannda bir devrimbetimlemesini yapyorlard. Yani buuygulamalarla tbbi alflmalarda dakkten bir deiflim olacak ve genlerinortaya karlmfl ifllevleri, dierbiyoteknoloji ve bilgi teknolojileriyle biraraya geldiinde hastalklarn nlenmesi,

teflhisi, tedavisi kolaylklagerekleflebilecekti. 1950li yllardabafllayan alflmalarn sonucunda, 1990 ylnn Ekim aynda nsan Genom Projesi bafllatld. 18lkenin destek verdii bu projenin amac insann gen haritasnn, yani genetik flifresinin zlmesiydi.zld de Ancak zellikle hastalklarn teflhisi ve tedavisi konusunda beklenen sonu tam anlamylaelde edilemedi; genom alflmalarna dayanan teflhis yaklaflmlar klinik kullanm iin uygun ve pratikdeildi. Biliminsanlar bu durgunlua dinamizm kazandrmann yolunu da buldular: Genlerin kodladproteinlerin yapsn ortaya koymak. Bunun iin de proteom analizi ad verilen proteinlerin flifresiniortaya karmaya ynelik analitik yntemlerle karflmza ktlar.

Biyokimya vegenetik blm

Genomik veproteomik

blm


2/4

Proteom analiziyle hastalklarn ge-liflim srelerini de kapsayan birokbiyolojik olayla proteinlerin yapsal veifllevsel eflitlilii arasnda iliflki kuru-larak, salkl ve hastalkl durumdafarkllaflan proteinler belirlenebilecek.Bu proteinlerin belirlenmesiyle dekanser, kalp-damar hastalklar, hemo-fili ve osteoartirit gibi birok hastalk-ta daha iyi sonular veren teflhis ve te-davi yntemleri gelifltirilerek yeni ila-lar retilebilecek. Yani proteomik yada proteom analiziyle proteinlerin ifl-levleri aydnlanacak. Ancak proteomanalizi olduka da zor bir ifllem. yleki, bu konuda alflan uzmanlar buanalizi DNAnn analiziyle kyaslana-mayacak kadar zor diye ifade ediyor-

lar. Bu zorlu konuyla ilgili olarak, ala-nnn statlarndan biri olan, kanserbaflta olmak zere birok hastalnteflhis ve tedavisinde yol gsterici ola-cak biyoteknolojik arafltrmalara imza-sn atmfl, TBA yesi, 2006 TB-TAK Bilim dl sahibi, Hacettepeniversitesi Kimya Blm retimyesi Prof. Dr. Adil Denizliden bilgialdk. Dr. Denizli, Hacettepe niversi-tesi Kimya Blm Biyokimya labora-tuvarlarnda, ocuklarm dedii

gen bilimcilerden oluflan ekibiyle bir-likte proteom analizi konusunda daevrensel bilime katkda bulunan ol-duka nemli alflmalar yapyor.

nce Proteom szc hakkndabilgi verir misiniz?

PROTEOM bir organizma ya dadokunun genomu tarafndan ifade edi-len proteinlere verilen ad. PROTEinve genOM szcklerinin birlefltirilme-siyle oluflturulmufl. Proteom szcilk kez 1994te, Marc Wilkins tarafn-dan nerilmifl.

Proteom analiziyle ne yaplr?Proteomik olarak tanmlanan

proteom analizi proteinlerin yapsalzelliklerinin belirlenmesini, ifllevleri-nin aydnlatlmasn kapsar. Proteinanalizi DNA analiziyle karfllafltrla-mayacak kadar zordur. DNA yalnzcadrt yap taflndan oluflurken doalproteinler 20 farkl amino asitten olu-flur ve boyutlu yaplar ifllevlerinietkiler. Sizin de belirttiiniz gibi, has-talklara zg proteinlerin belirlenme-

sini amalayan iki nemli biyomolek-ler disiplin var: genomik ve proteo-mik. Genomik alflmalarda hastalkya da fizyolojik srele ilgili genler ta-

nmlanmaya alfllr. Hastaln farklaflamalarnda baz genlerin ifade ora-nnn, yani ifllevselliinin artaca yada azalaca dflncesiyle, bu genler-den oluflan mRNA dzeyleriyle hasta-ln ilerleyifli arasnda bir iliflki kurul-

maya alfllr.Ancak hem insan dokularnda, hem

de maya hcrelerinde mRNAlarn ifa-de dzeyleriyle bu mRNAlardan kod-lanan proteinlerin miktarlar arasnda-ki iliflki konusunda kuflkular var. Bu-nun yan sra bir gen, birok biyolojikiflleve sahip farkl proteinler kodla-makta ve bu proteinler translasyon(evrim) sonras deiflimlere uramak-ta. ou durumda, translasyon sonra-s deiflimler de gen ifllevindenn ba-

msz. Bu nedenlerden dolay, okfazla miktarda bilimsel veri olmasnakarfln genomik alflmalara dayananteflhis yaklaflmlar klinik kullanmiin uygun ve pratik deil.

Aslnda bu durumu daha net ortayakoymak iin bir kyaslama da yapabili-riz. Proteom ile genom arasndaki te-mel farkllklar bu flekilde daha iyi an-lafllr.

Bir organizmann bir genomu amabirok proteomu vardr. Bu nedenleproteom analizi genom analizine gredaha karmaflktr ve ok daha glanalitik tekniklere gereksinim duyar.Genom ve proteom arasndaki diernemli bir fark da, genomun duraanolmas ve zaman iinde deiflmemesi.Buna karfln hcresel proteinler dina-miktir ve srekli deiflime urarlar.Hcre zarna balanabilirler, dierproteinlerle etkileflime girerler, fleker,ya ya da fosfat gibi gruplar kazana-rak deiflime urayabilirler. Proteinlerve/veya modifiye (deiflmifl) protein-ler, hcre tipine ya da farkl hastalkaflamalarna gre, hatta ayn hcredefarkl etkilerle farkllaflabilirler. Prote-

inlerin miktarlar da deiflkendir. r-nein insan kannda albumin deriflimi,interlkin-6dan 106 kat daha fazladr.

Genomun duraan yapsnn aksi-ne proteomun dinamik yaps, proteo-mu organizmada gerekleflen olayla-rn gerek ve eflzamanl belirteci ya-par. Dolaysyla bir organizmann pro-teomunu tanmlamak, genomu tanm-lamaktan ok daha yararldr.

Anlafllan o ki, bir organizmayoluflturan hcrelerin tm ayn geno-

ma sahip olmalarna ramen, genom-da depolanan bilgi, deiflik hcre tr-lerini oluflturmak iin deiflik hcre-lerde farkl flekilde kullanlyor.

Evet. Bafllca hastalklar genlerinyanlfl birlefliminden kaynaklanr. Has-tala neden olan genlerin belirlenme-si bir, iki hatta on deiflik kifliden al-nan genomu sralayarak bulunamaz.Proteomlar zerinde alfllarak hasta-

67Temmuz 2007 BLM veTEKNK

Proteom Analizinin Tarihsel Geliflimi

Protein Kimyas ve Enzimoloji

nsangenomprojesi

Marc Wilkins:Proteomik

yonlaflma Teknolojisi Hzlatom bombardman (FAB)

Peptid Analizleri

MALDI.........................ESI..............................Biyomolekl analizi

MALDI-TOFESI-MS/MSProtein analizi

Bilgisayar Teknolojileri(Swiss-Prot, PC/GENE, GCG, NCBI)

Klause Biemann KtlespektrometresiAminoasit analizi

1958 1981 1987 1990 2000

Gen Bankas

Protein Veritabanlar


3/4

lkl genleri belirlemek daha kolaydr.Hastalklarn geliflimine dier bir ne-den, normal bir proteinin yanlfl biim-de deiflime uramasdr. Bu deiflim,genomik alflmalarla belirlenemez.Yani anlafllaca gibi proteinler hasta-lklarn teflhisinde daha etkili. Zatentedavi iin hemen hemen tm ilalarnhedefleri de proteinler.

Proteom analizinin trlerinden bi-

raz sz eder misiniz? Bir de uygulamaalanlar neler, bu konuyu biraz dahaayrntlandrabilir miyiz?

Proteom analizi de kendi iinde b-lmlere ayrlr. Hcre ya da dokudaifade edilen proteinleri belirleyenekspresyon proteomik; proteinlerin boyutlu tayiniyle ilgilenen yapsalproteomik, proteinlerin ifllevlerini in-celeyen ifllevsel proteomik, hcreler-le hangi kk molekllerin etkileflti-ini inceleyen bir yaklaflm olan ke-moproteomik, protein-protein etkile-

flimi ve proteinlerin hcre iindekiyerlefliminin belirlenmesini kapsayanhcre-haritas proteomik en temelolanlar. En nemli uygulamalar daelbette tp alannda. Bu uygulamalarlahastalklara zg proteinlerin belirlen-mesi ve hastaln profillendirilmesisalanyor. Ama farkl uygulamalar davar; rnein, genel hcre biyolojisi,gen ifllevleri, dzenleme mekanizmala-r, metabolik yollar gibi bilgilendiricigenel uygulamalarda; tarmda; diren

mekanizmalar, verimlilik ve kaliteninartrlmas, hastalk yapc parazit etki-leflimlerini ortaya koymada; alerji vetoksikolojide; yeni ilalarn bulunmas

ve gelifltirilmesinde; teflhis ve tedaviyeynelik alflmalarda genifl bir uygula-ma alan bulmakta proteomik.

Belirttiiniz bu analizler iin farklfarkl teknikler mi sz konusu?

Proteomun karmaflk yaps nede-niyle ok gl analitik tekniklere ih-tiya vardr. Genel olarak kullanlanteknikler tek ve iki boyutlu elektrofo-rez, kapiler elektroforez, kromatografi

(ters faz, iyon deiflim, afinite vb.) veultrafiltrasyon teknikleri.Proteom analizinde iki farkl yakla-

flm sz konusudur. Afladaki fleklin Bblmnde gsterilen yaklaflmda r-nekte yer alan proteinler, yukarda be-lirtilen teknikler kullanlarak ayrlr veardndan her bir protein ktle spek-

troskopisiyle analiz edilir. A harfiylebelirtilen dier yaklaflmdaysa iki fark-l strateji uygulanabilir. 1. stratejideproteinler saflafltrlr ve her bir prote-in proteaz enzimi (tripsin) ile parala-narak oluflan peptid paralar ktlespektroskopisiyle analiz edilir. 2. stra-tejideyse tm proteinleri ieren kar-flm tripsin ile peptidlerine paralanrve ardndan ayrma ifllemine tabi tutu-larak ktle spektroskopisiyle, karflm-da bulunan proteinler tayin edilir.

Proteomikde hangi rnekler kulla-nlr?

Proteom alflmalarnda beyin,kalp, karacier, akcier, kas, pankre-as, dalak, testis gibi insan dokularnnyan sra beyin svs, idrar, tkrk,

hcreler aras sv, amniyotik sv, kanplazmas ve serum gibi biyolojik sv-lar kullanlabilir. En ok alfllan biyo-lojik sv, kan plazmas ve serumdur.Kan santrifjlendikten sonra stte ka-lan sar renkli ksm plazma olarak ad-landrlr ve kann % 55lik ksmnoluflturur. Plazma phtlaflma protein-lerini de ierir ve bu proteinlerin ayrl-masndan sonra geriye kalan ksm se-rumdur.

En ok alfllan biyolojik sv ola-

rak neden kan plazmas kullanyorsu-nuz?Hastalk teflhisinde de kullanlan

temel malzemedir kan. Mililitrede 60-80 mg protein, yani yksek deriflimdeprotein ierir. Kann farkl organlar vedokularla temasta baz proteinlerininayrlmasna ve var olan proteinlerin

68 Temmuz 2007BLM veTEKNK

Genom ve proteom arasndaki iliflki

Proteomik Yaklaflmlar

Hcresel proteinlerin

ayrfltrlmas

Proteom Analizinde Kullanlan Yaklaflmlar

Peptidlereparalama

Peptidlereparalama Ayrma

Blmleme

Transkripsiyon (yazlm)

mRNAformA formCform B

Translasyon (evrim)

ProteinlerinTranslasyon (evrim)sonras deiflimleri

nsan Proteomu(Bir gen birden fazla protein kodlar)

26.000gen

150.000protein

500.000protein

protein cprotein Bprotein A

B1

B2 B3

fosforilasyon dorulama

glikozilasyonheterojenite

BilinenBilinmeyen

Gen (DNA)

Fragment iyonlarMS/MS

MS/MS

2D-jel elektroforezi(molekllerin elektrik

yklerine greayrlmas teknii)


4/4

deiflimine yol aar. Bu proteinlerinbelirli bir fizyolojik durum ya da has-talk durumunda deiflime uramasolasdr. nsan plazma proteinleri ze-rine yaplan son deerlendirmeler, v-cutta yer alan ana protein kategorile-

rinin byk ounluunun kan plaz-masnda yer aldn da gstermifltir.Yani ok sayda protein iermesi nede-niyle plazma, hastalklara zg prote-inlerin belirlenmesi iin ideal bir kay-nak. Ancak plazma proteomu, yapsn-da yer alan proteinlerin genifl deriflimaral (1010) nedeniyle olduka karma-flktr da. rnein kanda albumin deri-flimi 30-50 mg/mL gibi yksek bir de-erdedir. Hastalklara zg proteinler;rnein sitokinler ve prostat spesifik

antijen (PSA) ise pg/mL (yani mililit-rede bir pikogram; ki, bu da gramntrilyonda biri demektir) dzeyindedir.Tm plazma proteinlerinin % 90n 10protein, % 9unu ise 12 protein olufltu-rur ve hastalklara zg proteinler ge-riye kalan % 1lik ksmda yer alr.

Plazmada en fazla bulunan protein-ler hangileri?

Albumin ve immuno-globulinler.Bu proteinler plazma proteinlerinin %80ini olufltururlar ve az miktardaki

dier proteinleri maskelerler. rne-in, iki boyutlu jel elektroforezindennce bu proteinler uzaklafltrlmazsa,

jelde hastalklara zg proteinlere aitnoktalar tespit etmek neredeyse ola-nakszdr. Dolaysyla bu proteinlerinuzaklafltrlmas, proteom analizindebyk nem taflr.

Son yllarda plazma protein ierii-

nin belirlenmesinde albumin ve immu-noglobulinlerin uzaklafltrlmas iinbirok ticari rn gelifltirilmifltir. Burnlerin birounda kullanlan temelyaklaflm, albumine ekilmeye yksekyatknlk gsteren bir tekstil boyasolan Cibacron blue, immunoglobu-

linler iin ise Protein A/G kullan-maktr.

Laboratuarlarnzda gereklefltirdi-iniz alflmalardan biraz sz eder mi-siniz?

alflmalarmzda zellikle albuminve IgG uzaklafltrlmasna ynelik poli-merik malzemeler hazrland ve etkin-likleri ticari rnlerinkiyle karfllaflt-rld. Uluslararas bilimsel dergilerdeyaymlanan alflmalarda plazmadanalbumin ve IgGnin etkin olarak uzak-

lafltrld rapor edildi. Albumini ayr-mak iin boya-afinite (ekim yatknl-) yaklaflmndan yararlanld ve %99,3 uzaklafltrma verimine ulaflld.Ticari bir malzeme olan Aurum SerumProtein Minikit (Bio-Rad, USA) albu-mini en az %96,4 etkinlikle uzaklaflt-ryor. IgG uzaklafltrlmasndaysa, im-mobilize metal afinite kromatografisikullanld. Hazrlanan manyetik mik-rokrelere Cu+2 iyonlar yklendi veplazmadan IgG uzaklafltrma etkinliiarafltrld. Uzaklafltrma, literatrde

ilk kez manyetik kolonlarda gereklefl-tirilmifl oldu. IgG ortamdan %99,4 et-kinlikle uzaklafltrld.

Yeni ufuklara gidiyoruz. ok heye-can verici...

Evet, proteom analizi klinik arafltr-malarda yeni ufuklar ayor; ama bunaramen elde edilen veri miktarn veduyarlln artrmak iin daha aln-mas gereken uzun bir yol var.

G l g n A k b a b a

KaynaklarE.B. Altntafl, A. Denizli, J. Chromatogr. B 832 (2006) 216.M. Karatafl, S. Akgl, H. Yavuz, R. Say, A. Denizli, Int. J. Biol. Mac-

romol. 40 (2007) 254

69Temmuz 2007 BLM veTEKNK

Kan ve plazma

Poli (glisidil metakrilat) mikrokrelerinSEM fotoraf

Albumin ve IgGnin uzaklafltrlmas

Plazma (%55)

Akyuvarlar ve kanpulcuklar(trombositler) (%1)

Alyuvarlar (%45)

1) Kan, kaynandan alnr 2) Santrfjlenir

A) Albumin ve IGguzaklafltrlmadan nce

B) Albumin ve IGguzaklafltrldktan sonra

bilimteknik protein 072007

Documents