LEGAMI BIOLOGICI

Un legame chimico rappresenta una forza d’attrazione che tiene uniti gli atomi; originariamente si pensava che soltanto i legami covalenti potessero tenere uniti gli atomi per formare delle molecole, ma in seguito è stato visto che le forze attrattive deboli sono molto importanti per la formazione di complessi costituiti da più macromolecole (basti pensare alla molecola dell’emoglobina, dove le quattro sub unità che la compongono sono tenute insieme dall’azione combinata di vari legami deboli); comunque è ora consuetudine definire come legami chimici anche le interazioni deboli non sufficientemente forti, quando prese singolarmente, da legare stabilmente tra di loro due atomi. Un’importante caratteristica dei legami risulta quindi essere la loro forza; i legami forti non vengono quasi mai distrutti alle temperature fisiologiche (questa è la ragione per cui gli atomi uniti da legami covalenti fanno sempre parte di un’unica molecola), a differenza di quelli deboli che vengono rotti molto facilmente ed hanno una vita molto breve se il loro numero è esiguo (questi legami, infatti, diventano stabili soltanto quando sono numerosi e disposti in gruppi ordinati). Siccome, però, i legami biologicamente importanti devono essere dinamici, non possono essere estremamente forti, per cui raramente si tratta di legami covalenti, in cui si ha condivisione di elettroni e un’energia di legame elevata (50-110 kJ mol-1); per cui i legami che maggiormente di riscontrano nelle macromolecole biologiche sono:

LEGAMI IONICI

Molte macromolecole organiche possiedono al loro interno gruppi ionici che contengono una o più cariche nette positive o negative; per esempio, i mononucleotidi hanno una carica netta negativa, in quanto posseggono un gruppo fosfato, mentre gli amminoacidi (eccetto la prolina) hanno sia una carica netta negativa sul gruppo carbossilico, che una carica netta positiva sul gruppo amminico; queste cariche sono generalmente neutralizzate da gruppi dotati di una carica opposta che si trovano nelle vicinanze. Le forze elettrostatiche che agiscono fra gruppi aventi carica opposta formano i legami ionici; in strutture cristallizzate le interazioni fra gli ioni sono forti e possiedono energie di circa 80 Kj mol-1, tuttavia, in un solvente come l’acqua, gli ioni sono rivestiti da uno strato di molecole d’acqua che non permette di legare direttamente i gruppi aventi carica opposta, per cui l’energia viene dispersa (dalle molecole del solvente) e i legami diventano perciò molto più deboli (1-3 Kj mol-1).

LEGAMI A IDROGENO

Nella formazione del legame a idrogeno è implicato un atomo di idrogeno, coinvolto in un legame covalente con elementi molto elettronegativi come fluoro ossigeno e azoto, i quali attraggono a sé gli elettroni di valenza, assumendo una parziale carica negativa e lasciando l’idrogeno con una parziale carica positiva; il legame a idrogeno si forma, quindi, quando questo atomo di H viene in contatto con un doppietto elettronico di un gruppo funzionale di un’altra molecola, il quale lega l’H e viene definito accettore; il gruppo dove l’H è legato in maniera covalente viene detto donatore. Il legame a idrogeno presenta un’energia compresa fra 3-7 Kj/mol e risulta essere più forte nel caso in cui l’H giace in linea retta con l’atomo accettore (quindi i legami a idrogeno sono orientati), mentre, se si forma un angolo superiore ai 30°, l’energia di legame diminuisce notevolmente.

FORZE DI VAN DER WAALS

I legami di van der Waals sono determinati da forze di attrazione non specifiche, che si creano quando due atomi si avvicinano l’uno all’altro; essi non sono basati su una separazione permanente di carica, ma piuttosto sulle fluttuazioni di carica indotte dalla vicinanza reciproca fra molecole diverse; queste interazioni si possono creare fra tutti i tipi di molecole, sia polari

che non polari, e dipendono dalla distanza reciproca (l’energia di legame infatti è inversamente proporzionale alla distanza). Gli atomi che sono coinvolti in questo tipo di legame, infatti, possono avvicinarsi solo fino a una certa distanza, oltre la quale i due atomi tendono a respingersi a causa della sovrapposizione dei loro elettroni localizzati sul guscio + esterno; perciò si forma un equilibrio tra i due atomi ad una distanza ottimale (chiamata raggio di van der Waals) oltre questa distanza si crea una repulsione, mentre, se i due atomi vengono allontanati, l’energia del legame diminuisce. La forza di questi legami è comunque molto bassa (all’incirca 1 Kj/mol), per cui diventano rilevanti solamente nel caso in cui sono presenti in grande quantità (per esempio questi legami stabilizzano la molecola di DNA).

ATTRAZIONI IDROFOBICHE

Le molecole apolari (o sostanze idrofobiche) tendono a ridurre al minimo le interazioni con l’acqua, interagendo fra di loro a formare delle strutture compatte in cui è esposta la minima parte possibile alle molecole del mezzo idrofilico; queste forze che si creano fra molecole apolari rappresentano le attrazioni idrofobiche, che ritroviamo, per esempio, nella formazione del doppio strato lipidico delle membrane cellulari.

PROTEINE

STRUTTURA

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TECNICA: SDS-PAGE

Lo scopo di questo esperimento è andare a determinare il peso molecolare delle proteine e la loro lunghezza in termini di amminoacidi, effettuando un’elettroforesi su gel di acrilammide in presenza di SDS. Per calcolare il peso molecolare di una proteina bisogna far uso di un setaccio Preparazione del setaccio: MATERIALI:

- Acrilammide (in alcuni esperimenti di elettroforesi, però, il gel può essere anche di agarosio; la differenza è che la poliacrilammide ha elevate capacità di risoluzione, ma è in grado di separare le molecole solo in un ambito ristretto di dimensioni; per esempio la poliacrilammide sarà in grado di separare molecole di DNA che differiscono solo per una singola coppia di basi, ma ciò avviene solo con molecole lunghe fino a qualche centinaio di paia di basi; l’agarosio invece ha una capacità di risoluzione inferiore, ma è in grado di separare molecole di DNA lunghe fino a decine, o centinaia, di chilobasi), una molecola che volendo può essere sciolta e poi fatta polimerizzare in modo da formare un gel di poliacrilammide (la poliacrilammide a differenza dell’acrilammide, che è una sostanza neurotossica, non è nociva per il nostro organismo), che presenterà maglie più o meno fitte, a seconda della concentrazione di acrilammide che abbiamo usato (per esempio se prepariamo un gel al 10% o al 20% il primo presenta delle maglie più larghe). Di conseguenza, facendo passare delle molecole attraverso questo gel, quelle più grandi saranno rallentate, mentre quelle più piccole si muoveranno più velocemente.

- Acqua.- Un tampone (tris-HCl a pH 8).- SDS (sodio dodecil solfato), un detergente ionico abbastanza forte, che è in grado di

rompere i legami idrofobici presenti nelle proteine, contribuendo alla perdita della loro struttura spaziale (le proteine si comporteranno, quindi, come dei polimeri non strutturati, che possiedono, cioè, solo la struttura primaria); gli ioni SDS sono poi in

grado di legarsi alle proteine, caricando negativamente la catena amminoacidica, così che possa migrare nel gel sotto l’effetto del campo elettrico.

- Ammonio persolfato, che un catalizzatore per la polimerizzazione dell’acrilammide.- TEMED (tetraetildiammina), che è l’iniziatore della polimerizzazione dell’acrilammide.

METODO:1) Per sciogliere l’acrilammide si prepara una soluzione in cui sono contenute le sostanze

suddette;2) Creo uno stampo viene utilizzando due lastre di vetro (una rettangolare e una con due

“orecchie”) e due striscioline di plastica dello spessore di 2mm. Pongo ai lati della lastra con le “orecchie” le strisce di plastica e sopra metto la seconda lastra grazie alle strisce si crea una camera d’aria tra le due lastre;

3) la soluzione viene rovesciata all’interno dello stampo;4) si prepara una nuova soluzione con una concentrazione di acrilammide più bassa (per

esempio al 5%, mentre nella prima soluzione poteva essere al 10%) e a pH di 6,8 (il pH + acido è necessario, in quanto questa parte del gel verrà utilizzata per costituire i pozzetti, dove si mettono i campioni quindi, utilizzando un pH + acido, le proteine non sentono subito la carica negativa dell’SDS e si addensano in un solo punto, cioè si dispongono tutte sulla stessa linea; questo gel prende il nome di stacking gel, che si distingue dal running gel, cioè quello preparato a pH 8, nel quale, invece, le proteine si muovono a velocità differenti in base al loro peso molecolare);

5) anche questa soluzione viene rovesciata nello stampo, ma prima che solidifichi, si inserisce un pettine, che poi sarà rimosso una volta avvenuta la polimerizzazione e che sarà servito per creare i pozzetti nei quali inserire i campioni.

Le proteine da analizzare, però, si devono presentare tutte con una struttura primaria, perché, comunque, tutte le proteine hanno una struttura spaziale ben precisa che potrebbe influenzare il loro passaggio nel gel e quindi falsare i risultati ottenuti: per cui bisogna andare a rompere tutti i legami che permettono la formazione di tutte le strutture secondarie, terziarie e quaternarie6) si utilizza sia l’SDS, che è in grado di rompere dei legami idrofobici;7) inoltre si usa il β-mercaptoetanolo, che è in grado di rompere i ponti disolfuro;8) infine si scalda il campione a 100°C (l’alta temperatura infatti rompe tutti gli altri legami, in

modo da linea rizzare completamente tutta la struttura).

9) Una volta preparati i campioni, questi vengono inseriti nei pozzetti con l’ausilio di una siringa.

A questo punto le proteine devono attraversare il gel: per farlo si usa un apparato per elettroforesi: ci sono due vaschette, contenenti un tampone a pH 8, poste ai capi delle lastre di vetro.Ad una vaschetta (solitamente a quella inferiore) è collegato il polo positivo di un elettrodo, mentre a quella in posizione superiore è collegato il polo negativo.Si accende la corrente e si provoca la formazione di un campo elettrico: le proteine, che grazie all’SDS sono cariche negativamente, iniziano a muoversi nel gel dirigendosi verso il polo positivo.Nel running gel le proteine si dividono in base alla loro lunghezza (quelle + lunghe si muovono + lentamente). Finita l’elettroforesi, tolgo il vetro e pongo il gel in un colorante, il blu di Coomassie e pongo in acqua di modo da eliminare il colorante che non si è legato alle proteine e lasciare solo quello legato: utilizzando il colorante si evidenziano sul gel delle bande, che corrispondono a gruppi dei proteine con PM omogeneo. La corsa elettroforetica ha un andamento logaritmico: questo può essere sfruttato per andare a calcolare il peso molecolare delle proteine isolate: si costruisce un grafico, in cui nell’asse dell’ascisse si indica la distanza di migrazione delle proteine (con numeri decimali), mentre nell’asse delle ordinate si indica il PM (in scala logaritmica).Grazie all’utilizzo di proteine markers, cioè a PM noto, si costruisce una retta di taratura, su cui poter individuare approssimativamente il PM delle proteine di interesse: per poterlo fare si misura la distanza di migrazione della proteine di interesse (dal punto di inizio fino al punto in cui ha migrato) e, una volta individuata, basandosi sulla retta di taratura costruita, si evidenzia il PM molecolare della proteina considerata. La tecnica della SDS-page (SDS-poliacrilammide gel) può essere usata anche per purificare le proteine, poiché le separa; una proteina denaturata, inoltre, può essere sfruttata per studiarne la sequenza amminoacidica.

ACIDI NUCLEICI

SCOPERTA DEL DNA COME MATERIALE GENETICO

Prima della scoperta del DNA, gli studiosi erano tutti d’accordo sull’affermare che doveva esistere un materiale, che permetteva il trasferimento dell’informazione genetica da una generazione all’altra; tale materiale doveva possedere tre caratteristiche principali:- Doveva contenere, in forma stabile, l’informazione riguardante la crescita, lo sviluppo e le

funzioni svolte dalle cellule di un organismo- Doveva essere in grado di replicarsi in maniera accurata, di modo che ogni cellula

dell’organismo contenesse la stessa informazione genetica- Doveva essere in grado di sottoporsi a variazione, in quanto, se questo non fosse possibile,

gli organismi non potrebbero evolversi e adattarsi all’ambiente in cui vivonoFino al 1940 gli studiosi erano fermamente convinti che il materiale genetico fosse rappresentato dalle proteine, perché erano tante e i 20 amminoacidi potevano costituire un alfabeto valido per esprimere le varie informazioni. Gli acidi nucleici vennero scoperti solo nel 1869, grazie a Miescher, il quale li isolò dal pus ritrovato nelle bende dei soldati della guerra franco-prussiana; il DNA però aveva un alfabeto di sole 4 lettere, che non sembrava adatto a esprimere l’informazione genetica. Nonostante questo, il DNA, a differenza delle proteine, la cui quantità e qualità è diversa da cellula a cellula, è presente in quantità costante in tutte le

cellule, escludendo quelle della linea germinale, dove la quantità di DNA è la metà di quella che si trova nelle cellule somatiche (questo perché, normalmente, una cellula germinale si unisce con un’altra cellula germinale, nel fenomeno della fecondazione, dando quindi origine ad una cellula con la stessa quantità di DNA delle cellule somatiche). Diversi esperimenti portarono ad identificare definitivamente il DNA come materiale genetico.

ESPERIMENTO DI GRIFFITH

Nel 1927 Griffith stava effettuando degli studi sul batterio Streptococcus pneumoniae, un agente patogeno della polmonite. Di questo batterio Griffith utilizzò due ceppi: il ceppo S (virulento e avvolto da un guscio liposaccaridico) e il ceppo R (non virulento e non avvolto dal guscio liposaccaridico); il ceppo S dava origine a delle colonie lisce (per la presenza della capsula), mentre il ceppo R dava origine a delle colonie rugose. A questo punto vennero effettuati diversi esperimenti, basati sull’iniezione di questi batteri all’interno di un topo e Griffith osservò che: - Nel caso in cui, nel topo, erano stati iniettati batteri del ceppo S, il topo moriva. - Con batteri del ceppo R, il topo restava in vita.- Iniettando nel topo batteri del ceppo S, che erano stati precedentemente uccisi al calore, il

topo restava, anche in questo caso, in vita.- Se, invece, si prendono delle cellule del ceppo S uccise al calore e si uniscono insieme a

cellule del ceppo R ancora vive e il tutto si inietta all’interno del topo, il topo muore; di conseguenza qualcosa si era trasferito dalle cellule del ceppo S a quelle del ceppo R, rendendole virulente Griffith chiamò questo qualcosa, principio trasformante.

ESPERIMENTO DI AVERY

10 anni dopo l’esperimento di Griffith, Avery, insieme ai suoi assistenti MacLeod e McCarty, eseguì un nuovo esperimento per cercare di spiegare la natura del principio trasformante. In questo esperimento si presero delle cellule del ceppo S concentrate tramite centrifugazione e vennero denaturate al calore rompendo queste cellule, si potette prelevarne il loro contenuto; a questo punto l’estratto cellulare venne messo in contatto con delle cellule del ceppo R, che a questo punto venivano trasformate in cellule virulenti. Per capire quale fosse il principio trasformante, l’estratto cellulare venne trattato con degli enzimi idrolizzanti, in modo da eliminare una per volta tutte quelle sostanze che potevano essere il materiale genetico. Andando a trattare l’estratto con delle proteasi, il principio trasformante rimaneva attivo (questo esclude che le proteine possano essere il materiale genetico) la stessa cosa succedeva trattando l’estratto con delle RNAasi, ma non con delle DNAasi (in quest’ultimo caso infatti, le cellule del ceppo R restavano non virulenti). Questo esperimento aveva già dimostrato che il materiale genetico fosse il DNA, ma era comunque un esperimento sporco perché magari le proteasi non andavano ad idrolizzare tutte le proteine, per cui molti studiosi restarono fermi sull’ipotesi che fossero le proteine ad essere il materiale genetico.

ESPERIMENTO DI HERSEY E CHASE

La definitiva dimostrazione che il DNA fosse il materiale genetico provenne dagli esperimenti effettuati da Hersey e Chase. In questi esperimenti, vennero utilizzati dei batteriofagi T2, che messi in contatto con cellule di E.coli, erano in grado di infettarle dando vita ad un ciclo litico, durante il quale iniettano il proprio materiale genetico all’interno dell’ospite e sfruttano il suo apparato biosintetico per replicarsi. Una particella virale è costituita solamente da un cromosoma di DNA o RNA, avvolto da un involucro proteico; per cui il materiale genetico poteva essere costituito solo da DNA o da proteine. Per scoprire la natura del materiale genetico, i due studiosi presero due colture di E.coli fatte crescere, una in un terreno con fosforo radioattivo (32P) e l’altra in un terreno con zolfo radioattivo (35S): scelsero S e P perché

lo S è presente nelle proteine (cisteina e metionina) ma non nel DNA, mentre il P è presente nel DNA ma non nelle proteine; a questo punto si lasciarono infettare entrambe le colture da parte di fagi T2, di modo da marcare radioattivamente, in un caso la parte proteica dei fagi e nell’altro caso il DNA. Una volta avvenuta l’infezione, tramite centrifugazione, si provocò il distacco fra i batteri e le ombre fagiche (parti proteiche) e si andò ad analizzare la radioattività presente nelle due soluzioni: se il fago era stato marcato con S radioattivo, la radioattività era presente soprattutto a livello delle ombre fagiche, mentre se il fago era stato trattato con P radioattivo, la radioattività era presente soprattutto nelle cellule batteriche e nella progenie fagica. In questo modo venne dimostrato che era il DNA ad essere entrato nelle cellule batteriche e che, quindi, il DNA rappresentava il materiale genetico.

STRUTTURA DEL DNA

Il DNA è un acido nucleico e presenta come monomero il nucleotide, che è costituito da 3 parti fondamentali: uno zucchero pentoso (che può essere il ribosio nell’RNA o il desossiribosio nel DNA; la differenza sta nel fatto che nel desossiribosio manca un ossigeno nel C in 2), una base azotata (che si lega sempre al C in 1 dello zucchero e può essere una purina o una pirimidina; le purine sono l’adenina e la guanina, mentre le pirimidine sono la citosina, la timina e l’uracile; l’uracile è presente solo nell’RNA, mentre la timina solo nel DNA) e un fosfato (che si lega sempre al C in 5 dello zucchero; volendo i gruppi fosfato legati allo zucchero possono essere anche due o tre, dare i nucleotidi di- o trifosfato). Il legame che unisce due nucleotidi fra di loro è il legame fosfodiesterico, che avviene tra l’OH del C in 3 di un nucleotide e il fosfato in 5 del nucleotide successivo (il fosfato che forma il legame è quello in α); un polimero di nucleotidi può essere letto sia da destra a sinistra, che da sinistra a destra, solamente che la sequenza delle basi nei due casi cambia; per cui si parte sempre dall’estremità 5’ dove è presente un fosfato libero, fino ad arrivare all’estremità 3’ dove è presente un OH libero. Se dei filamenti di DNA o RNA vengono messi in una soluzione acquosa, le basi azotate, essendo idrofobe, tendono a interagire fra di loro, mentre le regioni del fosfato, essendo idrofile, tendono a interagire con l’acqua per neutralizzare le proprie cariche negative; si crea, in questo modo, un gradiente di affinità all’acqua all’interno del nucleotide e il filamento si ripiega in modo da formare una sorta di “sfera” che presenterà al suo interno le basi azotate, che interagiscono fra loro e all’esterno i fosfati, che interagiscono con le molecole del mezzo acquoso. Una molecola di DNA, invece, è costituita da due catene polinucleotidiche che sono tenute insieme da legami a idrogeno che si instaurano fra le coppia di basi; l’adenina di una catena è sempre appaiata con la timina che si trova sull’altra catena e, parallelamente, la guanina è sempre appaiata con la citosina. Questo perché l’ingombro trasversale di A+T è di all’incirca 10Å, quello di A+G è di all’incirca 13Å, quello di G+C è di all’incirca 10Å e infine quello di C+T è inferiore di 10Å; per cui, in modo da mantenere i ritti (o scalini) del DNA tutti paralleli fra di loro un’adenina si associa sempre con una timina formando 2 legami a idrogeno, mentre una guanina si associa sempre con la citosina formando 3 legami a idrogeno. Sempre all’interno della molecola di DNA si evidenziano degli spazi fra le varie coppie di basi: questi sono dovuti all’azione delle forze di van der Waals che agiscono fra le coppie di basi azotate e danno origine alla cosiddetta energia di impilamento (queste forze prese singolarmente sono molto deboli, ma insieme danno un contributo importante nello stabilizzare la molecola di DNA).

STUDI SUL DNA

Per arrivare a definire la struttura del DNA, Watson e Crick si basarono sugli studi effettuati da Chargaff, sulla composizione in basi, e da Rosalind Franklin, sulla diffrazione dei raggi X.

STUDI SULLA COMPOSIZIONE IN BASI

Grazie ai suoi studi Chargaff aveva dimostrato che in qualsiasi tipo di DNA a doppia elica la quantità di purine era sempre uguale a quella di pirimide e, in modo particolare, la quantità di adenina era pari a quella di timina e la quantità di guanina era uguale a quella di citosina. Chargaff arrivò a queste conclusioni effettuando un esperimento basato sulla cromatografia:

1) Tramite trattamento chimico si idrolizza il DNA di diversi organismi andando a rompere tutti i legami fosfodiesterici presenti nella molecola.

2) Si preleva una goccia di ogni campione contenente i nucleotidi andandola a disporre su una lastrina di vetro, su cui è stato precedentemente stratificato un sottilissimo strato di fosfocellulosa (un tipo di cellulosa caricata con gruppi fosforici che si comporta come una carta assorbente per affinità di carica), che viene successivamente immersa in una vaschetta contenente un eluente, in modo che la soluzione arrivi poco sotto il punto di deposizione dei nucleotidi.

3) L’eluente sale per capillarità e trascina con sé a velocità differente i vari nucleotidi (la diversa velocità è dovuta al fatto che i vari nucleotidi hanno una diversa affinità con l’eluente e con la matrice su cui l’eluente si muove: la diversa affinità dipende dalla loro carica e quindi dalla base azotata presente, che è l’unica parte della molecola variabile).

4) Una volta conclusa la cromatografia (quando l’eluente è arrivato all’incirca in cima alla lastrina), andando ad analizzare i dati (analisi che può essere effettuata sfruttando la capacità delle basi azotate di assorbire gli UV e quindi illuminando la lastrina con una lampada a UV oppure si può marcare radioattivamente i nucleotidi con fosforo radioattivo e in seguito misurare la radioattività per rilevarne concentrazione e posizione), Chargaff si accorse che la dA (=desossiadenina) era stata il nucleotide + lento a risalire ed era seguita, nell’ordine, da dC T (non metto la “d” perché la timina non c’è nell’RNA) e dG; ma, cosa più importante, grazie a questi esperimenti Chargaff si accorse che la quantità di A era uguale a quella di T, mentre quella di G era uguale a quella di C questo è valido in ogni molecola di DNA.

STUDI DI DIFFRAZIONE DEI RAGGI X

Rosalind Franklin aveva studiato fibre isolate di DNA mediante la tecnica della diffrazione dei raggi X, una procedura nella quale un fascio parallelo di raggi X viene diretto su un arrangiamento regolare e ripetuto di atomi; il raggio viene diffratto dagli atomi secondo uno schema che è caratteristico della disposizione spaziale degli atomi nella molecola. I raggi X diffratti vengono registrato su una lastra fotografica; analizzando la fotografia, Franklin ottenne delle informazioni sulla struttura atomica della molecola e concluse che il DNA doveva essere una struttura ad elica che presentava due periodicità distintive di 0,34nm e di 3,4nm lungo l’asse della molecola.

IL MODELLO DI WATSON E CRICK

Watson e Crick utilizzarono gli studi effettuati in precedenza per costruire il proprio modello tridimensionale della struttura del DNA, dove questo era presentato come una doppia elica, nella quale si riscontravano le seguenti caratteristiche:

- La molecola di DNA consiste di due catene polinucleotidiche avvolte l’una intorno all’altra a formare una doppia elica destrorsa (ossia, immaginando di guardare lungo l’asse centrale dell’elica, i due filamenti si avvolgono in senso orario).

- Le due catene sono antiparallele, in quanto i filamenti sono orientati, uno in direzione 5’-3’ e l’altro in direzione 3’-5’. Le impalcature di zucchero-fosfato si trovano all’esterno della doppia elica, mentre le basi azotate sono orientate verso l’asse centrale dove interagiscono (insieme, zucchero – fosfato - base azotata, presentano un ingombro sterico di all’incirca 20Å).

- La doppia elica è tenuta insieme da legami a idrogeno che si instaurano fra le basi azotate

- Le coppie di basi distano di 0,34nm e un giro completo dell’elica richiede 3,4nm per cui in ogni giro d’elica sono presenti 10 coppie di basi che sono ruotate di 36° le une rispetto alle altre

- A causa del tipo di legame tra le basi, le impalcature zucchero-fosfato non si trovano sempre alla stessa distanza dall’asse dell’elica questo provoca la formazione di due solchi con dimensione differente, che vengono chiamati solco maggiore e solco minore; i solchi sono importanti perché sono gli unici punti in cui le basi azotate possono essere contattate da proteine.

È importante ricordare che i singoli filamenti di DNA da soli non formano un’elica, ma un random coil; l’elica si forma solo nel caso dell’intera molecola di DNA con due filamenti.

VARIE FORME DEL DNA

I parametri che sono stati descritti nel modello di Watson e Crick non sono però sempre validi, poiché tendono a variare a seconda della fase del ciclo cellulare in cui si trova il DNA, perché diverse sono le condizioni ambientali riscontrate nei vari momenti; esistono per questo varie isoforme del DNA in funzione della loro idratazione e situazione fisiologica/in vitro in cui si trovano:

- Forma B: è la forma che è stata descritta da Watson e Crick, che si osserva in un ambiente molto acquoso (all’incirca il 92% di acqua) e con bassa forza ionica (bassa salinità); contiene 10 paia di basi per giro d’elica, ha un ampio solco maggiore ed un solco minore più chiuso. L’angolo di rotazione tra due coppie di basi è di 36° e il diametro dell’intera molecola di 20Å.

- Forma A: si ottiene da una soluzione con un più basso contenuto d’acqua (per esempio per passare dalla forma B alla A si può aggiungere glicerolo nella soluzione) e con una salinità più elevata (si aggiungono degli ioni per passare dalla B alla A); ci sono 11 paia di basi per giro d’elica, il solco maggiore è più stretto rispetto alla forma B mentre quello minore è più aperto; l’angolo di rotazione tra due coppie di basi è di 32,7° mentre il diametro dell’intera molecola è di 23Å; se la forma B è la forma con cui la maggior parte del DNA della cellula si presenta, il DNA A è quello che si trova specialmente in corrispondenza di complessi con proteine.

- Forma C: se l’umidità relativa diminuisce ancora (all’incirca 66%) e ci troviamo in presenza di litio, il DNA cambia ancora la sua conformazione e si riscontra un nuovo cambiamento dei parametri: il numero di paia di basi per giro d’elica diminuisce (all’incirca 9,3), la distanza fra le basi aumenta (infatti l’angolo di rotazione tra due coppie di basi è di 38°) e il diametro dell’intera molecola diminuisce (arriva intorno ai 19Å).

- Forma Z: è una particolare forma in cui il DNA si presenta come un’elica sinistrorsa; per comprendere come possa formarsi questo tipo di elica bisogna considerare il legame glicosidico che lega la base al desossiribosio: tale legame può presentarsi in una delle due conformazioni, definite sin o anti; nella conformazione destrogira il legame glicosidico è sempre nella forma anti, mentre nella forma levogira vi sono delle fondamentali ripetizioni di dinucleotidi purine-pirimidine che presentano il legame glicosidico nella forma anti sui residui pirimidinici e nella forma sin sui residui purinici. La forma sin è responsabile dell’avvolgimento in senso levogiro dell’elica, mentre il fatto che ci sia un’alternanza tra forme sin e anti determina la caratteristica conformazione a zig-zag del DNA Z. Questa forma è stata per la prima osservata in laboratorio tramite la sintesi di zone ricche in G/C o A/T e fornendo molta energia: le eliche sinistrorse ottenute sono state successivamente iniettate in conigli, che sono stati in grado di produrre degli anticorpi contro il DNA Z, dimostrando che tale forma doveva esistere anche in natura. La forma Z del DNA è molto energetica ed è quindi ritenuta un metodo

di salvataggio per evitare la rottura del DNA in seguito ad un eccesso di energia. Il numero di basi per giro d’elica in questo caso sono 12.

PURIFICAZIONE DEL DNA

Il processo di purificazione del DNA consta di diversi passaggi:1) Si permette la crescita di cellule batteriche in una piastra di Petri e in seguito si centrifuga in modo da prelevare queste cellule.2) Le cellule vengono trattate con degli enzimi che agiscono andando a rompere la parete cellulare e a questo punto si prosegue utilizzando un meccanismo che permetta di rompere anche la membrana e ottenere un estratto cellulare: i meccanismi sono vari: possiamo trattare con dei detergenti, utilizzare degli ultrasuoni (ma in tal caso si rischia di rompere anche il DNA) oppure provocare una lisi osmotica (ponendo le cellule in un ambiente ipotonico).3) L’estratto cellulare viene centrifugato in modo da separare i lipidi, che rimangono in

superficie e possono così essere eliminati.4) La soluzione ottenuta viene immersa in un tampone composto da Tris-HCl (a pH 7,5 che

serve per mantenere un pH adeguato e circa costante) e EDTA (un sistema che è in grado di catturare gli ioni bivalenti, che sono una causa di rottura per il DNA).

5) Per eliminare le proteine dalla sospensione, si usa un denaturante delle proteine, il fenolo, una sostanza non idrosolubile e più pesante dell’acqua.

6) La beuta dove è presente il tutto viene agitata in modo da far emulsionare le due fasi: in questo modo le micelle di fenolo vanno a contatto con le proteine e le legano; poi le micelle si separano nuovamente dall’acqua e trascinano sul fondo le proteine denaturate; per velocizzare il processo si può centrifugare e mettere il tutto in una provetta.

7) Alla fine si formano 3 strati: sul fondo si deposita il fenolo; in uno strato intermedio, biancastro, si impaccano le proteine denaturate. Sopra rimane la fase acquosa che contiene al suo interno polisaccaridi, RNA, DNA, ioni…

8) Con una pipetta si trasferisce la fase acquosa in un becker. 9) Per separare il DNA dall’acqua e da tutte le altre molecole idrofile ancora presenti, si versa

lentamente lungo la parete del becker etanolo freddo, mescolando intanto con una bacchetta di vetro (viene scelto questo materiale perché il vetro attira elettrostaticamente il DNA).

10)L’etanolo sottrae acqua al DNA, che di conseguenza si raggruppa a formare dei grossi complessi che precipitano avvolgendosi attorno alla bacchetta.

11)Si estrae la bacchetta e si asciuga per eliminare eventuale etanolo.12) Il DNA ottenuto a questo punto non è puro al 100%; le impurità sono dovute alla presenza

di piccole molecole rimaste impigliate (l’RNA solitamente rimane in soluzione perché le sue molecole sono troppo piccole per essere raccolte con la bacchetta).

13)Per eliminare le impurità si rimette il DNA nel tampone TE e si tratta con RNAasi e polisaccaridasi.

14)Per togliere questi enzimi tratto nuovamente con fenolo e poi riprendo il DNA con la bacchetta (ripeto l’esperimento fatto in precedenza); a questo punto il DNA ottenuto è puro al 99% perché abbiamo ridotto al minimo la presenza di inquinanti.

CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE DEL DNA

Viscosità del mezzoCome spiegato nel procedimento di purificazione, una molecola di DNA può essere raccolta su una bacchetta di vetro; quando viene nuovamente immersa in un tampone acquoso TE si reidrata, tornando in soluzione e aumentando la viscosità del mezzo. Si può assumere che le molecole d’acqua si dispongano formando una serie di foglietti sovrapposti dello spessore di una molecola d’acqua, chiamati filetti fluidi: la viscosità viene quindi intesa come la

possibilità dei filetti fluidi di scorrere gli uni rispetto agli altri; il DNA si dispone in maniera casuale attraverso diversi strati, con cui interagisce, e, di conseguenza, va a limitare il movimento dei filetti, provocando un aumento della viscosità. La viscosità del mezzo è quindi in funzione della lunghezza del filamento del DNA. Questa proprietà può essere utilizzata per verificare l’integrità del DNA, perché, basandosi sul concetto che filamenti più lunghi provocano un aumento maggiore della viscosità rispetto ai filamenti più corti, se il DNA si rompe la viscosità diminuisce, in quanto i filamenti interagiscono con un minor numero di filetti fluidi.

Assorbanza ed effetto della temperatura sul DNAPoiché i due filamenti della doppia elica di DNA sono tenuti insieme mediante dei legami relativamente deboli, ci si può aspettare che siano facilmente divisibili: prendendo infatti una soluzione contenente all’interno del DNA e scaldandola ad una temperatura superiore a quella fisiologica (all’incirca intorno ai 100°C) con un pH elevato, si ottiene la separazione dei due filamenti, secondo il processo noto come denaturazione del DNA. Tale processo è comunque reversibile, perché, infatti, quando la temperatura della soluzione viene abbassata lentamente, i singoli filamenti spesso incontrano quelli complementari e riformano una regolare doppia elica (la possibilità di rinaturare filamenti di DNA complementari è alla base dei processi di ibridazione, dove si formano delle molecole artificiali semplicemente abbassando la temperatura di una miscela di DNA denaturato proveniente da fonti diverse. Volendo, allo stesso modo, si possono anche formare degli ibridi mescolando dei filamenti complementari di DNA e RNA). Basandoci, quindi, su questi concetti, si possono fare alcune considerazioni riguardanti l’assorbanza del DNA nelle diverse condizioni in cui si trova. Sappiamo che le basi azotate del DNA sono in grado di assorbire luce nel campo dell’ultravioletto, ma la loro assorbanza, come vedremo, dipende dalla molecola in cui si trovano. Questi esperimenti vengono effettuati facendo uso di uno spettrofotometro, uno strumento la cui struttura può essere schematizzata nel modo seguente:

- Una sorgente di radiazioni UV- Una parete opaca alle radiazioni, con un foro centrale di diametro noto- Una cuvetta di quarzo (tale materiale è infatti trasparente agli UV) nel quale viene

inserita la soluzione della quale si vuole studiare l’assorbanza- Un contaraggi in grado di misurare la radiazione che arriva alla fine dello strumento

La quantità di energia che arriva alla provetta è nota perché sono note la potenza della sorgente e il diametro del foro; di conseguenza il compito del contaraggi sarà quello di andare a calcolare la quantità di energia luminosa che è stata trattenuta nel caso in cui nella provetta fosse presente del DNA. La quantità di luce assorbita è all’incirca uguale alla quantità di basi azotate presenti e viene espressa in assorbanza o densità ottica, che corrisponde circa a 40/50µg di DNA per ml di soluzione. Con lo spettrofotometro vengono effettuati 3 esperimenti, in cui varia la soluzione usata:1) Soluzione di N nucleotidi non polimerizzati2) Soluzione di N nucleotidi polimerizzati in singolo filamento3) Soluzione di N nucleotidi polimerizzati in doppio filamentoTutte e 3 le soluzioni presentano la stessa concentrazione di DNA e, effettuando le analisi, si riscontra che in tutti e 3 i casi il picco d’assorbimento è a 260nm (per le proteine è intorno ai 280nm), ma la prima soluzione assorbe + della seconda, che a sua volta assorbe + della terza. Questo fenomeno viene chiamato effetto ipercromico ed è dovuto al fatto che i singoli nucleotidi non polimerizzati sono disposti casualmente in soluzione ed espongono le proprie basi alle radiazioni nel singolo filamento invece le basi sono impilate e quindi meno esposte nel doppio filamento, infine, le basi sono protette dallo scheletro zucchero-fosfato e per questo assorbono ancor meno radiazioni. Utilizzando, inoltre, la legge di Lambert-Beer è possibile andare a misurare la concentrazione di DNA in soluzione:

A = ε * l * c

Dove A è l’assorbanza registrata, ε è il coefficiente di estinzione molare (che dipende dalla lunghezza d’onda della radiazione, dal solvente e dalla natura della specie chimica in esame), l è il cammino ottico e c è la contrazione della specie chimica in esame. Un altro esperimento si basa sull’utilizzo di uno spettrofotometro con camera termostatica, in cui è possibile variare la temperatura della cuvetta in maniera graduale con questo esperimento vengono mostrati gli effetti della temperatura sul DNA e quindi il processo di denaturazione. Con l’ausilio di questo strumento aumentiamo gradualmente la temperatura e di conseguenza si potrà registrare anche un aumento dell’assorbanza (perché l’energia immessa denatura il DNA); l’andamento dell’assorbanza in funzione della temperatura è sigmoide perché, all’inizio, l’assorbimento avviene lentamente, poi diventa esplosivo e infine si stabilizza in una zona di plateau; durante la prima fase le prime zone del DNA che vengono denaturate sono quelle ricche di coppie A/T, perché fra queste due basi si formano solamente 2 legami a idrogeno, e le zone terminali, perché sono dinamiche anche a temperatura ambiente. Si creano così delle bolle di denaturazione che aumentano la cattura degli UV e che diventano più grandi via via che la temperatura aumenta; quando poi temperatura ed energia sono sufficientemente elevate, il fenomeno di separazione diventa esplosivo e si ha un rapido aumento dell’assorbanza. Alla fine la curva si stabilizza perché tutto il DNA è denaturato e quindi l’assorbimento non potrà aumentare ulteriormente. Il punto di flesso individuato sulla curva corrisponde alla temperatura alla quale il 50% del DNA è denaturato e viene definito temperatura di fusione: questo valore è caratteristico per ogni molecola di DNA perché è minore quanto maggiore è la concentrazione di A/T ed è maggiore quanto è maggiore la concentrazione di C/G (questo a causa del diverso numero di legami a idrogeno); in termini matematici la Tm è rappresentata dalla formula:

Tm = 69,3 + 0,41 * [G,C]

Tramite l’utilizzo di questa formula si può calcolare la concentrazione di citosine e guanine all’interno della molecola di DNA presa in esame. Inoltre, nonostante la temperatura di fusione è caratteristica di ogni molecola di DNA, questa dipende anche dalla concentrazione salina del mezzo, in quanto minore è la concentrazione, minore sarà anche il valore della temperatura di fusione. Una volta ottenuto del DNA denatura, comunque, si può ripetere lo stesso esperimento appena effettuato, solamente che il procedimento avviene in maniera inversa, cioè invece di aumentare la temperatura, questa viene diminuita, in modo da osservare il fenomeno della rinaturazione; ci sarà quindi una prima fase in cui il processo avviene lentamente, perché i due filamenti scorrono l’uno rispetto all’altro fino a quando non trovano una complementarietà di 10/15 nucleotidi una volta avvenuta questa prima fase il processo prosegue rapidamente (diventa esplosivo) e raggiunge il plateau quando il DNA è completamente rinaturato. Di conseguenza è avvenuto un fenomeno di ibridazione, cioè di ricostruzione del doppio filamento (può avvenire tra due filamenti di DNA, di RNA o tra un filamento di DNA e uno di RNA) tale processo non avverrebbe nel caso in cui l’abbassamento della temperatura non avvenisse in maniera graduale, perché, in tal caso, si formerebbero delle zone a doppio filamento intramolecolari, che impedirebbero l’appaiamento tra i due filamenti complementari.

COT E COMPLESSITA’ DEL GENOMA

La complessità di un genoma viene stabilita in base alla presenza al suo interno di sequenze di DNA ripetut ; se una sequenza è ripetuta molte volte allora il DNA risulterà essere poco complesso, mentre se non ci sono ripetizioni allora la complessità sarà elevata. Questo può essere valutato andando a dividere il genoma in molti frammenti; nel caso in cui il genoma è complesso, difficilmente si riusciranno a trovare dei frammenti simili fra loro, mentre se consideriamo un DNA che si presenta come un omopolimero poliA/poliT (quindi un DNA semplice), in questo caso tutti i frammenti saranno uguali fra di loro. Questa caratteristica di traduce nel fatto che, se noi andiamo a denaturare questi frammenti, si avrà in entrambi i casi rinaturazione, ma nel caso in cui il DNA è poco complesso, la probabilità che avvenga tale processo e la velocità con cui avviene saranno sicuramente + alte rispetto a un DNA complesso. Basandoci su questo meccanismo, si possono definire diversi gradi di complessità:

- Un genoma è poco complesso nel caso in cui ci sono poche sequenze molto ripetute- È mediamente complesso nel caso in cui ci sono molte sequenze ripetute- È complesso se ci sono molte sequenze che si ripetono poche volte

Gli esperimenti effettuati per studiare la complessità di un genoma si basano sullo studio del Cot, ossia il prodotto fra la concentrazione del DNA e il tempo di rinaturazione (cioè il tempo medio per vedere l’abbassamento dell’ipercromismo), e portano alla costruzione di grafici nei quali vengono messi in rapporto fra loro la percentuale di DNA a singolo filamento e, per l’appunto, il valore di Cot. Vediamo come viene organizzato un esperimento di questo tipo:

1) Si mettono in diversi capillari diversi frammenti di DNA (in tutti i capillari è presente, comunque, la stessa quantità di DNA)

2) I capillari vengono portati ad una temperatura di 100°C alla quale il DNA si denatura3) La temperatura viene poi abbassata fino ad arrivare alla temperatura di fusione del

DNA (circa 77°C) alla quale il DNA inizia a rinaturarsi4) Un capillare viene tenuto a questa temperatura per circa 5 minuti e in seguito, per

stabilizzare la situazione, disperdiamo il suo contenuto in un ambiente più ampio (per esempio una provetta)

5) Ripetiamo lo stesso procedimento per i diversi capillari, solamente che il tempo in cui vengono tenuti alla temperatura di fusione aumenta gradualmente da capillare a capillare

6) Ora si prosegue alla separazione del DNA a singolo filamento da quello a doppio filamento, in modo da capire quanto DNA si è rinaturato per farlo si usa l’idrossiapatite, un composto che è in grado di legare il DNA

7) Si rovescia il contenuto della provetta contenente il primo campione sull’idrossiapatite il DNA quindi si lega al composto

8) Per staccare il DNA si usa una soluzione con una elevata forza ionica utilizzando soluzioni con un diverso grado di forza ionica, inoltre, si riesce a staccare prima il DNA a singolo filamento e poi quello a doppio filamento

9) Una volta separati, si può misurare la quantità di DNA che si è rinaturato andando a utilizzare uno spettrofotometro

10)Si ripetono questi passaggi per tutti i campioni e si costruisce infine un grafico che presenta in ascisse il logaritmo del Cot e in ordinate la percentuale di DNA a singolo filamento ancora presente

11)La curva costruita ha un andamento sigmoide e presenta all’inizio dei bassi valori di Cot, che diventano via via sempre + alti; si individua inoltre un punto di flesso, che corrisponde al punto in cui metà del DNA presente in soluzione si è rinaturato.Basandoci su questo valore di Cot, si stabilisce la complessità del genoma di un organismo, perché se tale valore è alto vuol dire che il genoma è complesso, mentre se è basso vuol dire che il genoma è poco complesso. Se infatti ripetiamo l’esperimento

utilizzando il DNA proveniente da un organismo diverso, la curva che otteniamo mostra sempre lo stesso andamento, solo che sarà spostata verso destra o verso sinistra a seconda della complessità del genoma dell’organismo considerato.

Se si ripete l’esperimento per il DNA proveniente da una cellula eucariote, si ottiene una figura più complessa costituita da più sigmoidi. A bassi valori di Cot si ha un primo sigmoide e il 25% del DNA circa si è riassociato dopo un plateau c’è un secondo sigmoide e un 25% in più del DNA si è riassociato infine, dopo un secondo plateau, c’è un terzo sigmoide che porta alla rinaturazione di tutto il DNA. Questo significa che il DNA eucaristico è caratterizzato da 3 livelli di complessità:

- DNA poco ripetuto o unico, che codifica per delle proteine la cui quantità non deve essere elevata e che è l’ultimo a rinaturare.

- DNA mediamente ripetuto, che è il secondo a rinaturare.- DNA altamente ripetuto (clusters), che caratterizza l’eterocromatina, un potente

regolatore dell’espressione genica, e ed il primo a rinaturare.

Densità del DNA

Per determinare la lunghezza di un campione di DNA (o per dividere diversi frammenti di DNA in base alla loro lunghezza) potrebbe essere utile andare a costruire un gradiente di densità la densità viene espressa, infatti, come il rapporto numero di paia di basi/volume, mentre per gradiente si intende una variazione lineare, in questo caso, di densità su cui si possono analizzare delle macromolecole, che verranno separate in base alla loro grandezza. Esistono diversi tipi di gradienti: quelli che sono stati analizzati sono i gradienti di saccarosio e cloruro di cesio:Saccarosio

Per la costruzione di questo gradiente viene utilizzato un apparecchio che consta di due camere comunicanti (A e B), che presentano due rubinetti, uno che permette di regolare il passaggio di fluidi da A a B e uno che invece sbocca all’esterno. Nella camera A viene inserita una soluzione di saccarosio al 10%, mentre nella camera B si mette una soluzione, sempre di saccarosio, al 30% (corrisponde a 30g di saccarosio in 100ml). I due rubinetti vengono a questo punto aperti e si lascia percolare

la soluzione in una provetta dove si formerà un gradiente (in basso alla provetta troviamo il saccarosio al 30% e in cima quello al 10%), poiché man mano che il liquido passa da A a B diluisce la soluzione presente precedentemente in B, che intanto ha cominciato a scendere nella provetta, dove si formerà quindi una variazione lineare e decrescente di densità.Cloruro di cesioQuesto gradiente di densità a differenza di quello di saccarosio ci permette di arrivare a densità più elevate. In questo caso si utilizza una soluzione 7M di CsCl e si centrifuga ad alta velocità per all’incirca 3 giorni il risultato di questa centrifuga è l’autoformazione del gradiente di densità, dovuto al fatto che gli ioni cesio si concentrano sul fondo e quelli di cloro si concentrano in alto (in mezzo si trovano quantità intermedie di entrambi gli ioni).In ogni caso utilizzando uno qualsiasi di questi gradienti di densità si possono eseguire delle analisi sul DNA. Una volta formato il gradiente di densità, infatti, si può procedere aggiungendo del DNA alla soluzione e andando a centrifugare; la forza centrifuga tenderebbe a spingere il DNA verso il basso, ma la contrazione crescente di

CsCl (per esempio) lo respinge verso l’alto.

Dopo un certo periodo il DNA raggiunge l’equilibrio, ossia trova il punto del gradiente in cui la densità del mezzo è uguale alla sua; il punto di equilibrio viene a dipendere dalla densità del mezzo e del DNA analizzato; quest’ultima dipende dalla conformazione e dalla grandezza della molecola e di conseguenza viene a dipendere dalla concentrazione di G/C, perché i legami di van der Waals fra le basi adiacenti sono più corti per le coppie C/G che per le coppie A/T, per cui un DNA ricco di G/C è più denso perché le basi sono + impaccate. A questo punto per andare a individuare dove si posizionato il DNA (ossia per cercare il valore della densità) si prosegue frazionando il gradiente in diverse provette, applicando un forellino sul fondo della provetta dove era stato precedentemente creato il gradiente e lasciando percolare; le varie provette vengono analizzate allo spettrofotometro e si può quindi procedere con l’individuazione della densità del DNA analizzato (da notare che se questo esperimento viene ripetuto su DNA proveniente da diversi organismi, i valori di densità registrati sono sempre diversi, per cui può essere utilizzato come metodo per distinguere i vari genomi); dall’analisi con lo spettrofotometro infatti si ottiene un picco, che corrisponde alla densità del DNA analizzato, che viene calcolata costruendo sullo stesso grafico una retta che rappresenta il gradiente di densità (questa retta viene formata calcolando la densità di ogni frazione, semplicemente prelevandone un volume fisso e analizzando il peso). I risultati che si possono ottenere con lo spettrofotometro, però, variano a seconda dell’omogeneità del DNA, perché solo nel caso in cui il DNA è omogeneo (ossia non è a sequenza ripetuta) otteniamo un solo picco stretto e simmetrico. Se sono presenti + picchi vuol dire che il DNA non è omogeneo e si potranno individuare un picco principale, cioè quello più alto, e altri picchi più bassi, che sono quelli creati dai cosiddetti DNA satelliti (formati da DNA altamente o mediamente ripetuto); se questi picchi si trovano alla destra del picco principale vorrà dire che hanno un maggior contenuto di A/T, mentre se si trovano a sinistra avranno un maggior contenuto di G/C; può capitare anche casi in cui un unico picco non sia simmetrico, in questo caso vorrà dire che sotto quel picco si trova quello di un DNA satellite. Per spiegare la natura di questi DNA satellite è necessario introdurre gli enzimi di restrizione.

ENZIMI DI RESTRIZIONE

Le nucleasi sono enzimi capaci di idrolizzare il DNA e possono essere divise in due tipi:- Esonucleasi degradano il DNA nucleotide per nucleotide partendo da un’estremità

esistono esonucleasi specifiche per degradare il DNA dal 5’ al 3’ e altre per degradarlo in senso opposto

- Endonucleasi tagliano il doppio filamento in specifici punti presenti al suo interno (e non a partire da una delle due estremità) sono, infatti, degli enzimi specifici, perché riconoscono e agiscono solo a livello di particolari sequenze

Gli enzimi di restrizione sono delle endonucleasi, che riconoscono delle brevi sequenze bersaglio (all’incirca di 4-8 paia di basi), normalmente palindromiche (ossia con ripetizione invertita), e tagliano in posizioni definite all’interno di esse (agiscono sul legame fosfodiesterico, lasciando un fosfato libero al 5’ e un OH libero al 3’). Solitamente le sequenze che possono essere riconosciute da questi enzimi, prodotti dalla cellula stessa come difesa dall’ingresso di DNA esogeni, sono presenti all’interno del DNA cromosomico, ma non subiscono l’azione di questi stessi enzimi perché vengono protette tramite processi di metilazione (le sequenze metilate non vengono + degradate dagli enzimi di restrizione) il DNA esogeno invece subisce l’azione enzimatica e quindi viene degradato, permettendo alla cellula di difendere il proprio patrimonio genetico. Le endonucleasi di restrizione sono costituite da due subunità omologhe, che affiancano il DNA da entrambi i lati: tali subunità, siccome devono legare il DNA che è acido, presentano dei domini basici oltre ai siti catalitici usati per l’idrolisi; in base a come sono disposti i siti catalitici l’uno rispetto all’altro, si avranno diversi tipi di taglio operati dai vari enzimi. Infatti una classificazione degli enzimi può essere fatta in base al tipo di estremità del DNA che essi generano: alcuni enzimi, infatti, come HpaI, generano delle estremità piatte (tagliando le palindrome nel mezzo), mentre altri, come EcoRI, generano delle estremità sfalsate, che vengono definite sticky (“appiccicose”) ends, che, a differenza delle plate ends, si riuniscono prontamente tra di loro, alla rinaturazione, mediante appaiamento delle basi, sulla stessa molecola oppure su molecole diverse tagliate con lo stesso enzima (proprietà che risulterà essere molto importante come vedremo nei processi di clonaggio del DNA). Il nome di un enzima di restrizione è generalmente formato da 3 lettere che simboleggiano il batterio da cui è stato estratto, seguite da un numero, nel caso in cui il batterio ne ha forniti + di uno (per esempio EcoRI vuol dire che è stato estratto dal ceppo R si E.coli e che è stato il primo ad essere isolato). A questo punto prendiamo come esempio l’enzima EcoRI e vediamo cosa succede quando questo viene messo a contatto con una molecola di DNA lineare:Supponiamo che questa molecola di DNA contenga al suo interno sei copie della sequenza specifica che questo enzima riconosce, per cui l’enzima di restrizione andrà a dividere il filamento in sette frammenti, le cui dimensioni dipendono dalla distribuzione dei siti nella sequenzaPer sapere la lunghezza dei diversi frammenti, questi vengono sottoposti ad un esperimento di elettroforesi su gel di agarosio (cioè su un setaccio con una poratura più grande rispetto a quello che si ottiene con la poliacrilammide)METODO

1) Il setaccio viene creato utilizzando uno stampo rettangolare (come quello del coperchio di una scatola per le scarpe); per fare un gel all’1% si prende 1g di agarosio e lo si scalda in 100ml di soluzione.

2) si versa il tutto nello stampo, inserendo un pettine in modo da formare i pozzetti, una volta che il gel si sarà solidificato.

3) Si lascia quindi solidificare e si costruisce l’apparato di elettroforesi, utilizzando due vaschette con dentro il tampone, che vengono messi ai capi del gel.

4) Dal lato dove ci sono i pozzetti si collega il polo negativo dell’elettrodo, mentre dall’altro lato il polo positivo: viene quindi generato un campo elettrico.

5) Il DNA essendo carico negativamente si sposta verso il polo positivo: i vari frammenti di DNA si dispongono a diverse altezze perché si muovono con diversa velocità nel gel a seconda della loro grandezza.

6) Finita l’elettroforesi, per visualizzare il DNA sul gel si può usare uno spettrofotometro oppure un transluminatore a luce UV; in quest’ultimo caso però, bisogna immergere il gel in bromuro d’etidio (questo è un agente intercalante, ossia una sostanza capace di inserirsi fra le coppie di basi azotate del DNA e di rendere quindi il DNA fluorescente se illuminato con luce UV)

Vengono quindi evidenziate le diverse bande, che mostrano i punti in cui sono migrati i diversi filamenti di DNA: nel caso in cui conoscessimo già la lunghezza dei campioni utilizzati durante l’elettroforesi, si potrebbe costruire una retta di taratura, che potrebbe essere utilizzata per conoscere la lunghezza di un frammento ignoto.

DNA ALTAMENTE RIPETUTO O OMOGENEO

Per cercare di capire se un DNA è altamente ripetuto oppure è omogeneo (ossia non presenta ripetizioni al suo interno) è necessario andare ad effettuare un’analisi di restrizione, ossia trovare un enzima di restrizione che sia in grado di riconoscere dei siti di restrizione all’interno di questa molecola di DNA e permettere a tale enzima di agire:- La digestione che può essere effettuata dall’enzima, però, può essere di due tipi: esaustiva

e non- Nel caso di una digestione esaustiva, se la molecola di DNA è altamente ripetuta (quindi

presenta al suo interno una certa sequenza che si ripete + volte), siccome l’enzima agisce a livello di tutti i siti di restrizione presenti, si arriva alla formazione di frammenti tutti uguali fra di loro (per esempio ipotizzando che l’unità di ripetizione, o cluster, fosse costituito da 100bp, allora si formeranno tutti frammenti di questa lunghezza); se a questo punto effettuiamo un’analisi elettroforetica, noteremo la presenza di un’unica banda, a livello della quale sono localizzati tutti i frammenti di 100bp, e di una strisciata (o smear), dovuta alle sequenze che non vengono riconosciute dall’enzima e che quindi vengono tagliate casualmente (la lunghezza della strisciata dipende dai tempi di digestione + i tempi sono lunghi, + è lunga la strisciata)

- Nel caso di una digestione non esaustiva (o parziale), invece, l’enzima di restrizione non agisce a livello di tutti i siti di riconoscimento, per cui non si formeranno tutti frammenti di ugual lunghezza, ma in questo caso si otterranno frammenti di lunghezza diversa (la lunghezza di questi frammenti però è sempre un multiplo dell’unità di ripetizione di base. Per esempio oltre ai frammenti di 100bp, ossia i monomeri, otterremo, per esempio, anche dimeri e trimeri, di 200 e 300bp); eseguendo, quindi, un’analisi elettroforetica, oltre alla smear, non evidenziamo + una sola banda, ma due o tre, a seconda della lunghezza dei frammenti creati dall’enzima

In questo modo riusciamo a capire se il DNA è altamente ripetuto, perché nel caso in cui presenta delle ripetizioni evidenziamo la banda dovuta al monomero, che invece non sarà presente nel caso in cui il DNA è omogeneo (in questo caso infatti si vedrà solo la strisciata); inoltre l’intensità della banda evidenziata insieme allo smear è un indice del grado di ripetizione del DNA, perché sarà più intensa nel caso in cui nella molecola ci sono molte sequenze ripetute della stessa

lunghezza.

CLONAGGIO DEL DNA

La capacità di costruire molecole di DNA ricombinante e di mantenerle nelle cellule viene detta clonaggio del DNA; il processo coinvolge un vettore, che fornisce l’informazione per propagare il DNA clonato nella cellula, ed un inserto del DNA, che viene inserito nel vettore e contiene il DNA di interesse.

Per costruire delle molecole di DNA ricombinante, come vedremo, è fondamentale l’azione di enzimi di restrizione, che tagliano il DNA in siti specifici, e di altri enzimi in grado di unire gli uni agli altri i frammento di DNA che sono stati tagliati; una volta che il DNA di interesse è stato tagliato da degli enzimi di restrizione, infatti, deve essere inserito in un vettore per la propagazione, che a sua volta sarà inserito in un organismo ospite (solitamente E.coli) dove potrà essere replicato; di conseguenza i vettori per il DNA devono possedere 3 caratteristiche fondamentali:

- Devono contenere un’origine di replicazione che permetta loro di replicarsi indipendentemente dal cromosoma dell’ospite.

- Devono contenere un marcatore di selezione che permetta alla cellula che contiene il vettore di essere facilmente identificata.

- Devono possedere singoli siti di taglio per enzimi di restrizione, in modo da consentire l’inserimento dei frammenti di DNA in posizioni definite all’interno del vettore stesso.

I vettori più comunemente usati sono i plasmidi, ossia delle molecole di DNA circolare, costituite da circa 2000/20000 bp presenti nei procarioti e nei bassi eucarioti, che sono in grado di replicarsi autonomamente dal DNA cromosomico e contengono, solitamente, al loro interno geni che codificano per la resistenza a particolari antibiotici. METODO1) Si supponga che un vettore plasmidico contenga al suo interno un singolo sito di

riconoscimento per l’enzima di restrizione EcoRI; si esegue quindi una digestione del plasmide con questo enzima che quindi risulterà essere linearizzato (EcoRI, inoltre, permette la formazione di sticky ends).Inoltre il DNA di interesse è stato tagliato con lo stesso enzima di restrizione e che quindi si siano formati dei frammenti con le stesse estremità sticky del plasmide.

2) Si mescolano i frammenti di DNA, ottenuti, col DNA vettore di modo che i frammenti entrino all’interno dei plasmidi; solitamente per favorire l’innesto dei frammenti nei plasmidi si aggiunge un eccesso di frammenti rispetto al DNA plasmidico (le due molecole possono unirsi perché le estremità, essendo complementari, si appaiono fra di loro).

3) Si viene a formare nuovamente una struttura circolare, dove però sono presenti 4 interruzioni (o nicks), che devono essere rimosse, perché un DNA con dei nicks non è funzionale; per cui si prosegue aggiungendo della DNA ligasi, un enzima in grado di formare dei legami fosfodiesterici e di chiudere le interruzioni presenti.

4) Si ottiene in questo modo una molecola circolare di DNA covalentemente chiusa, che, però, sarà diversa dal plasmide iniziale per la presenza, al suo interno, dell’innesto.

5) I vettori che vengono utilizzati per questo esperimento devono presentare alcuni requisiti:- Un’origine di replicazione riconoscibile da E.coli.- Un gene per la resistenza ad un antibiotico, come l’ampicillina.- Un gene che codifica per la β-galattosidasi.- Un polilinker all’interno del gene LacZ, con siti di restrizione unici nel plasmide.

6) La presenza del polilinker sarà fondamentale per la riuscita di questo esperimento: questo elemento viene infatti definito come una sequenza di DNA di natura sintetica, creata in modo da non alterare la funzionalità del gene in cui viene inserita; possiede alcune caratteristiche:- Deve essere composto da un numero ridotto di nucleotidi.- Deve essere in fase con l’ordine di lettura del gene, così da non causare mutazioni

frameshift.- Deve contenere solo triplette senso, in modo da non causare mutazioni nonsenso.- Deve contenere siti di taglio per enzimi di restrizione.

Il polilinker è importante in questo esperimento perché quando trattiamo il DNA plasmidico con l’enzima di restrizione evitiamo di tagliare il DNA in punti casuali, poiché l’enzima agirà solamente in questa regione

7) Una volta ottenuto il plasmide vettore si prosegue con un processo di trasformazione, grazie al quale il plasmide viene inserito in una cellula ospite (solitamente E.coli), che viene scelta in quanto sensibile all’antibiotico, per il quale il DNA plasmidico porta la resistenza

8) Una volta avvenuta la trasformazione, le cellule batteriche vengono trasferite su un terreno di coltura che contiene questo antibiotico (in questo caso ampicillina), dove solo le cellule che hanno incorporato il plasmide saranno in grado di crescere, formando una colonia di cloni (ossia tutte le cellule che hanno incorporato quel plasmide)

9) Non è però detto che le cellule che riescono a crescere su questo terreno abbiano integrato al loro interno l’inserto, perché possono essere state trasformate con un plasmide con l’inserto oppure senza inserto; per capirlo eseguo un test della β-galattosidasi:La β-galattosidasi (che come abbiamo visto viene codificata dal gene LacZ) è un enzima in grado di catalizzare la reazione di scissione del lattosio in glucosio e galattosio; questo test viene utilizzato per cercare di capire se il processo di inserimento di un frammento estraneo in un plasmide ha avuto successo oppure no; per capirlo abbiamo inserito il polilinker nel gene LacZ (il polilinker, come abbiamo visto non altera l’espressione del gene).Nel caso in cui sia avvenuto l’inserimento del frammento all’interno del polilinker, il gene verrà trascritto comunque, ma la proteina ottenuta non sarà + funzionale; quindi bisogna trovare un modo per verificare se la cellula produce ancora una β-galattosidasi funzionante oppure no.La β-galattosidasi è in grado di idrolizzare altri composti oltre al lattosio, come per esempio l’x-galattosio, un composto permeabile alle membrane batteriche; normalmente una soluzione di x-gal è trasparente, ma in seguito all’idrolisi dovuta all’azione della β-galattosidasi si forma un prodotto di colore azzurro; in questo modo si potranno distinguere le cellule dove il plasmide inserito contiene l’inserto, perché saranno quelle rimaste bianche, in quanto la β-galattosidasi non è più funzionale.

10)Una volta evidenziate le cellule in cui è presente il plasmide con l’inserto, si prendono alcune di queste cellule e si estrae il DNA plasmidico.

11)A questo punto si excide l’inserto dal plasmide, usando due enzimi di restrizione che agiscono a livello di due siti di taglio, localizzati uno a destra e uno a sinistra del frammento da isolare in questo modo ottengo l’inserto che presenta le metà palindromiche dei due siti ai suoi fianchi

12)Questo elemento può essere usato come sonda per capire in quali altre colonie è presente lo stesso frammento secondo il processo di IBRIDAZIONE IN SITU:

METODO1) Si preparano innanzitutto delle sonde (= frammenti di DNA purificato o molecole di

DNA sintetizzate chimicamente, che vengono usate per cercare molecole con una sequenza complementare in miscele di acidi nucleici), che nel nostro caso era il frammento di DNA inserito nel plasmide, e si trattano con degli enzimi di restrizione che formano delle sticky ends

2) Si denatura la sonda al calore.3) Si prende del DNA genomico che contiene al suo interno una sequenza uguale a quella

della sonda e si denatura anche questo al calore.4) A questo punto bisogna marcare radioattivamente la sonda, in modo da renderla

facilmente localizzabile una volta trovata la sequenza complementare; esistono fondamentalmente due metodi per poter marcare il DNA:

- 1° METODO si usa una DNA fosfatasi, ossia un enzima in grado di eliminare i gruppi fosfato presenti all’estremità 5’ della sonda; si prende un ATP marcato radioattivamente nel fosfato in γ e utilizzando una chinasi l’ATP viene idrolizzato e il fosfato marcato viene trasferito alla sonda, che a questo punto risulterà essere marcata radio attivamente.

- 2° METODO che può essere utilizzato, definito nick translation, si basa sull’attività sequenziale di due enzimi sulla molecola di DNA avviene nel seguente modo:

In una prima fase un’endonucleasi produce su entrambi i filamenti di DNA diversi nicks, ossia delle rotture del legame fosfodiesterico fra due nucleotidi adiacenti.A questo punto si aggiunge una DNA polimerasi I insieme ai 4 dNTPs, che presentano il fosfato in α marcato radioattivamente (viene marcato quello in α perché è l’unico a rimanere quando un nucleotide viene inserito in una catena polinucleotidica).Per funzionare la DNA polimerasi necessita di un innesco (che qui è rappresentato dal 3’ OH libero creato dall’azione della nucleasi) e di un filamento stampo (che è già presente perché stiamo considerando una molecola di DNA a doppio filamento).La DNA polimerasi si lega quindi all’estremità 3’ e, siccome è noto che tale enzima sia dotato di un’attività esonucleotidica in direzione 5’3’, elimina le basi non marcate che incontra andandole a sostituire (grazie alla sua attività polimerasica) con le basi marcate presenti nella miscela di reazione (in questo modo provoca lo spostamento del nick).Il risultato finale della reazione sarà una molecola di DNA a doppio filamento che risulterà essere marcata in un’alta percentuale dei suoi nucleotidi.

5) Una volta marcata la sonda, questa viene unita al DNA genomico e la temperatura viene abbassata in modo da permettere la rinaturazione; durante questo processo è possibile che alcuni filamenti del frammento analizzato (ossia la sonda) si uniscano con filamenti del DNA genomico; in questo modo si ottengo degli ibridi.

METODO alternativo1) Utilizziamo un disco di nitrocellulosa, che viene poggiato sulla piastra batterica dove

sono cresciute delle colonie, in modo da prelevarne dei campioni e creare una sorta di stampo della posizione iniziale occupata dalle colonie sulla piastra.

2) Il filtro viene poggiato su carta assorbente imbevuta di soda, che ha la capacità di attraversare il filtro e entrare in contatto con le cellule batteriche, idrolizzando le pareti cellulari, di modo da ottenere un estratto cellulare.

3) Il DNA contenuto in questo estratto viene denaturato sempre per effetto della soda.4) Si sposta il filtro in un bagno contenente un tampone adeguato, in modo da eliminare la

soda in eccesso, riabbassando il pH.5) In questa vaschetta viene inserita la sonda, già denaturata al calore, e si porta alla

temperatura di rinaturazione di modo che possa avvenire ibridazione fra la sonda e il DNA genomico.

6) Il filtro viene poi lavato con un tampone, per eliminare l’eventuale sonda che non ha legato e che potrebbe dare un falso segnale.

7) A questo punto poggio il disco su una lastra autoradiografica, che ci permette di individuare quali cellule della colonia hanno legato la sonda e quindi di capire quali sono le cellule che presentano al loro interno il plasmide con l’inserto; se molte cellule vengono marcate, vuol dire che quella sequenza di DNA usata come sonda è molto ripetuta e quindi il DNA è altamente ripetuto.

SOUTHERN BLOT

Talvolta è utile monitorare l’abbondanza o le dimensioni di una particolare molecola di DNA o RNA, in una popolazione che consta di molte molecole simili fra loro; questo tipo di

informazione si può ottenere utilizzando le tecniche di blot, tra cui appunto la Southern blot, che permettono di localizzare acidi nucleici specifici una volta che questi sono stati separati mediante elettroforesi. Vediamo come può avvenire questo tipo di esperimento.METODO

1) Si supponga di aver tagliato il genoma di un certo organismo tramite un enzima di restrizione, quale, per esempio, può essere EcoRI, e di voler conoscere le dimensioni del frammento che contiene un certo gene di interesse.

2) Il campione viene così analizzato per elettroforesi.3) Per andare a evidenziare la posizione dei vari frammenti di DNA, volendo, si potrebbe

utilizzare il bromuro d’etidio, un agente intercalante che permette di colorare le molecole di DNA e renderle visibili alla luce UV; nel caso in cui, però, dalla digestione effettuata, si fossero ottenuti migliaia di frammenti di lunghezza diversa, questi sarebbero troppo numerosi per essere risolti in bande discrete tramite colorazione con bromuro d’etidio e infatti apparirebbero come una singola strisciata (smear).

4) Per cui si utilizza la tecnica dell’ibridazione Southern blot, che permette di identificare, all’interno della strisciata, le dimensioni del frammento specifico che contiene il gene di interesse.

5) In questa tecnica il gel di agarosio sul quale è stata effettuata la corsa elettroforetica viene immerso in una soluzione di soda che denatura il DNA (in quanto gli ioni OH-

competono con i legami a idrogeno all’interno della doppia elica).6) Dopodichè viene rapidamente neutralizzato il pH spostando il gel in una soluzione

neutrale7) A questo punto di fianco al gel pongo due vaschette che contengono al loro interno un

tampone e creo una sorta di ponte, che colleghi fra di loro queste due vaschette, con un foglio di carta da filtro, che viene quindi immerso nel tampone.

8) Sopra la carta da filtro deposito il gel e, in seguito, sopra di questo, metto un foglio di nitrocellulosa della stessa grandezza.

9) A sua volta, sopra il foglio di nitrocellulosa, si deposita uno strato di “pannolini” (= fogli di carta da filtro avvolti in carta assorbente).

10) Infine, in cima, pongo una lastra di vetro e un peso, che pressi il sistema.

11) I “pannolini” fungono da pompa aspirante, richiamando il tampone dagli strati inferiori e, in ultima analisi, dalle vaschette che erano state poste di fianco al gel.

12) Il tampone quindi inizia a risalire e, nel suo tragitto, attraversa il gel e trascina il DNA, che viene bloccato dal filtro di nitrocellulosa, poiché carico elettricamente (è impermeabile al DNA).

13)Si ottiene in questo modo uno stampo perfetto del gel sul filtro.14)A questo punto il filtro viene immerso in un tampone con la sonda precedentemente

marcata radioattivamente e si porta a temperatura di rinaturazione se il DNA analizzato contiene delle sequenze complementari alla sonda, questa darà origine a fenomeni di ibridazione.

15) Infine si lava il filtro per eliminare la sonda in eccesso e si analizza su lastra fotografica, per evidenziare la posizione del DNA da analizzare.

DNA CLUSTERIZZATO O INTERDISPERSO

Una volta che è stato evidenziato che una certa molecola di DNA sia altamente ripetuta, si può a questo punto determinare se questo DNA altamente ripetuto si presenti nella forma clusterizzata oppure interdispersa (si differenziano fra di loro per la diversa disposizione dei

clusters): un DNA clusterizzato presenta le unità di ripetizione compattate in un’unica zona del genoma (disposte una di seguita all’altra), mentre quello interdisperso presenta i clusters sparsi nel genoma:

Per cercare di capire quindi come si dispongono le unità di ripetizione si esegue questo esperimento:METODO- Si effettua un’analisi di restrizione sul nostro DNA altamente ripetuto di conseguenza si

evidenzia una strisciata con l’aggiunta di una banda dove si condensano i clusters- Si taglia la parte di gel contenente la banda e si pone sopra un batuffolo d’ovatta che è

stato precedentemente posto in una provetta bucata sul fondo- Si centrifuga in modo da estrarre il DNA dal gel- Il frammento di DNA viene a questo punto clonato per aumentarne la quantità nel caso in

cui la banda sul gel di elettroforesi non fosse stata così evidente- Una volta clonato il frammento di DNA viene estratto tramite degli enzimi di restrizione e

usato come sonda per effettuare una Southern blot- La Southern blot viene usata su di un gel dove i risultati che erano stati ottenuti erano

dovuti ad un trattamento della nostra molecola di DNA di partenza con un enzima di restrizione in questo caso però la digestione effettuata era stata non esaustiva

- A questo punto con la sonda riesco a evidenziare anche le bande che sarebbero state coperte dalla strisciata nei diversi tempi di digestione se ai diversi tempi di digestione evidenzio delle bande che costituiscono una sorta di “scaletta” (che perdono comunque di intensità man mano che i tempi di digestione si accorciano) allora vuol dire che il DNA era clusterizzato, mentre se evidenzio sempre e solo un’unica banda (che corrisponde a quella dei monomeri), che al diminuire dei tempi di digestione perde di intensità, allora vuol dire che il DNA è interdisperso

BANCHE DI DNA RICOMBINANTE

Spesso si vuole studiare un gene o un frammento di DNA particolare e individuarlo all’interno del DNA dell’organismo analizzato. Per farlo si può ricorrere, volendo, all’utilizzo di banche di DNA, che possono essere classificate in varie tipologie:

- Banche genomiche: sono collezioni di cloni contenenti almeno una copia di ogni singola sequenza di DNA del genoma dell’organismo considerato.

- Banche cromosomiche: sono collezioni di cloni di frammenti di singoli cromosomi.- Banche di cDNA (DNA complementare): sono collezioni di cloni di copie di DNA degli

mRNA isolati dalla cellula di un certo organismo.

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

Se si conoscono le due estremità delle sequenza di DNA che si vuole clonare, il clonaggio può risultare più semplice e veloce utilizzando la tecnica della PCR, un metodo che permette di produrre un numero estremamente grande di copie di una specifica sequenza di DNA senza doverla clonare, mediante un meccanismo chiamato amplificazione. Il punto di partenza della PCR è un DNA a doppia elica contenente la sequenza di DNA da amplificare e due primers, ovvero degli inneschi per la replicazione del DNA. Le fasi di questi procedimento sono sostanzialmente le seguenti:

1) Denaturo il DNA da doppia elica a singola elica incubandolo per circa 30 secondi a una temperatura di circa 94-95°C.

2) Raffreddo la soluzione, portando a una temperatura tra i 37°C e i 65°C per circa 30 secondi (la temperatura viene scelta in base al grado di omologia tra le sequenze di basi dei primers e la sequenze di basi del DNA; inoltre + lungo è il primer, + l’annealing avviene a temperatura elevata), per permettere l’appaiamento (annealing) dei primers. I due primers sono disegnati in modo che si appaino sui filamenti opposti del DNA stampo, alle estremità della sequenza da amplificare.

3) Estendo i primers mediante DNA polimerasi a 70-75°C per circa 2-5 minuti. Per fare questo però bisogna utilizzare una particolare DNA polimerasi resistente al calore, chiamata Taq polimerasi: la normale polimerasi infatti, a temperatura elevata, si distrugge, per cui occorrerebbe aggiungerla ad ogni ciclo di replicazione (ma aprire continuamente una provetta nel corso di un esperimento è rischioso, perché si può andare incontro a contaminazione dei campioni); per questo si usa la Taq polimerasi, che è stata ricavata da un batterio termofilo (Thermus aquaticus), il quale vive ad alte temperature e quindi contiene un enzima polimerasi che tollera bene le varie temperature raggiunte durante il processo di PCR.

4) Dopo il primo ciclo di replicazione si ottengono molecole di DNA con un’estremità fissata da noi grazie all’introduzione in un preciso punto dei primers.

5) A questo punto si prosegue continuando a ripetere le tre fasi di denaturazione, annealing e estensione, per un numero di cicli indefinito.

6) Al termine del secondo ciclo si iniziano ad ottenere dei frammenti limitati.7) Solo con il terzo ciclo si iniziano ad ottenere molecole con la lunghezza del DNA

bersaglio (comprese quindi fra i due primers utilizzati).8) Proseguendo con i cicli di replicazione, il numero di molecole con una lunghezza definita

aumenta in modo geometrico. Si ottiene quindi un elevato numero di frammenti di DNA tutti uguali fra di loro e in un tempo molto breve; queste reazioni vengono eseguite all’interno di un termociclatore, ossia una macchina termostatica che automaticamente compie dei cicli di temperatura programmati.

Durante il corso di questa reazione possono verificarsi degli errori dovuti per esempio a delle mutazioni improvvise; se le mutazioni avvengono all’interno di una cellula, esistono dei sistemi di controllo che permettono di correggerle, ma in vitro questi non sono presenti: per cui la PCR non è un esperimento esente da errori. La PCR viene, inoltre, condotta a volumi molto piccoli (50-100ml) perché per il suo corretto svolgimento è necessario che le molecole si incontrino fra di loro, per cui se aumenta il volume di reazione, la probabilità che si incontrino diminuisce.

SEQUENZIAMENTO DEL DNA

Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell’ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono un acido nucleico; questa informazione può essere utile per identificare sequenze geniche e sequenze di controllo all’interno di un frammento e per confrontare le sequenze di geni omologhi di organismi diversi. Nel metodo più comunemente usato per il sequenziamento del DNA, detto metodo di terminazione della catena, il DNA viene copiato da uno stampo grazie all’utilizzo di una DNA polimerasi, a partire da un punto fisso, specificato dall’uso di un particolare innesco oligonucleotidico (primer)

La DNA polimerasi utilizza dei dNTPs come substrati per la sintesi di DNA, che avviene sempre in direzione 5’3’, ed è capace di catalizzare il legame fosfodiesterico che si forma fra il gruppo OH, presente sul carbonio in 3 di un nucleotide, e il fosfato in α della molecola di substrato (che costituirà il nucleotide seguente nella catena) Di conseguenza, nella tecnica del sequenziamento, si fa uso di particolari substrati modificati, chiamati ddNTPs (didesossi-), a cui manca un ossigeno, oltre che sul carbonio in 2, anche sul carbonio in 3: in questo modo la DNA polimerasi sarà in grado di includere questi nucleotidi all’interno della catena, ma questi saranno poi la causa della fine del processo di allungamento (perché mancando l’O sul carbonio in 3, la molecola di substrato successiva non può essere attaccata). METODO

1) Si denatura la molecola di DNA della quale si vuole conoscere la sequenza e si mescola insieme al primer selezionato per l’esperimento

2) Si riabbassa la temperatura in modo da permettere l’appaiamento tra il primer e il singolo filamento del DNA di interesse

3) Si preparano 4 provette contenenti tutti e 4 i dNTPs

4) In ogni provetta si aggiunge anche un didesossiribonucleotide trifosfato, diverso per ciascuna di queste (nella 1° si aggiunge ddGTP, nella 2° ddATP, nella 3° ddTTP e nella 4° ddCTP); il rapporto con cui vengono inseriti questi particolari nucleotidi è all’incirca di una molecola di ddNTPs ogni 100 molecole dNTPs.

5) Si pongono le 4 provette in un bagno a 37°C (temperatura ottimale per l’azione dell’enzima) e si lascia che la DNA polimerasi esegua l’allungamento delle catene di DNA: la presenza dei ddNTPs però provocherà l’interruzione della sintesi in diversi punti e porterà quindi alla formazione di frammenti che avranno una lunghezza diversa, pur iniziando dallo stesso punto (la DNA polimerasi inizia a sintetizzare DNA sempre a partire dallo stesso punto). La lunghezza dei diversi frammenti che vengono ottenuti specifica la posizione di una certa base sul filamento stampo: per esempio, se consideriamo la 1° provetta dove erano stati aggiunti i ddGTPs, la lunghezza dei diversi frammenti specifica la posizione delle C nel filamento stampo.

6) I frammenti ottenuti vengono ora marcati radioattivamente all’estremità 5’: per farlo si usa, prima di tutto, una fosfatasi, che rimuove il gruppo fosfato da questa posizione, e in seguito si tratta con una chinasi che è in grado di aggiungere un gruppo fosfato, prelevandolo da una molecola donatrice, che in questo è una molecola di ATP radioattivo sul fosfato in γ.

7) Ora si prende un apparato elettroforetico e si esegue un’elettroforesi su gel di poliacrilammide; poiché è necessario denaturare il DNA, si unisce alla soluzione nelle provette dell’urea e le si scalda: il calore denatura il DNA, che non potrà riassociarsi anche una volta che la temperatura è stata riabbassata a causa della presenza dell’urea.

8) Si caricano i campioni sul gel e si esegue la corsa elettroforetica.9) Otteniamo quindi una serie di bande, determinate dalla diversa

lunghezza dei frammenti, ciascuna delle quali rappresenta la posizione di una particolare base sul filamento stampo utilizzato. Analizzando quindi l’ordine con cui sono migrati i vari frammenti contenuti nelle 4 provette si può capire la sequenza del DNA

analizzato, a partire dalla molecola che è migrata di più (cioè la + corta, la cui banda è quella + in basso di tutte) fino a quella che è migrata di meno (la molecola + completa, la cui banda è quella + in alto) ovviamente, al momento della lettura, non si dovranno mai trovare due bande che si trovano alla stessa altezza.

ESPERIMENTO DI MESELSON E STAHL

Furono avanzate 3 ipotesi riguardo il meccanismo di replicazione seguito dal DNA:- Modello conservativo: le due eliche di DNA parentali si denaturano e ognuna funge

da stampo per la sintesi di nuovi filamenti; una volta avvenuta la replicazione però, si riassociano, di conseguenza otteniamo una molecola di DNA che avrà solo filamenti parentali e un’altra molecola che, invece, avrà solo filamenti appena sintetizzati.

- Modello semiconservativo: le due eliche di DNA si denaturano e ognuna funge da stampo per la sintesi di nuove eliche: in questo caso però, i due filamenti parentali non si riassociano fra di loro, per cui ogni molecola figlia avrà un filamento parentale e uno appena sintetizzato.

- Modello dispersivo: la doppia elica parentale viene tagliata in diversi frammenti, che funzionano da stampo per la sintesi di nuovi segmenti di DNA a doppia elica; i segmenti poi si riassociano in doppie eliche complete di DNA, che avranno al loro interno segmenti parentali e figli mescolati.

La dimostrazione che la replicazione del DNA avviene secondo il modello semiconservativo, proviene dall’esperimento effettuato da Meselson e Stahl nel 1958;METODO1) Fecero crescere delle cellule di E.coli in un terreno minimo in cui l’unica fonte di azoto era

rappresentata dal 15NH4Cl, dove il normale isotopo dell’azoto, 14N, era stato sostituito dall’isotopo pesante, 15N (che presenta un neutrone in + nel nucleo); come risultato, tutte le molecole di queste cellule batteriche, che avrebbero dovuto contenere il normale isotopo dell’azoto al loro interno, presentavano l’isotopo pesante.

2) Tra queste cellule c’è anche il DNA: è importante sottolineare a questo proposito che il DNA che contiene 15N può essere separato dal DNA che contiene 14N, andandoli ad analizzare all’interno di un gradiente di CsCl, in quanto, a causa della loro diversa densità, si formeranno due bande in punti diversi del gradiente (ricordando che il DNA si dispone nel punto del gradiente in cui la densità del mezzo risulta essere uguale alla sua)

3) A questa punto le cellule batteriche vengono spostate in un terreno contenente il normale isotopo dell’azoto: da questo momento in poi, tutto il DNA sintetizzato presenta al suo interno il normale isotopo dell’azoto.

4) Si permette, quindi, che avvenga replicazione del DNA e, ogni mezz’ora circa (perché E.coli ha un tempo di sviluppo di circa mezz’ora), si prelevano delle cellule di E.coli, dalle quali si estrae il DNA che viene analizzato nel gradiente.

5) Alla prima mezz’ora, evidenzio, nel gradiente, una sola banda che si dispone ad un’altezza intermedia fra la banda del DNA 15N e quella del DNA 14N.

6) Dopo un’ora trovo invece due bande, una sempre in posizione intermedia e l’altra a livello del DNA 14N (quindi meno densa): queste due bande contengono la stessa quantità di DNA

7) Alla terza mezz’ora, ottengo sempre due bande, nelle stesse posizioni di prima, solo che la quantità di DNA della banda + densa è ¼ dell’altra.

Questo esperimento può essere spiegato solamente ipotizzando che la replicazione del DNA segua il modello semiconservativo, perché se seguisse, per esempio, il modello conservativo, già dopo il primo ciclo di replicazione avrei dovuto vedere due bande all’interno del gradiente.

CROMOSOMI PROCARIOTICI

I procarioti generalmente possiedono una sola molecola di DNA, detta nucleoide, di forma circolare, sebbene vi siano anche organismi con cromosomi lineari.Quando le cellule sono in rapida divisione, però, alcune porzioni del cromosoma possono essere presenti in due o quattro copie; in più frequentemente i procarioti possono possedere anche uno o più DNA circolari di piccole dimensioni, covalentemente chiusi, ed indipendenti, detti plasmidi.Essi non sono normalmente essenziali per la crescita batterica e portano geni che conferiscono specifiche caratteristiche, come ad esempio la resistenza ad un antibiotico.I plasmidi si differenziano dal cromosoma anche perché possono essere presenti in copie multiple per ciascuna cellula.Una molecola di DNA molto grande (2 metri nelle cellule umane, 2 mm nelle cellule di Coli) deve stare in uno spazio molto stretto: per cui deve essere estremamente compattata, rimanendo funzionale; devono esserci quindi sistemi di compattazione e di decompattazione.

Denaturando un’elica di DNA circolare attorcigliata a 360° (ovvero tagliando i legami a idrogeno centrali) si ottengono due anelli legati tra loro;invece, se l’elica è attorcigliata a 180°, si forma un unico anello.I due anelli non si possono disgiungere tra loro, se non interrompendo uno dei due, tagliando un legame fosfodiestere e facendo passare un filamento attraverso l’interruzione dell’altro.Viene definito numero di legame topologico ( linking number) il numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso l’altro affinchè le due catene possano separarsi l’una dall’altra.Il DNA circolare covalentemente chiuso (cccDNA) viene detto topologicamente definito, in quanto il numero di volte che un filamento gira attorno all’altro non può cambiare. Anche il DNA lineare può essere ritenuto tale se esistono delle binding proteins, che impediscono al DNA di srotolarsi completamente; generalmente, però, il numero di avvolgimenti può variare mediante la rotazione reciproca.

4 LINKING NUMBERS (immagine)

Facendo passare 4 volte un filamento sotto all’altro, si possono eliminare i 4 linking numbers ed in questo modo i due filamenti di DNA plasmidico si separano, senza alcun danneggiamento.In alternativa, occorre tagliare uno dei due filamenti.

Il numero di legame topologico (linking number) è un parametro invariante, intero, caratterizzato da due componenti:

- Tw (twist) numero di giri d’elica nello spazio (numero di volte che un filamento incrocia l’altro);

- Wr (writhe) numero di volte in cui l’asse longitudinale della doppia elica incrocia se stesso.

Lk (linking number) = Tw + Wr

Quando il DNA è rilassato, Lk = Tw; nel caso di una doppia elica destrogira il Tw è positivo e quindi anche Lk lo sarà.

Tuttavia i cccDNA non hanno una conformazione planare bensì presentano delle tensioni torsionali che impongono all’asse della doppia elica di incrociarsi su se stessa, determinando una struttura tridimensionale; in caso di un superavvolgimento, Lk rimane costante: per cui a variare in modo inversamente proporzionale saranno Tw e Wr;

Ex.

1000 bp 10 bp per ogni avvolgimento 100 linking numbersTagliando il DNA, arrotolandolo o srotolandolo di 5 giri d’elica, il Lk passa a 105 o a 95 (rispettivamente); in DNA, però, tenderà sempre a tornare alla situazione di partenza (nello spazio), quindi 100 Lk.

Quando il DNA, costretto su un piano, ha più di 10 bp per giro d’elica se lasciato libero nello spazio si superavvolge negativamente se invece ha meno di 10 bp per giro, allora si superavvolge positivamente.In natura esistono tuttavia solo quelli superavvolti negativamente; si possono creare gli altri usando, ad esempio, bromuro di etidio: questa sostanza è, infatti, un intercalante delle basi del DNA e inserendosi tra una e l’altra fa allargare la doppia elica con conseguente diminuzione del numero di bp per giro d’elica (e con conseguente superavvolgimento positivo).Per fissarsi ad un oggetto, ad esempio, il DNA cambia in quel determinato punto in numero di basi per giro d’elica, assumento la conformazione a toroide, ovvero l’asse longitudinale è avvolta come attorno ad un cilindro come conseguenza, il resto del DNA si superavvolge positivamente o negativamente.Oppure il numero di bp per giro d’elica varia anche (su un piano) quando si denatura una molecola di DNA circolare in un determinato punto, dando una bolla di replicazione; la tendenza, però, è tornare a 10 bp per giro d’elica e quindi ci saranno delle compensazioni con dei superavvolgimenti positivi.

TOPOISOMERASI

Due molecole di DNA di ugual lunghezza, con ugual sequenza ma con diverse geometrie, sono definite topoisomeri.Esistono degli enzimi in grado di controllare la geometria ed il compattamento di molecole di DNA, le topoisomerasi: esse possono creare una rottura del singolo o doppio filamento di DNA in maniera temporanea.Le topoisomerasi possono essere ascritte in due classi principali, presenti sia negli eucarioti che nei procarioti:

- Topoisomerasi II permettono di cambiare il numero di legami topologici di due unità per volta; esse determinano una rottura temporanea dei due filamenti del DNA attraverso la quale può passare un tratto di elica integra, prima che il taglio venga risaldato. Ogni passaggio fa variare la superelicità di 2 superavvolgimenti per volta.Richiedono l’energia di idrolisi dell’ATP per poter funzionare.

- Topoisomerasi I permettono di cambiare il numero di legame topologico di un’unità per volta: esse producono una rottura sul singolo filamento della doppia elica, permettendo in questo modo al filamento integro di poter passare attraverso la rottura dell’altro prima che il nick venga eliminato. Ogni passaggio attraverso il nick equivale ad aumentare o diminuire di 1 i superavvolgimentiNon richiedono, per il loro funzionamento, ATP: sanno quindi solamente far rilassare l’elica, scaricando l’energia libera.La loro azione è possibile solo su DNA superavvolto negativamente, in quanto meno stabile: nelle zone ricche di T-A l’elica si apre e si richiude spontaneamente di continuo ed a questo livello agisce la topoisomerasi I.

Nei procarioti si trova un tipo particolare di topoisomerasi II, la DNA girasi: essa introduce (anziché eliminare) superavvolgimenti negativi, in grado di facilitare la denaturazione della doppia elica necessario per l’attuazione di molte reazioni che coinvolgono in DNA, incluse la trascrizione e la replicazione. La girasi è formata da 4 subunità, due A e due B ed è dotata di attività ATP-asica.Due sostanze sono in grado di inibire questa proteina:

- Acido navidixico inibisce la subunità A, nella quale risiede la capacità di formazione e chiusura del nick; come conseguenza viene inibita la capacità di taglio e il DNA non si modifica topologicamente.

- Comermicina inibisce la subunità B, dove risiede l’attività ATP-asica; anche in questo caso il DNA non viene superavvolto ma rimane rilassato.

Per cui nei procarioti il DNA può essere superavvolto o rilassato; negli eucarioti, dove non esiste la girasi, il DNA non può essere superavvolto.

Le topoisomerasi sono in grado di promuovere le reazioni di taglio e risaldatura del DNA senza cofattori produttori di energia, come l’ATP, perché esse usano un meccanismo che prevede la formazione in un legame covalente (la topoisomerasi II richiede ATP non per creare il nick bensì per promuovere cambiamenti nel complesso proteina-DNA).Il taglio della molecola di DNA avviene quando un residuo di tirosina presente nel sito catalitico dell’enzima attacca un legame fosfodiesterico dell’impalcatura della molecola di DNA bersaglio; questo attacco causa una rottura nel DNA in seguito alla formazione di un legame covalente tra la topoisomerasi e un terminale fosfato del nick e la tirosina.L’altra estremità del nick, che termina con un gruppo OH, è legata molto saldamente all’enzima.Il legame fosfo-tirosina conserva l’energia che viene liberata dall’idrolisi del legame fosfodiesterico; di conseguenza il DNA può essere risaldato semplicemente tornando indietro nella reazione: il gruppo OH esistente al terminale del nick attacca il legame fosfo-tirosina, riformando il legame fosfodiesterico del DNA.Questa reazione ripristina l’integrità del filamento di DNA e rilascia la topoisomerasi che torna così ad essere disponibile per un altro ciclo.

I NUCLEOSOMI

La maggior parte del DNA delle cellule eucariotiche è impaccato in strutture definite nucleosomi.Il nucleosoma è composto di un core di otto proteine istoniche ed il DNA è avvolto attorno ad esse; il DNA compreso tra ciascun nucleosoma viene definito DNA linker.Dato che è compreso tra due nucleosomi, il DNA linker è topologicamente definito: esso risponde a questa condizione andando in superavvolgimento; il superavvolgimento è dovuto al fatto che a livello dei nucleosomi si passa da 10,5 bp a 10 bp per giro d’elica.Mediante l’assemblaggio in nucleosomi il DNA viene compattato di 6 volte: ciò è ben lontano dalle 1000-10000 volte che deve essere raggiunto nelle cellule eucariotiche.La porzione di DNA più legata intimamente al nucleosoma viene definita DNA core: esso ha una lunghezza di circa 147 bp ed è in quantità invariabile in tutte le cellule eucariotiche; il DNA si avvolge attorno all’ottamero istonico 1,65 volte, come un filo attorno ad un rocchetto.La lunghezza del DNA associato con ciascun nucleosoma può essere determinata usando una nucleasi; nell’esperimento seguente vengono mostrati i meccanismi che hanno portato all’identificazione dei nucleosomi e alla scoperta della lunghezza del DNA associato ad essi.METODO

1) Si rompono delicatamente i nuclei di alcune cellule e si tampona con un sale, di modo da aumentare la forza ionica e da distendere il DNA.

2) Si analizza l’immagine al microscopio elettronico e si evidenzia la presenza di alcuni “pallini” (i nucleosomi) lungo la catena di DNA (questa è la struttura della cromatina, detta “a collana di perle”).

3) Per capire come sono strutturati i nucleosomi, si tratta brevemente (effettuando una digestione non esaustiva) il DNA con una nucleasi micrococcale (enzima estratto dall’organismo Micrococcus lucicus), che taglia casualmente il DNA in zone non protette da proteine.

4) Il prodotto di questa reazione viene infine analizzato tramite diversi esperimenti.5) Per prima cosa si esegue un gradiente di saccarosio: si stratifica il campione in cima

alla provetta contenente il gradiente e si centrifuga; il gradiente viene poi frazionato e analizzato allo spettrofotometro (sapendo che il DNA assorbe a 260nm, mentre le proteine a 280nm); dall’analisi si ricava un profilo con massimi sempre crescenti dal fondo della provetta verso la cima : questo perché l’altezza dei picchi dipende dalla quantità di nucleasi che è stata usata e dal tempo di reazione.

6) Si estraggono le proteine dal gradiente e si esegue una corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide, per vedere quali proteine sono presenti nei diversi picchi: in tutti si trovano i 5 istoni in quantità variabili a seconda dell’altezza del picco (più è alto e più istoni ci sono).

7) Il prodotto della migrazione viene poi analizzato al microscopio elettronico: nel picco più leggero (cioè quello più in alto nel gradiente) si riconoscono singoli nucleosomi, che portano legati a sé due tratti di DNA linker; nel secondo picco sono presenti i dimeri, ossia due nucleosomi legati fra di loro, nel terzo i trimeri e così via; questo vuol dire che gli istoni hanno protetto il DNA dalla digestione da parte della nucleasi in una quantità che dipende dalla quantità di nucleasi che è stata utilizzata e dai tempi di azione. Se infatti la nucleasi agisce per un tempo sufficiente tutto il DNA che noi otteniamo si presenta sottoforma di monomero.

8) Per determinare, a questo punto, la quantità di DNA presente in ogni picco, si esegue una corsa elettroforetica su gel d’agarosio: in questo modo si forma una scaletta di bande, contenenti frammenti di DNA direttamente proporzionali fra di loro (per esempio

la quarta banda presenta DNA con una lunghezza doppia rispetto alla seconda oppure la sesta presenta un DNA con lughezza doppia rispetto alla terza); il picco + leggero contiene frammenti tutti uguali fra di loro con una lunghezza di all’incirca 197bp ciascuno.

9) Nel caso in cui si effettua una digestione esaustiva, invece, la nucleasi taglia il DNA in tutti i siti non protetti da proteine e di conseguenza, ripetendo l’esperimento, otteniamo una sola banda che contiene al suo interno DNA di lunghezza pari a 147bp.

10)La differenza fra la lunghezza riscontrata nella digestione esaustiva (147bp) e quella nella digestione parziale (197bp) è dovuta alla presenza del DNA linker, che nella digestione parziale non viene completamente idrolizzato dalla nucleasi, come invece succede nella digestione esaustiva.

Da questa serie di esperimenti, quindi, si evince che il nucleosoma ha una struttura fissa, costituita da 147bp con l’aggiunta degli istoni, che è valida per qualsiasi cellula eucariote.Ciò che varia è invece la lunghezza del DNA linker: tipicamente è di 20-60 bp ma ciascun organismo mostra una lunghezza caratteristica.Le porzioni del DNA che sono impegnate nell’espressione genica, nella replicazione o nella ricombinazione non presentano questa struttura di compattamento; sebbene non legate ai nucleosomi, queste regioni sono comunque associate con proteine non istoniche che regolano o partecipano a questi eventi.

ISTONI

Gli istoni sono piccole proteine cariche positivamente; le cellule eucaristiche ne contengono cinque tipi:H1 (peso molecolare di 20800), H2A (14000), H2B (13900), H3 (15400), H4 (11400). Gli ultimi quattro sono gli istoni del core e formano il complesso proteico attorno al quale si arrotola il DNA; l’istone H1, invece, non fa parte del core ma lega il DNA linker che unisce due nucleosomi adiacenti ed è perciò indicato come l’istone linker.I quattro istoni del core sono presenti sostanzialmente in egual quantità nella cellula, mentre H1 è quantitativamente la metà degli altri quattro.Per potersi associare strettamente al DNA (carico negativamente), gli istoni contengono un gran numero di amminoacidi carichi positivamente: più del 20% dei residui amminoacidici sono di lisina o di arginina; alcuni amminoacidi delle code degli istoni* possono essere acetilati (come la lisina), fosforilati (sempre come la lisina) oppure metilati: ciò li rende acidi.(La metilazione diretta delle citosine è un esempio di modificazione epigenetica: metilando le citosine si può modificare la regolazione genetica: in seguito a questa operazione, la coda istonica si sposta e non abbraccia più il DNA, rendendolo accessibile all’azione di varie proteine. Lo stesso risultato può essere ottenuto anche acetilando, fosforilando, demetilando, defosforilando, deacetilando altri amminoacidi). Gli istoni sono formati da una regione conservata che viene chiamata dominio histone-fold; tale dominio è formato da 3 regioni ad α elica separate da due tratti curvi non strutturati.L’histone-fold ha la caratteristica di essere affine al DNA e a se stesso: ciò è importante perché l’histone-fold media la formazione di specifiche coppie eterodimeriche: gli istoni H3 e H4 formano, infatti degli eterodimeri che poi si associano dando origine ad un tetramero in cui sono presenti due H3 e due H4; H2A e H2B invece formano degli eterodimeri che però restano separati. Ciascun istone possiede, poi, delle estremità (N e C-terminale) che variano a seconda dell’istone considerato: tra le due quella più importante è l’estremità C-terminale, che è causa del diverso peso molecolare dei vari istoni.

* le code istoniche saranno spiegate più avanti

STRUTTURE DI ORDINE SUPERIORE DELLA CROMATINA

L’avvolgimento del DNA attorno al core degli istoni avviene grazie alle differenti cariche presenti su questi due elementi: il DNA, infatti, presenta delle cariche negative, mentre gli istoni hanno cariche positive; nel punto di contatto con gli istoni le cariche negative del DNA vengono annullate, mentre quelle presenti sulla faccia esterna si respingono fra di loro e causano il ripiegamento del DNA intorno alle proteine. L’interazione fra il DNA e il core ha come conseguenza la deformazione dell’ottamero e del DNA: infatti il contatto col tetramero H3-H4 determina una periodicità di 10,7 bp per giro d’elica, mentre il contatto con i dimeri H2A-H2B determina 10bp per giro d’elica; facendo una media, viene un valore di 10,2 bp per giro d’elica, superiore al normale 10bp. Per cui il DNA linker risponde andando in superavvolgimento negativo. Una volta che i nucleosomi si sono formati, il passaggio successivo che permette un ulteriore impaccamento del DNA è il legame dell’istone H1; come gli istoni del core, anche H1 ha una carica netta positiva e ciò gli permette di interagire col DNA linker, costringendo il DNA ad una maggiore adesione all’ottamero istonico.Questo istone ha la non comune proprietà di legare due regioni distinte del DNA duplex, localizzate in punti asimmetrici del DNA; questo legame aumenta la lunghezza del DNA arrotolato strettamente attorno all’ottamero istonico e produce un più definito angolo di entrata e di uscita del DNA dal nucleosoma.: gli angoli variano sostanzialmente in funzione delle condizioni ambientali, come la concentrazione salina, il pH o la presenza di altre proteine.Tutto questo sistema permette di compattare il DNA di circa 40 volte.In seguito all’aggiunta dell’istone H1, la struttura acquisisce una sezione trasversale di 30 nm: la fibra da 30 nm; questa struttura, che può anche essere vista in vivo, rappresenta il successivo livello strutturale necessario per condensare il DNA; da notare che questa fibra determina una minore accessibilità per molti enzimi e proteine al DNA (come la RNA polimerasi).Esistono due modelli strutturali che possono spiegare la fibra da 30 nm:

- Solenoide il DNA organizzato in nucleosomi forma una superelica contenente approssimativamente 6 nucleosomi per giro; questo modello è supportato da studi eseguiti al microscopio elettronico e di diffrazione ai raggi X, che indicano che la fibra al centro presenta un foro da 11 nm, approssimativamente uguale a quello del core nucleosomico.

- Zig-zag la fibra da 30 nm è una struttura compatta, formata da nucleosomi disposti a zig-zag; questa conformazione richiede che il DNA linker attraversi l’asse longitudinale della fibra: i DNA linker più lunghi favoriscono questa struttura e, dato che le lunghezze dei linker variano da specie a specie, la struttura della fibra da 30 nm potrebbe non essere sempre la stessa.

Il grado di compattazione raggiunto dalla fibra da 30 nm non è ancora sufficiente per alloggiare i 2 metri di DNA nel nucleo; sono quindi necessarie ulteriori strutture che permettano al DNA di impaccarsi maggiormente.Sebbene la struttura non sia ancora del tutto chiara, è stato proposto un modello condiviso: la fibra da 30 nm forma delle anse, contenenti 40-90 kb di DNA; queste anse sono bloccate alla loro base da una struttura proteica detta scaffold nucleare; dato che il DNA è superavvolto, anche queste anse vanno in superavvolgimento. Sono state identificate due classi di proteine che contribuiscono alla formazione dello scaffold: le topoisomerasi II e le proteine SMC.Tutto ciò superavvolge di 100 volte; occorrerebbe super avvolgere il tutto di altre 10 volte, ma ancora non si sa come accade.

LE CODE DEGLI ISTONI

Gli istoni sono dotate di code; ogni coda, carica positivamente, si infila sotto ai due solchi dell’elica del DNA, dirigendosi verso l’esterno del nucleosoma. Avendo carica opposta al DNA, lo abbracciano, rendendo la parte del filamento all’esterno del nucleosoma inaccessibile, in quanto viene coperta.In più, gli istoni del core mancanti delle code N-terminali sono incapaci di formare la fibra da 30 nm: il ruolo più verosimile delle code è quello di stabilizzare la fibra da 30 nm, interagendo con i nucleosomi adiacenti.

LOCALIZZAZIONE DELLA CROMATINA NEL NUCLEO

Il nucleo di una cellula eucariote è avvolto esternamente dalla cisterna perinucleare e comunica con il citoplasma grazie alla presenza di pori nucleari; sotto la membrana nucleare interna è presente la lamina nucleare, che ha il compito di sostenere la struttura del nucleo. Agganciate alla membrana nucleare interna inoltre, ci sono delle proteine che sporgono nel nucleo e che hanno il compito di ancorare la lamina alla membrana nucleare e legare la cromatina e altre proteine; queste proteine sono specifiche della membrana nucleare interna e vengono prodotte dal RER. I cromosomi, quindi, si trovano in posizioni specifiche all’interno del nucleo e restano fissi in questi punti.

ETEROCROMATINA E EUCROMATINA

Si possono distinguere due tipi distinti di cromatina:- Eterocromatina: è la parte del nucleo più intensamente colorabile, costituita da DNA

molto condensato, che può raggiungere condensazioni di 20000 volte; è molto poco coinvolta nella trascrizione, perché inattiva, ed è generalmente attaccata alla membrana nucleare; può essere divisa in: costitutiva (non si decondensa quasi mai) e facoltativa (si può decondensare)

- Eucromatina: è la parte del nucleo meno colorabile e situata nella zona più interna; è meno condensata dell’eterocromatina e infatti è la parte che viene attivamente trascritta.

LA SINTESI DEL DNA

La sintesi del DNA è differente dalla replicazione del cromosoma: dal punto di vista chimico, infatti, sintetizzare significa legare tramite un legame fosfodiesterico vari nucleotidi. Per poter seguire la sintesi del DNA si utilizza la tecnica del TCA precipitabile (TCA acido tricloroacetico).MATERIALI:

- DNA radioattivo (nucleotidi marcati radioattivamente in α utilizzando fosforo 32);- DNA polimerasi.- Soluzione di TCA.

L’obiettivo è separare la radioattività che rimane in soluzione da quella incorporata nel DNA dall’azione della DNA polimerasi.METODO:

1) La miscela con i materiali suddetti viene collocata su un quadratino di lana di vetro.2) Il quadratino viene buttato in un becker contentente TCA.

3) I polimeri (DNA) precipitano e per effetto elettrostatico si attorcigliano alle fibre di lana di vetro; le piccole molecole, invece, si disperdono nel mezzo esterno (soluzione): tra queste piccole molecole si trovano anche i nucleotidi marcati radioattivamente.

4) Si fa asciugare il quadratino e lo si mette in un contatore geiger, in grado di contare la radioattività.

Per poter determinare la cinetica nel tempo di sintesi, occorre ripetere le misurazioni ogni 5-10 minuti: ciò che mi aspetto è che al passare del tempo aumenti la radioattività dei campioni in quanto la polimerasi sintetizza un filamento sempre più lungo, che quindi contiene un maggior numero di nucleotidi marcati. In realtà:

- Se all’inizio si parte con un DNA a doppio filamento la radioattività nel campione non varia e rimane sempre a 0 la polimerasi NON ha un innesco (primer) sul quale legarsi, iniziando a inserire i nucleotidi marcati, che rimarranno quindi tutti in soluzione: nessuno precipiterà sulla lana di vetro e il geiger non registrerà alcuna radioattività.

- Se all’inizio si parte da un DNA a singolo filamento, la radioattività rimarrà sempre 0 (stesse motivazioni di prima).

- Se si parte con un DNA a doppio filamento con frequenti rotture (DNA attivato) che lo rendono ogni tanto a singolo filamento (usando delle DNasi in grado di mangiucchiare), la radioattività aumenta costantemente ad ogni prelievo si è partiti con un DNA substrato ricco di terminazioni 3’OH e 5’P : per la DNA polimerasi FONDAMENTALE è la presenza delle estremità 3’OH, che fungono da innesco. Da qui, infatti, la polimerasi si attacca ed inizia ad incorporare nucleotidi monofosfato (radioattivi) al 3’OH, per chiudere i buchi.

Per poter studiare la DNA polimerasi da sola, occorre purificarla; per farlo si utilizza la tecnica della cromatografia di affinità.

1) Si prepara una colonna contenente fosfocellulosa: le proteine affini a questa molecola rimangono intrappolate nel passaggio attraverso la colonna.

2) Si prende l’estratto utilizzato nell’esperimento precedente e lo si carica sulla colonna, aggiungendo un tampone, in modo che il tutto scenda lungo la colonna stessa.

3) Se il legame tra le proteine e la fosfocellulosa è di natura ionica, per staccarle è sufficiente utilizzare una soluzione ad alta molarità di sale: creando un gradiente di forza ionica, nella colonna passa una forza ionica crescente. In questo modo le varie proteine attaccate si staccano una alla volta.

4) Si raccolgono in varie provette diverse: la DNA polimerasi va a finire tra la 30° e la 45° frazione (lo si capisce riutilizzando il TCA precipitabile: se si aggiungono DNA attivato e questa proteina, c’è sintesi, quindi è la polimerasi).

In questo modo si riscontrano più PICCHI di attività della DNA polimerasi.I 3 picchi sono identificati come Pol I, Pol II e Pol III: essi hanno differenti altezze in quanto le attività dei 3 enzimi non sono uguali tra loro; ciò suggerisce che nella cellula di E.coli vi siano tre differenti polimerasi, come in tutti i procarioti.

LE DNA POLIMERASI PROCARIOTICHE

La DNA polimerasi è una proteina dotata di struttura quaternaria, ovvero è costituita da più subunità (oloenzima): tra tutte, la subunità α è quella dotata di attività catalitica; le altre possiedono attività accessorie. Se si estrapola la subunità α e la si utilizza da sola, essa sa svolgere ancora la sua azione ma in modo molto meno processivo: riaggiungendo le altre subunità (soprattutto la β), la processività torna ai livelli originari.I procarioti possiedono 3 tipi di polimerasi:- Polimerasi I è specializzata nella rimozione degli RNA primer che vengono utilizzati

per iniziare la sintesi del DNA; per questa ragione, questa polimerasi ha associata una attività esonucleasica 5’3’ (o anche da 3’5’) che permette di rimuovere i

ribonucleotidi, sostituendoli con i deossinucleotidi. La processività di questo enzima è molto bassa (20-100 nucleotidi) e questa proprietà è l’ideale per la rimozione dell’innesco e la sintesi del DNA necessario per riempire l’interruzione che tale rimozione ha determinato. Questo enzima, dato che può rimanere ancorato al DNA per poco tempo e continua ad attaccarsi ed a staccarsi, viene definito distributivo.

- Polimerasi II polimerizza come la Pol I, ma depolimerizza solo da 3’5’; ha la funzione di riparare il DNA.

- Polimerasi III è il principale enzima coinvolto nella replicazione del cromosoma; poiché l’intero genoma di E.coli (4,6 Mb) è replicato a partire da due sole forche replicative, l’enzima deve essere molto processivo. In accordo con ciò, la Pol III fa parte, normalmente, di un grande complesso che conferisce all’enzima questa processività molto elevata (DNA Pol III oloenzima). È in grado sia di polimerizzare il DNA in direzione 5’3’, sia di depolimerizzarlo in direzione 3’5’ (attività esonucleasica: viene demolito il DNA a partire da una estremità, nucleotide per nucleotide).

Tra tutte e 3, la più abbondante nelle cellule procariotiche è la Pol I; della Pol II e della Pol III ce ne sono quantità sempre decrescenti.La I e la III devono essere molto precise e non devono compiere alcun tipo di errore: per questa ragione sono entrambe dotate di attività esonucleasica, che permette tra le altre cose anche di correggere errori di appaiamento delle basi azotate durante il processo di polimerizzazione.

LE DNA POLIMERASI EUCARIOTICHE

Negli eucarioti la situazione è molto più complicata in quanto essi posseggono fino a 15 DNA polimerasi; di queste 5 sono quelle più importanti:

- Pol α/primasi è specificatamente coinvolta nell’iniziare le nuove catene e consiste di una proteina formata da 4 subunità: a due di queste è associata l’attività polimerasica, mentre le altre due hanno attività primasica. Dopo la sintesi dell’innesco in conseguenza dell’attività primasica, il risultante complesso innesco-stampo viene utilizzato immediatamente nell’attività polimerasica; in questa fase la Pol α/primasi (poco processiva) è sostituita dalle Pol δ e della Pol ε. Questo processo di sostituzione prende il nome di switching della polimerasi.

- Pol β ripara Il DNA, ripristinando le basi eliminate.- Pol γ enzima fondamentale nella replicazione del DNA mitocondriale e riparazione.- Pol δ enzima principale della replicazione del DNA; è in grado anche di riparare le

basi ed i nucleotidi eliminati.- Pol ε enzima importante per la replicazione del DNA, per la riparazione delle basi e

dei nucleotidi eliminati.

A differenza della maggior parte degli enzimi, che posseggono un sito dedicato ad ogni singola reazione, la DNA polimerasi utilizza un unico sito attivo per catalizzare l’aggiunta di tutti e 4 i deossinucleosidi trifosfati: la polimerasi controlla la capacità del nucleotide che deve essere polimerizzato di formare le coppie aventi un ingombro sterico identico, come lo sono quelle A-T e G-C, piuttosto che verificare la correttezza del nucleotide che entra nel sito attivo.Coppie di basi non corrette determinano un brusco abbassamento della velocità di polimerizzazione dovuto ad uno sfavorevole allineamento dei substrati (questo è un esempio di selettività cinetica: l’enzima aumenta di molto la velocità di formazione del legame solo se è presente in substrato corretto).Inoltre la DNA polimerasi mostra una elevata capacità di riconoscimento fra i ribo- e deossinucleotidi trifosfati: questa discriminazione è mediata da una esclusione di carattere sterico che coinvolge il sito attivo della polimerasi. Infatti, il sito di legame al nucleotide è troppo piccolo per permettere la presenza di un 2’OH sul nucleotide che deve essere

polimerizzato: questo spazio è occupato da due amminoacidi che formano interazioni di Van der Waals con l’anello dello zucchero.Cambiando questi amminoacidi con altri aventi catena laterale più piccola si ottiene una DNA polimerasi con una significativa riduzione della capacità di discriminare fra dNTP e rNTP.

Il DNA substrato si pone in una grande fenditura che assomiglia ad una mano destra parzialmente chiusa: i tre domini che formano la polimerasi sono così chiamati per analogia pollice, dita e palmo.

- Palmo è composto da un foglietto β e contiene gli elementi principali del sito catalitico; in particolare questa regione lega due ioni bivalenti Mg2+ e Zn2+ che modificano dal punto di vista chimico l’ambiente attorno alle basi appaiate e il 3’OH dell’innesco.In aggiunta al suo ruolo catalitico, il palmo controlla anche l’accuratezza dell’accoppiamento delle basi che sono appena state polimerizzate: questa regione della polimerasi forma numerosi legami a idrogeno con le coppie di basi attraverso il solco minore della doppia elica neo sintetizzata. Appaiamenti scorretti abbassano la velocità di polimerizzazione: ciò (unito ad una bassa affinità per il DNA) permette il rilascio dell’innesco.

- Dita sono anch’esse importanti per la catalisi: alcuni amminoacidi localizzati all’interno delle dita legano i dNTP che devono essere polimerizzati. Altra importante funzione è che una volta formatasi una corretta coppia di basi fra lo stampo ed il suo nuovo nucleotide le dita si muovono per racchiudere e trattenere il dNTP; questa forma più compatta della polimerasi stimola la catalisi spostando il nucleotide fino a porlo a stretto contatto con gli ioni bivalenti che fungono da catalizzatori.

- Pollice non è direttamente coinvolto nella catalisi, ma piuttosto interagisce con il DNA neo sintetizzato. Questo serve a due scopi: primo, mantiene in corretta posizione l’innesco ed il sito attivo; secondo, stabilizza il complesso tra la DNA polimerasi ed il substrato. Questa associazione contribuisce ad aumentare la capacità della DNA polimerasi nell’aggiungere molti nucleotidi tutte le volte che si lega al complesso innesco-stampo.

La catalisi mediata dalla DNA polimerasi è un evento rapido: è in grado di polimerizzare fino a 1000 nucleotidi al secondo.La velocità di sintesi è principalmente dovuta alla natura processava dell’enzima; la processività è una caratteristica degli enzimi che hanno come substrato dei polimeri; nel caso delle DNA polimerasi, la processività viene definita come il numero medio di nucleotidi polimerizzati dall’enzima nell’unità di tempo.Ogni polimerasi è caratterizzata da una propria processività che può variare da pochi nucleotidi a più di 50000 basi aggiunte ogni volta che l’enzima si poggia sullo stampo.Questa elevata processività viene persa se, in vitro, la polimerasi viene utilizzata da sola, senza altre proteine: essa non riesce infatti a sintetizzare più di 20-100 basi prima di staccarsi dal filamento di DNA. Alla forca replicativa la polimerasi è infatti associata a proteine dette DNA sliding clamp (= pinza scorrevole): queste proteine sono composte da più subunità, uguali fra loro, che determinano, nel loro complesso, una forma a ciambella. Sono in grado di scivola lungo il DNA, senza mai staccarsi da esso, mantenendo la DNA polimerasi fortemente posizionata sulla forca replicativa: il complesso così formato si sposta efficientemente lungo tutto il DNA stampo durante il processo di sintesi.Anche in presenza della sliding clamp la polimerasi tenderebbe a staccarsi ogni 20-100 nucleotidi però non può allontanarsi e quindi rapidamente si rilegherà al complesso innesco-stampo.Una volta rilasciata la DNA polimerasi, le sliding clamp possono richiamare altre proteine che devono lavorare sul sito di sintesi del DNA.

Dato che la struttura della sliding clamp è ad anello, prima di attaccarsi o staccarsi al DNA deve essere aperta; uno speciale complesso proteico, noto come posizionatore delle sliding clamp, catalizza l’apertura ed il posizionamento della proteina sul DNA utilizzando l’energia di idrolisi dell’ATP; questo posizionatore è quindi anche in grado di rimuovere l’enzima nel momento in cui la reazione di sintesi del DNA è finita.Il posizionatore e la DNA polimerasi NON possono interagire contemporaneamente col la sliding clamp, poiché queste proteine riconoscono lo stesso sito di legame; per cui se è legata alla polimerasi, la sliding non può essere rimossa dal DNA.

L’ATTIVITA’ ESONUCLEASICA

Durante la polimerizzazione la cellula è dotata di una elevata accuratezza, in quanto commette un errore di appaiamento ogni 1010 basi polimerizzate.Ciò può essere spiegato solo con una attività di correzione del DNA neo sintetizzato, grazie alla presenza di nucleasi che rimuovono le basi scorrette; questo tipo di nucleasi è stato inizialmente identificato come attività associata alla stessa DNA polimerasi ed è conosciuto con il nome di esonucleasi correttore di bozze. Questo tipo di esonucleasi è capace di demolire il DNA a partire dal terminale 3’OH, cioè dal punto in cui la nuova catena di DNA si sta allungando (esonucleasi).La rimozione dei nucleotidi errati è facilitata dalla ridotta capacità della DNA polimerasi di aggiungere successivi nucleotidi ad una coppia di basi che non rispetta il principiò della complementarietà; infatti tratti di DNA non correttamente accoppiati alterano la geometria del 3’ –OH, determinando una debole interazione fra il nucleotide che deve essere polimerizzato ed il “palmo” della polimerasi. Questa alterazione riduce la velocità della reazione di catalisi, facendo quindi diminuire il numero di nucleotidi polimerizzati nell’unità di tempo e facendo aumentare l’attività esonucleasica.La correzione di eventuali errori può essere effettuata senza che il DNA debba distaccarsi dalla polimerasi; infatti, quando l’enzima rileva la presenza di una coppia di basi non corretta, il complesso innesco-stampo scivola via dal sito attivo della DNA polimerasi e si avvicina al sito che presenta attività esonucleasica; effettuata la correzione, il complesso innesco-stampo ritorna nella posizione di partenza e riparte la polimerizzazione.

LA REPLICAZIONE DEL DNA

Affinchè la replicazione del DNA possa iniziare, è necessaria la separazione della doppia elica, in modo tale da creare due catene di DNA stampo a singolo filamento. Sebbene la separazione dei filamenti sia relativamente semplice alle estremità terminali dei cromosomi, la sintesi inizia generalmente in una o più regioni interne: gli specifici siti dove il DNA si apre e dove inizia la sintesi vengono chiamati origini di replicazione (a seconda degli organismi ci possono essere da una a migliaia di origini di replicazione per cromosoma).Nei procarioti, come E.coli, tutto il DNA è sintetizzato a partire da un’unica origine di replicazione che prende il nome di replicone e vi sono due blocchi replicativi: la replicazione si arresta nel centro compreso tra i due blocchi in quanto le due forche si rallentano. Il modello del replicone contempla due componenti che controllano l’inizio della replicazione: il replicatore e l’iniziatore.

- Replicatore è definito come l’intero set di sequenze nucleotidiche agenti in cis sufficiente per dirigere l’inizio della replicazione; sebbene l’origine di replicazione faccia sempre parte del replicatore, a volte è soltanto una frazione delle sequenze del DNA necessarie per dirigere la replicazione. (il replicatore di E.coli è lungo 250 bp e se vengono tolte il batterio muore; è formato da 4 nonimeri e da 3 tredicimeri, ovvero sequenze ripetute 4 e 3 volte rispettivamente).

- Iniziatore è una complesso proteico che riconosce in modo specifico un elemento del DNA che si trova nel replicatore ed attiva l’inizio della replicazione; più

precisamente è un multimero di proteina A, con capacità di formare polimeri in quanto affine a se stessa, in grado di legare i nonimeri come se fosse un ottamero istonico. In seguito a questo legame cambia il numero di bp per giro d’elica, si formano superavvolgimenti, che si possono aprire a dare le bolle di replicazione, che si aprono in prossimità dei tredici meri, ricchi di A-T.

Il punto che si trova fra i due filamenti separati e la doppia elica che ancora non è andata incontro a divisione prende il nome di forca replicativa ed è il punto dove attivamente vengono sintetizzate le nuove catene; la forca si sposta continuamente verso la parte di DNA non ancora denutarata, lasciandosi dietro due catene a singolo filamento.La forza replicativa lavora insieme alla DNA elicasi: questo è un enzima in grado di catalizzare la separazione dei due filamenti, legandosi e spostandosi lungo un singolo filamento di DNA, utilizzando l’energia fornita dall’idrolisi di nucleotidi trifosfati (di solito ATP). La elicasi è una proteina esamerica, che assume una conformazione ad anello, circondando uno dei due singoli filamenti vicino alla forca, dove è presente la giunzione fra singolo e doppio filamento; il meccanismo d’azione è processivo: è in grado infatti di separare un numero molto elevato di coppie di basi, rimanendo tenacemente adesa al DNA in quanto il rilascio dell’enzima può avvenire solo in seguito all’apertura dell’anello, un evento abbastanza raro. Ciascuna elicasi si sposta lungo il DNA in una direzione definita: questa è una caratteristica tipica, nota come polarità (5’3’ o 3’5’).METODOSi prendano un frammento di DNA circolare freddo (non radioattivo) ed uno di DNA caldo (radioattivo) complementare; facendo correre su gel di agarosio, il movimento dei due frammenti si può seguire, in quanto uno è radioattivo.Dopodichè, al DNA si aggiunga un estratto proteico di E.coli: facendolo correre sempre su gel di agarosio, la corsa si ferma alla stessa altezza di prima.Mettendo però anche ATP e facendo una elettroforesi, il DNA radioattivo corre di più: l’elicasi necessita ATP; una volta che gli viene fornito, separa i due filamenti di DNA che, essendo più piccoli, corrono di più.

Dopo il passaggio della DNA elicasi, il singolo filamento generato non può riappaiarsi con il filamento complementare in quanto deve essere utilizzato come stampo dalla polimerasi; per stabilizzare le catene separate esistono delle proteine, le SSB (single stranded binding protein), che rapidamente si legano al singolo filamento: la presenza di una SSB facilita il legame di un’altra SSB sul tratto di DNA adiacente (legame cooperativo le molecole di SSB si legano l’una all’altra con una forza di legame che aumenta con l’aumentare del numero di molecole presenti). L’interazione con il DNA è di tipo sequenza-indipendente e le interazioni sono di natura elettrostatica.Una volta ricoperto di SSB, il DNA assume una conformazione distesa che facilità il suo ruolo di stampo sia per la sintesi dei nuovi filamenti che per l’innesco.Nel momento in cui i due filamenti vengono separati, a valle della forca replicativa si formano dei superavvolgimenti positivi; questo accumulo di superavvolgimenti è il risultato dell’attività della DNA elicasi che elimina i legami a idrogeno fra le catene complementari. In una molecola circolare covalentemente chiusa, non si possono ridurre i linking number, per cui non possono essere scaricate le tensioni torsionali a cui la molecola è sottoposta; di conseguenza, mentre la elicasi prosegue, i legami topologici della molecola si accumulano nella parte a doppia elica non ancora replicata. Affinchè la superelicità di questa parte di molecola possa rimanere costante, deve essere eliminato un legame topologico ogni 10 bp denaturate; le supereliche introdotte vengono rimosse dalle DNA topoisomerasi, che agiscono a valle della forza replicativa.Il problema è molto evidente nel cromosoma circolare dei batteri (in quanto covalentemente chiuso), ma è presente anche nei cromosomi eucariotici: essi potrebbero (in quanto lineari) ruotare attorno al loro asse longitudinale in modo tale da disperdere all’estremità della molecola i superavvolgimenti; tuttavia ciò non accade perché è impossibile, per motivi di

inerzia, far ruotare un molecola di DNA lunga milioni di bp ogni qualvolta un giro d’elica viene denaturato.

Dato che la replicazione può avvenire solo in direzione 5’3’ ma i due filamenti sono antiparalleli, soltanto uno dei due può essere replicato seguendo in maniera continua la forca replicativa: su questo filamento la DNA polimerasi semplicemente segue la forca replicativa ed il DNA neo sintetizzato è definito leading strand (= filamento continuo).La sintesi che ha come stampo l’altro filamento, invece è più difficoltosa, in quanto la polimerasi è costretta a muoversi in direzione opposta rispetto alla forca replicativa; questo filamento viene definito lagging strand (=filamento ritardato): su di esso la sintesi avviene in maniera discontinua e ritardata, in modo di permettere alla forca replicativa di creare una quantità sufficientemente lunga di singolo filamento. Ogni qual volta che si crea uno stampo di lunghezza adeguata, inizia la sintesi del DNA, fino a raggiungere il terminale 5’ del DNA precedentemente sintetizzato.I frammenti risultati prendono il nome di frammenti di Okazaki e possono variare di lunghezza dai 1000 ai 2000 nucleotidi nei procarioti e dai 100 ai 400 nucleotidi negli eucarioti.È fondamentale che il DNA resti a filamento singolo per il minor tempo possibile: per coordinare e velocizzare la replicazione di entrambi i filamenti, molte DNA polimerasi lavorano in corrispondenza della forca replicativa.In E.coli l’azione coordinata è facilitata dal legame fisico che unisce le polimerasi nel Pol III oloenzima; questo include:

- 2 copie dell’enzima DNA polimerasi III core.- 1 complesso formato da 5 proteine γ (il posizionatore dello sliding clamp), in grado di

legare entrambe le polimerasi.- 2 proteine τ, che fanno da tramite tra le proteine γ e le DNA polimerasi.

Il modello ipotizzato per la sintesi del DNA sfrutta il fatto che questa molecola è flessibile.Non appena la elicasi apre la doppia elica in corrispondenza della forca, il filamento leading viene rapidamente copiato mentre il lagging viene mantenuto a singolo filamento per effetto delle SSB; ad intervalli di tempo regolari, viene sintetizzato su questo filamento un innesco. Non appena una molecola di DNA polimerasi ha terminato di sintetizzare il frammento di Okazaki precedente, viene rilasciata dallo stampo pur rimanendo associata alla DNA polimerasi del filamento leading (mediante il complesso dell’oloenzima) potendo così trovare il nuovo innesco. Legandosi a questo nuovo primer, la polimerasi forma una nuova struttura a laccio iniziando un successivo ciclo di sintesi del frammento di Okazaki.Questo sistema di sintesi viene chiamato modello a trombone, con riferimento al fatto che il laccio che si viene a formare aumenta di dimensione man mano che la sintesi procede.

Tutte le DNA polimerasi richiedono un innesco che presenti un OH sul 3’ dello zucchero: infatti questi enzimi non possono iniziare la sintesi de novo; la cellula utilizza la capacità della RNA polimerasi per sopperire a ciò che la DNA polimerasi non è in grado di fare. La primasi è infatti una RNA polimerasi specializzata che permette la formazione di piccoli primer (inneschi) da 5-10 nucleotidi: questi inneschi sono successivamente allungati dalla DNA polimerasi.La frequenza con cui interviene la primasi sui due filamenti è completamente differente: mentre il leading strand necessita di 1 solo primer, il lagging ne necessita 1 per ogni filamento di Okazaki (per cui potrebbero servire fino a centinaia di migliaia di inneschi).La primasi non richiede sequenze specifiche per iniziare la sintesi dei primer, ma viene attivata soltanto quando associata ad altre proteine coinvolte nella replicazione del DNA, come la DNA elicasi.

Affinchè la replicazione del DNA sia completa, gli RNA primer devono essere rimossi e rimpiazzati con deossiribonucleotidi; l’enzima che interviene è la RNAsi H, che riconosce e rimuove la maggior parte di ciascun primer. Questo enzima idrolizza specificamente l’RNA appaiato con catene di DNA (l’H indica proprio Hybrid RNA:DNA); l’RNAsi H rimuove tutto il

primer eccetto il ribonucleotide covalentemente attaccato al nucleotide di inizio del DNA. Ciò può essere spiegato dal fatto che questo enzima può idrolizzare i legami covalenti SOLO tra due ribonucleotidi; per cui l’ultimo ribonucleotide viene rimosso da una attività esonucleasica che degrada indifferentemente l’RNA o il DNA a partire dal terminale 5’.La rimozione del primer lascia nel DNA uno spazio (gap) che è un substrato ideale per la DNA polimerasi, che riempie questo gap fino a che non si ricostituisce un doppio filamento, formando così un DNA completo eccetto per l’interruzione di un legame fosfodiesterico.Questa interruzione viene poi chiusa da un altro enzima, la DNA ligasi: essa utilizza un cofattore ad alta energia (coma l’ATP) per creare il legame fosfodiesterico.Soltanto quando tutti i primer sono stati rimpiazzati e i nick saldati si può dire che la sintesi del DNA sia completata.

TUS protein riconoscono la sequenza di terminazione e lì si collocano: a seconda della situazione possono diventare oltrepassabili oppure degli ostacoli per la DNA elicasi.Se i blocchi della replicazione non intervengono, nel punto diametralmente opposto all’origine di replicazione (nei cromosomi circolari) le due forche replicative si incontrano.Una volta replicato il DNA (in cromosomi circolari) si formano due anelli concatenati, che si separano grazie alla topoisomerasi 2: questa reazione permette la decatenazione dei due cromosomi neo sintetizzati e quindi la loro segregazione nelle cellule separate.

LA TRASCRIZIONE

La trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA; tale processo degli eucarioti avviene all’interno del nucleo mentre nei procarioti (che non sono compartimentalizzati) avviene nel citoplasma contemporaneamente con la traduzione.L’enzima alla base di questo procedimento è la RNA polimerasi; essa agisce in maniera molto simile alla DNA polimerasi, in quanto catalizza la polimerizzazione tra un nucleotide e l’altro, sebbene non utilizzi dei desossiribonucleotidi ma dei ribonucleotidi trifosfato (uracile al posto della timina).

L’elica di DNA usata come stampo viene letta in direzione 5’3’ e per poter dare inizio al processo non occorre alcun tipo di primer in quanto l’enzima può iniziare la trascrizione ex novo.I procarioti presentano una sola RNA polimerasi contro le 3 degli eucarioti; inoltre un’importante differenza è che nei primi tale enzima svolge l’azione di elicasi (perché è necessario che i due filamenti di DNA siano denaturati affinchè avvenga il processo), mentre nei secondi interverranno diversi fattori proteici (TFIIH).Per estrarre questo enzima si esegue il seguente esperimento:METODO

1) Si prepari una colonna di resina a scambio ionico (DEAE sephadex) carica negativamente.

2) Attraverso di essa si faccia passare l’estratto proteico di E.coli: ciò che è carico positivamente viene intrappolato dalla resina, il resto no.

3) Si esegue un gradiente di forza ionica per eluire le proteine trattenute, tra le quali si trova anche la RNA polimerasi; queste vengono raccolte in varie provette a seconda della forza ionica con la quale erano legate alla resina.

4) Con le provette si effettua un saggio mediante NTPs, Mg2+, Mn2+, NaCl (senza innesco tanto la RNA polimerasi non ne ha bisogno); a un certo punto del gradiente registrerò un picco di attività RNA polimerasica, capendo così in quale frazione si trovava questo enzima.

5) Uso quella frazione per purificare la RNA polimerasi.La polimerasi procariotica è composta da due copie della subunità α e da una copia delle subunità β,β’,ω e σ; le prima cinque costituiscono il core enzimatico, contenente il sito catalitico. Invece tutte e sei insieme formano l’oloenzima.In generale la forma di questo enzima assomiglia alla chela di un granchio (ciò ricorda la struttura a mano della DNA polimerasi); le due pinze della chela sono costituite principalmente dalle due subunità maggiori β e β’; il sito attivo, che è costituito da alcune regioni di entrambe queste subunità, si trova alla base delle pinze, all’interno di una regione chiamata solco centrale attivo (il sito attivo è in grado di legare due ioni Mg2+ in modo da adattarsi al meccanismo catalitico a cationi bivalenti per l’aggiunta dei nucleotidi proposto per ogni tipo di polimerasi).Il core della RNA polimerasi batterica è in grado di iniziare la trascrizione in qualsiasi punto della molecola di DNA; nelle cellule però la polimerasi inizia la trascrizione solamente dai promotori: questo è possibile grazie alla presenza del fattore σ, in grado di convertire l’enzima core nella forma che è in grado di iniziare solo dai promotori. Questo viene dimostrato nel seguente esperimento:METODO

1) Si prende un RNA messaggero: mediante l’enzima trascrittasi inversa si effettua una retro trascrizione, ovvero si passa dal RNA al DNA, usando deossinucleotidi radioattivi (in questo modo il retrotrascritto è radioattivo).

2) Utilizzando la banca genomica contenuta in E.coli, si seminano vari cloni su una piastra.3) Si effettua una colony hibridization: si colloca una sonda radioattiva (costruita prima)

all’interno di questi batteri; quando la sonda incontra un frammento a lei complementare, si lega formando un ibrido (DNA banca genomica + sonda radioattiva): come conseguenza tutte queste colonie saranno radioattive.

4) A questo punto si estrae il DNA batterico dalle colonie radioattive e si excidono quelle parti con enzimi di restrizione che tagliano a livello dei polilinker; tramite southern blot si ottiene una banda radioattiva.

5) Utilizzando su questi frammento la RNA polimerasi core, si ottengono frammenti eterogenei (tutti diversi); se si utilizza, invece, l’oloenzima si ottengono molecole omogenee (tutte lunghe uguali) tranne in un caso in cui restano eterogenee.

Questo perché la subunità σ riconosce una sequenza specifica di partenza (definita promotore); senza quella subunità il core sarebbe affine a qualsiasi parte del DNA e quindi la trascrizione inizia dove vuole.

Rimane ora da determinare quale sia la sequenza consensus dei promotori; per farlo si utilizza un ulteriore esperimento, che permette di trovare proteine che riconoscono sequenze specifiche, leggendole nel solco maggiore o nel solco minore del DNA, il footprinting.METODO

1) Si prende un frammento di DNA di 100 o 200 bp e lo si rende radioattivo ad una estremità (utilizzando una proteina chinasi per aggiungere un fosfato radioattivo; dato che in questo modo otterrei due estremità radioattive ma ne occorrerebbe una sola, si utilizza un enzima di restrizione che taglia una delle due estremità).

2) Si tratta questo DNA con una DNasi (un enzima in grado di creare casualmente dei nick) in modo che essa formi statisticamente un solo nick per frammento di DNA.

3) Si denatura in DNA al calore (con conseguente apertura delle due eliche) e lo si analizza su un gel di acrilammide ed urea (l’urea impedisce che si ricreino i legami tra le due eliche); in questo modo si trovano delle bande in scaletta che differiscono tra loro per un solo nucleotide alla volta. Se insieme ad DNA, però, si mette anche una proteina che si lega ad esso su una sequenza specifica, la DNasi crea il nick o prima o dopo, preservando le basi azotate coperteNel gel si potrà così apprezzare un buco senza bande, che corrisponde al punto in cui si era fermata la proteina (se la proteina non è affine ad una sequenza specifica, non si troverà alcun buco ma solo un indebolimento delle bande).

NEI PROCARIOTI

Si è così visto che la proteina σ protegge due zone, che stanno a monte del trascritto:- La regione a -10 (minus 10 o Pribnow box), che si trova 10 nucleotidi prima rispetto al

primo nucleotide trascritto (+1) TATAAT- La regione a -35 (minus 35) TGTTGACA

Le due sequenze sopra indicate sono definite sequenze consenso: essa rappresenta le regioni -10 e -35 più comuni, separate dallo spaziatore ottimane, di 17 paia di basi; tuttavia solo un esiguo numero di promotori ha esattamente quella sequenza di basi azotate; questi sono definiti promotori forti. La forza di un promotore viene intesa come il numero di trascritti a cui può dare inizio in un dato tempo.Questa misura dipende da quanto il promotore leghi la polimerasi, con quale efficienza supporti l’isomerizzazione e quanto prontamente la polimerasi possa evadere dal promotore stesso.

La prima fase del ciclo di trascrizione (INIZIO) prevede il legame della polimerasi al promotore, dando così origine al complesso chiuso; in questa forma il DNA rimane a doppia elica e l’enzima è legato ad una faccia dell’elica stessa. In seguito si ha il passaggio al complesso aperto: le catene di DNA si separano (melting) per circa 14 paia di basi (tra la posizione -11 e +3 rispetto al sito di inizio), attorno al punto di inizio, formando la bolla di trascrizione. Nel caso degli enzimi batterici, questa transizione da complesso chiuso a complesso aperto viene detta spesso isomerizzazione: non richiede energia derivata dall’idrolisi dell’ATP bensì è un cambio conformazionale spontaneo e irreversibile verso una forma energeticamente più favorita.L’apertura del DNA libera il filamento stampo e così la polimerasi comincia a muoversi su di esso, aprendo l’elica del DNA davanti al suo sito di polimerizzazione e permettendo al DNA di richiudersi dietro. In questo modo i nucleotidi successivi vengono incorporati nella catena di RNA; l’incorporazione dei primi 10 è un processo piuttosto inefficiente e in questo stadio spesso l’enzima rilascia dei piccoli trascritti e poi ricomincia subito la sintesi (inizio abortivo): una volta che l’enzima ha superato i 10 nucleotidi si dice che è evaso dal promotore. Si forma così il complesso ternario stabile, contenente l’enzima, il DNA e l’RNA.

Può iniziare così la seconda fase del ciclo della trascrizione (ALLUNGAMENTO): all’apertura del solco centrale attivo, le due catene di DNA si separano e seguono diversi cammini passando dall’enzima prima di uscire lungo i rispettivi canali e si riassociano in doppia elica dietro alla polimerasi che sta allungando.I ribonucleotidi entrano nel sito attivo per il loro canale e vengono aggiunti alla catena di RNA sotto la guida del filamento stampo; solamente 8 o 9 nucleotidi della catena di RNA rimangono accoppiati allo stampo in ogni determinato momento: il resto della catena di RNA si stacca e viene portata fuori dall’enzima attraverso il canale di uscita dell’RNA.L’ultima fase della trascrizione prende il nome di TERMINAZIONE: alcune sequenze, chiamate terminatori, segnalano alla polimerasi in fase di allungamento di staccarsi dal DNA e di rilasciare la catena di RNA sintetizzata; nei batteri, i terminatori sono di due tipi:

- Rho – indipendenti questi terminatori, detti anche terminatori intrinseci, sono costituiti da due elementi: una sequenza invertita (palindromica) corta (circa 20 nucleotidi), cui segue un piccolo segmento di circa otto coppie di basi A-T. Questi elementi non hanno effetto sulla polimerasi fino a che non vengono trascritti: in seguito a ciò, l’RNA risultante può formare una struttura a cappio (stem-loop), detta anche forcina, grazie all’appaiamento intramolecolare di basi; la forcina provoca la terminazione attraverso la rottura del complesso di allungamento.La forcina funziona da terminatore in maniera efficiente solo quando è seguita da un segmento di coppie A-U: difatti, in questo contesto, nel momento in cui si forma la forcina, l’RNA è unito al DNA stampo dall’accoppiamento di A-U il cui legame, essendo dovuto a soli 2 legami a idrogeno, è debole e più facilmente separabile.

- Rho – dipendenti questi terminatori hanno elementi di RNA molto meno caratterizzati e perciò hanno bisogno dell’aiuto fornito dal fattore rho: questo è una proteina a forma di anello, costituita da sei subunità identiche, in grado di legarsi all’RNA a doppia elica appena questo esce dalla polimerasi. La proteina ha anche attività ATPasica: una volta legata al trascritto, usa l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per staccare l’RNA dallo stampo e dalla polimerasi.Il legame avviene quando la polimerasi incontra una sequenza che rallenta la sua attività: rho si attacca, indebolendo ulteriormente in complesso; i siti ottimali di legame (rut) consistono in una serie di 40 nucleotidi, che non formano una struttura secondaria e contengono un buon numero di residui di C.

NEGLI EUCARIOTI

Negli eucarioti la trascrizione è quantitativamente più imponente: essa viene svolta sempre dalla RNA polimerasi, simile a quella dei procarioti; tuttavia qui ve ne sono tre differente, ognuna con una sua funzione:

- Pol I è localizzata esclusivamente nel nucleolo; catalizza la sintesi di tre RNA ribosomiali, il 28S, il 18S ed il 5,8S.

- Pol II sintetizza gli mRNA ed alcuni piccoli snRNA, alcuni dei quali coinvolti nel processo di maturazione dell’RNA messaggero.

- Pol III localizzata anch’essa soltanto nel nucleolo, sintetizza i tRNA che portano gli amminoacidi ai ribosomi, l’rRNA 5S e gli snRNA non sintetizzati dalla polimerasi II.

1° esperimento: permette di evidenziare la presenza di 3 RNA polimerasi.METODO

1) Si eluisce l’estratto proteico di cellule eucariote su una colonna di resina a scambio ionico (DEAE sephadex), carica negativamente; tutto ciò carico positivamente rimane intrappolato all’interno.

2) Tutte le proteine intrappolate vengono staccate secondo gradiente crescente di forza ionica, utilizzando solfato d’ammonio.

3) Il gradiente di forza ionica viene frazionato in varie provette: si può così saggiare l’attività della RNA polimerasi nelle varie frazioni: si ottengono 3 picchi di attività:a) 1° picco Pol Ib) 2° picco (più alto rispetto al prima) Pol II (più attiva)c) 3° picco (il più basso) Pol III (meno attiva)

4) Tramite una purificazione spinta delle tre frazioni, si può osservare che sono tutte costituite da più di una subunità.

2° esperimento: permette di determinare cosa trascrive ogni singola RNA polimerasi.METODO

1) Si aggiunga in tutte le frazioni ottenute precedentemente, che presentano anche la minima attività polimerasica, una dose di amanitina (nell’ordine di picogrammi):a) Concentrazione 1 (minima) scompare il secondo picco, e quindi l’attività della Pol

II;b) Concentrazione 2 (media) scompare anche il primo picco e quindi l’attività della

Pol I;c) Concentrazione 3 (massima) scompare anche il terzo picco e quindi l’attività della

Pol III.2) Aggiungere le concentrazioni 1,2,3 ad alcune cellule.3) Estrarre l’RNA e svolgere elettroforesi su gel di agarosio:

a) Concentrazione 1: scompare lo smear la Pol II trascrive mRNA;b) Concentrazione 2: scompaiono anche le due bande più pesanti la Pol I trascrive gli

RNA ribosomiali 18S e 28S;c) Concentrazione 3: scompare anche la banda 5S la Pol III trascrive i tRNA e gli

snRNA.

TRASCRIZIONE DI CLASSE I

La RNA polimerasi I trascrive gli rRNA 28S, 18S e 5,8S; queste molecole entrano tutte a far parte della struttura del ribosoma, infatti si può notare che:- La subunità minore del ribosoma è costituita da 33 polipeptidi e un solo rRNA che è il

18S.- La subunità maggiore invece è formata da 45 polipeptidi e da 3 rRNA, ossia il 28S, il 5,8S

e il 5S che però viene sintetizzato grazie all’azione della RNA polimerasi III.Gli RNA ribosomiali vengono trascritti in un’unica unità di trascrizione, producendo anche in questo caso una molecola di RNA precursore; la maggior parte degli eucarioti, inoltre, ha le unità trascrizionali ripetute in serie, una di seguito all’altra (ripetizione in tandem), separate da una sequenza spaziatrice che non viene trascritta (definita NTS). Il promotore per l’unità trascrizionale è localizzato all’interno dell’NTS ed è a questo livello che si legano tutti i fattori proteici specifici che facilitano l’inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi I. Lo schema del gene che viene trascritto per dare origine a queste 3 molecole viene studiato effettuando degli esperimenti di ibridazione tra DNA e i 3 rRNA e andando poi ad individuare quali regione vengono ibridate e quali no:

dove per SS si intendo i tratti a singolo filamento che non sono stati ibridati dai 3 rRNA. All’interno della sequenza dell’RNA 28S esiste inoltre una zona che rimane a singolo filamento, che prende il nome di introne e che tramite fenomeni di splicing dovrà essere eliminata durante il processo di maturazione di questo RNA. Esistono due tipi di splicing che possono essere usati in questo caso:- Autocatalitico in cui è la stessa molecola di RNA che diventa enzima e taglia l’introne;

l’RNA, in questo caso, sfrutta l’energia liberata dalla rottura del legame fosfodiesterico tra il

3’ dell’esone e il 5’ dell’introne per formare un altro legame tra il 3’OH del GTP e il 5’ dell’introne; l’introne stesso, poi, idrolizza il legame fosfodiesterico tra il suo terminale 3’ e il 5’ del secondo esone, che viene saldato al 3’OH dell’altro esone. Tutta la reazione deve avvenire in tempi molto brevi perché l’introne non deve perdere il 3’OH di un esone prima di averlo legato al 5’ dell’altro esone.

- Enzimatico in questo caso intervengono delle proteine specifiche che effettuano il processo (questo meccanismo però è tipico degli mRNA che hanno molti introni).

LA TRASCRIZIONE DI CLASSE II

Mentre i batteri hanno bisogno di un solo fattore addizionale d’inizio, ovvero σ, negli eucarioti, per avere un inizio di trascrizione di classe II efficiente sono richiesti numerosi fattori d’inizio addizionali: questi sono chiamati fattori generali di trascrizione (GTF).In vitro, questi fattori insieme alla Pol II rappresentano tutto ciò che serve per iniziare la trascrizione su uno stampo di DNA; in vivo, invece, il DNA è incorporato nei nucleosomi: in queste condizioni, i fattori generali di trascrizione non sono sufficienti per produrre un’espressione significativa. Per cui sono richiesti altri fattori.All’inizio della trascrizione, la RNA polimerasi si lega in un punto a caso del DNA e scorre su di esso, fino a trovare la sequenza specifica di inizio della trascrizione; in questa fase fondamentale è il promotore base, ovvero il gruppo minimo di sequenze necessarie per un inizio accurato e preciso del macchinario proteico.Un promotore si divide in due porzioni, il nucleo del promotore e gli elementi prossimali del promotore:

- nucleo è costituito da una serie di sequenze che agiscono in cis e sono elementi fondamentali per fare iniziare la trascrizione nel punto corretto; questi elementi tipicamente constano di una cinquantina di bp a monte del sito di inizio. Il nucleo meglio caratterizzato è costituito da:1) Inr è un breve sequenza che copre il sito di inizio della trascrizione.2) TATA box è una sequenza consenso, contenuta nel 30-40% dei promotori; si

trova a -30 bp rispetto al punto di inizio della trascrizione. È il primo punto di aggancio del complesso trascrizionale; la presenza della TATA box in vitro è sufficiente per avere un corretta trascrizione. Togliendola, la trascrizione invece non avviene in quanto i fattori trascrizionali da soli non bastano.

Non è detto che tutti i promotori abbiano sia la TATA box che Inr; quando però accade, la trascrizione è decisamente migliore.

- Elementi prossimali sono localizzati più a monte della TATA box, a circa 50-200 bp dal punto di inizio della trascrizione; esempi di questi elementi sono:1) CAAT box è una sequenza consenso localizzata a -75 bp rispetto al punto di

inizio.2) GC box situata a -90 bp, viene definita così in quanto ricca di guanine e citosine.

A valle rispetto ad Inr si trova l’elemento promotore DPE (downstream promoter element): combinandosi con Inr stesso, esso da una trascrizione migliore.

Come detto, molti promotori presentano la TATA box: è da qui che ha inizio la formazione del complesso di pre-inizio, ovvero tutto il gruppo completo dei fattori generali di trascrizione e della DNA polimerasi.La TATA box viene riconosciuta dal fattore generale di trascrizione chiamato TFIID: questo è un complesso di molte subunità; la subunità che lega la TATA box è TBP (TATA binding protein) mentre le altre subunità sono dette TAF (TBP associated factors).In seguito al legame con il DNA, TBP distorce la sequenza TATA in maniera molto marcata: il complesso risultante fornisce una piattaforma per il reclutamento di altri fattori di trascrizione e della polimerasi stessa sul promotore; in vitro si associano, in ordine, TFIIA, TFIIB e TFIIF insieme alla polimerasi ed in seguito TFIIE e TFIIH, che si legano a monte della polimerasi.

La formazione del complesso di pre-inizio è seguita dalla dissociazione dei due filamenti del promotore: contrariamente a ciò che accade nei batteri, ciò richiede l’idrolisi dell’ATP ed è mediata da TFIIH; è infatti l’attività elicasica di questo fattore che stimola l’apertura del DNA del promotore.In seguito, proprio come accade nei batteri, segue un periodo di inizio abortivo, prima che la polimerasi lasci il promotore ed entri in fase di allungamento; negli eucarioti, l’evasione del promotore, prevede la fosforilazione della polimerasi: l’RNA polimerasi presenta una coda formata dall’estremità terminale (CTD) ricca di amminoacidi basici. Grazie alla subunità TFIIH, che ha anche attività chinasica; l’aggiunta dei vari fosfati aiuta la polimerasi a liberarsi dai fattori generali di trascrizione utilizzati per l’inizio e che l’enzima lascia indietro appena evade dal promotore.A questo punto inizia la fase di allungamento: una volta che la RNA polimerasi si libera di gran parte di fattori di inizio, viene reclutato un altro gruppo di fattori, i fattori di allungamento (come TFIIS); alcuni di essi stimolano l’allungamento dell’RNA, altri la sua maturazione.Infine, come per i procarioti, la terminazione può dipendere o meno dalla proteina rho.Alla fine di tutti questi eventi si ottiene il pre-mRNA: prima di poter essere tradotto, esso deve andare incontro a un processo di maturazione che lo trasformerà nell’RNA messaggero maturo; gli eventi di maturazione sono tre: rivestimento (capping) dell’estremità 5’, splicing degli esoni e poliadenilazione dell’estremità 3’.

Regolazione

La regolazione della trascrizione può avvenire attraverso diversi meccanismi:- Un primo meccanismo è rappresentato dalla eterocromatina, che come abbiamo detto è un

potente regolatore dell’espressione genica, in quanto normalmente contiene dei geni che non possono essere trascritti in quanto queste zone non sono accessibili da parte dei fattori trascrizionali

- Un altro sistema è rappresentato dalla conformazione generale del cromosoma interfasico, che può essere trascritto oppure no a seconda dei casi

- Un ultimo meccanismo è rappresentato dagli enhancer e dai silencer, ossia delle sequenze di DNA che possono localizzarsi sia a monte che a valle del gene: queste sequenze sono affini a dei fattori proteici, che a loro volta interagiscono con altri fattori proteici capaci di legarsi al complesso trascrizionale; in questo modo si può andare a migliorare il processo di trascrizione (nel caso degli enhancer) oppure a inibirlo (nel caso dei silencer)

Maturazione

Se analizziamo la struttura del trascritto, ottenuto al termine del processo di trascrizione, noteremo che è costituito da diverse parti:- Un codone AUG che rappresenta il punto di inizio della traduzione e che presenta al suo 5’

un tratto di DNA che è stato trascritto, ma che non verrà tradotto (5’ UTR)- Una sequenza che codifica per la proteina e contiene al suo interno sia esoni che introni- Un codone di terminazione della traduzione- Una sequenza AAUAAA, che rappresenta il punto in cui la RNAasi deve tagliare l’RNA

durante la maturazione e dove verrà aggiunta la coda di poli(A)Negli eucarioti il trascritto ottenuto, però, non entra subito in contatto con i ribosomi, ma deve prima fuoriuscire dal nucleo e subire alcune modifiche, che rappresentato il processo di maturazione del trascritto primario il processo consta di 3 eventi:- Capping: consiste nell’aggiunta di una 7-metilguanosina all’estremità 5’ del trascritto

tramite un insolito legame 5’-5’:la funzione di questo cap, che rimane all’interno dell’RNA maturo, è quella di proteggere l’mRNA dalla degradazione da parte delle esonucleasi e fungere da punto di attacco per la subunità minore del ribosoma

- Poliadenilazione: consiste nell’aggiunta all’estremità 3’ di una sequenza di 50-250 adenine, detta coda di poli(A), che viene effettuata da parte di un enzima, ossia la poli(A) polimerasi; la coda aggiunta serve per favorire il trasferimento del trascritto dal nucleo al citoplasma e per proteggere l’mRNA maturo dalla degradazione da parte delle esonucleasi