biokonversi asam lemak bebas terhidrolisis dari …
TRANSCRIPT
BIOKONVERSI ASAM LEMAK BEBAS TERHIDROLISIS
DARI MINYAK KEDELAI MENJADI BIODIESEL
MENGGUNAKAN Lactobacillus plantarum DAN Acetobacter
aceti
SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat
mencapai gelar Sarjana Sains S.Si., Program Studi Kimia pada
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Islam Indonesia
Yogyakarta
Diajukan oleh:
ADWI HANTONI
No. Mahasiswa: 16612138
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA
2021
ii
BIOKONVERSI ASAM LEMAK BEBAS TERHIDROLISIS
DARI MINYAK KEDELAI MENJADI BIODIESEL
MENGGUNAKAN Lactobacillus plantarum DAN Acetobacter
aceti
SKRIPSI
yang diajukan oleh :
ADWI HANTONI
No. Mahasiswa: 16612138
Telah dipertahankan dihadapan Panitia Pengujian Skripsi Prodi Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Islam Indonesia
Yogyakarta, 12 Maret 2021
Dewan Penguji Tanda Tangan
Dr. Tatang Shabur Julianto, M.Si. ………………
Dr. Habibi Hidayat, S.Pd., M.Si. ………………
Ika Yanti, S.Si., M.Sc. ………………
Mengetahui,
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Islam Indonesia
Prof. Riyanto, S. Pd., M.Si., Ph.D.
iii
PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN
Yang bertanda tangan dibawah ini :
Nama : Adwi Hantoni
NIM : 16612138
Program Studi : Kimia
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahua Alam
Dengan ini menyatakan bahwa skripsi Saya dengan judul Biokonversi Asam
Lemak Terhidrolisis Dari Minyak Kedelai Menjadi Biodiesel Menggunakan
Lactobacillus plantarum Dan Acetobakter aceti bersifat asli dan tidak berisi
material yang telah diterbitkan sebelumnya kecuali referensi yag disebutkan
didalam skripsi ini. Apabila terjadi kontribusi dari penulis lain, maka penulis
tersebut seara eksplisit telah disebutkan didalam skripsi ini. Apabila di kemudian
hari ditemukan ketidaksesuaian denga pernyataan ini, maka saya bersedia dituntut
dan diproses sesuai dengan ketentuan yang berlaku. Demikian pernyataan ini
dibuat dengan sesungguhnya dan penuh tanggung jawab.
Yogyakarta, 12 Maret 2021
Yang menyatakan,
(Adwi Hantoni)
NIM. 16612138
iv
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum wr.wb.
Alhamdulillah hirobbil’alamin penulis ucapkan kepada Allah SWT yang
telah melimpahkan rahmat, taufik serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan penyusunan Tugas Akhir/Proposal Skripsi yang berjudul
“BIOKONVERSI ASAM LEMAK TERHIDROLISIS DARI MINYAK
KELAPA MENJADI BIODIESEL MENGGUNAKAN Lactobacillus
plantarum DAN Acetobacter aceti”. Shalawat dan salam senantiasa tercurahkan
kepada Akhiirul anbiyaa’ Nabiyallah Muhammad SAW beserta keluarga, sahabat
dan seluruh pengikutnya hingga akhir zaman.
Tugas akhir/ Proposal Skripsi adalah salah satu mata kuliah wajib bagi
mahasiswa semester VII Program Studi S-1 untuk mendapatkan gelar Sarjana
Sains (S.Si). tujuan dari penelitian ini adalah Untuk mengetahui potensi metode
elektrokimia (elektrosintesis/elektroreduksi) untuk mengkonversi komponen
minyak nabati trigliserida menjadi suatu senyawa alkana dan Untuk mengetahui
kondisi reaksi yang sesuai (jenis elektroda, jenis elektrolit, potensial listrik, dan
waktu reaksi) untuk dapat mengkonversi komponen minyak nabati trigliserida
menjadi senyawa alkana secara elektrokimia dengan nilai % konversi dan
kemurnian tinggi.
Dalam penyusunan laporan ini penulis banyak dibimbing dan didukung
oleh berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengungkapkan rasa
terimakasih kepada :
1. Allah SWT yang senantiasa selalu melimpahkan rahmat serta karunia_Nya.
2. Amak dan ayah tercinta yang tiada hentinya memberikan dukungan dan
nasihat serta mengirimkan doa disetiap waktunya.
3. Prof. Fathul Wahid, S.T., M.Sc., Ph.D. Selaku Rektor Universitas Islam
Indonesia.
4. Prof. Riyanto, M.Sc., Ph.D. Selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Islam Indonesia.
v
5. Dr. Dwiarso Rubiyanto, S.Si., M.Si. Selaku Ketua Program Studi Kimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
6. Dr. Tatang Shabur Julianto., M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan bimbingan dan berbagai macam masukan juga telah banyak
meluangkan waktu dan juga masukan dalam melakukan penelitian hingga
skripsi ini.
7. Keluarga besar penulis yang setia untuk menyemangati dan selalu support
penulis.
8. Teman-teman JB fams yang setia menemani belajar dan juga yang sudah
banyak membantu penulis hingga terselesaikan skripsi ini.
9. Teman seperjuangan Helmi, Afrida, yang selalu memberi support, motivasi
dan dukungan yang hebat hingga penulis bisa menyelesaikan skripsi ini.
10. Seluruh teman-teman seangkatan, terutama kelas C angkatan 16 yang selalu
mengisi hari demi hari menjadi sangat menyenangkan.
11. Seluruh Bapak/Ibuk dosen jurusan KIMIA yang telah memberikan
pengetahuan yang sangat bermanfaat selama masa perkuliahan.
12. Seluruh staf dan karyawan Universitas Islam Indonesia yang telah
memberikan bantuan kepada penulis.
13. Semua pihak yang sudah membantu dan memberikan informasi baik secara
langsung maupun secara tidak langsung dalam perbuatan proposal tugas
Akhir ini.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kesalahan yang dilakukan dalam
penyusunan laporan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran yang
bermanfaat untuk perbaikan laporan ini. Semoga laporan kerja praktik lapangan
ini dapat bermanfaat bagi kami semua.
Wassalamu’allaikum wr.wb
vi
DAFTAR ISI
HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... ii
PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN .......................................................iii
KATA PENGANTAR ...................................................................................... iv
DAFTAR ISI ..................................................................................................... vi
DAFTAR TABEL ..........................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ ix
INTISARI .......................................................................................................... x
ABSTRACT ...................................................................................................... xi
BAB I. PENDAHULUAN .................................................................................. 1
1.1 Latar belakang ........................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ..................................................................................... 4
1.3 Tujuan Penelitian ....................................................................................... 4
1.4 Manfaat Penelitian ..................................................................................... 4
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 5
BAB III. DASAR TEORI ................................................................................... 7
3.1 Minyak Kedelai ......................................................................................... 7
3.2 Biokonversi/Biotransformasi ..................................................................... 8
3.3 Hidrolisis ................................................................................................... 8
3.4 Biodiesel Fatty Acid Methyl Ester (FAME) ............................................. 9
3.5 Lactobacillus plantarum ............................................................................ 9
3.6 Acetobacter aceti ..................................................................................... 10
3.7 Gas Chromatography – Mass Spectrometry (GC-MS) ........................... 11
3.8 Spektrofotometer uv-vis .......................................................................... 12
vii
BAB VI. METODOLOGI PENELITIAN ........................................................ 15
4.1.1 Alat ....................................................................................................... 15
4.2 Cara Kerja ................................................................................................ 15
4.2.1 Hidrolisis Minyak Kedelai ................................................................ 15
4.2.2 Penentuan bilangan asam lemak bebas hasil hidrolisis ............... 15
4.2.3 Pembuatan Medium Pertumbuhan dan Proses Inakulasi .................. 16
4.2.4 Perhitungan Mikroba Menggunakan Metode McFarland ........... 16
4.2.5 Proses Fermentasi ....................................................................... 17
4.2.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi ......................................................... 17
BAB V. PEMBAHASAN ................................................................................. 18
5.1 Hidrolisis Minyak Kedelai dan Penentuan Bilangan Asam .................... 18
5.2 Perhitungan Mikroba dengan Metode McFarland ................................... 19
5.3 Proses Fermentasi .................................................................................... 21
5.4 Karakterisasi GC-MS Hasil Fermentasi Pada Variasi Waktu 24 jam ..... 22
5.4 Karakterisasi GC-MS Hasil Fermentasi Pada Variasi Waktu 48 jam ..... 23
5.5 Karakterisasi GC-MS Hasil Fermentasi Pada Variasi Waktu 72 jam ..... 25
5.6 Mekanisme Pembentukan FAME Oleh Mikroba Lactobacillus Plantarum
dan Acetobacter aceti .............................................................................. 26
BAB VI. PENUTUP ......................................................................................... 29
6.1 Kesimpulan .............................................................................................. 29
6.2 Saran ........................................................................................................ 29
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 30
LAMPIRAN 1. Perhitungan ............................................................................. 35
Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian ................................................................ 38
viii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Komposisi minyak kedelai secara umum ................................................ 7
Tabel 2. Standar McFarland CFU (x106/mL), Absorbansi Standar mcFarland dan
Absorbansi Sampel Mikroba (L. plantarum dan A. aceti)..................... 20
Tabel 3. Hasil GC-MS terhadap produk biokonversi asam lemak bebas
terhidrolisis oleh mikroba L. plantarum dan A.aceti dengan variasi
waktu 24 jam ......................................................................................... 22
Tabel 4. Hasil GC-MS terhadap produk biokonversi asam lemak bebas
terhidrolisis oleh mikroba L. plantarum dan A.aceti dengan variasi
waktu 48 jam ......................................................................................... 24
Tabel 5. Hasil GC-MS terhadap produk biokonversi asam lemak bebas
terhidrolisis oleh mikroba L. plantarum dan A.aceti dengan variasi
waktu 72 jam ......................................................................................... 25
ix
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Lactobacillus Plantarum ...................................................................... 10
Gambar 2. Prinsip Instrumen GC-MS ................................................................... 12
Gambar 3. Prinsip Instrumen Spectrofotometer uv-vis ......................................... 13
Gambar 4. Reaksi hidrolisis minyak kedelai menjadi asam lemak........................ 18
Gambar 5. Kurva Kalibrasi Hasil Analisis Spektrofotometer uv-vis Standar
McFarland ........................................................................................... 20
Gambar 6. Kromatogram hasil analisis GC-MS produk fermentasi variasi waktu
24 jam .................................................................................................. 22
Gambar 7. Kromatogram hasil analisis GC-MS produk fermentasi variasi waktu
48 jam .................................................................................................. 24
Gambar 8. Kromatogram hasil analisis GC-MS produk fermentasi variasi waktu
72 jam .................................................................................................. 25
Gambar 9. Reaksi Pembentukan Asam Lemak Metil Ester dari Asam Lemak
Oleh mikroba L. plantarum dan A. aceti ............................................. 27
x
BIOKONVERSI ASAM LEMAK BEBAS TERHIDROLISIS
DARI MINYAK KEDELAI MENJADI BIODIESEL
MENGGUNAKAN Lactobacillus plantarum DAN Acetobacter
aceti
ADWI HANTONI
No Mhs : 16612138
INTISARI
Dewasa ini, green process sedang dikembangkan mengingat prosesnya
yang tidak menghasilkan limbah berbahaya, ramah lingkungan, dan tidak
memerlukan energi tinggi. Penelitian mengarah pada penggunaan
biokonversi/bioteknologi yang biasanya didasarkan pada proses fermentasi
mikroba, menjadikannya sebagai alternatif yang berpotensi dan layak. Metode
fermentasi mikroba memiliki potensi yang besar dalam mengkonversi asam lemak
bebas terhidrolisis menjadi biodiesel secara enzimatik menggunakan mikroba
Lactobacillus plantarum dan Acetobacter aceti dengan produk FAME (Fatty Acid
Methyl Ester). Senyawa FAME (Fatty Acid Methyl Ester) didapatkan melalui
proses fermentasi oleh mikroba Lactobacillus plantarum dan Acetobacter aceti
pada variasi waktu fermentasi 24 jam, 48 jam, 72 jam dengan total % konversi
masing-masing sebesar 85,87%, 41,88%, dan 93,25%.
Kata kunci: Fatty Acid Methyl Ester (FAME), Biodiesel, Lactobacillus plantarum,
Acetobacter aceti.
xi
BIOCONVERSION OF HYDROLYZED FREE FATTY ACIDS FROM
SOYBEAN OIL TO BIODIESEL USING Lactobacillus plantarum AND
Acetobacter aceti
ADWI HANTONI
No Mhs : 16612138
Abstract
Currently, the green process is being developed considering the process
that doesn’t produce hazardous waste, it’s environmental friendly, and doesn’t
require high energy. The research has led to the use bioconversion/ biotechnology
which are usually based on microbial fermentation process, making them a
potential and viable alternative. Microbial fermentation method has a great
potential in converting hydrolyzed free fatty acids into biodiesel using enzymatic
system of Lactobacillus plantarum and Acetobacter aceti bacteria with FAME
(Fatty Acid Methyl Ester) as the products. The compound FAME (Fatty Acid
Methyl Ester) was obtained through a fermentation process by the microbes
Lactobacillus plantarum and Acetobacter aceti at the variation of fermentation
time that is 24 hours, 48 hours, 72 hours with the conversion total is 85.87%,
41.88%, and respectively. 93.25%.
Keywords: Fatty Acid Methyl Ester (FAME), Biodiesel, Lactobacillus plantarum,
Acetobacter aceti.
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Dunia saat ini dicemaskan oleh semakin memburuknya kualitas
lingkungan yang disebabkan pencemaran lingkungan salah satunya adalah
pertambangan minyak bumi. Hal ini terjadi karena penambangan minyak bumi
memerlukan lahan yang luas mengakibatkan pegundulan hutan dan setiap
tanah yang ada digunakan untuk olahan minyak bumi tidak akan bisa lagi
digunakan untuk lahan hutan atau pertanian. Gas alam dari minyak bumi
merupakan bahan baku dalam pembuatan metanol dimana metanol ini
merupakan salah satu bahan dasar dari biodiesel. Produksi biodiesel secara
kimia memiliki kelebihan yaitu penggunaan teknologi yang murah dan proses
produksi yang relatif cepat. Akan tetapi, dalam proses produksinya, produk
yang disintesis secara kimia memerlukan banyak tahapan dan tidak dipungkiri
dalam hasilnya menghasilkan produk samping berupa limbah yang tidak
diinginkan yang dapat membahayakan lingkungan.
Dewasa ini, green process sedang dikembangkan mengingat prosesnya
yang tidak menghasilkan limbah berbahaya, ramah lingkungan, dan tidak
memerlukan energi tinggi. Hal ini bertujuan agar lingkungan dan kelangsungan
makhluk hidup tetap terjaga. Green production process, merupakan suatu cara
memproduksi dengan teknologi yang membatasi polusi atau memiliki manfaat
terhadap lingkungan ( Prakash, 2002). Green process mengacu pada langkah-
langkah untuk menghilangkan beban lingkungan sedemikian rupa meliputi
input sumber daya, penggunaan zat kimia, dan konsumsi energi untuk
digunakan seminimal mungkin dari semua proses yang terlibat dalam
pembuatan produk. Salah satu langkah tersebut adalah dengan biokonversi.
Berdasarkan hal tersebut penelitian mulai mengarah pada penggunaan
biokonversi yang biasanya didasarkan pada proses fermentasi mikroba,
menjadikannya sebagai alternatif yang berpotensi dan layak.
Biokonversi adalah sebuah proses yang mampu mengubah bahan organik
menjadi produk lain yang berguna dan memiliki nilai tambah dengan
2
memanfaatkan proses biologis dari mikroorganisme dan enzim (Hardjo et al.,
1989). Metode ini dianggap sangat berpotensi karena tidak menggunakan zat
kimia berbahaya, tidak membutuhkan energi tinggi, dan tidak menghasilkan
produk samping atau residu yang berbahaya bagi lingkungan.
Bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah asam lemak bebas
dari minyak kedelai. Pemilihan bahan ini didasarkan pada kegunaannya yang
beragam dan sumber daya yang mudah diperoleh serta memiliki jalur paling
mudah dalam produksi biodiesel. Biodiesel dapat diperoleh dari proses
esterifikasi menggunakan alkohol (contoh: metanol, etanol, dll) dengan
bantuan katalis asam sehingga menjadi alkil-ester (Zahriyah, 2009). Namun,
proses atau produk tersebut masih menggunakan metode konvensional yang
membutuhkan energi tinggi serta membutuhkan biaya produksi yang besar.
Oleh karena itu, alternatif yang mungkin untuk biodiesel berbasis minyak
nabati adalah produksi biodiesel langsung secara biosintetik dalam
mikroorganisme (Sherkhanov et al., 2016).
Produksi biodiesel dengan cara fermentasi mikroba dapat dibedakan
menjadi dua pendekatan yang berbeda yaitu produksi biodiesel tidak langsung
dari mikroba oleaginous dengan transesterifikasi (in vitro), dan produksi
biodiesel langsung dari metabolisme mikroba (in vivo) (Shi et al., 2011). Cara
produksi biodiesel secara tidak langsung dari mikroba atau in vitro ini
dilakukan dengan mengekstraksi mikroba spesies oleaginous sebagai sumber
lemak yang kemudian dilakukan transesterifikasi menggunakan metanol dan
bantuan katalis asam atau basa (Kuan et al., 2018). Mikroba dianggap spesies
oleagenus jika ia memiliki kemampuan mengakumulasi lebih dari 20% b/b
lemak pada basis berat kering sel (Patel et al., 2020). Sedangkan untuk
produksi biodiesel secara langsung dihasilkan dari metabolisme mikroba dalam
penelitian ini C. Antarctica dimana lipase yang terimobilisasi mengubah 95-
98% trigiliserida menjadi Fatty Acid methyl Ester (FAME) dengan
penambahan metanol secara bertahap (Hou & Shimada, 2009). Akan tetapi,
penggunaan bahan baku metanol sebagai alkohol yang dibutuhkan dalam
produksi biodiesel terutama jenis FAME merupakan hambatan utama untuk
3
penggunaan biodiesel yang lebih luas karena metanol dihasilkan dari turunan
bahan bakar fosil yang bersifat unrenewable (sumber tidak terbarukan). Karena
adanya alkohol berupa metanol dari bahan fosil tersebut mengakibatkan produk
FAME dianggap 80% renewable sedangkan 20% unrenewable (Toscano &
Duca, 2009). FAME sangat penting bagi lingkungan dan ekonomi karena
digunakan sebagai bahan bakar alternatif baik dalam bentuk murni atau
dicampur dengan proporsi yang bervariasi (Ginn et al. 2009).
Baru-baru ini, produksi FAME tanpa penggunaan metanol mulai digagas
oleh peneliti. Namun, penelitian dan kajian mengenai jalur produksi dan
mikroba yang digunakan dalam produksi FAME secara in situ ini masih sangat
terbatas. Penelitian sebelumnya, Escherichia coli telah direkayasa untuk
menghasilkan FAME secara in situ menggunakan asam lemak O-
methyltransferase (FAMT) dari Mycobacterium marinum atau homolog serupa
dengan menggunakan S-adenosylmethionine (SAM) sebagai pendonor metil.
Dalam studi ini, suplai SAM ditingkatkan dengan penghapusan metJ yaitu
pengatur protein yang menghambat enzim yang terlibat dalam sintesis SAM.
Tetapi hasil FAME sangat rendah, karena kurangnya aktivitas thioesterase
untuk memproduksi asam 3-hidroksidekanoat, substrat yang disukai FAMT
dari M. marinum (Lennen & Pfleger, 2013). Jauh lebih sederhana lagi, jalur
untuk mendapatkan biodiesel (FAME) adalah dengan metilasi langsung S-
adenosyl-L-methionine (SAM) yang bergantung pada asam lemak bebas yang
dihasilkan mikroba, tetapi produksi FAME dengan rute ini terbatas hanya ~ 16
mg/L (Sherkhanov et al., 2016). Selain itu, produksi biodiesel yang dihasilkan
memerlukan jalur yang rumit karna perlunya rekayasa genetika dan produk
biodiesel yang dihasilkan masih sangat sedikit karena masih mengandalkan
asam lemak yang dihasilkan dari tubuh mikroba itu sendiri. Oleh karena itu,
perlu dilakukan biokonversi tanpa menggunakan reagen metanol sehingga
mengatasi masalah FAME yang dianggap 80% renewable menjadi 100%
renewable dengan jalur yang lebih sederhana tanpa rekayasa genetik dan
menghasilkan produk biodiesel yang lebih banyak.
4
Pada penelitian ini telah dilakukan proses biokonversi asam lemak
terhidrolisis dari minyak kedelai menjadi biodiesel (FAME) dengan enzimatik
mikroba menggunakan Lactobacillus plantarum dan Acetobacter aceti.
Penggunaan dua mikroba ini bertujuan untuk meningkatkan hasil FAME yang
dihasilkan karena berdasarkan penelitian sebelumnya produk SAM pada
lactobacillus plantarum hanya 1,47mM. Proses fermentasi dilakukan dengan
tiga variasi waktu fermentasi yang berbeda, yaitu: 24 jam, 48 jam, dan 72 jam.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang tersebut, dapat dirumuskan suatu rumusan
masalah sebagai berikut :
1. Bagaimana potensi metode fermentasi dalam mengkonversi asam lemak
bebas terhidrolisis menjadi biodiesel secara enzimatik mikroba
menggunakan mikroba Lactobacillus plantarum dan Acetobacter aceti ?
2. Bagaimana pengaruh waktu proses fermentasi ?
1.3 Tujuan Penelitian
Berdasarkan masalah tersebut, dilakukan penelitian yang bertujuan untuk:
1. Untuk mengetahui potensi metode fermentasi mikroba dalam
mengkonversi asam lemak bebas terhidrolisis menjadi biodiesel.
2. Untuk mengetahui kondisi optimal waktu fermentasi untuk dapat
mengkonversi asam lemak bebas terhidrolisis menjadi biodiesel.
1.4 Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat untuk mengetahui dan membuka jalan
baru untuk pengembangan pembuatan produk biodiesel dengan jalur
bioteknologi untuk mendapatkan hasil dalam jumlah yang banyak dengan
bahan pembuatan yang lebih murah serta ramah lingkungan sehingga
membuka peluang untuk diterapkan pada skala industri.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Produksi biodiesel dengan cara fermentasi mikroba dapat dibedakan
menjadi dua pendekatan yang berbeda yaitu produksi biodiesel tidak langsung
dari mikroba oleaginous dengan transesterifikasi (in vitro), dan produksi
biodiesel langsung dari metabolisme mikroba (in vivo) (Shi et al., 2011).
Biodiesel (FAME) yang berasal dari mikroba oleaginous (mikroalga, ragi, dan
bakteri) secara aktif sedang dikejar sebagai pengganti potensial terbarukan
untuk solar minyak bumi (Wahlen et al., 2013). Penelitian yang dilakukan
Kuan, transesterifikasi langsung 1 g biomassa R. glutinis kering dalam 20 mL
metanol yang dikatalisis oleh 0,6 M H2SO4 pada 70 oC selama 20 jam,
rendemen asam lemak methyl ester (FAME) mencapai 111%. Menggunakan
jumlah biomassa dan metanol yang sama tetapi dikatalisis oleh 1 g/L NaOH
pada 70 oC selama 10 jam, hasil FAME mencapai 102%. Dibandingkan dengan
transesterifikasi konvensional, yang memerlukan pra-ekstraksi lemak,
transesterifikasi langsung tidak hanya menyederhanakan proses dan
mempersingkat waktu reaksi, tetapi juga meningkatkan hasil FAME (Kuan et
al., 2018).
Escherichia coli juga telah direkayasa untuk menghasilkan FAME
secara in situ menggunakan asam lemak O-methyltransferase (FAMT) dari
Mycobacterium marinum atau homolog serupa. Enzim yang diuji paling
banyak aktif pada C8-C12 jenuh dan FFA 3-terhidroksi dan menggunakan S-
adenosylmethionine (SAM) sebagai pendonor metil. Dalam studi ini, suplai
SAM ditingkatkan dengan penghapusan metJ yaitu pengatur protein yang
menghambat enzim yang terlibat dalam sintesis SAM. Tetapi hasil FAME
sangat rendah, karena kurangnya aktivitas thioesterase untuk memproduksi
asam 3-hidroksidekanoat, substrat yang disukai FAMT dari M. marinum.
FAME mencapai hasil lebih tinggi kemungkinan akan membutuhkan
kombinasi rekayasa protein (meningkatkan thioesterase dan aktivitas FAMT
melawan berbagai asam lemak) dan proses metabolisme (mengoptimalkan daur
ulang SAM) (Lennen & Pfleger, 2013).
6
Sampai saat ini, jalur paling efektif untuk produksi biodiesel dalam
bakteri menghasilkan asam lemak etil ester (FAEEs) hingga ~1,5 g/L. Jauh
lebih sederhana jalur ke biodiesel menghasilkan FAME dengan metilasi
langsung bergantung S-adenosyl-L-methionine (SAM) dan asam lemak pada
mikroba, tetapi produksi FAME dengan rute ini hanya ~16 mg/L. Sherkhanov
memberikan sebuah alternatif yaitu dengan cara memperluas spektrum
methyltransferase, Drosophila melanogaster Juvenile Hormone Acid O-
Methyltransferase (DmJHAMT). Dengan memperkenalkan DmJHAMT dalam
E. coli yang direkayasa untuk menghasilkan rantai sedang asam lemak dan
memproduksi SAM berlebih, diperoleh FAME rantai menengah pada titer 0,56
g/L, 35 kali lipat meningkat melebihi titer yang dicapai sebelumnya.
Sherkhanov menyadari bahwa perlu perbaikan yang cukup besar dibutuhkan
agar dapat bertahan produksi bakteri FAME dan FAEE untuk biofuel,
menurutnya mungkin lebih mudah untuk mengoptimalkan dan menggunakan
jalur produksi FAME ke mikroorganisme lain karena melibatkan lebih sedikit
enzim (Sherkhanov et al., 2016).
S-Adenosylmethionine (AdoMet) di Lactobacillus plantarum
ditemukan meningkat bersamaan dengan produksi asam lemak siklopropana
membran di bawah normal kondisi pertumbuhan. Aktivitas sintetase AdoMet
sebagian besar tidak dipengaruhi oleh variasi pH kultur medium (Smith &
Norton, 1980). Bakteri asam laktat (BAL) dapat menghasilkan SAM
konsentrasi tinggi, BAL diisolasi dari kimchi komersial dan dari produk kimchi
olahan yang mengandung jeotgal udang (makanan laut asin yang difermentasi)
atau jeotgal tombak pasir yang difermentasi masing-masing pada suhu 5 atau
10 °C. Lactobacillus menghasilkan SAM hingga 1,47 mM dalam kultur strain
(Myung-ki lee, 2008).
7
BAB III
DASAR TEORI
3.1 Minyak Kedelai
Kedelai (Glycine max L) merupakan tanaman tahunan yang termasuk
dalam famili Fabaceae. Ini didistribusikan secara luas di Asia Timur, Australia,
dan Afrika, dan didomestikasi lebih dari 3000 tahun yang lalu. Sekarang
tanaman ini merupakan tanaman kacang-kacangan terpenting di dunia ke-6 dari
semua tanaman budidaya dalam hal panen. Kedelai paling banyak diproduksi
untuk minyaknya, dan ditanam di berbagai iklim di seluruh dunia. Kedelai
adalah salah satu kacang terpenting di dunia, menyediakan protein nabati bagi
jutaan manusia dan bahan untuk ribuan produk kimia. Kedelai dianggap
sebagai salah satu sumber protei terkaya dan murah (Badole et al., 2015).
Kandungan minyak kedelai berupa lemak kasar yang terdiri dari
trigliserida sebesar 90-95% dan sisanya berupa fosfatida, asam lemak bebas,
sterol dan tokofenol. Fosfatida yang terkandung dalam kedelai sekitar 2% yang
terdiri dari lesithin dan sephalin. Komposisi minyak kedelai secara umum
sesuai dengan (Tabel 1) sebagai berikut (Ketaren, 2005) :
Tabel 1. Komposisi minyak kedelai secara umum
Asam lemak tidak jenuh Kadar (%)
Asam linolenat 15-64
Asam oleat 11-60
Asam linoleat 1-12
Asam arachidonat 1,5
Asam lemak jenuh
Asam palmitat 7-10
Asam stearat 2-5
Asam arachidat 0,2-1
Asam laurat 0-0,1
Fosfolipida Jumlah sangat kecil
Lecithin Jumlah sangat kecil
8
Cephalin Jumlah sangat kecil
3.2 Biokonversi
Biokonversi adalah sebuah proses yang mampu mengubah bahan
organik menjadi produk lain yang berguna dan memiliki nilai tambah dengan
memanfaatkan proses biologis dari mikroorganisme dan enzim (Hardjo et al.,
1989). Metode/proses ini dianggap sangat berpotensi karena tidak
menggunakan zat kimia berbahaya, tidak membutuhkan energi tinggi, dan
tidak menghasilkan produk samping atau residu yang berbahaya bagi
lingkungan. Penggunaan biokonversi/bioteknologi biasanya didasarkan pada
proses fermentasi mikroba tanpa menggunakan bahan kimia berbahaya.
Biotransformasi menggunakan enzim bebas sebagai biokatalis sekarang
menjadi metodologi sintetik yang sepenuhnya diterima dan divalidasi untuk
menyiapkan senyawa homochiral yang digunakan dalam industri farmasi,
bahan tambahan makanan, atau agrokimia (Carballeira et al., 2009). Senyawa
kiral yang akan digunakan sebagai bahan kimia pertanian, farmasi, wewangian,
dan sebagai bahan tambahan makanan dapat dengan mudah disintesis dengan
biotransformasi, biasanya dalam kondisi ringan jika dibandingkan dengan
sintesis kimia. Resolusi kinetik zat rasemat menjadi proses yang umum dan
sukses. Penerapan biotransformasi dalam proses industri menjelaskan lebih
lanjut keberhasilan penggunaan enzim dan sel mikroba untuk produksi
senyawa yang menarik secara komersial (de Carvalho & da Fonseca, 2011).
3.3 Hidrolisis
Hidrolisis adalah proses antara reaktan dengan air agar suatu senyawa
pecah atau terurai. Hidrolisis melibatkan reaksi bahan kimia organik dengan air
untuk membentuk dua atau lebih banyak zat baru dan biasanya diartikan
dengan pemutusan ikatan kimia oleh penambahan air. Hidrolisis bisa menjadi
kebalikan dari kondensasi reaksi di mana dua molekul bergabung bersama
menjadi lebih besar dengan menghilangkan molekul air. Jadi hidrolisis
menambahkan air untuk memecah, sedangkan kondensasi menumpuk dengan
menghilangkan air (J. G. Speight, 2017).
9
Reaksi hidrolisis adalah pemutusan ikatan kimia dengan penambahan
air atau basa yang memasok ion hidroksil (ikatan tunggal -OH). Sebuah ikatan
kimia terputus, dan dua ikatan baru terbentuk, masing-masing memiliki
komponen hidrogen (H+) atau komponen hidroksil (-OH) dari molekul air (J.
Speight, 2018).
3.4 Biodiesel Fatty Acid Methyl Ester (FAME)
Biodiesel merupakan bahan bakar transportasi cair terbarukan yang dapat
menjadi bahan bakar untuk menggantikan bahan bakar diesel yang diturunkan
dari minyak bumi tanpa modifikasi signifikan pada mesin yang ada. Biodiesel
terdiri dari alkil ester dari asam lemak dan biasanya diproduksi dari trigliserida
(misalnya, minyak kedelai) dan alkohol (misalnya, metanol) dengan adanya
basa atau asam sebagai katalisator (Wahlen et al., 2013).
Dalam proses yang paling umum, FAME diproduksi melalui
transesterifikasi bahan baku melalui reaksi dengan metanol dengan adanya
katalis. Campuran yang dihasilkan mengandung FAME dan gliserin (gliserol)
dan terakhir dipisahkan dari FAME sebelum digunakan. FAME dapat
bersumber dari berbagai macam bahan baku termasuk minyak nabati (rapeseed,
kedelai, sawit, bunga matahari dan jagung), lemak hewani (lemak, lemak babi,
dan unggas dan minyak ikan) dan minyak dan lemak sisa (minyak goreng
bekas) (Ginn et al., 2009).
FAME memiliki struktur molekul umum CH3(CH2) nCOOCH3 (jenuh)
dan CH3(CH2)n(CH)xCOOCH3 (tidak jenuh) dan contoh FAME yang
dihasilkan dari minyak nabati utama yang digunakan untuk produksi biodiesel
yaitu asam palmitat metil ester, asam stearat metil ester, asam oleat metil ester,
asam linoleat metil ester, dll (Thomas et al., 2017).
3.5 Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum adalah anggota genus Lactobacillus yang
tersebar luas, umumnya ditemukan pada daging dan makanan olahan, pada
banyak produk makanan fermentasi serta bahan tanaman anaerobik. L.
plantarum memiliki salah satu genom terbesar yang dikenal BAL dan
merupakan spesies yang sangat fleksibel dan serbaguna. Ini adalah bakteri
10
Gram-positif aerotolerant yang tumbuh pada suhu 15 ° C dan dengan
konsentrasi NaCl 4%, tetapi tidak pada suhu 45 ° C, dan menghasilkan kedua
isomer asam laktat (D dan L). L. plantarum umumnya ditemukan di banyak
produk makanan fermentasi termasuk sauerkraut, acar, zaitun asin, kimchi
Korea, Ogi Nigeria, dan bahan tanaman fermentasi lainnya, beberapa keju,
sosis fermentasi, dan ikan kaldu (Lorenzo et al., 2018). Spesies BAL ini sangat
serbaguna dan mampu bertahan di berbagai ekosistem. Di antara sistem
bakteriosin berbeda yang dijelaskan dalam spesies L. plantarum (Ruiz-Larrea,
2011).
Sumber : Wang et al., 2018
Gambar 1. Lactobacillus Plantarum
Adaptasi ekologis yang luar biasa dari L. plantarum ke lingkup ekologi
yang berbeda mencerminkan kemampuannya untuk memanfaatkan sejumlah
besar karbohidrat, yang mana asam laktat diproduksi sebagai metabolit akhir
utama. L. plantarum digunakan sebagai starter dan kultur tambahan dalam
fermentasi bahan mentah yang berasal dari tumbuhan dan hewan, yang
berkontribusi untuk meningkatkan kualitas sensorik dan memperpanjang umur
produk terfermentasi. Beberapa strain juga digunakan sebagai probiotik hewan
atau manusia (Mayo & Flórez, 2020)
3.6 Acetobacter aceti
Acetobacter aceti adalah bakteri Gram-negatif yang bergerak
menggunakan flagela peritrichous. Louis Pasteur membuktikannya sebagai
penyebab konversi etanol menjadi asam asetat pada tahun 1864. Ini adalah
mikroorganisme jinak yang ada di mana-mana di lingkungan, ada di lingkup
ekologi beralkohol yang meliputi bunga, buah-buahan, dan lebah madu, serta
di air dan tanah. Ia hidup di mana pun fermentasi gula terjadi. Tumbuh paling
11
baik pada suhu yang berkisar dari 25 hingga 30 derajat Celcius dan dalam pH
yang berkisar antara 5,4 hingga 6,3 (De Ley et al., 1984)
Pembentukan asam asetat hanya dapat berlangsung bila oksigen yang
cukup tersedia, yaitu pada buah-buahan, jus, dan kentang tumbuk. Di bawah
kondisi anaerobik pembuatan anggur, peleburan cuka jarang terjadi.
Kemunculannya ditunjukkan dengan meningkatnya konsentrasi asam asetat,
etil asetat dan d-laktat (Hommel, R. K., & Ahnert, P., 1999) Bakteri ini juga
digunakan dalam produksi produk metabolisme lainnya, misalnya asam
glukonat dan l-sorbosa dengan aplikasi potensial dalam industri makanan dan
biomedis. Klasifikasi AAB (Acetic Acid bacterial) menjadi general yang
berbeda telah mengalami beberapa modifikasi selama beberapa tahun terakhir,
berdasarkan karakteristik morfologi, fisiologis dan genetik (Gomes et al.,
2018).
3.7 Gas Chromatography – Mass Spectrometry (GC-MS)
James dan Martin memperkenalkan teknik GC pertama kali pada tahun
1952 (Sparkman et al., 2011), yang seiring dengan perkembangan teknologi
teknik GC sering digunakan secara bersama-sama dengan instrumen lain
seperti Mass-Spectrometer (MS). GC merupakan salah satu teknik
kromatografi yang hanya dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa
yang mudah menguap. Sedangkan MS merupakan spektrometer massa yang
diperlukan untuk identifikasi senyawa sebagai penentu bobot molekul dan
penentuan rumus molekul (Darmapatni dkk, 2016).
12
Sumber : Kim et al., 2016
Gambar 2. Prinsip Instrumen GC-MS
Instrumen GC-MS terdiri dari dua komponen utama. Bagian
kromatografi gas memisahkan senyawa berbeda dalam sampel menjadi sinyal
bahan kimia murni berdasarkan volatilitasnya dengan mengalirkan gas inert
(fase gerak), yang membawa sampel, melalui fase diam yang ditetapkan di
kolom (Skoog et al., 2007). Spektrum senyawa dikumpulkan saat mereka
keluar dari kolom kromatografi oleh spektrometer massa, yang
mengidentifikasi dan mengkuantifikasi bahan kimia menurut rasio massa
terhadap muatannya (m / z). Spektrum ini kemudian dapat disimpan di
komputer.
Peningkatan penggunaan GC-MS banyak digunakan yang dihubungkan
dengan komputer dimana dapat merakam dan menyimpan data dari sebuah
analisis akan berkembang pada pemisah yang lebih efisien. Karena komputer
dapat diprogram untuk mencari spektra library yang langka, membuat
identifikasi dan menunjukkan analisis dari campuran gas tersebut (Willett,
1987).
3.8 Spektrofotometer uv-vis
Spektrofotometri UV-VisSpektrofotometer merupakan alat yang
digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan, dan diemisikan sebagai fungsi dari spektrum
13
dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang di absorbsi (Khopkar, 2008:
184). Serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi
elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang
sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri
ultraviolet, cahaya tampak, inframerah dan serapan atom. Jangkauan
panjang gelombang untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah
cahaya tampak 380-780 nm, daerah infra merah dekat 780-3000 nm, dan
daerah infra merah 2,5-40 μm atau 4000-250 cm-1 (Ditjen POM, 1995).
Pada umumnya spektrofotometri ultraviolet dalam analisis senyawa
organik digunakan untuk:
a. Menentukan jenis khromofor, ikatan rangkap yang terkonjugasi dan
auksokhrom dari suatu senyawa organik.
b. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang serapan
maksimum suatu senyawa.
c. Mampu menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer.
Sumber : (Rocha et al., 2018)
Gambar 3. Prinsip Instrumen Spectrofotometer uv-vis
Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi
yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik
yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi
14
(atau panjang gelombang) sinar merupakan spectrum absorpsi. Transisi yang
dibolehkan (allowed transition) untuk suatu molekul dengan struktur kimia
yang berbeda adalah tidak sama sehingga spectra absorpsinya juga berbeda.
Dengan demikian, spectra dapat digunakan sebagai bahan informasi yang
bermanfaat untuk analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada
panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul
yangmenyerap radiasi, sehingga spectra absorpsi juga dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif (Gandjar dan Rohman,2007).
Hal–hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektofotometri uv-vis
(Rohman, 2007) :
a. Pemilihan Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah
panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperoleh
panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan dengan membuat kurva
hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan
bakupada konsentrasi tertentu.
b. Pembuatan Kurva Kalibrasi
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing–masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi
diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi
dengan konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva
kalibrasi berupa garis lurus.
c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2
sampai 0,6. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai
absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling
minimal.
15
BAB VI
METODELOGI PENELITIAN
4.1 Alat dan Bahan
4.1.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah, Autoclave (Yazumi),
Neraca Analitik (Ohaus), Evaporator Vakuum (N-1100SWD), Hotplate (C-
MAG HS 7), Oven (Memmert), micropipet ukuran 1000 μL (Eppendorf), Labu
Leher 3 (merk Pyrex), Kondensor, Termometer Alkohol, Karet Penyumbat,
Tabung Reaksi (pyrex), Alat Sentrifugasi (merk DS), Inkubator Shaker
(Scilogex, SK-O330-Pro), Instrumen GC-MS (Shimadzu QP2010 SE),
Instrumen Spektrofotometer uv-vis (Perkin Elmer),
4.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah minyak
kedelai, aquadest, Lactobacillus plantarum, acetobacter aceti, medium nutrien
broth (NB), buffer fosfat 6,3, polisorbat 80 (tween 80), Natrium klorida (NaCl)
0,9 %, Asam klorida (HCl) 6 N, Natrium hidroksida (NaOH) 0,1 N, etil asetat,
metanol p.a, Etanol 95%, Barium klorida (BaCl2) 1%, Asam sulfat (H2SO4)
1%, Asam oksalat (H2C2O4) 0,1 N.
4.2 Cara Kerja
4.2.1 Hidrolisis Minyak Kedelai
Hidrolisis minyak kedelai dilakukan dengan cara refluks. Perbandingan
minyak dan air pada rasio perbandingan 1:8 selama 12 jam pada temperatur
100˚C. Kemudian ditambahkan secara perlahan HCl 6N sebanyak 1% dari
berat total, penambahan HCl dilakukan selama proses pemanasan berlangsung.
Lalu fasa minyak dipisahkan dengan fasa air menggunkan corong pisah.
4.2.2 Penentuan bilangan asam lemak bebas hasil hidrolisis
Penentuan bilangan asam dilakukan dengan cara titrasi menggunakan
larutan basa NaOH. Ditimbang sebanyak 5 gram minyak kelapa, kemudian
ditambahkan dengan etanol 95% sebanyak 50 mL. Campuran tersebut
selanjutnya dipanaskan selama 10 menit di atas penangan air sambil diaduk-
16
aduk. Setelah dingin selanjutnya dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N dengan
menggunakan fenolftalin sebagai indikator sampai terbentuk warna merah
muda. Dilakukan pengulangan sebanyak dua kali. Larutan NaOH 0,1 N yang
digunakan untuk titrasi distandarisasi dengan larutan asam oksalat 0,1 N.
Rumus penentuan bilangan asam sebagai berikut :
% 𝐹𝐹𝐴 =𝑉 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑥 𝑁 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑥 𝐵𝑀
1000 𝑥 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 100
Keterangan :
V NaOH : Volume ( mL )
BM : Berat Molekul Minyak Kedelai (280,447𝑔
𝑚𝑜𝑙⁄ )
N : Normalitas ( N )
Berat Sampel : Massa Asam Lemak yang dititrasi ( g )
4.2.3 Pembuatan Medium Pertumbuhan dan Proses Inakulasi
Pembuatan nutrien broth dilakukan dengan penimbangan 1,3 gram dan
dilarutkan dengan akuades 100 mL Larutan dipanaskan dalam oven selama ±
10 menit lalu dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave selama ± 2 jam.
Setelah dilakukan proses sterilisasi media dapat digunakan sebagai media
tumbuh. Dilakukan dengan cara diambil 200 mikroliter indukan mikroba
kemudian dilarutkan kedalam medium nutrient broth yang telah steril.
4.2.4 Perhitungan Mikroba Menggunakan Metode McFarland
a. Standar McFarland
Pembuatan standar McFarland dengan mencampurkan BaCl2 1% ke
dalam H2SO4 1%. Larutan standar McFarland tersebut dibuat 5 tabung yang
berisikan tabung 1 (0,05 mL BaCl2 + 9,95 mL H2SO4), tabung 2 (0,1 mL
BaCl2 + 9,9 mL H2SO4), tabung 3 (0,2 mL BaCl2 + 9,8 mL H2SO4), tabung 4
(0,3 mL BaCl2 + 9,7 mL H2SO4), tabung 5 (0,4 mL BaCl2 + 9,6 mL H2SO4).
Yang kemudian tiap tabung dianalisis dengan instrumen Spektrofotometer
uv-vis.
b. Pembuatan Sampel
Diambil mikroba dalam indukan sebanyak 10 mL ke dalam tabung
reaksi. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 4000-an rpm dengan
17
waktu 10 menit. Pellet yang diperoleh dipisahkan dari sisa medium
kemudian pellet dilarutkan dalam 10 mL larutan NaCl 0,9% menggunakan
alat vortek. Kemudian sampel dianalisis menggunakan spektrofotometer uv-
vis.
4.2.5 Proses Fermentasi
Proses fermentasi dilakukan dengan menambahkan 6 g asam lemak
terhidrolisis ke dalam medium 25 mL yang sudah berisi mikroba. Lalu
ditambahkan 0,2 mL tween 80 dan pH buffer fosfat 6,3 sebanyak 10 mL.
Proses fermentasi dilakukan menggunakan alat shaker dengan kecepatan 120
rpm pada suhu ruang. Dilakukan dengan 3 variasi waktu fermentasi yaitu 24
jam, 48 jam, dan 72 jam.
4.2.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi
Setelah proses fermentasi selesai kemudian medium yang berisi produk
biokonversi tersebut diasamkan dengan HCl 6 N sebanyak 5 mL. Kemudian
hasil fermentasi diekstrak menggunakan etil asetat sebanyak 50 mL. Terdapat 2
lapisan dimana lapisan atas diambil dengan cara dipisahkan menggunakan
corong pisah lalu lapisan atas tersebut dicuci menggunakan aquadest sebanyak
2x dan dipisahkan kembali. Lapisan atas yang sudah netral dievaporasi untuk
menghilangkan pelarut etil asetat dari campuran produk. Hasil evap kemudian
diekstrak kembali menggunakan metanol p.a 5 mL.
18
BAB V
PEMBAHASAN
Pada penelitian ini dilakukan studi biokonversi asam lemak bebas
terhidrolisis dari minyak kedelai menjadi biodiesel menggunakan mikroba
lactobacillus plantarum dan acetobacter aceti. Optimasi kondisi fermentasi
meliputi variasi waktu fermentasi dilakukan guna mengetahui produk biodiesel
optimum yang dihasilkan sehingga diperoleh % komposisi atau konversi yang
tinggi.
5.1 Hidrolisis Minyak Kedelai dan Penentuan Bilangan Asam
Asam lemak terhidrolisis merupakan bahan utama yang berperan
sebagai substrat fermentasi dalam penelitian ini. Proses hidrolisis minyak
kedelai yang dilakukan pada tahap awal penelitian ini sangat penting guna
memperoleh asam lemak bebas yang digunakan pada tahap selanjutnya. Secara
alami, asam lemak bebas dalam minyak kedelai dapat terbentuk melalui
hidrolisis alami dengan air tetapi konsentrasinya sangat rendah sehingga perlu
dilakukan hidrolisis menggunakan katalis asam. Katalis asam berguna untuk
meningkatkan laju reaksi kimia karena kemampuannya dalam menurunkan
energi aktivasi reaksi reaktan untuk menjadi produk. Katalis asam yang
digunakan yaitu HCl 6 N yang ditambahkan secara perlahan ke dalam
campuran minyak dan air pada saat suhu campuran 100 oC selama 12 jam.
Reaksi yang terjadi sebagai berikut :
Gambar 4. Reaksi hidrolisis minyak kedelai menjadi asam lemak
Penentuan bilangan asam atau kadar asam lemak bebas ditentukan
untuk mengetahui seberapa besar produk asam lemak bebas terhidrolisis yang
dihasilkan. Penentuan dilakukan sesuai dengan metode SNI 01-3555-1998
19
“cara uji minyak dan lemak” yang prinsipnya pelarutan contoh lemak/minyak
dalam pelarut organik tertentu (alkohol 95% netral) dengan penambahan
indikator PP dilanjutkan dengan penitaran basa (NaOH atau KOH). Penentuan
bilangan asam dilakukan pada minyak kedelai sebelum dan sesudah hidrolisis.
Diperoleh bilangan asam lemak bebas pada minyak kedelai sebelum hidrolisis
sebesar 0,75% sedangkan setelah hidrolisis sebesar 1,59%. Berdasarkan SNI
No.01-3555-1998 tentang syarat asam lemak bebas pada minyak kedelai yaitu
maksimal 0,2% Hal ini menandakan bahwa proses hidrolisis berjalan dengan
sangat baik karena terjadi peningkatan persentase asam lemak bebas yang
cukup signifikan.
5.2 Perhitungan Mikroba dengan Metode McFarland
Standar McFarland digunakan untuk standarisasi perkiraan jumlah
bakteri dalam suspensi cair dengan membandingkan kekeruhan suspensi uji
dengan Standard McFarland sebelum dilakukan fermentasi. Standar McFarland
adalah larutan kimia barium klorida dan asam sulfat, reaksi antara dua bahan
kimia ini menghasilkan endapan halus barium sulfat. Ketika dikocok pelan,
kekeruhan Standar McFarland visual sebanding dengan konsentrasi suspensi
mikroba. Digunakan 5 standar McFarland dengan konsentrasi berbeda – beda
yaitu : 0,5, 1, 2, 3, 4 dan 2 sampel yaitu mikroba L. Plantarum dan mikroba A.
Aceti masing – masing 10 mL yang dianalisis menggunakan alat
spektrofotometer uv-vis pada panjang gelombang maksimum (λ = 600 nm).
Hasil analisis standar McFarland dibuat kurva kalibrasi sehingga jumlah
mikroba dapat ditentukan. Kurva kalibrasi merupakan grafik yang membentuk
garis lurus (linear) yang menyatakan hubungan antara kadar larutan kerja
termasuk blanko dengan respon yang proporsional dari instrumen. Perubahan
secara proporsional antara kadar analit dengan respon instumen tersebut akan
membentuk garis lurus yang memenuhi persamaan y = ax + b dimana :
y = respon instrumen ) b = kemiringan (slope)
x = kadar analit a = intersep (intercept)
20
Hasil data yang diperoleh dari analisis spektrofotometer uv-vis disajikan pada
(Tabel 2) sebagai berikut :
Tabel 2. Standar McFarland CFU (x106/mL), Absorbansi Standar mcFarland,
dan Absorbansi Sampel Mikroba (L. plantarum, A. aceti)
Skala 0,5 1 2 3 4
CFU (x106/mL) <300 300 600 900 1200
Absorbansi 0,153 0,302 0,521 0,656 0,852
Sampel L. plantarum 0,577
Sampel A. aceti 0,586
Berdasarkan data yang diperoleh dari (Tabel 2) hasil analisis
spektrofotometer uv-vis tersebut, kemudian dibuat grafik kurva kalibrasi guna
mengetahui konsentrasi mikroba L. plantarum dan A.aceti secara kuantitatif.
Grafik kurva kalibrasi tersebut disajikan pada (Gambar 5) berikut ini :
Gambar 5. Kurva Kalibrasi Hasil Analisis Spektrofotometer uv-vis Standar
McFarland
Jika dilihat dari data kurva kalibrasi (Gambar 2) terdapat R2 (koefisien
determinasi). Secara umum, R2 digunakan sebagai informasi mengenai
y = 0,0006x + 0,1464
R² = 0,9958
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
abso
rban
si (
nm
)
CFU (x106/mL)
Abs vs CFU (x106/mL)
21
kecocokan suatu model. Dalam regresi R2 ini dijadikan sebagai pengukuran
seberapa baik garis regresi mendekati nilai data asli. Jika R2 sama dengan atau
mendekati 1, maka angka tersebut menunjukkan garis regresi cocok dengan
data secara sempurna atau hampir sempurna. Pada penelitian ini diperoleh R2 =
0,9958 yang berarti bahwa kecocokan garis regresi dengan data sangat baik
(bersesuaian) karena nilai R2 yang mendekati nilai 1 sehingga hasil data dapat
diterima. Jika dilihat dari (Tabel 1), sampel L. plantarum memiliki absorbansi
0,577 dan sampel A. aceti memiliki absorbansi 0,586. Jika tiap absorbansi
tersebut dimasukkan dalam rumus persamaan garis y = 0,0006x + 0,1464
(Gambar 5), absorbansi sampel sebagai y maka dapat ditentukan konsentrasi
mikroba (nilai x). Sehingga konsentrasi mikroba L. plantarum yang diperoleh
sebesar 717,67 x 106 CFU/mL dan konsentrasi mikroba A. aceti yang diperoleh
sebesar 1465,33 x 106 CFU/mL dimana konsentrasi tersebut diperoleh dari 1
hari masa pertumbuhan dalam 10 mL media.
5.3 Proses Fermentasi
Proses fermentasi dilakukan dengan 3 variasi waktu yang berbeda yaitu
pada waktu fermentasi 24 jam, 48 jam, 72 jam. Tujuannya adalah untuk
mengetahui pengaruh perbedaan waktu fermentasi terhadap produk senyawa
biodiesel yang dihasilkan. Fermentasi dilakukan secara one pot yang artinya
mikroba L. plantarum dan A. aceti ditempatkan pada satu wadah (media) yang
sama. Penempatan satu wadah tersebut dilakukan dengan harapan terbentuknya
senyawa biodiesel dengan jumlah lebih banyak.
Fermentasi berjalan pada pH yang konstan yaitu pH 6,3 menggunakan
pH buffer fosfat 6,3 yang merupakan kondisi optimum mikroba tersebut dalam
produksi (Romano et al., 2013). Karena substrat asam lemak terhidrolisis tidak
larut dalam air maka ditambahkan tween 80 yang berfungsi sebagai pelarut
antar zat yang bertindak sebagai surfaktan dan meningkatkan tingkat kelarutan
antar zat yang biasanya tidak larut dalam larutan tertentu. Dalam hal ini asam
lemak bebas yang tidak larut dalam air akan teremulsi pada media NB sehingga
asam lemak terhidrolisis terdistribusi secara merata dan juga dibantu dengan
alat shaker dengan kecepatan 120 rpm sehingga hasil fermentasi lebih optimal.
22
5.4 Karakterisasi GC-MS Hasil Fermentasi Pada Variasi Waktu 24 jam
Identifikasi komponen senyawa produk hasil fermentasi yaitu biodiesel
dilakukan dengan membandingkan pola fragmentasi spektrum massa dengan
pola fragmentasi senyawa referensi. Hasil Analisis GC-MS produk biodiesel
dari hasil fermentasi 24 jam disajikan pada (Gambar 6) sebagai berikut :
Gambar 6. Kromatogram hasil analisis GC-MS produk fermentasi variasi
waktu 24 jam
Jika dilihat dari hasil kormatogram pada instrumen GC-MS terdapat 9
puncak yang teridentifikasi. Puncak tertinggi pada hasil fermentasi 24 jam ini
adalah peak 4 sedangkan terendah ada pada peak 1.
Tabel 3. Hasil GC-MS terhadap produk biokonversi asam lemak bebas
terhidrolisis oleh mikroba L. plantarum dan A.aceti variasi waktu 24 jam
peak Waktu
retensi (min.)
LuasArea
(%)
SI Nama Senyawa
1
2
3
4
5
6
7
6,469
6,769
13,999
15,724
15,777
16,005
16,123
1,78
3,13
10,64
43,82
24,69
3,43
4,27
96
97
97
95
94
95
92
2,4-Decadienal
2,4-Decadienal
Metil palmitat
Metil linoleat
Metil oleat
Metil stearat
Asam oleat
23
8
9
18,478
20,297
4,94
3,29
97
81
Asam Hexanedioic
Metil ricinoleat
Jika dilihat dari (Tabel 3) tersebut, hampir semua produk merupakan
Fatty Acid Methyl Ester (FAME) yang merupakan salah satu bahan bakar
terbarukan (biodiesel) dimana produk FAME terbanyak adalah peak 4 yaitu
metil linoleat sebesar 43,82%. Produk metil linoleat terbanyak karena
berdasarkan teori, asam linoleat yang merupakan bahan pada fermentasi ini
adalah asam lemak terbanyak yang terdapat pada minyak kedelai bisa
mencapai 64% dari asam lemak total pada minyak kedelai (Karen, 2005). Pada
hasil fermentasi 24 jam ini masih terdapat asam lemak yang belum termetilasi
secara sempurna yaitu peak 7 dan 8 berupa asam oleat dan asam hexanedioic
sebesar 4,27% dan 4,94%. Terdapat juga senyawa produk samping pada peak 1
dan 2 yaitu 2,4-Decadienal dengan persentase terendah sebesar 1,78% dan
3,13%. Total persentase biodiesel FAME pada variasi waktu 24 jam yang
dihasilkan adalah sebesar 85,87%.
5.4 Karakterisasi GC-MS Hasil Fermentasi Pada Variasi Waktu 48 jam
Hasil Analisis GC-MS produk biodiesel dari hasil fermentasi 48 jam
disajikan pada (Gambar 7) sebagai berikut :
24
Gambar 7. Kromatogram hasil analisis GC-MS produk fermentasi variasi
waktu 48 jam
Jika dilihat dari hasil kormatogram pada instrumen GC-MS terdapat 10
puncak yang teridentifikasi. Puncak tertinggi pada hasil fermentasi 48 jam ini
adalah peak 8 sedangkan terendah ada pada peak 6.
Tabel 4. Hasil GC-MS terhadap produk biokonversi asam lemak bebas
terhidrolisis oleh mikroba L. plantarum dan A.aceti variasi waktu 48 jam
Peak Waktu Retensi
(min.)
Luas Area
(%)
SI Nama Senyawa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11,673
14,002
14,346
15,724
15,775
16,006
16,087
16,123
16,338
18,435
1,41
4,06
3,89
12,14
13,10
1,40
11,18
28,15
2,18
22,48
75
96
94
93
95
90
89
89
75
95
1,5-Diisopropil,
2,3-dimetil
cycloheksana
Metil palmitat
Asam palmitat
Metil linoleat
Metil oleat
Metil stearat
Metil linolelaidat
Asam oleat
Asam stearat
Asam Hexanedioic
Jika dilihat dari (Tabel 4) tersebut, produk FAME terbanyak terdapat
pada peak 8 yaitu metil linolelaidat sebesar 28,15% dengan total persentase
FAME yang diperoleh sebesar 41,88%. Persentase ini turun dibandingkan
variasi waktu sebelumnya. Padahal secara teoritis, semakin lama fermentasi
(selama mikroba fase eksponensial) berjalan maka semakin besar konsentrasi
yang didapatkan dikarenakan pertumbuhan mikroba yang semakin banyak
(Silva & Malcata, 2000). Hal ini bisa terjadi karena variasi proses fermentasi
yang dilakukan berada pada wadah yang berbeda-beda mengakibatkan laju
pertumbuhan mikroba tiap variasi bergantung pada lingkungan yang berbeda
25
pula sehingga dimungkinkan adanya pengganggu atau kontaminan yang
mengakibatkan laju pertumbuhan mikroba pada variasi 48 jam kurang
baik/optimal. Hal ini didukung dengan hasil GC-MS yang menunjukan masih
banyaknya asam lemak yang tidak termetilasi oleh mikroba yaitu pada peak 3,
7, 8 berupa asam palmitat, asam oleat, asam stearat, dan asam hexanedioic
dengan total presentase asam lemak sebesar 56,7%.
5.5 Karakterisasi GC-MS Hasil Fermentasi Pada Variasi Waktu 72 jam
Hasil Analisis GC-MS produk biodiesel dari hasil fermentasi 72 jam
disajikan pada (Gambar 8) sebagai berikut :
Gambar 8. Kromatogram hasil analisis GC-MS produk fermentasi variasi
waktu 72 jam
Jika dilihat dari hasil kormatogram pada instrumen GC-MS terdapat 7
puncak yang teridentifikasi. Puncak tertinggi pada hasil fermentasi 72 jam ini
adalah peak 2 sedangkan terendah ada pada peak 7.
Tabel 5. Hasil GC-MS terhadap produk biokonversi asam lemak bebas
terhidrolisis oleh mikroba L. plantarum dan A.aceti variasi waktu 72 jam
Peak Waktu
Retensi (min.)
Luas Area
(%)
SI Nama Senyawa
1
2
13,999
15,724
12,23
46,40
97
95
Metil palmitat
Metil linoleat
26
3
4
5
6
7
15,775
16,004
16,080
16,100
18,239
30,80
3,82
1,76
4,10
0,89
94
96
87
91
78
Metil oleat
Metil stearat
Asam linoleat
Asam oleat
1-metoksi-,(E)-
9-Oktadekena
Jika dilihat dari tabel 5 tersebut, produk FAME terbanyak terdapat pada
peak 2 yaitu metil linoleat sebesar 46,40% dengan total persentase FAME
yang diperoleh sebesar 93,25%. Persentase ini naik dibandingkan variasi waktu
sebelumnya. Hal ini sesuai secara teoritis, dimana semakin lama fermentasi
(selama mikroba fase eksponensial) berjalan maka semakin besar konsentrasi
yang didapatkan karena pertumbuhan mikroba yang semakin banyak sehingga
semakin banyak pula substrat asam lemak bebas yang terkonversi (Silva &
Malcata, 2000). Terdapat masih ada asam lemak yang belum terkonversi secara
sempurna dibuktikan pada peak 6 yaitu adanya asam oleat dengan persentase
4,10%. Terdapat juga senyawa pengotor pada peak 7 yaitu 1-metoksi-,(E)-9-
Oktadekena. Senyawa tersebut dianggap merupakan senyawa pengotor yang
ikut teranalisis. Hal tersebut dibuktikan dengan rendahnya SI (similarity index)
yang dimiliki yaitu sebesar 78. SI (similarity index) mengindikasikan
presentase kecocokan pola fragmentasi sampel dengan pola fragmentasi
senyawa standar Library MS pada komputer. Semakin nilai SI menjauhi nilai
100 maka semakin tidak cocok pola fragmentasi sampel dan standar yang
dibandingkan sehingga senyawa yang diindentifikasi kurang akurat. Begitu
juga sebaliknya, semakin nilai SI mendekati atau sama dengan 100 maka
ketepatan senyawa yang diidentifikasi semakin akurat. Persentase luas areanya
juga sangat rendah yaitu 0,89%.
5.6 Mekanisme Pembentukan FAME Oleh Mikroba Lactobacillus
Plantarum dan Acetobacter aceti
Pembentukan Fatty Acid Methyl Ester (FAME) oleh mikroba dapat
terjadi karena adanya enzim SAM (S-adenosyl methionine) yang merupakan
enzim methyltranferase pada mikroba yang berfungsi sebagai pedonor metil
27
pada substrat asam lemak bebas (Sherkhanov et al., 2016). SAM (S-adenosyl
methionine) adalah kosubstrat umum yang terlibat dalam transfer gugus metil,
transsulfuration, dan aminopropylation (Cantoni, 1952). SAM terbuat dari
adenosin trifosfat (ATP) sebagai co-substrat dan metionin oleh methionine
adenosyltransferase. Telah dilaporkan SAM (S-Adenosyl methionine) pada
Lactobacillus plantarum ditemukan meningkat bersamaan dengan produksi
membran asam lemak siklopropana di bawah kondisi normal pertumbuhan
(Smith et al., 1980). Telah dilaporkan pula, produksi SAM diperoleh dengan
konsentrasi tinggi pada isolasi LAB (Lactobacillus) dalam produk kimchi
(Myung-ki Lee, 2008). Belum ada atau sangat sedikit penelitian mengenai
SAM pada acetobacter aceti. Tetapi secara umum pada mikroba, SAM terikat
oleh riboswitch SAM, yang mengatur gen yang terlibat dalam biosintesis
metionin atau sistein (Ding et al., 2015) sehingga tidak menutup kemungkinan
acetobacter aceti juga berperan pada pembuatan biodiesel FAME ini. Dengan
adanya enzim SAM pada penelitian yang telah dilaporkan sebelumnya dan
dengan adanya substrat asam lemak bebas terhidrolisis memungkinkan adanya
jalur biokonversi dengan reaksi sebagai berikut ini :
O O-
S+
O
OHHO
N
N
N N
NH2H2N
SAM
asam oleat
OHO
SO
OHHO
NN
N N
NH2H2N
SAH
asam oleat metil ester
OOH
O
O
Gambar 9. Reaksi Pembentukan Asam Lemak Metil Ester dari Asam Lemak
Oleh mikroba L. plantarum dan A. aceti
Pendonoran metil pada SAM terhadap asam lemak menghasilkan SAH
(S-adenosyl-L-homocysteine) dan FAME (Fatty Acid Methyl Ester)
(Sherkhanov et al., 2016). SAH (S-Adenosyl homocysteine) adalah pengatur
28
negatif yang kuat dari hampir semua metilase yang bergantung pada SAM.
SAH dihidrolisis menjadi homosistein dan adenosin oleh hidrolase S-
adenosylhomocysteine. Homosistein didaur ulang kembali ke metionin melalui
transfer gugus metil dari 5-metiltetrahidrofolat, oleh salah satu dari dua kelas
sintase metionin (yaitu tergantung kobalamin atau tidak tergantung kobalamin).
Metionin ini kemudian dapat diubah kembali menjadi SAM (Födinger M.,
2000).
S-Adenosyl methionine (SAM) adalah enzim yang terbentuk dari ATP
dan metionin (Van Keulen & Dyson, 2014). Metionin merupakan salah satu
asam amino esensial yang menjadi sumber utama dalam pembentukan SAM.
Semua mikroorganisme memiliki mekanisme untuk mengatur jumlah dan jenis
enzim sehingga hanya sejumlah tertentu asam amino yang dibutuhkan (Kumar
& Gomes, 2005). Metionin terdapat pada buah-buahan, daging (ayam, sapi,
ikan), susu (susu murni, beberapa jenis keju), sayuran (bayam, bawang putih,
jagung), serta kacang-kacangan (kapri, pistacio, kacang mete, kacang merah,
tahu tempe) (Andri et al., 2020). Pada penelitian ini, sumber metionin hanya
mengandalkan sumber protein yang terdapat pada media nutrien broth (NB).
Oleh karena itu kedepannya, perlu dikaji penambahan metionin murni atau
sumber protein lain dalam pembentukan SAM. Dengan penambahan metionin
ini dimungkinkan terbentuk SAM berlebih menjadikan semakin banyak
substrat asam lemak bebas yang termetilasi oleh SAM sehingga semakin
banyak pula biodiesel FAME yang dihasilkan. Hal lain yang juga perlu dikaji
setelah penelitian ini adalah banyaknya penambahan asam lemak bebas sebagai
substrat. Hal ini akan sejalan dengan perlakuan SAM berlebih dimana semakin
banyak substrat asam lemak bebas yang ditambahkan dan dengan adanya
perlakuan SAM berlebih maka akan diperoleh hasil biodiesel FAME yang
optimal .
29
BAB VI
PENUTUP
6.1 Kesimpulan
1. Metode fermentasi mikroba memiliki potensi yang besar dalam
mengkonversi asam lemak bebas terhidrolisis menjadi biodiesel secara
enzimatik menggunakan mikroba Lactobacillus plantarum dan Acetobacter
aceti dengan produk FAME (Fatty Acid Methyl Ester). Dengan cara
menghidrolisis minyak kedelai menjadi asam lemak bebas yang kemudian
dimetilasi oleh SAM (S-Adenosil Methionine) dalam mikroba yang bertindak
sebagai enzim methyltranferase sehingga terbentuk FAME.
2. Senyawa FAME (Fatty Acid Methyl Ester) didapatkan melalui proses
fermentasi secara one pot oleh mikroba Lactobacillus plantarum dan
Acetobacter aceti pada variasi waktu fermentasi 24 jam, 48 jam, 72 jam dengan
total % konversi dan kemurnian masing-masing sebesar 85,87%, 41,88%, dan
93,25%.
6.2 Saran
1. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan perlu adanya percobaan dengan
melakukan variasi jumlah mikroba yang digunakan saat fermentasi guna
mengetahui pengaruh terhadap produk fermentasi yang dihasilkan
2. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan perlu adanya pengadaan alat
dan bahan yang memadai terutama kesterilan di laboraturium terpadu UII agar
memperkecil terjadinya kontaminasi saat pertumbuhan mikroba maupun saat
fermentasi sehingga tidak terbentuk produk samping yang tidak diinginkan.
30
DAFTAR PUSTAKA
Andri, A., Harahap, R. P., & Tribudi, Y. A., 2020, Estimasi dan Validasi Asam
Amino Metionin, Lysin, dan Threonin dari Pakan Bijian Sebagai Sumber
Protein Nabati, Jurnal Nutrisi Ternak Tropis, 3(1), 18–22.
Badole, S. L., Patil, K. Y., & Rangari, V. D. 2015., Antihyperglycemic
Activity of Bioactive Compounds from Soybeans In Glucose Intake and
Utilization in Pre-Diabetes and Diabetes: Implications for Cardiovascular
Disease, Elsevier Inc.
Cantoni, G. L., 1952, The nature of the active methyl donor formed
enzymatically from l-methionine and adenosinetriphosphate. Journal of
the American Chemical Society, 74(11), 2942–2943.
Carey, F., Giuliano, R., 2011, Organic Chemistry, Edisi ke-8, McGraw-Hill,
Philadelphia.
Carballeira, J. D., Quezada, M. a, & Service, I. B., 2009, Industrial
Biotransformations Service, Madrid, Spa. 212–251.
Darmapatni, Komang. Ari.Gunapria., Basori, Achmad., dan Suaniti, Ni. Made.,
2016, Pengembangan Metode GC-MS Untuk Penetapan Kadar
Acetaminophen pada Specimen Rambut Manusia, Jurnal Biosains
Pascasarjana, Vol. 18.
de Carvalho, C. C. C. R., & da Fonseca, M. M. R., 2011, Biotransformations.
Comprehensive Biotechnology, Second Edition, 2, 451–460.
Ding, W., Smulan, L. J., Hou, N. S., Taubert, S., Watts, J. L., & Walker, A. K.,
2015, S-adenosylmethionine levels govern innate immunity through
distinct methylation-dependent pathways, Cell Metabolism, 22(4), 633–
645.
Edberg, S.C., 1992, Human health assessment:Acetobacter aceti, Unpublished,
U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C
Födinger M, Hörl W, Sunder-Plassmann G., 2000, Molecular biology of 5,10-
methylenetetrahydrofolate reductase, J Nephrol. 13 (1): 20–33.
31
Ginn, T.R., Hatch, T.J., McKone, T.E. & Rice, D.W., 2009, California
Biodiesel Multimedia Evaluation Tier I Report, University of California,
Davis and University of California, Berkeley.
Gomes, R. J., Borges, M. de F., Rosa, M. de F., Castro-Gómez, R. J. H., &
Spinosa, W. A., 2018, Acetic acid bacteria in the food industry:
Systematics, characteristics and applications, Food Technology and
Biotechnology, 56(2), 139–151.
Hardjo, S., N.S. Indrasi, dan T. Bantacut., 1989, Biokonversi : Pemanfaatan
Limbah Industri Pertanian. Bogor : Pusat Antar Universitas Pangan dan
Gizi IPB.
Homgren,J., Gosling, G., Marinangle R., Marker T., 2007, A New Development
in Renewable Fuels : Green Diesel, UOP.LLC, Des Palines, lilionis,
U.S.A.
Hommel, R. K., & Ahnert, P., 1999, ACETOBACTER, Encyclopedia of Food
Microbiology, 1–7.
Hou, C. T., & Shimada, Y., 2009, Lipases, Encyclopedia of Microbiology,
385–392.
Ketaren, S,. 2005, Minyak dan lemak pangan, Edisi Pertama, Jakarta : UI
Kemton, W. and S. Krabacher., 1987, Thermostat management: intensive
interviewing used to interpret instrumentation data, pp. 245-262 in W.
Kempton and M. Neiman (eds.) Energy Efficiency: Perspectives on
Individual Behavior. Washington, DC: Amer. Council for an Energy-
Efficient Economy.
Khopkar, S. M., 2010., Konsep Dasar Kimia Analitik, Jakarta: UI Press
Kim, I. Y., Suh, S. H., Lee, I. K., & Wolfe, R. R., 2016, Applications of stable,
nonradioactive isotope tracers in in vivo human metabolic research.
Experimental and Molecular Medicine, 48(1).
Kuan, I. C., Kao, W. C., Chen, C. L., & Yu, C. Y., 2018, Microbial biodiesel
production by direct transesterification of rhodotorula glutinis biomass.
Energies, 11(5).
Kumar, D., & Gomes, J., 2005, Methionine production by fermentation.
32
Biotechnology Advances, 23(1), 41–61.
Lennen, R. M., & Pfleger, B. F., 2013, Microbial production of fatty acid-
derived fuels and chemicals, Current Opinion in Biotechnology, 24(6),
1044–1053.
Lorenzo, J. M., Munekata, P. E., Dominguez, R., Pateiro, M., Saraiva, J. A., &
Franco, D., 2018, Main groups of microorganisms of relevance for food
safety and stability: General aspects and overall description. In Innovative
technologies for food preservation: Inactivation of spoilage and
pathogenic microorganisms, Elsevier Inc.
Mayo, B., & Flórez, A. B., 2020, Lactic Acid Bacteria: Lactobacillus spp.:
Lactobacillus plantarum, In Reference Module in Food Science. Elsevier.
Myung-ki, lee., Jong-Kyung, Lee., at all., 2008., S-Adenosyl-L-methionine
(SAM) production by lactic acid bacteria strains isolated from different
fermented kimchi products, Food Sci, Bioetechnol Vol. 17, No. 4
Patel, A., Karageorgou, D., Rova, E., Katapodis, P., Rova, U., Christakopoulos,
P., & Matsakas, L., 2020, An overview of potential oleaginous
microorganisms and their role in biodiesel and omega-3 fatty acid-based
industries. Microorganisms, 8(3), 1–39.
Prakash, A. 2002, Green Marketing, Public Policy And Managerial Strategies.
Business Strategy and the Environment 11.
Rocha, F. S., Gomes, A. J., Lunardi, C. N., Kaliaguine, S., & Patience, G. S.,
2018, Experimental methods in chemical engineering: Ultraviolet visible
spectroscopy—UV-Vis. Canadian Journal of Chemical Engineering,
96(12), 2512–2517.
Rohman, A. 2007, Kimia Farmasi Analisis, Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Romano, D., Contente, M., Granato, T., Remelli, W., Zambelli, P., & Molinari,
F., 2013, Biocatalytic oxidation of 1,4-diols and γ-lactols into γ-lactones:
Application to chemoenzymatic synthesis of drospirenone, Monatshefte
Fur Chemie, 144(5), 735–737.
Ruiz-Larrea, F., 2011, Applications of protective cultures and bacteriocins in
wine making In Protective Cultures, Antimicrobial Metabolites and
33
Bacteriophages for Food and Beverage Biopreservation, Woodhead
Publishing Limited.
Schröder, D., Golberg, N., Zummack, W., Schwars, H., Poutsma, J.C., Squires,
R.R., 1997, Generation of α-acetolactone and acetoxyl diradical
CH2COO in the gas phase, Internasional Journal of Mass Spectrometry
and Ion Processes, 165-166: 71-82.
Sherkhanov, S., Korman, T. P., Clarke, S. G., & Bowie, J. U., 2016, Production
of FAME biodiesel in E. coli by direct methylation with an insect enzyme,
Scientific Reports, 6(March), 1–10.
Shi, S., Valle-Rodríguez, J. O., Siewers, V., & Nielsen, J., 2011, Prospects for
microbial biodiesel production, Biotechnology Journal, 6(3), 277–285.
Silva, M. L., & Malcata, F. X.., 2000, Effect of time and temperature of
fermentation on the microflora of grape pomace, Bioprocess Engineering,
23(1), 17–24.
Skoog, D., Holler, T., and Nieman, F., 1998, Principles of Instrumental
Analysis, Edisi ke-5, Harcourt Brace, Philadelphia.
Smith, D. D., & Norton, S. J., 1980, S-Adenosylmethionine, cyclopropane fatty
acid synthase, and the production of lactobacillic acid in Lactobacillus
plantarum, Archives of Biochemistry and Biophysics, 205(2), 564–570.
Song, Chen., 2012, Green Oil Production by Hydroprocessing, International
Journal of Clean Coal and Energy, 1, 43-155.
Sparkman, O.D., Penton, Z.E. & Kitson, F.G., 2011, Gas Chromatography and
Mass Spectrometry : A Practical Guide, Second Edition, Academic
Press, Oxford.
Speight, J., 2018, Hidrólisis. Mecanismos de reacción en ingeniería ambiental.
203–229.
Speight, J. G., 2017, Industrial Organic Chemistry In Environmental Organic
Chemistry for Engineers.
Thomas, A. O., Leahy, M. C., Smith, J. W. N., & Spence, M. J., 2017, Natural
attenuation of fatty acid methyl esters (FAME) in soil and groundwater,
Quarterly Journal of Engineering Geology and Hydrogeology, 50(3),
34
301–317.
Toscano, G., & Duca, D., 2009, Renewable Energy Content of Fatty Acid
Methyl Esters (Fame) and Glycerol, Journal of Agricultural Engineering,
40(4), 47.
Van Keulen, G., & Dyson, P. J., 2014, Production of specialized metabolites by
streptomyces coelicolor A3(2) In Advances in Applied Microbiology (1st
ed., Vol. 89, Issue 2). Elsevier Inc.
Wadhawan, Jay. D., Marken, Frank., dan Richard, G. Compton., 2001,
Biphasic Sonoelectrosynthesis. A Review, Pure Appl Chem, Vol. 73, No.
12, pp. 1947-1955.
Wahlen, B. D., Morgan, M. R., McCurdy, A. T., Willis, R. M., Morgan, M. D.,
Dye, D. J., Bugbee, B., Wood, B. D., & Seefeldt, L. C., 2013, Biodiesel
from microalgae, yeast, and bacteria: Engine performance and exhaust
emissions, Energy and Fuels, 27(1), 220–228.
Wang, W., He, J., Pan, D., Wu, Z., Guo, Y., Zeng, X., & Lian, L., 2018,
Metabolomics analysis of Lactobacillus plantarum ATCC 14917 adhesion
activity under initial acid and alkali stress. PLoS ONE, 13(5), 1–16.
Willett J., 1987, Gas Chromatography. London: ACOL.
Zahriyah, S., 2009, Esterifikasi Asam Lemak Bebas Dalam Minyak Jelantah
Dengan Katalis TiO2/Montmorillonit dan Pengaruhnya Terhadap
Biodiesel yang dihasilkan, Depok, Skripsi FMIPA UNS.
35
LAMPIRAN 1. Perhitungan
1. Perhitungan penentuan nilai asam lemak bebas
𝐴𝐿𝐵 = 𝑉 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑥 𝑁 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑥 𝐵𝑀
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑥 1000𝑚𝑔
𝑔𝑟𝑎𝑚⁄ 𝑥 100 %
1.1 Normalitas NaOH
Vol hasil titrasi NaOH :
1 10,5 mL
2 10,2 mL
𝑁 𝑁𝑎𝑂𝐻 = 𝑉 𝑜𝑘𝑠 𝑥 𝑁 𝑜𝑘𝑠
𝑉 𝑁𝑎𝑂𝐻
= 10 𝑚𝐿 𝑥 0,1 𝑁
10,35 𝑚𝐿
= 0,096 N
1.2 Penentuan Persentase Asam Lemak Bebas pada Minyak Terhidrolisis
Volume hasil titrasi :
1 3,7 mL
2 2,2 mL
𝐴𝐿𝐵 = 2,95 𝑚𝐿 𝑥 0,096 𝑁 𝑥 280,447
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑜𝑙⁄
5 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑥 1000𝑚𝑔
𝑔𝑟𝑎𝑚⁄ 𝑥 100 %
= 1,58 %
1.3 Penentuan nilai asam lemak bebas pada minyak kedelai
Volume hasil titrasi :
1 1,8 mL
2 1,1 mL
36
𝐴𝐿𝐵 = 1,45 𝑚𝐿 𝑥 0,096 𝑁 𝑥 280,447
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑚𝑜𝑙⁄
5 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑥 1000𝑚𝑔
𝑔𝑟𝑎𝑚⁄ 𝑥 100 %
= 0,780 %
2. Perhitungan Metode McFarland
Skala 0,5 1 2 3 4
CFU
(x106/mL)
<300 300 600 900 1200
Absorbansi 0,153 0,302 0,521 0,656 0,852
Sampel LP 0,577
Sampel AA 0,586
Diketahui : Abs L. plantarum = 0,577
Abs A. aceti = 0.586
Faktor pengenceran A. aceti = 2x
y = 0,0006x + 0,1464
Dicari nilai x ?
y = 0,0006x + 0,1464
R² = 0,9958
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
abso
rban
si (
nm
)
CFU (x106/mL)
Abs vs CFU (x106/mL)
37
Jawab :
a. Konsentrasi L. plantarum
y = 0,0006x + 0,1464
𝑥 = 𝑦 − 0,1464
0,0006
𝑥 = 0,577 − 0,1464
0,0006
𝑥 = 717,67 x 106 CFU/mL
b. Konsentrasi a. aceti
y = 0,0006x + 0,1464
𝑥 = 𝑦 − 0,1464
0,0006
𝑥 = 0,586 − 0,1464
0,0006
𝑥 = 717,67 x 106 x 2 =
1465,33 CFU/mL
38
Lampiran 2. Dokumentasi Penelitian
2.1 Hasil Titrasi Penentuan Asam Lemak Bebas
2.2 Medium Nutrien Broth (NB)
39
1.5 Hasil Fermentasi
40
Lampiran 3. MS produk FAME (Fatty Acid Methyl Ester)
1. HASIL GC-MS T248
41
42
43
44
45
46
47
48
49
2. HASIL GC-MS T486
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
3. HASIL GC-MS T726
60
61
62
63
64
65