biologÍa(del(hepatocitoww2.aeeh.es/wp-content/uploads/2016/12/aeehpresentacionmlmc… · maría...
TRANSCRIPT
María Luz Martínez [email protected]
Group Leader Liver Disease LaboratoryCICbioGUNE
Technological Park of Bizkaia
BIOLOGÍA DEL HEPATOCITO
BIOLOGÍA DEL HEPATOCITO
GENERALIDADES DEL HIGADO
ORGANIZACION DEL HIGADO
HISTOLOGIA HEPÁTICA
HISTOLOGIA HEPATICASe presentan dos componentes:
Estroma. Constituido por tejido conectivo que sirve de soporte. Esta dado por la capsula de Glisson que se introduce a nivel de hilio y se ramifica hasta alcanzar el espacio porta.
Parenquima. Constituido por células epiteliales especializada, los hepatocitos, que son células poligonales dispuestas en cordones de una a dos células tejido llamadas columnas de hepatocitos.
Entre las columnas y cordones hay capilares sinusoidales cuya pared esta recubierta por endotelio y macrofagos (células de Kuppfer)
Entre el capilar y la columna se encuentra el Espacio de Disse (espacio perisinusoidal) que es el sitio de intercambio entre la sangre y el hepatocito y donde se encuentran las células de ito o estelares que almacenan Vitamina A
Células de Kupffer
-Núcleo grande y pálido-Citoplasma abundante-Origen médula ósea-Macrófagos anclados al Espacio de Disse-Su función principal es metabolizar Hematíes viejos, digerir hemoglobina, secretar proteínas y digerir bacterias
EL HEPATOCITO
FUNCIONES del HEPATOCITO
FUNCIONES METABOLICAS DEL HÍGADO
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO
METABOLISMO DE LIPIDOS
METABOLISMO DE PROTEÍNAS
ALMACENAMIENTO DE VITAMINAS Y MINERALES
ACTIVACIÓN DE LA VITAMINA D
EXCRECCIÓN DE BILIRRUBINA
PROCESAMIENTO DE FARMACOS Y HORMONAS
• Aislamiento de Hepatocitos primarios de ratón y de rata como modelo de experimentación animal en investigación básica
• Trasplante celular hepático. Aproximación Clínica
• Testado de Drogas e Hígados Artificiales. Aproximación Industrial y Clínica
EMPLEO DE HEPATOCITOSEN EXPERIMENTACION BASICA Y CLÍNICA
• El trasplante celular hepático (TCH) se basa en el empleo de células hepáticas adultas, hepatocitos humanos, viables y metabólicamente funcionales provenientes de órganos desechados para trasplante convencional.
• El TCH consta de 3 pasos: el aislamiento del hepatocito del hígado no válido para trasplante hepático, la preparación de las suspensiones celulares y, finalmente, su implante en el receptor.
• La obtención de los hepatocitos se realiza mediante digestión hepática con colagenasa a 37°C. Tras el aislamiento, las células pueden congelarse o administrarse en fresco. La criopreservación permite realizar el procedimiento de forma programada.
• Los aspectos clave del implante celular son la vía de infusión, el número de células por infundir, el número de infusiones y la viabilidad celular. La implantación es mediante catéter para infusión en la vena porta o la arteria esplénica.
TERAPIA CELULAR. APROXIMACIÓN CLÍNICA
. La perfusión enzimática se realiza previa canulación de la arteria hepática y la vena porta del tejido hepático desechado. Se perfunde primero un lóbulo y luego el otro
.La digestión enzimática consta de 2 etapas: una primera etapa de perfusión no recirculante:Krebs-‐Ringer exenta de calcio, pero que contiene EGTA y; una segunda etapa de perfusión recirculante: solución salina sin EGTA y contiene 5mmol de Cl2Ca y el 0,05% de colagenasa para conseguir la digestión completa del parénquima hepático.
Se procede a la disgregación mecánica del tejido hepático para obtener una suspensión de hepatocitos.
Esta suspensión celular se lava varias veces, se centrifuga, y se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular.
Finalmente, se determina la viabilidad mediante el colorante azul de tripán,
AISLAMIENTO DEL HEPATOCITO
Los hepatocitos aislados se resuspendenen el medio de infusión adecuado para trasplantarse en fresco o en el medio de congelación si se crioconservan para utilizarse.
Se remiten muestras para estudio microbiológico a fin de descartar cualquier contaminación en el proceso de obtención celular, con adición de antibióticos de forma profiláctica
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN CELULAR
El trasplante celular requiere la infusión de los hepatocitos humanos en suspensión en un período que oscila entre minutos y horas
La composición del medio se basa en un buffer de proteínas plasmáticas con agentes anticoagulantes y glucosa. La adición de N-acetil-cisteína ha demostrado que disminuye el estrés oxidativo y disminuye la apoptosis
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN CELULAR
Control de calidad funcional de los hepatocitos que se realiza mediante la determinación de la actividad de 5 isoenzimas del citocromo P450 (CYP1A2, CYP2A6, CYP3A4, CYP2C9 y CYP2E1) y enzimas de conjugación de fase ii (UGT y SULT).
. Se determina su capacidad ureogénica mediante la medición de la conversión de amonio en urea.
CONTROL DE LA CALIDAD CELULAR
• Takanori Takebe (Nature 2013) describen por primera vez la formación de un tejido humano hepático a partir de cultivos de células madre potenciales inducidas (iPS)
TESTADO DE DROGAS E HÍGADOS ARTIFICIALES
TESTADO DE DROGAS E HÍGADOS ARTIFICIALES
Estan disponibles los primeros hígados artificiales construidos con ayuda de una impresora 3D.
El órgano artificial no cuenta con el tamaño de un hígado normal, sino que únicamente mide unos pocos milímetros, pero su función no es servir para trasplantes, sino ayudar a la investigación médica determinando el impacto de la toxicidad de drogas y empleándose como modelo de daño hepático.
TESTADO DE DROGAS E HÍGADOS ARTIFICALES
La “descelularización” consiste en eliminar todas las células de un órgano(por ejemplo un hígado), preservando los componentes de la matrizextracelular y los vasos sanguíneos para, posteriormente, repoblar laestructura con células del pacienteque va a recibir el trasplante.