BIOLOGÍA EN AGRONOMÍA

Volumen 4, No. 2 Octubre de 2014

ISSN 1853-5216

Universidad Nacional de Catamarca

Secretaría de Ciencia y Tecnología ‐Editorial Científica Universitaria

ISSN: 1853-5216

DETERMINACIÓN DE DIVERSIDAD MICROBIANA Y ACTIVIDAD

BIOLÓGICA DE SUELOS DEL PARQUE NACIONAL LOS ALISOS,

TUCUMÁN-ARGENTINA. Estudio preliminar.

Marcolongo, Reynaldo1; Moisiuk, Alejandro Sergio2; Di Barbaro, María Gabriela3;

Andrada, Horacio3; Nieto, Maira Soledad 1y Batallán Morales, Silvana3.

1- Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Catamarca. 2- Parque

Nacional Los Alisos. 3- Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Catamarca. E-

mail: cortamarcolongo@yahoo.com.ar; gabydibarbaro@yahoo.com.ar

Recibido: 19/10/2014 Aceptado: 31/10/2014

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RESUMEN

El Parque Nacional Los Alisos se encuentra en la provincia de Tucumán,

Argentina y tiene una extensión de 10.661ha. Comprende una diversidad de

ambientes que están comprendidos entre los 1.000 y los 3.000 msnm. Fue creado en

el año 1995 y este es el primer estudio que tiene como objetivo conocer la diversidad

microbiana y evaluar la actividad de biológica del suelo de diferentes sitios del Parque

Nacional Los Alisos.

Se establecieron ocho puntos de muestreos abarcando las zonas de las

Mesadas a 1.700 msnm, de los Chorizos a 1.100 msnm y zonas bajas del Parque

850msnm, desde el Río Las Pavas, el Arroyo Hondo y el Río La Jaya.

Para investigar la presencia de grupos fisiológicos microbianos a partir de

elución de biofilm y examen microscópico directo se enterraron en cada punto de

muestreo 20 portaobjetos a dos profundidades (0-15 cm y de 15 a 30 cm) y se

tomaron muestras de suelo con las cuales se determinó la actividad biológica total

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mediante el método de hidrólisis del diacetato de fluoresceína. Se registraron

diferencias en el nivel de Actividad Biológica Total en los diferentes sitios. Estas

diferencias que se pueden atribuir a la exposición solar, a la acción del viento, el

contenido de humedad, temperatura y vegetación presente.

Este es un estudio preliminar que sentará las bases del conocimiento de la

biodiversidad microbiana en diferentes ambientes del Parque Nacional Los Alisos.

PALABRAS CLAVES: Parque Nacional Los Alisos; Diversidad microbiana; Suelo;

Actividad biológica.

DETERMINATION OF MICROBIAL DIVERSITY AND BIOLOGICAL ACTIVITY

OF SOILS OF NATIONAL PARK LOS ALISOS, TUCUMÁN-ARGENTINA.

Preliminary study.

SUMMARY

The National Park Los Alisos is located in the province of Tucumán, Argentina

and covers an area of 10.661ha. Includes a variety of environments that are between

1.000 and 3.000 msnm. It was created in 1995 and this is the first study that aims to

determine the microbial diversity and evaluate soil biological activity of different parts of

National Park Los Alisos.

Eight points of sampling covering the areas of countertops to 1.700 msnm, the

sausages to 1.100 msnm and lower areas of the park 850msnm from the Rio Las

Pavas, the Arroyo Hondo and River La Jaya.

To investigate the presence of microbial physiological groups of elution of biofilm

and direct microscopic examination were buried in each sampling point 20 slides at two

depths (0-15 cm and 15-30 cm) soil samples were taken with the the total biological

activity which was determined by the method of hydrolysis of fluorescein diacetate.

Differences in the level of Biological Activity Total in different sites were recorded.

These differences can be attributed to solar exposure to the wind, the moisture content,

temperature and vegetation present.

This is a preliminary study will lay the foundation of knowledge of microbial

biodiversity in different environments National Park Los Alisos.

KEY WORDS: National Park Los Alisos; Microbial diversity; Soil; Biological activity.

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INTRODUCCIÓN

Los microorganismos edáficos se distribuyen en el suelo de manera no

homogénea ocupando microhábitats producidos en los poros de las partículas del

suelo. Por consiguiente, los resultados de los estudios de microbiología del suelo

representan los promedios de los efectos de los microorganismos que ocupan los

diferentes microhábitats (Cardoso, 1992).

Los microorganismos del suelo pueden estudiarse utilizando una batería de

procedimientos de microbiología clásica que comprenden procesos de enriquecimiento

para facilitar la detección de microorganismos poco frecuentes, sistemas de

enumeración directa realizando preparaciones microscópicas de cantidades conocidas

de suelo que se tiñen con colorantes o agentes fluorescentes específicos, técnicas de

siembra en masa, determinación del número más probable, determinación de

coliformes y cualquier otro método clásico. Por otra parte, resulta útil la determinación

de substancias de grupos específicos. Es también relevante el estudio de la

distribución de los microorganismos en el suelo tomando muestras a diferentes niveles

(Carrillo, 2003; Frioni, 2011; Camacho Garrido, 2012).

Los estudios preliminares realizados permiten realizar predicciones simples

sobre las dinámicas de las poblaciones microbianas del suelo y sobre su influencia en

los procesos de descomposición de material orgánico.

Para estudiar la ocurrencia y desarrollo de los microorganismos en el suelo se

puede recurrir a diferentes métodos. Algunos de ellos se basan por examen directo, tal

como el de “determinación de la forma y ordenamiento de los microorganismos in situ

u observación microscópica directa”. Este tipo de estudios permite establecer la

distribución de los microorganismos en relación con los agregados de suelo, partículas

de materia orgánica, raíces de las plantas. Uno de los métodos más antiguos consiste

en la introducción de un portaobjeto en la tierra (solo o con un film de nutrientes) y su

posterior observación con microscopio, previa tinción con colorantes adecuados

(ácidos, anticuerpos fluorescentes) (Frioni, 2011; Camacho Garrido, 2012).

Cuando se estudia microscópicamente un suelo puede observarse una gran

cantidad de formas microbianas que luego no aparecen en los cultivos finales. Cuando

los microorganismos son claramente identificables mediante microscopía gracias a

tinciones diferenciales o a morfologías características dichos microorganismos pueden

ser estudiados in situ; sin embargo, en la mayoría de los casos las variaciones

morfológicas son demasiado leves para que los diferentes grupos sean identificables y

su estudio individualizado no es factible (Frioni, 2006; Camacho Garrido, 2012).

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Entre los métodos de estudio de los microorganismos del suelo por examen

indirecto se encuentran los de “determinación de Actividad biológica global”. Los

cuales consisten en técnicas comparativas que evalúan la actividad de las poblaciones

microbianas en su conjunto. Las actividades de los microorganismos que se miden son

metabólicas y enzimáticas.

Las actividades de los microorganismos requieren la participación de un conjunto

de enzimas; la actividad de una de ellas, bien escogida, puede reflejar la actividad

biológica global. La evaluación de las actividades enzimáticas en el suelo ha sido muy

diversa dependiendo del objetivo del estudio. Existen numerosos trabajos en los que

se ha medido: actividad sacarolítica, amilolítica, lipolítica, celulolítica, lignolítica, etc.

Otras enzimas que pueden cuantificarse son la ureasa, proteasa, fosfatasa,

deshidrogenasa. La cuantificación de esta última enzima es una medida indirecta de la

actividad respiratoria de un suelo (Carrillo, 2003; Frioni, 2011; Camacho Garrido,

2012).

La determinación de la actividad biológica total por el método de hidrólisis del

diacetato de fluoresceína (FDA) es una de las metodologías usadas para evaluar la

actividad microbiana en el suelo es la Hidrólisis de Diacetato de Fluoresceína; este

compuesto es susceptible de ser hidrolizado por varias enzimas (estearasas, lipasas y

proteasas) de las células vivas. La fluoresceína permanece en la célula causando

fluorescencia intracelular que puede ser visualizada por microscopía de fluorescencia

y/o cuantificada por espectofotometría (Schnürer and Roswall, 1982; Frioni, 2011).

En los estudios microbiológicos se puede determinar los Grupos funcionales o

fisiológicos del suelo, es decir al conjunto de microorganismos que en el suelo

cumplen una determinada función (nicho ecológico) aunque se diferencien

taxonómicamente. Para su determinación se emplean medios selectivos. Hay ciertos

grupos fisiológicos que no se desarrollan formando colonias visibles sobre un medio

sólido. Su presencia se determina crecimiento y por modificación de las características

del medio donde se cultiva. Uno de los más importantes grupos fisiológicos lo

constituyen los microorganismos fijadores libres de nitrógeno (no simbiótico), debido a

que son la fuente primaria del suministro de nitrógeno a las plantas. Son fijadores del

nitrógeno atmosférico. Algunas bacterias, actinomicetos y algas verde azules

(cianofíceas) reducen el nitrógeno atmosférico a nitrógeno amoniacal y lo incorporan al

suelo. Entre los géneros de bacterias aerobias nitrofijadoras están Azotobacter,

Azospirillum, Beijerinckia, Derxia y Azomonas (Cardoso, 1992; Carrillo, 2003; Frioni,

2011; Camacho Garrido, 2012).

La mayor actividad de las fijadoras de N2 se alcanza con una humedad

adecuada en el suelo y con una fuente de carbono accesible como el material vegetal

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en descomposición (pajas, hojas o subproductos de cosecha). Por esto siempre están

acompañadas por bacterias celulolíticas. Necesitan de alcoholes, azúcares o ácidos

orgánicos que se los suministran otros microorganismos degradadores. El desarrollo

de las fijadoras libres se estimula con las exudaciones que emite la planta cuando se

encuentra bien nutrida (Frioni, 2011; Camacho Garrido, 2012).

El Parque Nacional Los Alisos fue creado en 9 de agosto de 1995 y se encuentra

ubicado al oeste de la localidad de Alpachiri en la provincia de Tucumán, Argentina.

Tiene una extensión de 10.661ha. Comprende una diversidad de ambientes, desde

selva de las Yungas hasta Puna, que están comprendidos entre los 1.000 y los 3.000

metros sobre el nivel del mar. Desde la Administración de Parques Nacionales y el

Parque Nacional Campo de Los Alisos se quiere incentivar la investigación en las

Aéreas Protegidas y han permitido la realización de este trabajo siendo el primer

estudio de biodiversidad microbiana realizado en el mismo.

El objetivo de este trabajo fue conocer la diversidad microbiana y evaluar la

actividad de biológica del suelo de diferentes sitios del Parque Nacional Los Alisos.

Este es un estudio preliminar que sentará las bases del conocimiento de la

biodiversidad microbiana en diferentes ambientes del Parque Nacional Los Alisos.

MATERIAL Y MÉTODO

El trabajo de campo se realizó en el Parque Nacional Los Alisos. Se

establecieron nueve puntos de muestreos abarcando las siguientes zonas: La Mesada

a 1.700 msnm, Los Chorizos a 1.100 msnm y zonas bajas del Parque a 850 msnm,

desde el Río Las Pavas, el Arroyo Hondo y el Río La Jaya; y un punto de muestreo

comparativo fuera del Parque (Punto 10: Río Gastona) (Figura 1; Fotos 4 a 13). Para

conocer la diversidad microbiana se investigó la presencia de poblaciones microbianas

a partir del examen microscópico directo, para lo cual se enterraron en cada punto de

muestreo 20 portaobjetos a dos profundidades (0-15 cm y de 15 a 30 cm) por un mes

y se tomaron los puntos de muestreos con GPS (Fotos 1, 2 y 3), y transcurrido el mes

se extrajeron portaobjetos de cada estación de muestreo y con los cuales se realizó la

tinción de Gram Nicolle (Fotos 14 y 15).

Se tomaron muestras de suelo en cada punto de muestreo para los estudios de

actividad biológica y de presencia de microorganismos fijadores libres del nitrógeno

atmosférico. Se determinó la actividad biológica total mediante el método de hidrólisis

del diacetato de fluoresceína (Schnürer and Roswall, 1982) (Fotos 16 a 21). La

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determinación del grupo funcional de fijadores libres de N2 se realizó de la siguiente

forma:

- En forma aséptica, se sembró suelo con ansa en frascos que contenían medio NFb

semisólido y se incubó a 36 ºC (Fotos 22 y 23).

- Después de 2, 3 ó 5 días se observa "velo" y alcalinización del medio, tomándose la

presencia de fijadores libres de N2 como positivo cuando existen alguna de estas dos

características.

FIGURA 1: Ubicación del Parque Nacional Los Alisos, donde se marcan los puntos de

muestreos.

FOTOS 1, 2 y 3: Introducción en el suelo de portaobjetos para examen microscópico

directo y medición de coordenadas con GPS en los puntos de muestreos.

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FOTO 4: La Jaya (850 msnm). Parque Nacional Los Alisos, Tucumán, Argentina.

FOTO 5: Bosque de alisos en el lecho del río Las Pavas. Parque Nacional Los Alisos,

Tucumán, Argentina.

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FOTO 6: Río Las Pavas (1400 msnm). Parque Nacional Los Alisos, Tucumán,

Argentina.

FOTO 7: Arroyo Hondo zona de La Mesada (1.700 msnm). Parque Nacional Los

Alisos, Tucumán, Argentina.

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FOTO 8: Puesto La Mesada (1.700 msnm). Parque Nacional Los Alisos, Tucumán,

Argentina.

FOTO 9: Río Las Pavas a la altura de La Mesada (1.700 msnm). Parque Nacional Los

Alisos, Tucumán, Argentina.

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FOTO 10: Pluviómetro en Las Mesadas (1.700 msnm). Parque Nacional Los Alisos,

Tucumán, Argentina.

FOTO 11: Cuenca del río Las Pavas (1.400 msnm). Parque Nacional Los Alisos,

Tucumán, Argentina.

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FOTO 12: Refugio Los Chorizos (1.100 msnm). Parque Nacional Los Alisos, Tucumán,

Argentina.

FOTO 13: Bosque de pino del Cerro, zona de Las Mesadas (1700m).

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FOTOS 14 y 15: Tinción de Gram Nicolle de los portaobjetos enterrados en los

distintos puntos de muestreo.

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FOTOS 16, 17, 18, 19, 20 y 21: Determinación de la Actividad biológica total dde

suelos por el método de hidrólisis del diacetato de fluoresceína.

FOTOS 22 y 23: Siembras de suelo en frascos con medio NFB para la determinación

de microorganismos fijadores libres de N2.

RESULTADOS

En la tabla 1 se muestran los resultados del examen microscópico directo de las

comunidades microbiana presentes en los portaobjetos enterrados en el suelo de los

diferentes puntos de muestreos del Parque Nacional Los Alisos.

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TABLA 1: Diversidad microbiana en diversos puntos de muestreo del Parque Nacional

Los Alisos.

Comunidades microbianas presentes en los puntos de muestreo

Punto 1: La Jaya

Bacterias: Cocos G+, bacilos y bacilococos G-. Bacilos grandes con gránulos polares

Punto 2: Las Pavas (830msnm)

Bacterias: Cocos G+ y G-, bacilos y bacilococos G-. Hongos: Con hifas no tabicadas.

Punto 3: Las Pavas- vertiente.

Bacterias: Cocos y bacilococos G+ productores de biofilm. Hongos de hifas no tabicadas

Punto 4: Arroyo Hondo-

Mesadas (1.700 msnm)

Bacterias: Cocos y bacilococos G+, Bacilos G-. Hongos de hifas no tabicadas. Biofilm

Punto 5: Toma de agua- La Mesada.

Bacterias: Cocos G+. Bacilos, bacilococos y espirilos G-. Hongos de hifas no tabicadas y ramificadas.

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Punto 6: Las Pavas.

Bacterias: Cocos y bacilos largos G+. Cocos, bacilos y filamentosas G-.

Punto 7: Pluviómetro- La Mesada (1.780 msnm) Bacterias: Cocos y micrococos G+. Bacilos G-. Hongos no tabicados. Biofilm.

Punto 8: Las Pavas.

Bacterias: Cocos G+. Bacilos y cocos G-.

Punto 9: Los Chorizos. Bacterias: Cocos y bacilococos G+. Microorganismos productores de biofilm

Los resultados de los análisis de actividad biológica total por el método de

hidrólisis del diacetato de fluoresceína de los suelos procedentes de los distintos sitios

de muestreo del Parque Nacional Los Alisos se muestran en la tabla 2. Observándose

diferentes niveles de actividad biológica en los punto de muestreo.

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TABLA 2: Actividad biológica total por hidrólisis del diacetato de fluoresceína.

Punto de muestreo Absorbancia FDA metabolizado

Actividad Biológica

Total

Punto 1: La Jaya 0,024 0,0025 BAJA

Punto 2: Las Pavas (830msnm)

0,204 0,0265 BAJA

Punto 3: Las Pavas- vertiente

0,248 0,032 BAJA

Punto 4: Arroyo Hondo- Mesadas (1.700 msnm)

0,405 0,058 MEDIA

Punto 5: Toma de agua-Mesadas

1,799 >0,2 ALTA

Punto 6: Las Pavas 1,146 >0,2 ALTA

Punto 7: Pluviómetro- Mesada (1.780 msnm)

1,891 >0,2 ALTA

Punto 8: Las Pavas 0,171 0,2 ALTA

Punto 9: Los Chorizos 0,629 0,08 MEDIA

Punto 10: Río Gastona 0,075 0,096 MEDIA

Los resultados de la determinación del grupo fisiológico microbiano de fijadores

libres del nitrógeno atmosférico se presentan en la tabla 3. Se determinó presencia de

este grupo de diazótrofos microbianos en todos los sitios de estudio del Parque

Nacional Los Alisos. La presencia de microorganismos fijadores libres de N2 se

evidencia por viraje del color del medio de cultivo de verde a azul (Fotos 24, 25 y 26).

FOTOS 24, 25 y 26: Determinación de la presencia de microorganismos fijadores

libres de N2 del suelo de diversos puntos de muestreo del Parque Nacional Los Alisos.

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TABLA 3: Fijadores libres del nitrógeno atmosférico en diversos puntos de muestreo

del Parque Nacional Los Alisos.

Punto de muestreo Valoración por repetición

Presencia de Fijadores

libres de N2

Punto 1: La Jaya + + + Presente

Punto 2: Las Pavas (830msnm) + + + Presente

Punto 3: Las Pavas- vertiente - + + Presente

Punto 4: Arroyo Hondo- Mesadas + + - Presente

Punto 5: Toma de agua-Mesadas + + + Presente

Punto 6: Las Pavas + + + Presente

Punto 7: Pluviómetro- Mesada + + + Presente

Punto 8: Las Pavas + + + Presente

Punto 9: Chorizos + + + Presente

Punto 10: Río Gastona + + + Presente

CONCLUSIÓN

Se determinó la presencia de comunidades microbianas muy complejas y

diferenciadas entre las distintas zonas estudiadas. El conocimiento de la biodiversidad

microbiana y el análisis de la actividad biológica representan contribuciones

importantes para gestionar estrategias adecuadas de conservación y además de

permitir obtener información sobre los procesos de deterioro que afectan a estas

zonas y la monitorización del estado de conservación de las mismas en escalas

espacio-temporales.

BIBLIOGRAFÍA

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