Bioķīmija I

Kas ir bioķīmija?

• Bioķīmija ir zinātne par molekulām un ķīmiskajiem procesiem dzīvos organismos

• Molekulārā bioloģija pēta procesus, kuri gēnos iekodēto informāciju izmanto organisma funkciju nodrošināšanai – replikāciju, transkripciju un translāciju

• Robeža starp bioķīmiju un molekulāro bioloģiju nav stingri definēta

Bioķīmijas, ģenētikas un molekulārās bioloģijas radniecība

Funkcija

GēniProteīni

Bioķ

īmija

Ģenētika

Molekulārā bioloģija

Kursa saturs

• 20 lekcijas (beigsies 6. novembrī) • Aptuveni 15 pārbaudes darbiņi (15 min lekciju

sākumā par iepriekšējās lekcijas saturu)• 4 laboratorijas darbi (sāksies 1. oktobrī)• Eksāmens

Kursa vadītājs K. Tārs, kaspars@biomed.lu.lv, tel. 27076237

Laboratorijas darbi

• Vadītājs – doc. N. Līcis (licis@biomed.lu.lv)• 1. Laktātdehidrogenāzes reakcijas kinētika.• Enzimātisko reakciju kinētikas parametru un inhibitora

ietekmes noteikšana.• 2. Asins seruma proteīnu sadalīšana ar elektroforēzi.• Asins seruma proteīnu sastāva analīze.• 3. Aminoskābju titrēšana.• Aminoskābju skābju-bāžu īpašības.• 4. Seminārs – laboratorijas darbu protokolu ieskaite.

Lekciju saturs• 1. daļa – Strukturālā bioķīmija (K. Tārs):– ievads, aminoskābes, proteīnu struktūra un funkcija,

enzīmi, nukleīnskābes, ogļhidrāti, lipīdi, membrānas

• 2. daļa – Bioenerģētika un metabolisms– ievads, glikolīze, glikoneoģenēze, Krebsa cikls,

taukskābju katabolisms, aminoskābju oksidēšana, oksidatīvā fosforilēšana, lipīdu biosintēze, aminoskābju biosintēze, nukleotīdu biosintēze, hormoni, DNS, RNS un proteīnu biosintēze (U. Kalnenieks, K. Tārs)

Mācību grāmata

• Lehninger Principles of Biochemistry 6th edition. David L. Nelson, Michael M. Cox. W.H. Freeman and company, New York

• Aptuveni tas pats saturs ir arī iepriekšējos (4. un 5.) izdevumos

6. izdevums 4. izdevums5. izdevums

Studiju materiāli

• Atrodami «Grozā», molekularās bioloģijas katedras sadaļā

• Turpat būs pieejami arī vērtējumi

Prasības• Sekmīgi nokārtoti visi pārbaudes darbiņi• Apmeklēti visi laboratorijas darbi, par kuriem

vēlāk iesniegti protokoli• Sekmīgi nokārtots eksāmens• Kavētos pārbaudes darbiņus var uzrakstīt pēc

lekcijas 331. telpā• Galīgajā atzīmē 50% sastāda pārbaudes darbiņu

vidējā atzīme un 50% eksāmena atzīme• Sekmīgi nokārtoto pārbaudes darbiņu pārlikšana

nolūkā iegūt augstāku atzīmi netiks atbalstīta

Instrumentālās metodes

• Kurss sāksies 5. septembrī• Kura mērķis - iepazīstināt studentus ar

dažādām instrumentālām metodēm ar pielietojumu molekulārajā un šūnu bioloģijā, bioķīmijā un citās radniecīgās nozarēs

• Kurss notiks LU BF un Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā (BMC)

Instrumentālo metožu kursa saturs• Proteīnu ekspresija, attīrīšana un elektroforēze (BF, 2xlekc., lab.

d.)• Mikroskopija - optiskā (BF), konfokālā (BF), elektronu (BMC),

lekc., lab.d., demonstr.• Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā (BF, lekc.+lab.d)• DNS sekvenēšana (BMC, lekc. +demonstr.)• Masspektrometrija (BMC, lekc. + mini-lab.d.)• Reālā laika PCR (BMC, lekc. + demonstr.)• Plūsmas citometrija (BMC, lekc. + mini-lab.d.)• Radioaktivitātes pielietojums bioloģijā (BMC, lekc. + mini lab.d)• Proteīnu struktūru noteikšanas metodes –

rentgenstruktūranalīze un KMR (BMC, BF 2xlekc., 1xmini lab.d.)

Aminoskābes, peptīdi, proteīnu struktūra

1. lekcija

Aminoskābes• Organiski savienojumi ar amino- un karboksil- grupām• Proteīni sastāv no 20 dažādām aminoskābēm ar vienādu skeletu

(“backbone”), bet atšķirīgām sānu ķēdēm (“R”)• Visas proteīnus veidojošās aminoskābes ir -aminoskābes • T.i. karboksil- un amino- grupas ir pievienotas pie viena un tā

paša oglekļa atoma, saukta par C

H3+N―C―C―H

COO-

|

|R

H3+N―C―H

COO-

|

|R

| R’

H3+N―C―C―C―H

COO-

|

| R

| | R’ R’’

-aminoskābe - un - aminoskābes (proteīnus neveido)

Aminoskābju optiskie izomēri• Visu aminoskābju (izņemot

glicīnu) -ogleklim ir 4 dažādi aizvietotāji, tāpēc ir iespējami 2 optiskie izomēri – D un L.

• Proteīnos sastopamās aminoskābes ir L- aminoskābes

• DL nomenklatūra ir aizgūta no gliceraldehīda

Aminoskābes ar diviem optiskajiem centriem

• Treonīnam un izoleicīnam ir divi optiskie centri• Proteīnos vienmēr ir sastopams tikai viens no

2 vai 4 iespējamajiem optiskajiem izomēriem

L-treonīns (sastopams

dabā)

D-treonīns

L-allo-treonīns

D-allo-treonīns

Aminoskābju klasifikācija

• Parasti aminoskābes klasificē pēc to sānu ķēžu polaritātes

• Izdala nepolārās (hidrofobās), polārās un lādētās aminoskābes

Nepolārās (hidrofobās) aminoskābes-Sānu ķēde satur nepolāras, hidrofobas oglekļa virknes. Nepolārās aminoskābes (izņemot glicīnu) slikti šķīst ūdenī.

Leicīns un izoleicīns ir strukturālie izomēri

Glicīns Alanīns Valīns Leicīns Izoleicīns (G, gly) (A, ala) (V, val) (L, leu) (I, ile)

Glicīnam nav sānu ķēdes un to bieži klasificē atsevišķi. Vienīgā aminoskābe, kurai nav optisko izomēru

Fenilalanīns un triptofāns satur plakanus aromātiskos

gredzenusTriptofānu, tā NH grupas dēļ dažreiz klasificē kā

polāru, bet praksē tam ir izteiktākas nepolārās

īpašības

Metionīns satur sēra atomu

Prolīna sānu ķēde ir piesaistīta aminogrupai, veidojot ciklu

Nepolārās (hidrofobās) aminoskābes

Metionīns Fenilalanīns Triptofāns Prolīns (M, met) (F, phe) (W, trp) (P, pro)

- Sānu ķēde sastāv no oglekļa, skābekļa, un slāpekļa atomiem- O un N atomi sānu ķēdi padara polārāku un tādejādi hidrofilāku- Polārās aminoskābes labi šķīst ūdenī.

Polārās aminoskābes

Serīns Treonīns Cisteīns Tirozīns Aspargīns Glutamīns (S, ser) (T, thr) (C, cys) (Y, tyr) (N, asn) (Q, gln)

Cisteīnam ir gan polāras, gan hidrofobas īpašības. Divi cisteīni var savienoties ar SH grupām

- Sānu ķēdei ir lādiņš pie fizioloģiska pH

Lādētās aminoskābes

Aspargīnskābe Glutamīnskābe Lizīns Arginīns Histidīns (D, asp) (E, glu) (K, lys) (R, arg) (H, his)

Pie fizioloģiski relevantām pH vērtībām histidīns var būt gan lādēts (pH<6), gan polārs (pH>6) . Bieži klasificē kā polāru aminoskābi

Aminoskābju burtu kodi

• Aminoskābju un to secības pierakstam lieto saīsinātus apzīmējumus

• Izplatīti ir gan trīsburtu, gan vienburta kodi• Peptīda pieraksta piemērs:– Alanīns-glicīns-leicīns-triptofāns-metionīns– Ala-Gly-Leu-Trp-Met– AGLWM

Latviski Angliski 3-burtu Kā atcerēties 3-burtu?

1-burta

Kā atcerēties 1-burta?

10 vieglās, viss ir kā rakstītsAlanīns Alanine Ala Alanine A AlanineGlicīns Glycine Gly Glycine G GlycineValīns Valine Val Valine V ValineLeicīns Leucine Leu Leucine L LeucineMetionīns Methionine Met Methionine M MethionineCisteīns Cysteine Cys Cysteine C CysteineSerīns Serine Ser Serine S SerineTreonīns Threonine Thr Threonine T ThreonineProlīns Proline Pro Proline P ProlineHistidīns Histidine His Histidine H Histidine

Kā atcerēties aminoskābju kodus?

4 vidēji grūtāsIzoleicīns Isoleucine Ile Isoleucine I IsoleucineFenilalanīns Phenylalanine Phe Phenylalanine F FenilalanīnsArginīns Arginine Arg Arginine R A jau ir aizņemts

(alanīns), aRginineTirozīns Tyrosine Tyr Tyrosine Y T jau ir aizņemts

(treonīns), tYrosine

Kā atcerēties aminoskābju kodus?

6 grūtāsLizīns Lysine Lys Lysine K L jau ir aizņemts (leicīns),

alfabētā K ir pirms LAspargīn-skābe

Aspartic acid

Asp Aspartic acid D Gan A, gan G jau ir aizņemti. Abas skābes atzīmē ar D un E; E ir lielāka sānu ķēde, tāpēc alfabētiski nāk pēc D

Glutamīn-skābe

Glutamic acid

Glu Glutamic acid E

Aspargīns Aspargine Asn Atbilstošo skābju pirmajiem 2 burtiem pievienots "N" - jo tie ir skābju amīdi

N -Nav ideju Glutamīns Glutamine Gln Q "Qlutamine"

Triptofāns Tryptophane Trp Tryptophane W Vislielākā sānu ķēde - vislielākais alfabēta burts ir W

Kā atcerēties aminoskābju kodus?

Cisteīns un disulfīdi

• Vienīgais universālais veids, kā kovalenti savienot divas aminoskābes, kuras sekvencē nav blakus viena otrai, ir ar disulfīdu tiltiņu palīdzību

• Disulfīdu veidošanai ir nepieciešama oksidējoša vide. Tā kā šūnas iekšienē vide ir reducējoša, disulfīdi ir reti sastopami iekššūnas proteīnos, bet bieži sastopami šūnas virsmas un sekretējamos proteīnos

oksidēšanās

reducēšanās

Cisteīns Cistīns

Neparastās aminoskābes

Ornitīns Citrullīns

• Dzīvajos organismos ir konstatētas aptuveni 300 dažādas aminoskābes, bet lielākā daļa no tām nav proteīnu sastāvā

• Ornitīns un citrullīns ir nozīmīgi starpprodukti aminoskābju metabolismā

• Proteīnu sastāvā esošās aminoskābes var tikt modificētas – piem. hidroksilprolīns (Hyp) un hidroksillizīns (Hyl) kollagēnā

Selenocisteīns (U, Sec)

• Līdzīgs cisteīnam, bet ar selēnu sēra vietā• Atrodams t.s. selenoproteīnu sastāvā – parasti enzīmu aktīvajā

centrā• Cilvēkiem konstatēts 25 proteīnos• Atšķirībā no modificētajām aminoskābēm, Sec tiek inkorporēts

proteīnu sastāvā translācijas laikā ar īpaša ģenētiskā koda palīdzību, tādēļ Sec klasificē kā proteinogēno aminoskābi

• Tādejādi, eikariotiem ir 21 proteinogēnās aminoskābes – 20 standarta plus Sec

Aminoskābes kā cviterjoni

• Pie fizioloģiska pH aminoskābes pastāv galvenokārt bipolāru jonu – cviterjonu veidā

Nejonizētā forma Cviterjona forma

Aminoskābes kā skābes un bāzes• Aminoskābju sastāvā ir skāba karboksilgrupa un bāziska

aminogrupa• Aminoskābes var protonu gan donēt, gan akceptēt

Cviterjons kā skābe

Cviterjons kā bāze

Peptīds• Peptīds ir kovalenti saistītu aminoskābju kopums• Peptīda saite veidojas, vienas aminoskābes aminogrupai

reaģējot ar otras aminoskābes karboksilgrupu• Aminoskābes peptīda sastāvā mēdz saukt par atlikumiem• Izveidotā peptīda saite ir daļēji dubulta

Peptīdiem ir N-gals un C-gals

Peptīda saite

N-gals C-gals

Galvenā ķēde un sānu ķēdesKatram polipeptīdam ir viena galvenā ķēde un tik sānu ķēdes, no cik aminoskābēm peptīds sastāv

Atomu nomenklatūra aminoskābes atlikumā

• Galvenās ķēdes atomi ir N, C, C un O

• Sānu ķēdes atomi tiek saukti pēc grieķu alfabēta, sākot no C

• Sānu ķēdes sazarošanās gadījumā ir papildus indeksi “1” un “2”

“N” “C”

“C”

“O”

“C”

“C”“C”

“N” “N”

“N”

“C”

– phi () leņķis N-C– psi () leņķis C-CO– omega () leņkis C-N

Peptīdu torsijas leņķi

N

leņkis, cis- un trans- peptīdi• Tā kā peptīda saite ir daļēji dubulta, leņķis ir tuvu 180o

trans- peptīdiem vai 0o cis- peptīdiem (±30o ekstremālos gadījumos)

• Cis- peptīdi ir enerģētiski ļoti neizdevīgi (~1000 reizes salīdzinot ar trans-), jo blakus esošie C atomi ir pārāk tuvu viens otram

CC C C

• Cis- peptīda saite pirms prolīna ir tikai 4x neizdevīgāka par trans- saiti, jo tuvu blakus sanāk vai nu abi C atomi vai C un C atomi

• Prolīna cis-trans izomerizācija ir svarīgs faktors proteīnu foldingā un reakciju katalizē īpaši enzīmi – prolilpeptidil izomerāzes (Ppāzes).

• Aptuveni 0.03% no ne-prolīna un 5.2% no x-Pro peptīdiem proteīnos ir cis- konformācijā

• Cis- peptīdiem proteīnos bieži ir nozīmīga funkcijaC

C

C C

C

C

C CC

C

x-x

x-pro

Trans- Cis-

Prolīnu cis-trans izomerizācija

Galvenās ķēdes konformācijas• Tikai noteiktas un leņķu kombinācijas

ir enerģētiski izdevīgas, jo citādi sānu ķēdes pirmais atoms (C) novietojas pārāk tuvu galvenās ķēdes atomiem vai arī pārāk tuvu novietojas blakus esošo aminoskābju skābekļa atomi

• Tā kā glicīnam nav sānu ķēdes, tam ir atļautas daudz vairākas un leņķu kombinācijas. Tādejādi, glicīns ir īpaša un strukturāli nozīmīga aminoskābe, pārsvarā sastopams fleksiblos proteīnu rajonos

Neatļautās konformācijas nav fiziski neiespējamas, bet enerģētiski neizdevīgas

un leņķu kombinācijas var attēlot Ramačandrāna plotā

Visizdevīgākās konformācijas (90% aminoskābju)

Atļautās konformācijas (8%)

Neatļautās konformācijas (<2%)

Neatļauto konformāciju aminoskābēm bieži ir liela nozīme proteīnu funkcinalitātē

Aminoskābju statistiskais sadalījums zināmās struktūrās

Gly ProNon-Gly, non-Pro

Sānu ķēžu konformācijas

Ne-zigzagveida zigzagveida

Trīs iespējamie valīna rotamēri

• Sānu ķēdēm (izņemot alanīnu un glicīnu) var būt dažādas konformācijas

• Dažām konformācijām ir zemāka enerģija – tos sauc par rotamēriem

• Zemāka enerģija ir t.s. zigzagveida izvietojumā – kad visi atomi ir maksimāli tālu viens no otra

Nosauciet trīs aminoskābes, kuras ir ļoti atšķirīgas no citām!

Prolīns • Nav brīvas aminogrupas• Ļoti stingrs• Ievieš pārrāvumus vai izliekumus spirālēs un virknēsGlicīns• Nav sānu ķēdes• Var atrasties daudzās vietās Ramačandrāna plotā• Proteīnos bieži sastopams fleksiblos reģionosCisteīns• Disulfīdi

Pirmējā (primārā), otrējā (sekundārā), trešējā (terciārā) un ceturtējā

(kvartārā) struktūra

Otrējā struktūra• Izšķir divus galvenos otrējo struktūru veidus – alfa

spirāles un beta virknes• Alfa spirāles var pastāvēt atsevišķi, bet beta virknes

grupējas kopā vismaz pa divām vai vairākām, veidojot beta plāksnes

• Alfa spirāles shematiski attēlo kā spirāles vai cilindrus• Beta virknes shematiski attēlo kā bultas virzienā no N

uz C galu• Otrējā struktūrā aminoskābju galvenās ķēdes skābekļa

un slāpekļa atomi viens ar otru mijiedarbojas ar ūdeņraža saišu palīdzību

Alfa spirāle• Labās vītnes spirāle• 3.6 atlikumi vienā

pagriezienā• Ūdeņraža saites ir starp

atlikuma n N atomu un atlikuma n+4 O atomu

n

n+4

n

n+4

3.6 aminoskābes

Parādītas tikai saites starp atomiem

Parādītas arī H saites starp n un n+4 atlikumiem

Shematisks reālas-spirāles attēlojums

Pievienota shematiska spirāle. Var redzēt, ka sānu ķēdes virzās slīpi uz leju kā egles zari

C-galsCCC

N -gals N NN

Alfa spirāles galvenās ķēdes ģeometrija

• Ģeometriski ideālai α spirālei phi/psi leņķu kombinācija ir -57.8, -47.0• Realitātē vidējās vērtības ir -64 +/- 7, -41 +/- 7

Borēlijas virsmas proteīns BBA64 sastāv tikai no α spirālēm un dažām cilpām. Redzams, ka Ramačandrāna plotā lielākā daļa aminoskābju ir t.s. α rajonā.

Beta plāksnes

Plāksne no antiparalēlām -virknēm Plāksne no paralēlām -virknēm

•Sastāv no vismaz 2 -virknēm•Atšķirībā no -spirālēm, H saites ir starp divām dažādām virknēm•-virknēs polipeptīds ir izstieptā konformācijā

Jauktās plāksnes

Jauktās plāksnes ir daudz retāk sastopamas kā antiparalēlās vai paralēlās

Beta virknes galvenās ķēdes ģeometrija

• Ģeometriski ideālai β virknei phi/psi leņķu kombinācija ir -120, 120

Antivielu Fab fragments sastāv pārsvarā no β virknēm. Redzams, ka Ramačandrāna plotā lielākā daļa aminoskābju ir t.s. β rajonā.

Reversie pagriezieni• 2-6 aminoskābju gari fragmenti, kas kalpo, lai pagrieztu polipeptīdu ķēdi pretējā virzienā• Eksistē daudzi pagriezienu tipi un apakštipi• Veidojas 1 H-saite, starp atlikumiem i un i+n, n=1...5• Tipiskākie ir β-pagriezieni, H saite starp i un i+3. Eksistē 9 β-pagriezienu apakštipi, kuri atšķiras ar aminoskābju phi/psi leņkiem• Citi tipi: α: i→i+4, γ: i→i+2, δ: i→i+1, π: i→i+5• Dažu apakštipu pagriezieniem ir tādas phi/psi kombinācijas, ka nepieciešams viens vai divi glicīni

I, I’, II un II’ tipu beta pagriezieni

Jābūt glicīnam

Cilpas

• Cilpas savieno otrējās struktūras elementus• Cilpas atrodas uz proteīna virsmas • Atšķirībā no reversajiem pagriezieniem, galvenās ķēdes slāpekļa un

skābekļa atomi parasti cilpās neveido H-saites viens ar otru• Cilpās ir daudz polāro un lādēto aminoskābju, arī glicīnu• Cilpu garums var būt no 2 līdz 20 atlikumiem• Cilpas ir fleksiblas • Cilpas bieži veido ligandu piesaistes vietas un enzīmu aktīvos centrus• Homologos proteīnos cilpu rajoni ir daudz variablāki nekā sekundāro

struktūru rajoni

Motīvi

• Vienkāršas otrējo struktūru elementu kombinācijas• Motīvus mēdz saukt arī par superotrējo struktūru• Dažiem motīviem piemīt specifiska bioloģiska

funkcija (piem. DNS piesaistīšanās)• Citiem motīviem nav specifiskas bioloģiskās funkcijas

un tie ir lielāku agregātu sastāvdaļas

Spirāles-cilpas-spirāles motīvs

Kalcija piesaistīšanās motīvs

DNS piesaistīšanās motīvs

Grieķu atslēgas motīvs

• Visizplatītākais veids, kā savienot 4 virknes

Grieķu atslēgas motīvs Staphilococcus nukleāzē

motīvs

• Ērts veids, kā savienot 2 paralēlas virknes• motīvs ir gandrīz visu paralēlo beta

plākšņu proteīnu sastāvā

Trešējā (terciārā) struktūra un domēni

• Proteīnu trešējā struktūra veidojas no motīviem un papildus sekundārās struktūras elementiem

• Domēns ir proteīna daļa, kura spēj patstāvīgi safoldēties un izveidot stabilu trešējo struktūru

• Proteīniem var būt no viena līdz pat vairākiem desmitiem domēnu

• Daudzdomēnu proteīnos parasti katram domēnam ir sava bioloģiskā funkcija

2x matadata + virkne

16x

2x Grieķu atslēga

• Domēni parasti (bet ne vienmēr) ir nepārtraukti sekvences gabali

• Dažkārt viens domēns var ievietoties otra domēna cilpā

N C

N C

Daudzdomēnu proteīna piemērs – lac represors

C-terminālā spirāle (tetramerizācijai)

Spirāles-pagrieziena-spirāles domēns (piesaistas pie DNS)

Kodola domēns, satur 2 subdomēnus, kuri sastāv no motīviem (piesaista ligandu - laktozi)

Ceturtējā (kvartārā) struktūra • Daudzi proteīni ir bioloģiski aktīvi kā monomēri un tiem

ceturtējā struktūra neeksistē• Daudzi citi proteīni ir aktīvi kā homo- vai hetero- polimēri• Vienkāršākais un izplatītākais ceturtējās struktūras

paveids ir homodimērs• Monomēri homopolimēros gandrīz vienmēr ir novietoti

simetriski ar vienu vai vairākām simetrijas asīm vai spirālveida novietojumu

• Dažām bioloģiskajām vienībām, piemēram, vīrusu apvalkiem un ribosomām, ir ļoti sarežģīta ceturtējā struktūra un monomēru skaits var sasniegt vairākus simtus vai pat tūkstošus

Otrās kārtas simetrija glutationa transferāzes homodimērā

9-kārtas simetrija gaismas savākšanas kompleksā II no Rhodopseudomonas acidophila.

222 simetrija prealbumīnā

72 simetrija bakteriālajā GroElSkats no augšas Skats no sāniem

14 monomēri veido 2 gredzenus, 7 monomērus katrā gredzenā

Hepatīta B vīrusa nukleokapsīda – 240 ķīmiski identiskas subvienības 532 simetrijā

Spirālveida simetrija• Sastopama pavedienveida (spirālveida) vīrusos, bakeriālajos pili,

mikrotrubiņās, u.c.• Atšķirībā no iepriekš minētajām strutūrām, nav stingri noteikta

monomēru skaita• Spirāles gali mēdz būt nestabili

Tabakas mozaīkas vīruss

Mikrotrubiņu struktūra

Ribosomas mazā subvienība – heteropolimēra piemērs, daudz

monomēru, nav simetrijas