BIOLOGÍA CELULAR

4º CURSO DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA

Alumno: Iago Molist Pérez

Profesora: Mª Celina Rodicio Rodicio

Curso 2009 / 2010

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TEMA 1 COMPARTIMENTACIÓN CELULAR

Las células eucariotas están compartimentadas: tienen distintos compartimentos,

limitados o no por membranas, en los que tienen lugar reacciones específicas. La compartimentación permite así un mayor grado de especialización y complejidad.

Como estructuras no limitadas por membranas, la célula cuenta con ribosomas (ya conocidos) y proteosomas. Los proteosomas son complejos proteicos con forma de barril donde se degradan las proteínas: las proteínas que se van a degradar lo atraviesan, liberándose distintos péptidos por el otro extremo. La señal de degradación es la poliubiquitinación; y esa misma señal es la que reciben las ciclinas (implicadas en la formación del dímero ciclina-quinasa dependiente de ciclina del ciclo celular) para su degradación en el proteosoma.

Como estructuras limitadas por membranas, la célula cuenta con orgánulos separados por una doble membrana (mitocondria y cloroplastos) y con orgánulos separados por una membrana sencilla (lisosomas, retículo endoplasmático [RE], aparato de Golgi [AG], vacuola vegetal, envuelta nuclear [dependiente del RE] y peroxisomas). De todos estos orgánulos con membrana sencilla, todos excepto los peroxisomas están relacionados entre sí por vesículas y transporte vesicular con la membrana plasmática [MP]. Así, el conjunto de estos orgánulos, que derivan evolutivamente de invaginaciones de la MP, se conoce como sistema de endomembranas.

Mitocondrias y cloroplastos derivan de endosimbiosis, por lo que no forman parte del sistema de endomembranas; de los peroxisomas, no se sabe si incluirlos o no en dicho sistema debido a que su biogénesis tiene características de mitocondrias y cloroplastos, pero su origen parece estar en el RE.

Así, los peroxisomas crecen y se dividen como las mitocondrias y los cloroplastos (es una similitud) pero, en tanto que estos dos últimos orgánulos importan la mayor parte de sus proteínas del citosol (se sintetizan en ribosomas citosólicos libres y se importan postraduccionalmente), los peroxisomas deben importar absolutamente todas sus proteínas de la misma forma que mitocondrias y

cloroplastos, debido a que carecen de un sistema genético completo (es una diferencia). Asimismo, en este siglo se descubrió que los peroxisomas, además de crecer y dividirse, también pueden crearse de novo a partir de vesículas de una región especial del RE que contienen un tipo de proteínas peroxisomales (peroxinas tempranas), que son la maquinaria incluida en la membrana del peroxisoma que luego empleará para importar el resto de proteínas peroxisomales, que se sintetizarán en ribosomas citosólicos libres.

Se distinguen tres tipos de ribosomas: mitocondriales, cloroplásticos y citosólicos. Dentro de estos últimos, se distinguen dos poblaciones: los ribosomas que

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siempre se encuentran libres en el citosol durante la síntesis proteica y los ribosomas que terminan la síntesis proteica asociados al RE (formando así el RER).

Así, hasta ahora se ha estudiado la síntesis y tráfico de vesículas con un contenido proteico; sin embargo, en el caso de los carbohidratos, éstos se transportan unidos a lípidos o proteínas, produciéndose las glicosilaciones a nivel del AG (la mayoría de las veces, como el proteoglucano) o la MP (como la síntesis de celulosa o de ácido hialurónico). La síntesis lipídica se produce entre el RE y el AG: todos los lípidos comienzan su síntesis en el RE, pero algunos la terminan en el AG. Los peroxisomas, así como algunos plastos, también producen lípidos. Puede haber también gotas de grasa en el citosol.

• Compartimentos relacionados por transporte vesicular.

Las vías son fundamentalmente unidireccionales (aunque también las hay bidireccionales); pero incluso aunque sean unidireccionales hay procesos de reciclaje para devolver al compartimento anterior la maquinaria que ha participado en el transporte.

El transporte vesicular se define como la actividad celular responsable del transporte de moléculas incluidas en vesículas. Se habla de vesículas, pero es una expresión muy simplificada: se debería hablar de estructuras vesículo-tubulares. Muchos orgánulos (como los endosomas) y estructuras tienen esa forma, con una porción vesicular y otra tubular.

Si pudiesen formarse vesículas en cualquier lugar celular y viajar igualmente a cualquier lugar, todos los componentes celulares terminarían teniendo el mismo tamaño. Esto no ocurre porque las vesículas contienen moléculas específicas; y tanto en la membrana vesicular como la de la superficie de destino hay moléculas específicas de reconocimiento y unión. Así, se está creando orden al llevar cada vesícula a su sitio; y por la segunda ley de la termodinámica, para crear orden debe haber un gasto energético. De esta forma, el transporte vesicular conlleva un gasto energético.

A igual superficie celular, el volumen de la vesícula es mucho mayor que el de un túbulo; así, una vesícula se empleará para llevar muchas moléculas solubles y pocas de membrana; mientras que un túbulo se empleará para llevar muchas moléculas de membrana y pocas solubles. Las estructuras vesículo-tubulares tendrán así una parte tubular enriquecida en materiales de membrana y otra parte tubular enriquecida en materiales solubles. Se emplea el término material o molécula porque en las vesículas y los túbulos puede haber proteínas, glúcidos o lípidos.

• Formación de vesículas de transporte y selección de la carga que va en ellas.

Las vesículas de transporte se caracterizan por lo que se conoce como su cubierta. La cubierta se trata de complejos que se asocian a la membrana de la vesícula por su lado citosólico. Son complejos como la clatrina, dos tipos de complejos de cubierta COP1 y COP2, el retrómero y la caveolina. La función de la cubierta es así la selección de la carga y la formación de la vesícula de transporte.

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Una proteína puede pasar de un estado fosforilado a otro desfosforilado y viceversa, aunque no siempre el estado activo es el fosforilado.

En la formación de las cubiertas intervienen varios componentes: proteínas G, fosfoinositoles, proteínas de la cubierta propiamente dicha, adaptadores, diamina (y sus proteínas auxiliares, donde también está implicada la actina). Puede que no en todos los procesos intervengan todos estos componentes.

Las proteínas G son un tipo de proteínas de unión a GTP. Son proteínas reguladoras que se pueden considerar como interruptores celulares, porque alternan entre un estado inactivo GDP-enlazado y un estado activo GTP-enlazado: el paso entre uno u otro estado activa o inactiva la proteína.

El paso de GDP → GTP (activación) se debe a la enzima GEF (factor intercambiador de nucleótidos de guanina). El paso de GTP → GDP se debe a la enzima GAP (proteína con actividad GTPasa): hidroliza el GTP. Hay dos tipos de proteínas G: monoméricas (formadas por una sola subunidad) y triméricas (formadas por tres subunidades). Las implicadas en el transporte son las monoméricas, y destacan las proteínas Arf y Sar1p.

Su función es la regulación espaciotemporal del transporte vesicular: indican en qué momento y lugar ocurrirá el transporte. La forma unida a GDP (inactiva) está enlazada a la membrana: al activarse la proteína, ésta es capaz de activar vesículas de transporte y sus elementos.

Las proteínas de unión a GTP (monoméricas) indican también los lugares donde va a tener lugar la formación de la vesícula; en esto es fundamental el fosfatidilinositol y los fosfoinositidos, que sustituyen los grupos –OH del inositol por grupos fosfato. Como hay muchos –OH distintos que se pueden sustituir, hay muchos fosfoinositidos distintos. Existen además muchas enzimas que quitan y ponen grupos fosfato, transformando unos fosfoinositidos en otros. Así, la distribución de fosfoinositidos es distinta en distintos lugares de la célula: tienen una distribución específica en las membranas.

La posición de los grupos fosfato en el inositol varía en los fosfoinositidos, y

gran cantidad de proteínas pueden enlazar específicamente estos grupos polares; por lo que la distinta distribución de los fosfoinositidos en la membrana permite que se puedan enlazar distintas proteínas en diferentes lugares de la célula. También intervienen rutas

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de transducción de señales, participando en la localización y momento de formación de las moléculas de transporte.

• Formación de las vesículas de clatrina.

Fue el primer tipo de cubierta que se descubrió. Está formada por 6 cadenas: 3 pesadas y 3 ligeras, formando una estructura con tres puntas denominada trisquelión. Tiene un diseño modular, y estas moléculas se pueden autoensamblar, formando poliedros de caras pentagonales o hexagonales.

Si polimeriza cerca de una membrana, proporciona la fuerza para su

invaginación y la formación de vesículas. La clatrina sólo está implicada en endocitosis, ya que la vesícula pierde su cubierta de clatrina al fusionarse con la membrana

Para unirse a la membrana, la clatrina necesita unos adaptadores o adaptivas. Hay al menos cuatro adaptadores, formados por cuatro subunidades α, β o β’, γ y δ; así como dos polipéptidos, uno mayor µ y otro menor σ.

Hay regiones flexibles que permiten la adaptabilidad de las moléculas; según el adaptador se permite la unión de la clatrina. La unión adaptador-proteína de membrana es muy específica, siendo así responsable de la selección de la carga. Algunas son proteínas transmembrana; otras son receptores de membrana que seleccionan la carga soluble.

Los adaptadores interaccionan con las proteínas de membrana por medio de regiones reconocidas específicamente por el adaptador: son áreas señal, formadas por pequeñas regiones alejadas en la cadena polipeptídica (péptidos señal) que constituyen el área señal al plegarse en su estructura tridimiensional.

- GGAS: Es un adaptador descubierto, se ha comprobado que a veces trabajan solos y a veces trabajan en cooperación con otros adaptadores.

- Ad1: Reconoce la señal de Tyr (cuatro aminoácidos en un giro β-reverso). En la red de trans Golgi, selecciona la carga para ir a los endosomas. Selecciona los receptores de manosa 6-fosfato que llevan unidos los proenzimas lisosomales. Las proteínas de la membrana lisosomal llevan la señal dileucina (dos Leu consecutivas o muy próximas), y también van de la red de trans Golgi a los endosomas; y de ahí a los lisosomas. Puede funcionar solo o acompañado de los GGAS.

- Ad2: Media la endocitosis; la señal es la misma que la anterior, basada en Tyr.

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- Ad4: También utiliza la señal de Tyr. En células polarizadas como enterocitos, con regiones apical y basolateral: dichas regiones contienen distintas proteínas en sus membranas, que no se mezclan entre sí por los complejos de unión. Así, el Ad4 media el transporte al dominio basolateral en células polarizadas para distinguir las vesículas que van a uno u otro dominio.

En algunas regiones, la formación de la vesícula de clatrina depende de fosfoinositidos pero es independiente de proteínas G monoméricas; mientras que en otras regiones también depende de Arf.

Para la independización de la vesícula de la

invaginación, deben fusionarse las membranas: la molécula clave en este paso es la dinamina, otra molécula que lleva GTP unido y que, por ciclos de hidrólisis de GTP, puede proporcionar la energía necesaria para la fusión de las membranas. Así, la dinamina es una molécula necesaria, pero no es suficiente, ya que son necesarias otras moléculas accesorias como la auxilina, etc. A la región donde se localiza la dinamina se asocian también filamentos de actina, de papel incierto pero que podrían colaborar en la invaginación.

Cuando no interviene Arf, varía la concentración de Ca2+ y hay hidrólisis de ATP asociada a la clatrina, lo que provoca el desensamblaje de ésta.

Cuando interviene Arf, una vez formada la vesícula, se hidroliza el GTP del Arf, por lo que éste se desactiva y la clatrina se desensambla.

• Formación de las vesículas de COP1 (coatómero, capsómero o complejo de cubierta).

COP1 está formado por un bloque de subunidades proteicas α, β o β’, γ, δ, ε y ζ. Son 7 subunidades siempre asociadas entre sí, y es la subunidad α la que queda en el exterior y que proporciona la fuerza para la invaginación (actuando como la clatrina) y las restantes las que seleccionan la carga (funcionando como los adaptadores); aunque funcionan todos a la vez, como un bloque.

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La proteína de unión a GTP monomérica Arf intercambia GDP por GTP, activándose y enlazando el complejo de cubierta 1, selecciona la carga e incluye las proteínas. También intervienen más moléculas, como lípidos de membrana que interaccionan con los complejos de cubierta. Una vez separado de la membrana de origen, el Arf hidroliza el GTP, por lo que la cubierta se desensambla.

Interviene en el transporte de la red de cis Golgi al RE para el reciclaje de moléculas. En las proteínas que se deben devolver al RE hay dos tipos de señales: las señales KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) y dilisina. También interviene en el transporte entre cisternas del AG.

• Formación de las vesículas de COP2.

En COP2, en lugar de Arf, la proteína G monomérica se denomina Sar, cuya forma activa también es la forma GTP-enlazada. También están implicadas en el transporte vesicular las proteínas Sec (de secreción), de las cuales destacan dos:

- Sec12p: Es un intercambiador citosólico de GDP por GTP para la proteína Sar; de esta forma, la activan.

- Sec16p: Es un receptor que une la forma activada de la proteína Sar a la membrana y, una vez unida, recluta los componentes de la cubierta.

Los componentes de la cubierta son dos complejos: - Complejo exterior (Sec13-31p): Proporciona la fuerza para la

invaginación, siendo equivalente a la clatrina. - Complejo interior (Sec23-24p): Selecciona la carga, siendo equivalente

a los adaptadores.

El funcionamiento de las vesículas de COP2 es similar al de las de COP1.

Interviene en el transporte del RE al AG, interviniendo ciertas señales que permiten concentrar la carga, como la secuencia Asp-X-Glu o la difenilalanina. Para capturar

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proteínas solubles existen receptores de vesículas de COP2 para proteínas solubles, de 24kD, localizados en la membrana del RE para enviarlas al AG.

• Retrómero sobre membranas endosomales.

Es un tipo de cubierta diferente que sólo se forma sobre membranas de endosomas; y para que se forme una cubierta de retrómero se tienen que dar simultáneamente tres condiciones:

- Que la membrana esté previamente curvada. Porciones pequeñas de membrana son aplanadas; así, se forma preferentemente en las porciones tubulares de los endosomas, enriquecidas con material de membrana.

- Que interaccione con el fosfatidilinositol 3-fosfato (PI3P), que se emplea como marcador de los endosomas. Es lógico que los lípidos sean marcadores de membrana, ya que son sus componentes mayoritarios.

- Que interaccione con la carga, que en este caso son las colas citosólicas de los receptores de manosa 6-fosfato, que llevan los proenzimas lisosomales.

El retrómero es un tetrámero formado por cuatro subunidades, de las cuales una de ellas actúa como adaptador: selecciona la carga, interactuando con los receptores de manosa 6-fosfato (no con la carga, que puede parecer en el dibujo). Un dominio proteico interacciona con el PI3P; mientras que otro interviene en la dimerización del retrómero: la formación del dímero refuerza la curvatura y facilita la formación de más retrómeros (es cooperativa); así, las asociaciones cooperativas del retrómero permiten la invaginación y formación de la vesícula.

• Vesículas recubiertas de caveolina (caveolas).

La caveolina es una proteína de cubierta perteneciente a una familia multigénica, expresándose distintos genes en diferentes tipos celulares. Las caveolas son numerosas en el endotelio y el músculo liso; se conocieron por microscopía electrónica antes de conocer la caveolina. La caveolina tiene dos propiedades:

- Puede polimerizar, proporcionando la fuerza para la invaginación. - Puede interaccionar con el colesterol, lo cual es la base para la

selección de la carga. Las balsas lipídicas o rafts (dominios de membrana con una composición

lipídica diferente a la de las zonas adyacentes) de glucoesfingolípidos y colesterol interaccionan con la caveolina, ya que la interacción del colesterol es más fuerte con los gluecoesfingolípidos que con los fosfoglicerolípidos (composición típica de la membrana). La mayor afinidad del colesterol por los glucoesfingolípidos se debe a dos motivos:

- Los ácidos grasos de los glucoesfingolípidos son más largos. - Los ácidos grasos de los glucoesfingolípidos son más saturados. Así, la movilidad de los glucoesfingolípidos es menor, lo que le viene bien al

anillo planar del colesterol, asociándose así de forma más sencilla.

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De esta forma, la caveolina se une a estas balsas por sus propiedades fisicoquímicas; pero no es la única, ya que hay otras proteínas que también se unen preferentemente a esta región:

- Proteínas que median el transporte de materiales de membrana o receptores.

- Proteínas que intervienen en vías de señalización (señalización por óxido nítrico [NO], ruta de las MAP quinasas, etc.).

Así, en las caveolas se media el transporte vesicular y la señalización, mediando procesos de transcitosis. También hay transcitosis mediada por clatrina; la transcitosis consiste en la toma por parte de células polarizadas de una molécula en un dominio para pasarla al otro: la molécula no se queda en el interior celular.

Las vesículas recubiertas de caveolina forman en la célula un compartimento diferente a los endosomas. Si se forman vesículas de endocitosis, hay dos opciones:

- Que se transformen en un orgánulo permanente por fusión con un endosoma.

- Que se transformen en un endosoma por fusión entre ellos. Las caveolas no forman parte de esta vía; la fusión de caveolas forma un

caveosoma. Las balsas de colesterol y glucoesfingolípidos no son las únicas balsas: cualquier región con composición lipídica distinta a la adyacente es una balsa. Unas son las balsas formadas por glucofosfatidilinositol, que intervienen en la potocitosis (proceso que supone la invaginación de la membrana y formación de una vesícula, que no se aleja de la membrana y libera la carga directamente al citosol). El proceso de potocitosis más conocido mediado por glucofosfatidilinositol es la captación de folato.

En las balsas de glucofosfatidilinositol están preferentemente los receptores de folato y sus transportadores: estas balsas son necesarias para que receptor y transportador estén juntos. Se forma entonces la vesícula por unión del folato con su receptor; y mediante el transportador la carga sale al citosol.

• Reconocimiento por parte de la vesícula de la membrana con la que se debe fusionar.

La vesícula contiene moléculas de superficie que las identifican con respecto a su origen y su carga. Una vez formada, la vesícula pierde su cubierta; y son sus moléculas de superficie las que permiten el reconocimiento entre membranas. En éste y en la interacción entre las mismas intervienen dos procesos; el enlace y el acoplamiento o docking:

El enlace es el reconocimiento inicial, específico y débil entre las membranas que se van a fusionar. Depende de dos componentes: una familia de proteínas de unión a GTP monoméricas (Rab) y otras proteínas que son los llamados factores de enlace. Cuando se forma una vesícula de transporte, se activa un intercambiador de GDP por GTP en su membrana, que activa una proteína Rab, enlazándola a la membrana. La familia Rab tiene más de 30 miembros, habiendo uno distinto para cada orgánulo o vesícula. Se pensaba que eran responsables de la especificidad, pero se ha demostrado que las Rab son intercambiables siempre que puedan capturar al factor de enlace, los verdaderos responsables de la especificidad. Los factores de enlace son miembros de distintas familias, y tienen dos características comunes: son proteínas fibrosas y pueden formar superenrrollamientos en hélice entre sí. El factor de enlace que media la exocitosis a la membrana plasmática es un complejo con ocho subunidades: el exocisto. Una vez establecido el enlace entre Rab’s, se pasa a la siguiente fase: el acoplamiento.

El acoplamiento también es específico y fuerte, siguiendo al enlace. Salvo excepciones, la mayoría de los acoplamientos dependen de familias de proteínas. El

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principal responsable del acoplamiento es el SNARE (receptor de SNAP). Son ele elemento central del acoplamiento, y tienen una porción citosólica muy amplia enrollada en espiral. Se pensó que había dos tipos de SNARE: v-SNARE (en la vesícula) y t-SNARE (en la membrana con la que se fusiona la vesícula, t de target).

Los nombres se mantienen, aunque se ha demostrado que las vesículas tienen tanto v-SNARE como t-SNARE. Una proteína SNARE nunca estará aislada, ya que dicho estado es energéticamente muy inestable. De esta forma, a no ser que otra molécula la bloquee, las moléculas de SNARE siempre interaccionarán para formar dímeros o polímeros: cuando dicha interacción se produce en la misma membrana, el acoplamiento es en cis; cuando es entre distintas membranas, es en trans.

El enrollamiento siempre se produce extremo con extremo; por lo que en trans deben acercarse las membranas para permitir dicho enrollamiento.

Como las vesículas de transporte contienen tanto v-SNARE como t-SNARE, éstas estarán apareadas en cis, por lo que no podrían interaccionar con la membrana receptora; esto, sin embargo, no ocurre porque se asocian a las proteínas Snap. Dichas proteínas se asocian a los complejos v-t-SNARE en cis y el factor NSF, soluble y muy complejo; así como con otra proteína.

Al formarse la vesícula de transporte, una proteína Rab se asocia a la membrana mediante sus receptores, uniendo los factores de enlace. La interacción del factor de enlace de la vesícula con el de la membrana con la que se va a unir provoca la entrada de Ca2+ y la hidrólisis de ATP por parte del factor NSF (una ATPasa), lo que hace que las Snap se suelten; y la energía de hidrólisis del ATP es suficiente para separar la v-SNARE de la t-SNARE, uniéndose a esta última una proteína que impide su asociación en cis. A este proceso se le conoce como priming o preparación.

La asociación entre v- y t-SNARE en trans está desencadenada por interacciones entre las membranas opuestas, liberándose la proteína de unión a la t-SNARE. Es el acoplamiento.

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Tras el acoplamiento tiene lugar la fusión, que implica la reasociación de las dos bicapas lipídicas. Se debe eliminar el agua entre las membranas; y para ello intervienen proteínas fusogénicas, que proporcionan la energía necesaria para la fusión.

• Entrada en la célula del virus de la gripe.

Este proceso fue el primer mecanismo fusogénico conocido. Los virus de la gripe están rodeados por una membrana procedente de la célula huésped. En dicha membrana se insertan proteínas codificadas por el genoma viral, como en este caso la hemaglutinina.

La hemaglutinina se sintetiza en el AG como un precursor HA0, que luego dará por hidrólisis los fragmentos HA1 y HA2. Cada espícula de hemaglutinina está formada por seis cadenas: tres de tipo 1 y tres de tipo 2.

- Tipo 1: Tiene una cabeza globular y una porción lineal unida a las cadenas de tipo 2 por puentes disulfuro.

- Tipo 2: Tiene una pequeña porción citosólica, un segmento transmembrana, una larga porción en hélice α, otra porción estirada en la superficie celular, otra pequeña porción en hélice α y un fragmento hidrofóbico (péptido de fusión) protegido en el interior de las subunidades HA1.

En la superficie del virus, ésta es la estructura de la hemaglutinina. Durante una infección, la hemaglutinina interacciona con el ácido siálico de los glucolípidos o glicoproteínas de la membrana y el virus se introduce en una vesícula de endocitosis: se trata así de una endocitosis mediada por receptor.

En el endosoma, las porciones globulares de HA1 se separan al interactuar con la membrana, las porciones lineares que unen las regiones en hélice α también se enrollan; así, la región doblada se dispara, y con ella el péptido de fusión, que acabará unido a la membrana del endosoma. Esto provoca la fusión de las membranas y libera el virus a la célula, librándose así del ataque de los lisosomas y comenzando la infección.

• Entrada en la célula del virus HIV.

En la célula hay varios receptores que emplea el virus HIV. El virus también lleva un péptido de fusión similar al anterior y protegido por una proteína vírica. Al interaccionar el virus con el receptor CD4 de la superficie linfocitaria (linfocito T colaborador), éste pasa al receptor de las citoquinas.

De esta forma, el péptido de fusión queda desprotegido y se inserta en la membrana. Se dobla entonces la región bisagra, y la membrana vírica y la del linfocito se fusionan, ya que la doblez de la región bisagra proporciona la energía necesaria para la fusión de membranas.

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• Acoplamiento y fusión de membranas. Las SNARE, además de ser las proteínas centrales en el acoplamiento, son

también las proteínas responsables de la fusión (fusogénicas) en la mayoría de los procesos de fusión de membranas celulares.

El acoplamiento en trans de las SNARE es suficiente para la fusión: en la secreción constitutiva, bastan las proteínas SNARE. En la vía de secreción regulada, las vesículas deben esperar una señal para poder fusionarse con la membrana (en los neurotransmisores de las neuronas, la señal para la liberación de las vesículas que los contienen es la liberación de Ca2+).

El Ca2+ suele ser la señal desencadenante: parece haber un complejo cuya proteína central es la calmodulina, que es una proteína de unión al Ca2+ que actúa como un sensor de dicho catión.

Así, las SNARE son necesarias, pero no siempre suficientes para la fusión. En todas las fusiones reguladas, el acoplamiento y la fusión pueden estar separados en el tiempo simplemente por modificaciones en la concentración de Ca2+: la separación entre el acoplamiento y la fusión depende de los niveles de Ca2+.

Hay dos tipos de fusión: homotípica y heterotípica. Cada vez está más claro que la red cis del AG se debe a la fusión de vesículas del RE y que los endosomas se forman por fusión de vesículas de endocitosis: en estos casos, se trata se fusión homotípica (entre iguales). Cuando se rompe la envuelta nuclear y luego se fusiona de nuevo para formar los núcleos hijos, eso también es una fusión homotípica.

Cuando un endosoma se fusiona con la MP o un espermatozoide fecunda a un óvulo, eso es una fusión heterotípica.

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CUESTIONES TEMA 1

• Si los virus son capaces de usar la maquinaria de replicación de la célula para crear nuevos virus, ¿por qué no usan las SNARE entra entrar en la célula, sino sus proteínas fusogénicas?

Eso se debe a que las SNARE están hacia el interior celular para interaccionar

con las vesículas de exocitosis; así, aunque los virus pudiesen interaccionar con las SNARE, no encontrarían ninguna SNARE con la que poder fusionarse hacia el exterior de la célula. Además, suponiendo que pudiesen entrar, no podrían salir de la vesícula, ya que ésta sólo tiene moléculas SNARE hacia el citosol (carece de SNARE hacia el interior vesicular).

• Se puede observar el brote de vesículas de clatrina desde fragmentos de la

membrana plasmática de células eucariotas cuando se agregan adaptadores, clatrina y dinamina GTP a una preparación. ¿Qué se observaría si se omitiera…

a) … los adaptadores? b) … la clatrina? c) … la dinamina? ¿Qué se observaría si los fragmentos de la membrana plasmática fuesen los

de una célula procariota?

a) Los adaptadores son el puente de unión entre las proteínas de membrana de la vesícula y la clatrina. Así, no se puede unir a la clatrina, la cual es la responsable de la invaginación de la vesícula: de este modo, no se observarían invaginaciones ni vesículas.

b) En ausencia de clatrina, tampoco habrá invaginaciones en la membrana plasmática ni vesículas.

c) En ausencia de dinamina, la vesícula no se puede independizar de la membrana; por lo que se observarían invaginaciones incapaces de independizarse de la membrana.

Nada, ya que no hay procesos de endocitosis en procariotas. • Las levaduras y muchos otros tipos de organismos hacen un único tipo de

cadena pesada de clatrina y un único tipo de cadena ligera; así, hacen un único tipo de cubierta de clatrina. Explica cómo es posible que las vesículas recubiertas de clatrina sean utilizadas en distintas rutas de transporte vesicular. ¿Cómo saben las vesículas su destino, si todas tienen el mismo tipo de clatrina hacia el exterior?

Esto se debe a que la clatrina tiene distintos adaptadores, y son éstos los que

realizan el puente de la clatrina con las proteínas de la membrana: es el adaptador el que selecciona la carga y el que confiere la especificidad a la vesícula.

Una vez formada la vesícula, la clatrina se desprenderá para ser empleada en otros procesos de formación vesicular; así, la clatrina no influye en el transporte y destino de las vesículas. Cuando la vesícula llega a una membrana, el que interaccione con ella o no depende de las proteínas Rab y los factores de enlace en un primer paso y de las SNARE en un segundo paso, para producirse finalmente la fusión.

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• ¿Qué anticuerpos se podrían emplear para distinguir las vesículas recubiertas de clatrina formadas en la red de Golgi-trans de las formadas en la membrana plasmática?

Habría que emplear anticuerpos contra los adaptadores, que son los que les

confieren a las vesículas su especificidad. • ¿Por qué la activación de las proteínas Rab requiere la asociación con una

membrana? Las proteínas Rab afectan al enlace; así, deben estar en una membrana, porque si

no, no podrían unir los factores de enlace de una membrana. Las proteínas Rab, unidas a la membrana, son proteínas G: se activan por tanto por el intercambio de GDP por GTP.

Las proteínas Rab tienen un lípido asociado que se introduce en la membrana; además, hay un receptor para la proteína Rab activada en la membrana. La especificidad de la Rab con su receptor no es muy alta; es por ello que algunas proteínas Rab son intercambiables por otras.

• Los virus de la gripe están rodeados por una membrana que contiene una

proteína de fusión que se activa a pH ácido. Un antiguo remedio casero contra la gripe recomienda pasar la noche en un establo de caballos. Si bien puede sonar excéntrico, existe una explicación racional para este consejo: el aire de los establos contiene amoníaco generado por las bacterias de la orina del caballo.

1. Dibuja un esquema de la vía de entrada del virus en la célula. 2. Razona cómo el amoníaco puede proteger a las células del virus de la

gripe. 3. ¿Podría proteger a las células del virus del SIDA (HIV)? 1. El virus interacciona con la membrana plasmática, entrando a la célula por

endocitosis, aprovechando para ello la hemaglutinina viral y el ácido siálico de los glucolípidos y glucoproteínas de la superficie celular.

La vesícula de endocitosis llega entonces a los endosomas, centros de clasificación de las moléculas externas, que funcionan a pH ácido. La progresiva acidificación tiene como principal cometido separar los receptores de sus cargas por la modificación en la conformación tridimensional proteica que provoca, para permitir el reciclaje de los primeros.

Por el pH ácido, la hemaglutinina cambia de conformación, disparando el péptido de fusión, que se incluye en la membrana endosomal por su hidrofobicidad; esto provoca la fusión de las membranas y la liberación del virus a la célula.

2. El amoníaco aumenta el pH y, por su bajo tamaño y ausencia de carga, difunde a través de las membranas al citosol y el interior de los endosomas, aumentando así el pH de estos últimos, por lo que el péptido de fusión no se inserta en la membrana y el virus no puede infectar la célula.

3. No, ya que el virus se une a los receptores CD4 y de citoquinas para entrar al citosol de forma directa: el compartimento endosomal y los cambios de pH no influyen en la entrada y salida de virus.

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• Considera dos tipos de mutaciones que afectan a las vesículas que median el transporte entre las cisternas del AG. Una mutación afecta a los factores de enlace y la otra a las v-SNARE:

1. ¿Cuál es el efecto de dichas mutaciones? 2. Observando el AG con microscopía electrónica, ¿se vería lo mismo en

los dos tipos de mutantes? 1. La mutación en los factores de enlace hará que las membranas ni siquiera se

acerquen. La mutación en las v-SNARE hará que las membranas estén juntas pero que no se unan.

2. En los factores de enlace mutados, se verían las membranas de la vesícula y del blanco mutadas; mientras que en las v-SNARE mutadas se verían las membranas de la vesícula y del blanco juntas pero no unidas. De esta forma, no se vería lo mismo.

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TEMA 2 TRANSPORTE A TRAVÉS DE LA MEMBRANA DEL

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

Una de las principales funciones del RE es la síntesis proteica y de lípidos de membrana. En el RE se sintetizan las proteínas de los componentes del sistema de endomembranas, las de la MP y las del exterior celular.

Los ribosomas asociados al RE no son especiales: sólo es la proteína que sintetizan la responsable de determinar si es liberada al citosol o si en su síntesis el ribosoma se asociará al RE. La síntesis proteica siempre comienza en ribosomas citosólicos libres: la parte recién sintetizada (unos 30 aminoácidos) está en un canal en el ribosoma (no sale directamente al citosol). El ambiente del citosol es hidrofílico: la señal de que una proteína debe ser sintetizada en ribosomas asociados al RE es una secuencia denominada péptido señal hidrofóbico, situada cerca del extremo amino terminal o bien en una localización más interna.

De esta forma, su hidrofobicidad hace que no pueda estar en un ambiente hidrofílico como el citosol. Una proteína de 40 aminoácidos estará prácticamente terminada cuando salga al citosol el péptido señal; sin embargo, en proteínas de mayor tamaño, al salir el péptido señal, éste es reconocido por la partícula de reconocimiento del péptido señal cuando el polipéptido tiene unos 70 aminoácidos de longitud. Esta partícula tiene también un receptor en el RE.

Esta partícula hace que la proteína se termine de sintetizar en ribosomas asociados al RE: es responsable así de la translocación cotraduccional al RE (va al RE al mismo tiempo que se está sintetizando). Las proteínas pequeñas, como ya se dijo, no tienen tiempo a que las reconozca la partícula de reconocimiento del péptido señal; por ello, son translocadas al RE postraduccionalmente.

En mamíferos, sólo las proteínas muy pequeñas (de menos de 70 aminoácidos) se llevan postraduccionalmente al RE; en levaduras, sin embargo, las dos vías son ampliamente utilizadas.

• Translocación cotraduccional. Las proteínas que van al RE tienen el péptido señal hidrofóbico hacia el extremo

amino terminal, más o menos cerca de él. Al salir del ribosoma, el péptido señal interacciona con la partícula de reconocimiento de la señal, formada por 6 proteínas y un micro ARN (lo cual es raro, ya que los micro RNAs suelen actuar en el núcleo). Cinco de las proteínas interactúan directamente con el RNA; otra (la proteína P54) interacciona con el péptido señal hidrofóbico. Dicha proteína tiene una porción formada por muchas Met, con su grupo –R interactuando con dicho péptido señal. Otras regiones tienen otras funciones: el otro extremo del micro RNA se dobla cuando interaccionan el péptido señal y la partícula de reconocimiento, formando un bucle que se introduce en el lugar A del ribosoma: de esta forma, se detiene la síntesis proteica hasta que el complejo ribosoma + partícula de

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reconocimiento de la señal se encuentra con el receptor para la partícula de reconocimiento de la señal en la membrana del RE.

El ribosoma actúa como un dador de GTP para la partícula de reconocimiento de la señal, y es así como interacciona con el receptor. El receptor está formado por dos subunidades: una transmembrana que la une al RE y otra citosólica y unida a la anterior, que puede enlazar GTP e interaccionar con la partícula de reconocimiento de la señal en la forma GTP-enlazada.

Tanto la partícula de reconocimiento de la señal como el receptor de ésta actúan como GTPasas recíprocas: se hidroliza el GTP, liberándose la energía necesaria necesaria para liberar la partícula de reconocimiento de la señal e introducir el péptido señal (ya libre) en un translocador en la membrana del RE.

El translocador está formado en todos los tipos celulares por Sec61p, complejo formado por tres subunidades, teniendo una de ellas una porción que cierra el canal cuando el translocador no está unido a un ribosoma. Cada translocador está formado por cuatro complejos Sec61p. Al abrirse, forma un hueco que comunica el citosol con el lumen; pero también puede abrirse en el plano de la membrana cuando se coloca el péptido señal hidrofóbico: como el interior de la membrana del RE también es hidrofóbica, éste quedará incluido en la bicapa lipídica. A las porciones hidrofílicas se les deja pasar al interior. El translocador está en todos los tipos celulares en vertebrados, levaduras, etc. Sin embargo, en mamíferos, para que se abra, se necesita el componente

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TRAM, proteína transmembrana asociada al translocador que también reconoce el péptido señal hidrofóbico. Al existir TRAM, hay dos reconocimientos del péptido señal.

Otras proteínas quedan insertadas en la membrana: unas tienen el segmento amino terminal en el lumen, otras en el citosol. En otras ocasiones, el segmento transmembrana está más cerca del segmento amino terminal y viceversa. Las proteínas, tal y como quedan colocadas en el RE, nunca se invierten: a ello se debe la asimetría de la membrana.

- Proteínas liberadas en la cavidad del RE. En ausencia de otras señales que indiquen lo contrario, el péptido señal entra del

extremo amino terminal hacia el citosol. No siempre es así por otras señales. Si la proteína va al interior del RE, una señal de corte (peptidasa) libera la proteína en el interior del RE, el péptido señal queda en la membrana y luego se degrada.

- Proteínas transmembrana. Hay una combinación de señales, formada por dos péptidos señal. El primero de

ellos indica que lo que se libera lo hace al interior del RE; el segundo, es la señal de STOP de la transferencia al interior del RE. Así, el extremo amino terminal quedará dentro del RE y el extremo carboxilo terminal quedará fuera de él.

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En proteínas con un solo péptido señal y sin señal de corte, hay aminoácidos cargados positivamente, localizados antes o después del péptido señal, que casi siempre quedan hacia el citosol.

- Si se sitúan antes del péptido señal, la proteína es normal. - Si se sitúan después del péptido señal, lo que se sintetiza después del péptido

señal queda hacia el citosol. Cuando hay varios segmentos transmembrana, se alternan señales de

transferencia al retículo de de parada de la transferencia (STOP), siempre dispuestas de forma alterna.

• Translocación postraduccional. La proteína tiene su péptido señal hidrofóbico y ya está sintetizada. Entonces, se

unen chaperonas, que la mantienen desplegada. Éstas no intervienen en la partícula de reconocimiento de la señal ni en su receptor: hay un complejo Sec62/63p en la membrana del RE que reconoce la señal y la introduce en el translocador Sec61p (evolutivamente muy conservado). El complejo Sec62/63p reconoce la señal por su cara citoplasmática, provocando la interacción con el translocador; mientras que por el lado luminal enlaza una chaperona del RE (BiP), que va tirando de la proteína por ciclos de enlace e hidrólisis de ATP.

La chaperona BiP se va asociando a los segmentos de la proteína según van entrando al RE y tira de ellos. Las chaperonas citosólicas y la BiP cumplen su función con gasto de energía procedente de la hidrólisis de ATP. En levaduras, la BiP se denomina también Kar2p.

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El complejo Ssh1 o complejo regulador, se cree que regula qué proteínas se sintetizan y en qué lugar se finaliza su síntesis (el citosol o ribosomas asociados al RE), aunque el mecanismo por el que actúa no está totalmente aclarado.

La chaperona BiP también está implicada en el transporte cotraduccional para mantener desplegadas las proteínas primero y ayudar a su correcto plegamiento después, ya que se ha demostrado que sin BiP el correcto plegamiento proteico es imposible.

El complejo Sec61p es el responsable de la importación de las proteínas, apareciendo muy pronto en la evolución, estando también en la MP de procariotas y arqueas. De esta forma, en procariotas, los ribosomas se pueden asociar a la cara interna de la MP. En bacterias no hay chaperonas en el espacio extracelular que tiren de la proteína hacia fuera; por ello está la proteína SecA, que tira hacia fuera.

La chaperona BiP reconoce los

aminoácidos hidrofóbicos de las proteínas que, tras el plegamiento, a no ser que formen parte de segmentos transmembrana, deben estar hacia el interior de la estructura tridimensional proteica. De esta forma, los protege; para separarse BiP de la proteína, ésta hidroliza ATP; y es al hacerlo cuando se libera energía, que se emplea en conseguir el correcto plegamiento proteico. Si éste no se produce, BiP se vuelve a unir y se repite el ciclo. La oligomerización proteica también tiene lugar en el RE, y también es ayudada por chaperonas.

Otra chaperona importante en el RE es la disulfuro isomerasa: el aminoácido Cys tiene grupos –SH, y el ambiente redox del RE provoca que cuando dos grupos –SH estén cerca, se forme un puente disulfuro. Esta chaperona ayuda a la correcta formación de dichos puentes disulfuro.

Cotraduccional Postraduccional Levaduras Mamíferos Levaduras Mamíferos

Sec61p Ssh1p

Sec61p Sec61p Sec62/63p

Sec61p Sec62/63p

Receptor SRP Receptor SRP TRAM Kar2p

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Algunas proteínas, tras el corte del péptido señal hidrofóbico, se pueden transferir al glucosilfosfatidilinositol: la proteína se une así a la membrana del RE de forma indirecta mediante un lípido. Esto tiene dos consecuencias:

- Las porciones citosólicas se asocian a elementos del citoesqueleto. Como la asociación entre las proteínas de membrana a estos elementos limita su movilidad, su transferencia a dicho lípido evita dicha restricción en la movilidad.

- Las proteínas unidas al glucosilfosfatidilinositol son proteínas de la MP, por lo que la unión a este lípido es una señal de destino a la MP.

Otras proteínas sufren N-glucosilación: se asocian a

oligosacáridos N-enlazados, que además pueden ser varios por proteína. El oligosacárido que se transfiere es siempre el mismo, y está formado por 14 monosacáridos (2 N-acetilglucosaminas, 9 manosas y 3 glucosas), y es muy ramificado. Tanto en el RE como en el AG, los oligosacáridos se construyen uniendo los azúcares de uno en uno, aunque previamente deben ser activados mediante la unión a grupos fosfato (enlace rico en energía; al romperse proporcionará la energía para su unión al siguiente azúcar).

Las glicosil transferasas son enzimas que no sólo son específicas para la molécula que se va a unir, sino también para la molécula a la que se unen; de esta forma, es necesario un enzima nuevo prácticamente para cada paso de adición de un nuevo residuo. Esto es una diferencia entre la síntesis de azúcares y la de proteínas o ácidos nucleicos.

Esta estructura azucarada se construye sobre el dolicol, lípido de membrana con cuatro regiones transmembrana. Los primeros azúcares se unen en su parte citosólica; posteriormente, el conjunto experimenta flip-flop y se termina de sintetizar en el interior del RE. Una vez formado y unido al dolicol, el enzima transfiere el conjunto al grupo amino de una Asp en una secuencia especial. Dicha secuencia es necesaria pero no suficiente para la transferencia, ya que también influye que el plegamiento proteico permita la accesibilidad de la región al enzima.

La transferencia se realiza en bloque y, antes de salir del RE, se eliminan las 3 glucosas y una manosa. Entonces ¿por qué se unieron estos monosacáridos? Entre las chaperonas del RE, algunas como la calnexina o la calreticulina interaccionan con azúcares, reconociendo el azúcar terminal en los oligosacáridos unidos a proteínas.

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Si la eliminación de estos residuos es incompleta, se debe a un incorrecto plegamiento, y es una región inaccesible a los enzimas. Una glucosa terminal es reconocida por la calnexina, siendo retenida en el RE. Posteriormente, actúa una glucosidasa: si el plegamiento posterior es correcto, la proteína sale del RE; si no, se añade una glucosa mediante una glucosil transferasa, que vuelve a unirle la glucosa: el ciclo se repite hasta el correcto plegamiento. Así, el azúcar terminal debe su existencia a permitir un correcto plegamiento proteico.

En la membrana del RE hay muchos receptores, algunos de los cuales detectan

los niveles de proteínas mal plegadas. La chaperona BiP no se suelta de las proteínas hasta su correcto plegamiento; así, hay BiP suficiente como para interaccionar con su receptor en la membrana del RE. Si se acumulan muchas proteínas mal plegadas, no habrá BiP para unirse a los receptores, por lo que la señal es la falta de BiP. Esto activa diferentes rutas de transducción de señales para sintetizar más chaperonas que ayuden al plegamiento proteico y a disminuir la transcripción y la síntesis proteica.

Se ha descubierto que existe un mecanismo de splicing (corte y empalme) a nivel del citoplasma, asociado a una ruta de transducción de señales asociada al RE. Cuando se acumulan proteínas mal plegadas en el RE, se activa la porción citosólica del receptor, que actúa como una ribonucleasa, eliminando un intrón de un pre mRNA. Posteriormente, se unen los dos exones para conformar el mRNA maduro, que actúa como una proteína reguladora génica, entrando por los poros nucleares y provocando la transcripción de los genes de las chaperonas: habrá así más chaperonas, que ayudarán al correcto plegamiento proteico.

Si, a pesar de todo, las proteínas no se pliegan correctamente, no se pueden dejar en el RE, ya que acabarían interfiriendo en su actividad: se detectan por un componente de la membrana asociado al complejo Sec61p,

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asociado a su vez al complejo de detección de proteínas mal plegadas, haciendo que salgan por el canal translocador. En el citosol son reconocidas, se les eliminan los azúcares mediante una N-glicanasa y se poliubiquitinan, por lo que las proteínas irán a ser degradadas a los proteosomas, estructuras en forma de barril donde se degradarán en forma de pequeños péptidos.

Si aún así, esto no fuera suficiente, otra ruta de señalización desde el RE lleva a

la apoptosis. Las chaperonas se asocian con el complejo de translocación, formando un

enorme complejo en la membrana del RE que tiene dos características: - Mejora la eficacia del proceso. - Complejos proteicos de tan gran tamaño son retenidos en el RE simplemente

por razones físicas (no van a incluirse en vesículas). • Síntesis de fosfolípidos de membrana. Los ácidos grasos se localizan en el citosol, unidos a enzimas que incluyen en su

interior la cadena hidrofóbica; así como al coenzima A (CoA). Dichos enzimas los transfieren a la membrana de forma reversible. Entonces, por unión de dos ácidos grasos con el ácido fosfatídico, se forman los glicerofosfolípidos, primer paso del crecimiento de las bicapas lipídicas (glicerofosfolípidos = glicerol P + 2 ácidos grasos). El resto de los pasos consisten en modificaciones del grupo polar de cabeza. Los enzimas, tanto para la síntesis del ácido fosfatídico como para la modificación del grupo de cabeza, son proteínas enzimáticas transmembrana situadas en el RE con el centro activo siempre hacia la cara citosólica.

Las flipasas son enzimas que se localizan en la MP; en el RE hay enzimas similares: las escramblasas. Esto se debe a que la hemimembrana luminal no tiene síntesis de glicerofosfolípidos: las enzimas escramblasas son capaces de catalizar, con gasto de energía obtenida por hidrólisis de ATP (ya que es un paso energéticamente muy desfavorable), el paso de glicerofosfolípidos de un lado de la membrana al otro. Se piensa que la característica que diferencia a las escramblasas de las flipasas es que las primeras son inespecíficas: la membrana del RE es idéntica en cuanto a composición lipídica. La asimetría se empieza a generar en el AG (se unen glúcidos por la cara luminal); el resto de la asimetría se consigue en la MP debido a las flipasas, que también

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necesitan hidrolizar ATP para obtener la energía para la transferencia pero que, a diferencia de las escramblasas, son específicas: el fosfatidilinositol y los glicerofosfolípidos con carga negativa quedan siempre en la cara citosólica de la membrana.

La carga negativa de la cara citosólica se debe a que hay escramblasas en la MP

que se activan durante la apoptosis (muerte celular programada), provocando que la célula quede con cargas negativas hacia el exterior: esta señal es la que reconocen los macrófagos para fagocitar la célula. De esta forma, las escramblasas sólo se activan en condiciones especiales; normalmente, sólo actúan las flipasas.

En el RE también se sintetizan lípidos como el colesterol y la ceramida (precursor de los fosfoesfingolípidos). Así, en el RE se sintetizan todos los lípidos del sistema de endomembranas: lípidos del propio RE, lípidos de la MP y lípidos del AG.

Al igual que las proteínas, todos los lípidos del sistema de endomembranas se sintetizan en el RE pero, a diferencia de las proteínas, también se sintetizan en el RE los lípidos de los peroxisomas y de las mitocondrias (aunque éstas pueden modificarlos, como unir dos moléculas de fosfatidilcolina para formar una de cardiolipina, glicerofosfolípido que confiere una elevada impermeabilidad a la membrana mitocondrial interna).

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• Control de los niveles de colesterol. En el RE hay sensores de la concentración de colesterol, de forma que si ésta se

descompensa con respecto a la del resto de lípidos, se desencadena una ruta de transducción de señales que acaba con la síntesis de otros tipos de lípidos para equilibrar la membrana.

• Salida del material del RE. Hay dos mecanismos de salida de lípidos. Uno de ellos es el transporte vesicular,

con los lípidos incluidos en las vesículas (fosfoglicerolípidos, esfingolípidos y colesterol). Sin embargo, la ceramida no se incluye en las vesículas del RE: la ceramida no se transporta en vesículas. Así, hay una proteína CERT transportadora de ceramida que, al igual que las proteínas de enlace a los ácidos grasos, mantiene las colas hidrocarbonadas en un interior hidrofóbico para posteriormente transferirla a las membranas del AG. Lo mismo ocurre cuando se transfieren lípidos del RE a las mitocondrias o peroxisomas.

Con microscopía electrónica se han visto puntos de contacto entre el RE y todos los orgánulos a los que transfiere lípidos: aunque intervengan proteínas transportadoras, dichos puntos de contacto facilitan la transferencia de lípidos.

A diferencia de las mitocondrias, los plastos tienden a sintetizar todos los lípidos que necesitan; sin embargo, cuando la síntesis es insuficiente, pueden recibir lípidos mediante proteínas transportadoras desde el RE.

Una condición imprescindible para que una proteína abandone el RE es su

correcto plegamiento y, en el caso de que se trate de proteínas oligoméricas, su correcta oligomerización. Las proteínas, si forman grandes agregados, se quedan en el RE debido a su tamaño: son residentes permanentes.

Se han descubierto señales de salida del RE, formadas por dos aminoácidos ácidos (señales diacídicas, como Asp-X-Glu) o hidrofóbicos (señales dihidrofóbicas). Dicha señal no es imprescindible para la salida del material, pero sí para concentrar la carga. Son vesículas recubiertas de COPII. El anclaje a glicofosfatidilinositol también es una señal de salida. Forma parte de la vía constitutiva del RE.

Tanto en la vía de exocitosis como en la de endocitosis, hay orgánulos limitados por membranas relacionadas por transporte vesicular, por lo que las diferencias entre los compartimentos son a veces mínimas, siendo muy difícil su identificación. Así, se debate el número de compartimentos en el sistema de endomembranas y sus relaciones.

Las vesículas salen del RE con una cubierta de COPII, la pierden y se fusionan para formar los agregados vesículo-tubulares, que adquieren una cubierta de COPI. Éstas incluyen específicamente las moléculas propias del RE, reconociendo las señales

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de recuperación del RE (KDEL o dilisina) y devolviéndole a éste sus moléculas propias en vesículas recubiertas de COPI.

Estos agregados vesículo-tubulares también se denominan “compartimento de salvamento” (por la recuperación de las moléculas propias del RE), “compartimento intermedio (por estar entre el RE y el AG) e incluso se llegó a considerar como parte de la red de cis Golgi.

Cuando el RE y el AG están muy cerca el uno del otro, los agregados vesículo-tubulares alcanzan el AG por difusión; cuando están alejados, lo alcanzan por vesículas guiadas por microtúbulos. Hay vesículas que pueden devolver al material al RE de cualquier regíón del AG (cis, intermedia y trans). Hay así dos filtros para el material del RE: los agregados vesículo-tubulares y el RE.

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CUESTIONES TEMA 2

• En células mutantes para Sec61p, ¿cuál es el destino de las proteínas que normalmente se localizan a nivel del AG?

La proteína Sec61p es un translocador del RE para el transporte proteico. Así, sin Sec61p, las proteínas no pueden entrar a la cavidad luminal. Como las proteínas sintetizadas son proteínas del sistema de endomembranas, estas proteínas deberán quedarse en el citosol, por lo que se localizarán a nivel citosólico.

• Si para insertar las proteínas del RE se necesita un translocador, un

receptor, etc., que a su vez son proteínas del RE, ¿cómo llega el translocador al RE?

El RE procede evolutivamente de la MP; sin embargo, en las células se hereda a partir de trozos del RE de la célula madre tras la mitosis, que ya contienen todas las proteínas necesarias. Las células no pueden sintetizar RE de novo (ocurre lo mismo en el caso de mitocondrias y plastos) aunque, teniendo una mínima parte de él, lo pueden regenerar de forma completa.

• Colocar estas proteínas en la membrana del RE.

La proteína comienza a sintetizarse por el extremo N-terminal, por lo que dicho

extremo quedaría hacia el citosol. Sin embargo, como tiene una porción cargada, hay que tener en cuenta que la carga positiva debe estar hacia el citosol y que la carga negativa debe estar hacia el lumen. Así, la situación de esta proteína en la membrana del RE será la siguiente.

• ¿Y en esta proteína?

N C

Péptidos hidrofóbicos

Citosol

Lumen RE

N

C

Señal de corte N C

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(Error: Es al revés)

Citosol

Lumen RE

N

C N C

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TEMA 3 APARATO DE GOLGI Y TRANSPORTE DEL APARATO

DE GOLGI A LA MEMBRANA PLASMÁTICA

El AG se compara a una fábrica de procesamiento en serie, ya que es una estructura polarizada con una cara cis o de entrada y otra trans o de salida. La cara cis recibe el material del RE y, a medida que dicho material va siendo transportado por los distintos componentes del AG, se va procesando; pero, además, el AG es el lugar de síntesis de la mayoría de los polisacáridos complejos en células vegetales (hemicelulosas y pectinas; NUNCA la celulosa, cuya síntesis va siempre asociada a la MP).

La estructura del AG es compleja, variando de unos organismos a otros; e incluso de unos tipos celulares a otros dentro del mismo organismo. Tradicionalmente, se ha considerado que el AG está formado por unidades independientes, cada una de las cuales se denomina dictiosoma: el número de dictiosomas por célula puede variar de uno a cientos de ellos.

Por las técnicas actuales de microscopía, se ha evidenciado que las células de mamíferos tienen un solo dictiosoma en forma de cinta dispuesto perinuclearmente, pegado al AG. En neuronas, hay un dictiosoma principal en el soma, pero puede haber más en las dendritas.

El AG está formado por cisternas o túbulos aplanados con vesículas asociadas. Las cisternas forman distintos compartimentos. El número de compartimentos en el AG es variable según la especie y tipo celular considerado, pero el consenso es que en un AG tipo se considera que cada dictiosoma está formado por dos redes: la red cis (situada hacia la cara de entrada) y la red trans (situada hacia la cara de salida); en medio de ambas están las cisternas del AG, de las cuales se considera que hay tres tipos: las cisternas cis (hacia la red cis), las cisternas mediales (en el medio) y las cisternas trans (hacia la red trans).

En algunos dictiosomas pueden faltar compartimentos. Una cisterna puede estar

formada por varias cisternas con actividades enzimáticas similares. Se sabe que, al menos en mamíferos, cada uno de los componentes del AG tiene porciones tubulares y porciones cisternales: el que estas regiones adopten distintas morfologías se debe a su distinta composición lipídica.

La carga llega por la zona cis y se va modificando. En todos los componentes del AG se realizan actividades enzimáticas, pero las redes son además lugares de clasificación. Tanto el AG como el sistema endosomal presentan dificultades en su

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estudio por la dificultad para su aislamiento, aunque la actual posibilidad de marcaje fluorescente diferencial del sistema de endomembranas lo ha facilitado.

La perfecta organización de túbulos y cisternas se debe a la matriz del AG, responsable de mantener dicha organización, y está formada por los elementos del citoesqueleto. Los elementos del citoesqueleto proceden de familias multigénicas (la familia de las actinas expresa diferentes actinas en diferentes tipos celulares en distintos estados de desarrollo): la espectrina y la anquirina son diferentes isoformas de la membrana eritrocítica. La proteína ARP tiene un 50% de homología con la actina.

Los microtúbulos son responsables de la localización de los orgánulos de la célula: el AG está perinuclearmente porque la proteína motora de unión a microtúbulos dineína produce un transporte hacia el extremo – de los microtúbulos, que está unido al centro organizador de microtúbulos, el cual está situado de forma perinuclear. La quinesina es otra proteína de unión a microtúbulos, pero que produce un transporte hacia el extremo + de los microtúbulos. Por ciclos de hidrólisis de ATP, las cabezas de la dineína y la quinesina se mueven por el microtúbulos.

La interacción entre la dineína y la membrana de las vesículas es totalmente indirecta. La dineína interacciona con el complejo de la dinectina, éste con la espectrina (proteína de la matriz del AG), ésta con la anquirina y ésta finalmente con las proteínas transmembrana de la vesícula.

Así, la función de la matriz del AG es doble: por un lado, es estructural (mantiene los elementos del AG unidos); por otro, es organizadora (permite y organiza el tráfico en el AG).

• Funciones del AG. - Clasificación de sustancias procedentes del RE. - Glucosilación de proteínas: procesamiento de las cadenas de oligosacáridos

N-enlazados y glucosilación O-enlazada. - Sulfatación de glucosaminoglicanos (cadenas largas de carbohidratos que se

enlazan a proteínas, como el condroitín sulfato). - Metabolismo de lípidos (se les unen azúcares O-enlazados) y polisacáridos

(hemicelulosas y pectinas). - Procesamiento, clasificación y transporte de proteínas lisosomales y

moléculas destinadas a la MP y el exterior celular. • Glicosilación de proteínas. Para unir azúcares a un polisacárido, éstos deben estar activados mediante la

unión a nucleótidos fosfato: este enlace, rico en energía, proporciona mediante su ruptura la energía necesaria para la formación del nuevo enlace entre el monosacárido y el polisacárido.

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Las glicosidasas y glicosil transferasas son enzimas específicas tanto para el azúcar que transfieren como para el azúcar al que lo transfieren. Son proteínas transmembrana con el centro activo hacia el lumen.

• Modificación del oligosacárido N-enlazado. El oligosacárido N-enlazado, de 14 monosacáridos en el RE, pierde tres glucosas

y una manosa antes de dejar el RE, por lo que llega con 11 monosacáridos al AG, donde se va modificando a medida que pasa por los distintos compartimentos del AG.

No todas las asparraginas (Asn) de la secuencia señal de la N-glicosilación son glicosiladas, sino sólo las que sean accesibles según la conformación tridimensional de la proteína, por lo que no todas las proteínas se glicosilan de igual manera. En la parte trans del AG se le pueden añadir al oligosacárido distintos monómeros: ácido siálico, fucosa, galactosa, etc.

Cuando salen del AG, todos los carbohidratos N-enlazados mantienen una región central que ya provenía del RE, denominada precisamente región central. Si la configuración tridimensional de la proteína hace que no sean accesibles a los enzimas del AG, habrá muy pocas modificaciones, por lo que quedarán muchas manosas: son los oligosacáridos ricos en manosa. Si son accesibles, unas manosidasas eliminarán monómeros de manosa, por lo que se pueden añadir otros polisacáridos: son los oligosacáridos complejos.

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Otra clasificación clasifica dichos oligosacáridos según las modificaciones sufridas en cada rama.

• Oligosacáridos O-enlazados. Los oligosacáridos O-enlazados se forman en el AG, donde se transfieren a los

grupos hidroxilo (–OH) de los aminoácidos serina (Ser) o treonina (Thr) de las proteínas. Los oligosacáridos O-enlazados son mucho más pequeños que los N-enlazados, teniendo una longitud máxima de 5 monosacáridos.

• Procesamiento proteolítico. La mayoría de las proteínas del RE se sintetizan como precursores o

preproteínas; en el caso más sencillo, una peptidasa debe cortar el péptido señal en las proteínas sintetizadas en ribosomas asociados al RE.

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En el AG, las preproteínas se procesan proteolíticamente para obtener distintos péptidos o proteínas con distintas actividades, aunque algunos péptidos se pueden perder en este procesamiento.

Un mismo precursor se puede procesar de distinta manera en células diferentes según los enzimas que contenga cada una según su estado de desarrollo o de diferenciación celular.

En las proteínas sintetizadas en el RE, el procesamiento continúa en el AG, en los gránulos de secreción e, incluso, en el exterior celular (como ocurre, por ejemplo, en el caso del colágeno).

• Síntesis de esfingomielina y glucolípidos. La ceramida, formada en el RE por la unión del aminoácido serina (Ser) con dos

ácidos grasos, sufre la adición en el AG de un grupo de cabeza fosforilcolina para formar la esfingomielina; aunque también se le puede añadir de forma alternativa residuos azucarados para formar glucolípidos.

La unión de azúcares a lípidos se produce mediante grupos –OH. El mismo

carbohidrato puede unirse a lípidos o a proteínas, lo que implica que las enzimas reconocen sólo a los azúcares, no al resto de la molécula.

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• Modelos de organización del AG. La organización del AG está aún sujeta a debate, existiendo dos modelos

principales: 1. Transporte anterógrado o modelo

tradicional: Afirma que los dos componentes del AG son estructuras permanentes y las vesículas están recubiertas del COPI; estas vesículas viajan de un compartimento al siguiente en sentido cis → trans, llevando en su interior el material a procesar. Es un modelo cada vez más cuestionado.

2. Transporte retrógrado: Afirma que los componentes del AG no son permanentes, sino que se forman por agregación en la cara cis hasta que se deshacen en la cara trans y se envían a los lisosomas. Hay sin embargo un reciclamiento de enzimas al compartimento anterior.

Otros autores afirman que operan ambos mecanismos de forma simultánea. Hay un nuevo modelo, denominado modelo de la separación rápida, que admite que el AG tiene capacidad de autoensamblaje y autoorganización, y que sus compartimentos pueden ser permanentes. Tiene cuatro postulados:

- En el AG hay una distribución desigual de los lípidos en cada compartimento, de forma que los fosfoglicerolípidos se unen entre sí para formar las regiones cisternales; mientras que glucoesfingolípidos van por otro lado para formar las regiones tubulares: hay así una distribución espacial de los lípidos.

- Las proteínas se distribuyen según su afinidad por los lípidos en el AG. Las proteínas propias del AG son enzimas transmembrana con su centro activo hacia la cavidad: la afinidad de sus segmentos transmembrana, cortos debido a los fosfoglicerolípidos (cuyos ácidos grasos tienen cadenas más cortas e insaturadas que las de los fosfoesfingolípidos), tendrán mayor afinidad por las regiones formadas por fosfoglicerolípidos.

- El transporte en el AG es bidireccional, tanto para las enzimas como para las cargas (es posible tanto el transporte anterógrado como el retrógrado). El material de membrana se puede desplazar en cada uno de los compartimentos según su afinidad por los lípidos, lo que condiciona la separación de los distintos materiales; pudiendo haber tanto transporte anterógrado como retrógrado entre cada uno de los compartimentos.

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- Se podría hablar de un cuarto postulado por el cual, según este modelo, de las regiones tubulares de cada compartimento pueden salir vesículas a la MP (no sólo de la red de trans Golgi).

• Clasificación del material propio del AG. Las enzimas del AG son proteínas transmembrana con su centro activo hacia la

cavidad. El RE es el lugar principal de síntesis de lípidos de membrana (fosfoglicerolípidos, colesterol y ceramida [precursor de los fosfoesfingolípidos]). Los fosfoglicerolípidos tienen cadenas de ácidos grasos más cortas que las de fosfoesfingolípidos, habiendo así dos dominios de establecimiento progresivo en el AG: según se pasa de un compartimento a otro, hay una mayor separación y se van formando balsas de fosfoesfingolípidos.

Proteínas que individualmente tienen poca afinidad por un dominio lipídico pueden asociarse, formando agregados por interacciones de sus segmentos transmembrana, lo que potencia la afinidad y ayuda a su segregación a un mismo dominio.

En la distribución de las proteínas, con un segmento transmembrana de 17

aminoácidos en el AG (de 23 en la MP), se deben acomodar las zonas con cadenas cortas (de fosfoglicerolípidos); así, al alejarse de la cara cis, el aumento en la concentración de fosfoesfingolípidos es suficiente para mantener los distintos tipos de proteínas en distintos compartimentos. Esta forma de retención de proteínas en el AG explica tres hechos:

- La compartimentación de enzimas en el AG no es absoluta. - En distintos tipos celulares, una enzima puede estar en un compartimento y

en otros en otro: no todos los AG son iguales. - El establecimiento de la polaridad del AG surge de manera espontánea a

medida que sus compartimentos se van enriqueciendo en fosfoesfingolípidos. Tradicionalmente, se acepta que la cara trans es la cara de salida del AG, por lo

que las proteínas de la red de trans Golgi tienen un sistema adicional de clasificación con una señal basada en tirosina (Tyr), también propia de la endocitosis: las proteínas que llevan esta señal pueden alternar entre estar localizadas en el AG y la MP.

Todas las células tienen al menos dos vías de salida del AG: la vía constitutiva de secreción (desde todos los compartimentos del AG) y la vía a los lisosomas (mediante la señal de manosa 6-fosfato). Las células secretoras tienen además la vía regulada de secreción, que para algunos autores es una modificación de la vía a los lisosomas.

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En células polarizadas (con distintos dominios en la MP, aunque algunos autores consideran que todas las células están polarizadas en mayor o menor medida), tanto la vía constitutiva como la regulada se dividen en distintas rutas, cada una de ellas a su dominio específico:

- Vía constitutiva: Aporta material de membrana y extracelular. Tan pronto se forman las vesículas, éstas se funden con la MP (flujo no regulado).

- Vía regulada: Aporta material que va a influir sobre otras células, incluso a distancia o sobre otro organismo. Las vesículas se acumulan en el citoplasma, y sólo descargan su contenido cuando la célula recibe una señal.

La vía constitutiva de secreción o vía por defecto recibe estos nombres porque una característica fundamental de esta vía es que no necesita señales, por lo que lo que no tiene señal para ir a otro sitio o, aunque la tenga, no es correctamente clasificado (cuando hay gran cantidad de material que no puede empaquetarse selectivamente).

En criterio fundamental de clasificación del material que va del AG a la MP es la

longitud del segmento transmembrana: cuando es largo, tienen afinidad por las balsas de fosfoesfingolípidos, acumulados en las regiones tubulares del AG; por tanto, las regiones tubulares es de donde sale material a la MP del AG.

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Aunque no necesita señal, sí que hay señales para concentrar la carga y empaquetar moléculas en esta vía: el glicofosfatidilinositol, aunque no es un fosfoesfingolípido, se acumula en las balsas de este lípido, provocando que las proteínas unidas a él vayan a la MP. Los glicolípidos (que también se suelen asociar a estas balsas), cuyas porciones hidrofílicas por las lectinas, pueden unirse a estas moléculas, lo que también es señal de que las proteínas irán a la MP.

Tanto el material de membrana como el del interior (matriz o pared) van en la misma vesícula. Parece que no hay ninguna proteína característica del AG que sea de la cavidad. Si la vía constitutiva es una vía por defecto, para que una molécula vaya por esta vía no es necesario que haya experimentado las modificaciones postraduccionales correctas (eliminación del péptido señal, unión a lípidos o azúcares, etc.).

Las vesículas de la vía constitutiva no tienen cubiertas de clatrina, COPI ni COPII, ni se conoce qué tipo de cubiertas pueda tener. Se pensó en la caveolina, porque se une a fosfoesfingolípidos y colesterol, pero no se cree que se trate de ella.

En la vía regulada de secreción, parece claro que las vesículas de la vía regulada parten de la red de trans Golgi. Las vesículas llevan material en el interior: el material de membrana no es específico (va material de membrana similar al de la vía constitutiva), pero su membrana puede contribuir al crecimiento de la MP si es necesario. Las vesículas de la vía regulada se descargan como consecuencia de una señal, por lo que suponen un considerable alargamiento de la membrana, por lo que esto va seguido de procesos de endocitosis para eliminar el exceso de membrana.

Son las características fisicoquímicas de las vesículas las que determinan la clasificación: no hay secuencias señal de clasificación. La clasificación se basa en la propiedad de los productos de secreción de precipitar por interacción con otras moléculas, que en mamíferos son la cromogranina B y la secretina 2. Se debe a una acidificación del pH: en la red de trans Golgi, hay bombas de H+ que se incluyen en las vesículas y las acidifican progresivamente. A mayor acidez, mayor es la densidad de empaquetamiento. En la precipitación influye en aumento de la concentración de Ca2+ en la red de trans Golgi. Se forman vesículas con parches de clatrina: la clatrina aparece agrupada en algunas regiones, lo cual ocurre también en vesículas de gran tamaño. A medida que la vesícula se aleja del AG y baja el pH, el material se condensa más.

La señal de descarga suele ser un neurotransmisor u hormona: una señal extracelular se convierte en una señal intracelular por un segundo mensajero, que es un aumento en la concentración de Ca2+. Las vesículas de la vía regulada puede liberarse a lo largo de toda la superficie de la membrana (células cebadas o mastocitos) o a lo largo de una región de la membrana (descarga local; linfocitos T citotóxicos o NK, descarga de neurotransmisores, etc.).

• Vías a la MP en células polarizadas. En cierta medida, todas las células se podrían considerar polarizadas; pero los

ejemplos más claros de polaridad son las células epiteliales (con dos dominios que separan medios de distinta composición) y las células nerviosas (de origen epitelial).

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Las células epiteliales tienen un dominio apical hacia la cavidad o el exterior del organismo, y un dominio basolateral. A nivel de la unión de ambos suele haber complejos de unión (cinturón de adhesión, zónula ocluyente [impide el paso de moléculas] y desmosomas [implicados en la adhesión intercelular]). Tienen otras funciones: evitan el movimiento de componentes entre la membrana de uno y otro lado de estas uniones, por lo que no hay intercambio de materiales entre el dominio apical y el basolateral. La composición de ambos dominios es distinta, por tanto, los compuestos de estos dominios deben ser llevados específicamente al dominio correspondiente.

Las células nerviosas tienen regiones receptoras (soma y dendritas) y efectoras (axón). Se considera que el axón equivale al dominio apical de las células epiteliales; dendritas y soma equivalen al dominio basolateral. En la región del cono axónico, se integran las señales de la dendrita y el soma; si se llega al umbral, se dispara un potencial de acción.

• Clasificación de proteínas de membrana en células polarizadas. Al haber distintos dominios de membrana con distinta composición química, el

material de membrana debe ir a su dominio específico. Hay estudios que determinan la distribución a través del axón, pero se realizan en células epiteliales con dos dominios. Hay dos mecanismos de clasificación:

1. Clasificación directa: En la red de trans Golgi. Significa que las proteínas tienen distintas señales. Para el dominio basolateral, aunque hay varias señales, suelen ser señales basadas en tirosina (Tyr), señal de endocitosis de de las proteínas de la red de trans Golgi. En el dominio basolateral, se forman vesículas de clatrina con el adaptador Ad4. Para el dominio apical, las señales son mucho más variadas: unión a glicofosfatidilinositol, en el segmento transmembrana o la región citosólica de la proteína.

2. Clasificación indirecta: La clasificación tiene lugar en el sistema endosomal. Tanto las proteínas destinadas al dominio apical como las del dominio basolateral salen del AG en la misma vesícula y se llevan a uno de los dos dominios de la membrana, generalmente al basolateral; posteriormente, se internalizan por endocitosis y en los endosomas se clasifican: las proteínas que ya son del dominio basolateral se devuelven al mismo; mientras que las del dominio apical experimentan transcitosis y son llevadas al dominio apical.

No todas las proteínas del dominio basolateral serán internalizadas: muchas de ellas, como la bomba de Na+/K+ (nunca presente en el dominio apical), una vez que llegan a la membrana basolateral, se asocian por su porción citosólica a elementos del citoesqueleto (se anclan para evitar la difusión por la membrana), quedando inmovilizadas en el dominio basolateral.

Que una proteína emplee una u otra vía de clasificación depende del tipo celular, la proteína, el estado metabólico y de desarrollo, etc.; por lo que no hay una clasificación clara.

En células polarizadas se forman endosomas tempranos; en su formación tiene que haber endosomas tempranos en ambos dominios. En la vía constitutiva de secreción, está la cadena: Endosoma periférico → Endosoma temprano → Endosoma tardío → Lisosoma. Hay así distintos tantos tipos de endosomas periféricos como dominios de membrana. En células que emplean la vía de clasificación indirecta, la clasificación endosomal se complica aún más.

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Desde el dominio basolateral, se incluyen vesículas que son endosomas tempranos de dicho dominio; el material que no fue inmovilizado se recicla desde el endosoma temprano o desde el endosoma común. De ambos dominios llega contenido a los endosomas tardíos o perinucleares, y de éstos a los lisosomas.

El sistema de clasificación en células polarizadas no usa esta vía: la vía se separa

desde los endosomas tempranos desde los que el material se lleva a los endosomas comunes, donde tiene lugar la clasificación: devuelven lo propio y no inmovilizado al dominio basolateral y llevan material al dominio apical vía los endosomas apicales, que median la transcitosis y que son endosomas de reciclaje.

La dinámica del sistema de endomembranas hace que haya tanto componentes permanentes como otros que maduran unos en otros: la composición varía de unos a otros.

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TEMA 4 TRANSPORTE DESDE LA MEMBRANA PLASMÁTICA Y

BIOGÉNESIS DE LOS LISOSOMAS

En la biogénesis de los lisosomas influyen la vía constitutiva de secreción y la de la endocitosis. La endocitosis cumple varias funciones:

• Sustitución de componentes de membrana (en células secretoras, para retirar el exceso de membrana). • Control de actividades celulares.

- Toma de nutrientes. - Interacción regulada con el medio externo. - Transmisión de señales neuronales, metabólicas o proliferativas. - Capacidad de defensa frente a microorganismos invasores (aunque paradójicamente algunos de ellos la usan para entrar en la célula).

Hay dos tipos de endocitosis: - Pinocitosis: es la introducción

de material en disolución en pequeñas vesículas. Es constitutiva: la realizan todas las células.

- Fagocitosis: es la inclusión de material sólido en grandes vesículas. Sólo la realizan ciertos tipos celulares (fagocitos).

Siempre que se hace la clasificación, se habla de pinocitosis y fagocitosis; pero se emplea el término endocitosis sensu estricto refiriéndose a la pinocitosis. No todos los mecanismos de pinocitosis son iguales: la mayoría de los mecanismos de pinocitosis son dependientes de clatrina y dinamina; aunque también los hay dependientes de caveolina y dinamina. Hay también otros procesos independientes de clatrina y caveolina, como la macropinocitosis y otros procesos peor conocidos.

• Endocitosis dependiente de clatrina. Las vesículas recubiertas de clatrina que introducen material en el interior

celular incluyen dos tipos de material: el disuelto en el fluido, incorporado no selectivamente (endocitosis de fase líquida) y el incluido específicamente; bien porque es material de membrana, bien porque es material del exterior capturado por receptores de membrana (endocitosis mediada por receptor): esta es una clasificación artificial, porque en una misma vesícula va el líquido y el material unido a receptores de la MP.

Una vez sintetizados, los receptores se llevan a la MP por vesículas de exocitosis: algunas pueden recubrirse de clatrina aunque los receptores no se hayan cargado; otras necesitan tener la carga unida a los receptores para poder interaccionar con los adaptadores.

Los receptores dependen en tipo y cantidad de las necesidades fisiológicas de las células; así como del dominio al que se envían. En una misma vesícula de endocitosis hay distintos tipos de receptores con cargas distintas o del mismo tipo. Los materiales incluidos por los receptores son internalizados por la señal basada en tirosina (Tyr), reconocida por el adaptador Ad2 (LDL, Ig’s, transferritina, etc.). En las vesículas va material de membrana de dos tipos:

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- Proteínas de la membrana lisosomal: Con la señal dileucina (2 Leu), reconocida por el adaptador Ad3.

- Proteínas que se deben degradar: Con la señal monoubiquitina (y otras), se llevarán a los lisosomas para su degradación.

Todos los compartimentos de endocitosis tienen distintos marcadores y distinto material. El material incluido por endocitosis tiene varios posibles destinos:

- Reciclaje a la misma membrana de la que partió (receptores).

- Transcitosis, a otro dominio de la célula.

- Degradación en los lisosomas. La vía constitutiva de endocitosis lleva material a los lisosomas.

- Acumulación, como los ovocitos y los nutrientes del vitelo, que se acumulan en vesículas en el citoplasma.

El pH del sistema endosomal es ácido, y va disminuyendo según la vesícula de endocitosis se acerca al interior celular. Esta acidificación se produce por una bomba de H+ en la membrana, pero no se produce un gradiente eléctrico porque canales de entrada de Cl- compensan la carga. También va variando la composición lipídica y de RABs.

En endosomas periféricos hay una primera clasificación del material que proviene del exterior: algunos receptores sufren un cambio conformacional y liberan la carga. Estos receptores que liberan la carga son reciclados a la membrana de la que provienen para su reutilización.

¿Cómo no se degrada la MP que va a los lisosomas? Desde los endosomas periféricos se producen procesos de invaginación de la membrana para formar los cuerpos multivesiculares, se forman vesículas que quedan incluidas en el interior del compartimento, separando el material de membrana útil del que va a ser degradado.

Los cuerpos multivesiculares van a regiones perinucleares por microtúbulos, maduran a endosomas tardíos y reciben del trans Golgi las enzimas necesarias para luego transformarse en lisosomas.

• Endocitosis mediada por receptor: colesterol. El colesterol es una molécula lipídica insoluble en

sangre, que viaja en su seno unido a lipoproteínas de baja densidad (LDLs), que tienen sus partes hidrofílicas hacia el exterior y sus partes hidrofílicas recubiertas de colesterol, conteniendo en su interior moléculas de colesterol esterificadas con un ácido graso.

Cuando las células necesitan colesterol, tienen dos formas de obtenerlo: sintetizándolo (en el RE de células como los hepatocitos) o tomándolo de la sangre. En esta toma, la célula debe tener receptores para las LDLs, cuyo número y tipo dependerá de las necesidades celulares; pudiendo acumularse, degradarse, etc.

Los receptores de LDLs tienen una señal basada en tirosina (Tyr) y se incluyen en vesículas recubiertas de clatrina. Posteriormente, se fusionan con endosomas

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tempranos (también llamados perinucleares), y el pH ácido de éstos provoca un cambio conformacional en el receptor, que suelta la carga. Los receptores sin carga se acumulan en las regiones tubulares para formar vesículas, que van al endosoma de reciclaje (hay mucha confusión sobre si existen o si los receptores van directamente a la membrana) y se devuelven a la MP. La carga irá a los lisosomas, donde se degradará; y el colesterol libre se envía al citosol para su utilización.

Los receptores que no se separan de las cargas (por ejemplo, el factor de

crecimiento epidérmico o EGF) siguen el mismo destino de la carga: van a los lisosomas. El EGF es una molécula que desencadena una vía de transducción de señales que provoca la proliferación de sus células blanco. Para acabar con la señal de división, las células siguen una regulación a la baja o down regulation: se lleva tanto el receptor como el EGF a los lisosomas para su degradación, por lo que hasta que no se sinteticen más receptores, no podrá actuar más EGF. De esta forma, si está mutada la señal basada en tirosina (Tyr), no se puede incluir el receptor en vesículas de endocitosis, por lo que la señal de proliferación celular seguirá siendo activa, de forma que la división celular estará incontrolada (célula cancerosa).

• Endocitosis mediada por receptor: transferrina. La transferrina es una proteína que transporta el hierro en la sangre. Que se una

o no al hierro depende de su conformación tridimensional, y ésta depende del pH. Como es necesaria más acidez para que suelte la carga, los endosomas se localizarán más hacia el interior de la célula.

La proteína está unida al hierro a un pH neutro (pH 7): es la ferrotransferrina, e interacciona del receptor de forma que se incluye el conjunto en una vesícula recubierta de clatrina, fusionándose con endosomas periféricos hasta llegar a los endosomas perinucleares. En ellos, la proteína sufre un cambio de conformación que provoca que libere el hierro: esta forma proteica sin hierro es la apotransferrina. En este momento, con la proteína sin hierro y a pH ácido, proteína y receptor permanecen unidos; pero al

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reciclar el receptor a la MP, el pH se vuelve neutro, la afinidad del receptor por la apotransferrina es muy baja y se separan ambas partes.

• Formación de cuerpos multivesiculares. Las proteínas viejas de la MP se monoubiquitinan, llevándose a los lisosomas

para su degradación. Si cuando se produjera la fusión entre ambos compartimentos las proteínas siguiesen estando en la MP, no se degradarían al llegar al lisosoma; por ello, se incluyen al interior de la vesícula en el camino a los lisosomas. Por procesos de invaginación en la vesícula, se incluyen las proteínas que serán degradadas, formando los cuerpos multivesiculares, componentes de la vía constitutiva de endocitosis. Se cree que, por maduración de éstos, llegan a los lisosomas.

• Clasificación de las proteínas de membrana en los cuerpos

multivesiculares. Depende de complejos citosólicos denominados ESCRT (Endosomal Sorting

Complex Required for Transport). Son cuatro complejos, denominados ESCRT-0, ESCRT-I, ESCRT-II y ESCRT-III. Los tres primeros reconocen la señal monoubiquitina de las proteínas e interaccionan con ella; de estos, los complejos 0 y II interaccionan también con los fosfoinositidos de membrana. Estos complejos van interaccionando por orden con las proteínas monoubiquitinizadas (0, I, II).

El complejo III es más especial porque, aunque parece claro que es el responsable de la invaginación de la membrana, él mismo no va incluido en dicha invaginación. Interacciona con los fosfoinositidos y se dispone en los márgenes de la región invaginada: interviene en marcar los límites de la región invaginada y en seleccionar las proteínas que serán incluidas. Una vez formadas las vesículas, una ATPasa citosólica desensambla el complejo III. Una vez formados los cuerpos multivesiculares, las vesículas internas serán degradadas en los lisosomas.

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Las proteínas ESCRT intervienen en dos procesos: la salida de los virus de la célula (ya que es una situación topológicamente similar a la formación de las vesículas en los cuerpos multivesiculares) y la citocinesis (se forman dos compartimentos limitados por membrana).

• Exocitosis. Se ha comprobado que los cuerpos multivesiculares pueden fusionarse con la

MP, liberando las vesículas que contienen al exterior celular: a estas vesículas se les denomina exosomas. Son cuerpos de exocitosis. Parece que este proceso se emplea para mandar señales a otras células: dentro de los exosomas pueden ir moléculas señalizadoras (morfógenos), ácidos nucleicos (mRNA, miRNA), etc. Pueden fusionarse con células blanco, donde los morfógenos alterarán su patrón de desarrollo, el mRNA se empleará en la síntesis proteica y el miRNA interferirá en la síntesis proteica, modificando los patrones de dicha síntesis. Algunos virus emplean esta vía para pasar de una célula a otra.

• Transcitosis de inmunoglobulinas. Es una transcitosis mediada por receptor. Se produce en la toma de anticuerpos

de la leche materna en ratas recién nacidas, pero no es un proceso que opere en humanos.

Las células del epitelio intestinal tienen receptores para la fracción constante (Fc) de las inmunoglobulinas (Ig’s), que al pH ácido de la cavidad intestinal capturan los anticuerpos. Por endocitosis se internalizan, en una secuencia que va:

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Endosoma apical periférico → Endosoma común → Endosoma basolateral de reciclaje → Superficie basolateral

Los líquidos tisulares tienen un pH neutro, por lo que se produce un cambio conformacional que provoca la separación del anticuerpo del receptor, yendo el primero a la sangre. El receptor libre vuelve a experimentar transcitosis, en la secuencia: Endosoma basolateral periférico → Endosoma común → Endosoma apical de reciclaje

→ Superficie apical

• Almacenaje de proteínas en endosomas de reciclaje (o de almacenaje). Los receptores pueden ser almacenados en endosomas de reciclaje especiales,

cuya característica es que sólo se fusionan con la MP si reciben una señal para ello. Algunos autores, por esta característica, los denominan endosomas de almacenaje.

Un ejemplo son los transportadores de glucosa en células musculares. Cuando no necesitan glucosa, los transportadores de esta molécula se almacenan en los endosomas de almacenaje. Cuando la necesitan (a la célula le llega insulina, que es la señal), la unión insulina-receptor envía una señal al endosoma de almacenaje para que se fusione con la MP: el número de receptores aumenta, y con ello se consigue maximizar la captación de glucosa. Cuando ya hay suficiente glucosa, los transportadores se vuelven a internalizar.

Lo mismo ocurre en las vesículas sinápticas, donde tras la sinapsis las vesículas

se recargan con el neurotransmisor.

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• Endocitosis independiente de clatrina: caveolina. Hay endocitosis y transcitosis mediada por caveolina (caveolas; las caveolas son

las membranas invaginadas, no las vesículas). Las caveolas se caracterizan porque en ellas, además de la caveolina, interviene la dinamina en la formación de la vesícula. Las caveolas se forman en las balsas lipídicas, y su función es reguladora, estabilizando las caveolas de forma que para que una caveola se independice debe recibir una señal.

Además de para introducir moléculas, también se emplea en la transcitosis en células endoteliales (del aparato circulatorio). Se ha caracterizado un nuevo tipo de compartimento, al que se fusionan las vesículas de las caveolas y que se denominan caveosomas. La fusión con estos supone un mecanismo para separarse de la ruta de la endocitosis y evitar la degradación en los lisosomas.

Los productos contenidos en los caveosomas (por ejemplo, la toxina del cólera) pueden ir al AG por vías no clásicas: el virus SV40 va al RE vía caveosomas, el AMF (Autocrine Motility Factor) va directamente al RE sin pasar por los caveosomas.

• Endocitosis independiente de clatrina: macropinocitosis. La macropinocitosis supone la inclusión de material por repliegues de la MP

formados por remodelación del citoesqueleto de actina, constituyendo una bolsa que internalizará material líquido que, por su elevado tamaño, hace que este proceso se denomine macropinocitosis.

Las vesículas procedentes de la macropinocitosis se denominan macropinosomas, y experimentan una maduración con intercambio de componentes (reciclaje, cambios en la composición de la membrana, etc.) para acabar siendo similares a los endosomas e ir a la vía endocítica.

Algunas células experimentan la macropinocitosis de forma constitutiva,

mientras que otras sólo la experimentan en respuesta a señales extracelulares. La macropinocitosis puede ser aprovechada por microorganismos patógenos para entrar a las células: algunas bacterias (Salmonella) tienen señales de superficie que inducen la macropinocitosis: la unión con los receptores induce la internalización de las bacterias. Su destino no son los lisosomas, ya que pueden escaparse al citoplasma o alterar el macropinosoma, de forma que pueden reproducirse dentro del mismo.

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• Fagocitosis. La fagocitosis supone la inclusión de material sólido en la célula. Tiene

características en común con la macropinocitosis de microorganismos patógenos, pero en este caso la fagocitosis supone un mecanismo de defensa (el fagosoma irá a los lisosomas).

La fagocitosis sólo la realizan células especializadas, como son muchos protozoos (que la emplean como forma de alimentación) y los fagocitos de mamíferos (macrófagos y neutrófilos). Es posible la fagocitosis de partículas extrañas (como polvo, etc.), siendo posible la unión de varios fagocitos entre sí si uno es demasiado pequeño para ello.

La fagocitosis es un proceso específico, dependiendo de la interacción de moléculas en la superficie de la MP de la célula a fagocitar con receptores en la superficie del fagocito. Las moléculas reconocidas por los receptores de los fagocitos son las Fc de las Ig’s o algunos componentes del complemento; así como algunos azúcares en la superficie. En las células muertas por apoptosis (por ejemplo, eritrocitos), una señal de fagocitosis es la fosfatidilserina. Este lípido, con carga negativa, sólo se encuentra en la hemimembrana citosólica en células vivas: su presencia en la superficie identifica en los macrófagos las células muertas. Parece que las células vivas tienen otras moléculas en la superficie que impiden asimismo su fagocitosis, como forma de mecanismo de seguridad. Los protozoos reconocen azúcares sobre las células a las que fagocitan.

La unión a la partícula fagocitada debe mantenerse en todo el proceso de fagocitosis, que progresa como una cremallera. La formación de la vesícula de fagocitosis depende del citoesqueleto de actina y de parches de clatrina. Los fagosomas se irán modificando en el interior de la célula, confluyendo en la vía endocítica, de forma que las partículas terminan en los lisosomas, donde son degradadas.

• Lisosomas. Biogénesis. Los lisosomas son orgánulos limitados por

membrana cuyas características principales son tres: - Tienen una bomba de protones que

acidifica el interior. - Las moléculas de membrana (proteínas

y lípidos) están muy glicosiladas, de forma que los azúcares forman una cubierta interna. Se piensa que esto es un mecanismo de protección para evitar la degradación de su propia membrana.

- Tiene multitud de transportadores, ya que en su interior ocurren muchas degradaciones, y se emplean en enviar los productos de degradación al citosol para su utilización.

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Los lisosomas son el lugar donde confluyen distintas vías de tráfico vesicular en las células, incluida la autofagia. Tanto el material de membrana como las hidrolasas internas pueden seguir dos vías:

- La mayoría del material propio del lisosoma llega a éste por la vía de secreción RE → AG → Endosomas perinucleares → Lisosomas.

- Tanto el material de membrana como enzimas del interior pueden clasificarse incorrectamente en el AG, pudiendo ir al exterior de la MP mediante la vía constitutiva de secreción. Como los receptores que median la clasificación en el AG pueden ser reciclados al AG o la MP, el material de la MP puede incluirse por endocitosis y ser llevado al lisosoma por la vía constitutiva de la endocitosis.

Tanto proteínas como lípidos se insertan en el RE, las proteínas son N-

glicosiladas, y el material pasa al AG. En el AG, la mayor parte de las enzimas lisosomales de mamíferos son clasificadas en base a la formación de la señal manosa 6-fosfato (M6P). Para las proteínas de membrana y algunas hidrolasas de mamíferos (y de otros organismos como levaduras), la clasificación es independiente de la señal M6P. Las enzimas lisosomales se sintetizarán como proenzimas. A algunas manosas de los azúcares N-enlazados se les añade un grupo fosfato en el C6 en dos pasos:

1. La enzima N-acetilglucosamina fosfotransferasa transfiere el azúcar N-acetilglucosamina 6-fosfato al C6 de la manosa. La fosfotransferasa tiene un área señal de reconocimiento de la proteína y una región para la N-acetilglucosamina activada por unión a un nucleótido de UDP. Tiene lugar en los primeros compartimentos de la red de cis Golgi.

2. La enzima N-acetilglucosamina fosfoglicosidasa separa la N-acetilglucosamina, dejando solamente el grupo fosfato unido al C6 de la manosa: es ya la señal M6P, y este paso tiene lugar en la entrada de la red de cis Golgi.

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La clasificación tiene lugar en la red de trans Golgi, donde hay receptores de M6P, que son de dos tipos: catión independientes (de mayor tamaño) y catión dependientes (de menor tamaño):

1. Catión independientes: De mayor tamaño, no necesitan cationes divalentes (Ca2+). La porción citoplasmática reconoce los adaptadores de las vesículas recubiertas de clatrina (Ad1, GGAS), enviándolo a los endosomas perinucleares. Tiene una porción muy repetitiva con segmentos que, aunque sean diferentes unos de otros, tienen un origen común. Funciona generalmente como un monómero, y sólo 2 de las porciones repetitivas pueden reconocer la M6P, y siempre en proteínas diferentes.

2. Catión dependientes: De menor tamaño, necesitan cationes divalentes (Ca2+). Funciona como un dímero, pudiendo reconocer distintas señales M6P en la misma proteína (o en dos proteínas distintas).

Ambos reconocen la señal M6P en el AG (los dos están presentes); pero en la MP sólo está presente el receptor catión independiente. En el reciclaje de los receptores de M6P intervienen vesículas de retrómero: hay sobre todo un reciclaje al AG, pero también lo hay a la MP.

En el endosoma perinuclear, el pH es ácido: una fosfatasa eliminará la señal

M6P, evitando que pueda volver a unirse con el receptor. En los lisosomas, experimentan la degradación propia de las proenzimas. Algún material puede escaparse e irse por exocitosis: las proenzimas que se escapan pueden reintroducirse por endocitosis y volver a los lisosomas por la vía constitutiva de la endocitosis.

Las proteínas de la membrana lisosomal tienen la señal dileucina (diLeu) en la red de trans Golgi, siendo reconocidas en dicha localización y llevadas , vía endosomas perinucleares, a los lisosomas. Si se escapan a la MP, el Ad2 reconoce la señal dileucina, internalizándolas por endocitosis en vesículas recubiertas de clatrina, yendo a los endosomas y de ahí a los lisosomas.

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• Transporte de enzimas lisosomales independientes de la señal M6P. Son diversas señales que varían según la especie, y que se encuentran en la

proteína. En humanos enfermos con la enzima fosfotransferasa mutada (por tanto, carentes de la señal M6P) no debería haber enzimas lisosomales en los endosomas, sino en la sangre. Sin embargo, la mayor parte de las células carece de casi todas las enzimas excepto la β-cerebroglucosidasa (que, como es una proteína de membrana, no se excreta debido a la señal dileucina) y la fosfatasa ácida, ya que se procesa con un segmento transmembrana que luego se corta.

Aún así, en hepatocitos y leucocitos, los lisosomas tenían todas las enzimas

habituales. Esto constituyó un rompecabezas hasta que se descubrió la enzima preprosoprosina, que degrada los fosfoesfingolípidos: lleva una señal en la proteína que es reconocida por el receptor sortilina, cuya porción citoplasmática es igual a la del

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receptor de M6P catión independiente, que reconoce la señal de la preprosoprosina, funcionando de igual modo y llevando la carga a los lisosomas.

De esta forma, en hepatocitos y leucocitos, la clasificación depende únicamente de sortilina (no de la señal M6P), y dicha señal no está en la M6P, sino en la proteína. El material a degradar puede llegar a los lisosomas por tres caminos: la vía constitutiva de la endocitosis, la de la fagocitosis y la autofagia.

• Autofagia. La autofagia es la degradación de componentes de la propia célula. En el

citoplasma están los proteosomas, pero las proteínas de larga duración (aproximadamente, el 90% de las proteínas totales de la célula) y los orgánulos se degradarán en los lisosomas. Hay tres tipos de autofagia: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas.

- Macroautofagia: Comienza con la inclusión de componentes celulares en vesículas de doble membrana. La inclusión del material en esta doble membrana forma un autofagosoma, que luego se fusionará con un lisosoma. La membrana externa formará parte del lisosoma, mientras que la interna se degradará. Los autofagosomas no sólo se pueden fusionar con endosomas, sino también con endosomas de la vía constitutiva de endocitosis. La macroautofagia es, como norma, inespecífica; aunque se ha visto que los peroxisomas son seleccionados específicamente para su degradación: se habla entonces de macroexofagia (degradación específica de los peroxisomas). Las mitocondrias y otros componentes celulares también pueden ser seleccionados específicamente para su degradación.

- Microautofagia: Supone la invaginación de la membrana del lisosoma, con lo que se forma una vesícula en su interior que incluye material celular. Es similar a la formación de vesículas en endosomas para formar los cuerpos multivesiculares.

- Autofagia mediada por chaperonas: Independiente del transporte vesicular, las partículas tienen una señal de degradación en los lisosomas (KFERQ), señal reconocida por chaperonas, que las despliegan y mantienen desplegadas. Las proteínas atraviesan entonces un transportador y, en la membrana del lisosoma hay un receptor Lamp de tipo 2. La chaperona Hsp70 lisosómica tira de las proteínas hacia el interior.

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La autofagia sensu estricto se refiere a la macroautofagia, y tiene varias etapas. Se inicia con la señalización y regulación del proceso, seguido del secuestro del citoplasma y formación del fagosoma: el autogafosoma se desplazará por el citoplasma para fusionarse con el lisosoma.

Se han encontrado aproximadamente 25 genes implicados exclusivamente en la autofagia: son los genes ATG, que codifican las proteínas Atg. Otros 40 genes son necesarios, pero también están implicados en otros procesos celulares. Las funciones de la autofagia son:

- Control de la homeostasis celular: para degradar componentes viejos o dañados, retirar el exceso de orgánulos que se hayan necesitado en un determinado momento (en un tratamiento médico, crece el REL, implicado en la detoxificación; pero éste también se degrada al suspenderlo). Los peroxisomas de las levaduras pueden ser o no necesarios según las condiciones del medio.

- Adaptación a la falta de nutrientes: en situaciones de carencias nutricionales, las células pueden degradar sus propias proteínas para obtener aminoácidos.

- Procesos de remodelación durante el desarrollo y la diferenciación. Por ejemplo, en los eritrocitos de mamíferos, el núcleo se expulsa y el resto de los orgánulos se destruyen por autofagia.

La autofagia está señalizada tanto por señales externas como por señales internas. Las señales externas son hormonas como la insulina (la inhibe), el glucagón y la ecdisona (la estimulan); así como la falta de nutrientes (la estimula). Las señales internas son proteínas mal plegadas, orgánulos en exceso o defectuosos, etc.

Las hormonas actúan sobre la fosfoinositol 3-quinasa (inhibidora), pero el

elemento central es TOR, regulador del metabolismo de carbohidratos, sobre el que convergen las rutas de señalización de la autofagia. Como el producto de la autofagia son los aminoácidos, un incremento en la concentración de aminoácidos inhibe TOR y viceversa. La activación de TOR tiene dos efectos importantes: activa la transcripción y la síntesis proteica e inhibe la autofagia.

En el secuestro del citoplasma para la formación del autofagosoma, se pensaba que era el REL, RER o el AG quien proporcionaba la doble membrana a los autofagosomas. Actualmente, se ha propuesto un nuevo orgánulo, denominado fagoforo, como el origen de las membranas que envuelven a los fagosomas.

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La inhibición de TOR activa la Atg1, que señaliza la formación de las vesículas. La activación de Atg1 recluta componentes a pequeñas vesículas, que se fusionarán para envolver el material, que será llevado a los lisosomas para su degradación. Se necesita un primer complejo para reclutar al resto. El segundo es necesario para que las vesículas se fusionen y cubran la parte del citoplasma a envolver. El tercer complejo se necesita para que se complete la formación del autofagosoma. En la fusión y degradación se produce gasto de energía, GTP, Rab, etc.

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CUESTIONES TEMAS 3-4

• Para distinguir entre endocitosis y exocitosis en hepatocitos, los cuales secretan albúmina y captan transferrina, añadimos transferrina marcada con oro coloidal al medio y después de unos pocos minutos fijamos las células, preparamos secciones finas y las tratamos con anticuerpos contra albúmina marcados con ferritina. El oro coloidal y la ferritina son electrodensos, por lo que se ven con microscopía electrónica y se distinguen perfectamente por su tamaño y densidad.

- ¿Por qué este experimento te permite diferenciar las vesículas de las vías endocítica y exocítica? ¿Cómo las distingues?

Las vesículas de exocitosis contendrán albúmina marcada con anticuerpos que contienen ferritina; mientras que las de endocitosis contendrán transferrina marcada con oro coloidal; de esta forma, como la ferritina y el oro coloidal se distinguen en microscopía electrónica por su diferente tamaño y densidad, se podrán distinguir las vesículas de endocitosis de las de exocitosis.

- Observas que no todas las vesículas marcadas con oro están recubiertas de clatrina. ¿Por qué?

La endocitosis de transferrina está mediada por clatrina; en embargo, pasado un tiempo, las vesículas perderán la cubierta de clatrina. De esta forma, las vesículas jóvenes aparecerán recubiertas de clatrina; mientras que las más tardías carecerán de cubierta.

• Un paciente tiene un receptor de LDL que enlaza normalmente el colesterol pero no puede ser incluido en vesículas recubiertas. Señala cual es el probable defecto molecular:

- La habilidad del receptor para cambiar de conformación y transmitir una señal al citosol.

- La habilidad del dominio citoplásmico del receptor para interaccionar con el adaptador de las vesículas recubiertas de clatrina (✔).

- No está en el receptor, sino en la molécula con la que interactúa el receptor. - La habilidad del dominio citoplásmico del receptor para interaccionar con

los componentes de COP II.

• El transporte de colesterol a los lisosomas depende de los receptores de las lipoproteínas de baja densidad y el reciclaje de los receptores se efectúa desde los endosomas periféricos.

- ¿Qué esperas que suceda si el pH en el interior de los endosomas periféricos se eleva a 7?

La carga no se separará, por lo que el complejo receptor-carga irá a los lisosomas.

- ¿Y si el pH en el exterior celular se baja a 6? Las LDLs no se podrían unir al receptor.

• Estás investigando sobre enfermedades debidas a defectos en los lisosomas.

Quieres pedir un proyecto de investigación para testar si la inyección de proenzimas lisosomales en la sangre de pacientes con la enzima fosfotransferasa no funcional puede corregir su enfermedad. Para convencer a los evaluadores, haz un esquema indicando la ruta que deben seguir las proenzimas lisosomales inyectadas para alcanzar los lisosomas de los pacientes que pretendes curar y las señales, receptores y cubierta que intervienen en cada uno de los pasos.

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• La ausencia de una determinada molécula en la membrana de los lisosomas permite diferenciarlos de los componentes del sistema endosomal. ¿Cuál es?

No es ninguna, debido a que las proteínas de la membrana de los lisosomas van a pasar antes por la membrana de los endosomas perinucleares.

• ¿Hay alguna molécula en la membrana de los endosomas perinucleares

que permita diferenciarlos de los lisosomas? Razona la respuesta y si es afirmativa di cuál es.

Se trata de los receptores, ya que se reciclan; aunque también podrían ser las proenzimas, que en los lisosomas se encuentran de forma activa.

• Haz un esquema indicando todos los pasos que dirigen las proenzimas lisosomales a los lisosomas. ¿Qué efecto tendría la adición de una señal destino lisosoma sobre el destino de una proteína citosólica? ¿Y sobre la localización de una proteína que normalmente es excretada? Razona la respuesta.

Los lisosomas contienen poderosas enzimas hidrolíticos que son transportados desde su sitio de síntesis en el RE vía aparato de Golgi y endosomas perinucleares. ¿Por qué estas enzimas no dañan a los constituyentes de estos orgánulos? ¿Y por qué no destruyen la membrana lisosomal?

• Un paciente llega a su clínica con una acumulación de cerebrósidos en sus lisosomas. ¿Cuál es su diagnóstico y qué terapia le sugeriría si el precio no fuera un factor limitante? Justifique la efectividad de la terapia sugerida.

Se debe a la carencia del enzima encargado de degradar los cerebrósidos, ya que si se acumulan es porque su degradación es deficiente; se trata así de una mutación en el gen que codifica para en la enzima que degrada los cerebrósidos.

Se le debería inyectar la preproteína en la sangre; ésta la tomarían las células por endocitosis por los receptores de M6P en la superficie. Las vesículas de endocitosis irán de forma constitutiva a los lisosomas, donde se transformarán en su forma activa. Sin embargo, esta terapia tiene como inconveniente su precio desorbitado.

• Pacientes con los síndromes de Hunter o Hurley raramente viven más de 10 años. Estos pacientes acumulan glucosaminoglucanos en los lisosomas debido a la falta de enzimas necesarias para su degradación. Cuando se fusionan células de pacientes de los tipos, los glucoaminoglicanos se degradan correctamente lo que indica que carecen de enzimas diferentes. Incluso si las células se cultivan juntas se corrigen los defectos en ambas. Además si cualquiera de las dos células se cultiva en el medio en el que ha crecido la otra también se corrigen sus defectos. Los factores presentes en el medio que corrigen los defectos se inactivan mediante tratamientos con proteasas, con peryodato (que destruye los hidratos de carbono) y con fosfatasa alcalina.

- ¿Qué piensas que son los factores de corrección? Que las proteasas destruyan los factores implica que se trata de factores

proteicos; que el peryodato los destruya implica que es una proteína glicosilada, y que la fosfatasa también los destruya implica que está fosforilada. Así, es la M6P.

- ¿Cómo crees que corrigen los defectos? En el medio debe haber proenzimas lisosomales, que pueden corregir estos

defectos al ser englobadas por endocitosis.

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- ¿Cómo crees que los inactivan los distintos tratamientos? La fosfatasa degrada la proteína, el peryodato degrada los glúcidos y la fosfatasa

elimina el grupo fosfato. - ¿Podrías esperar el mismo tipo de corrección para mutantes que pierden

enzimas citosólicas? No, porque las enzimas irían a los lisosomas, nunca al citosol.

• Los niños que tienen la enfermedad celular-1 sintetizan las proenzimas

lisosomales pero las secretan al exterior celular. En principio, la enfermedad puede ser causada por mutaciones en la fosfotransferasa, en la fosfoglicosidasa o en el receptor M6P. Las tres potenciales clases de defectos pueden distinguirse por la habilidad de varios tipos de sobrenadantes de cultivos para corregir los defectos en las células mutadas. Tienes tres pacientes A, B y C; has cultivado sus células con distintos tipos de sobrenadantes y has obtenido los siguientes resultados:

1. El sobrenadante de células normales corrige los defectos en B y C pero no en A.

2. El sobrenadante de A corrige los defectos en células de Hurler, pero los sobrenadantes de B y C no.

3. Si los sobrenadantes de células mutadas se tratan con fosfoglicosidasa los sobrenadantes de A y C corrigen el defecto de las células de Hurler, pero el sobrenadante de B no.

De estos resultados, deduce el defecto en cada una de las tres líneas celulares mutantes.

El primer resultado sugiere que, al no corregir el defecto de A a pesar de secretar al medio enzimas con la señal M6P intacta, las células A son incapaces de tomarla, por lo que su receptor de la M6P debe estar mutado.

El segundo resultado confirma el resultado anterior: los sobrenadantes de B y C no contienen enzimas funcionales, por lo que no corrige las células Hunter; sin embargo, A sí que secreta enzimas funcionales, pudiendo corregir las células Hunter.

El tercer resultado hace pensar que las células C son mutantes para la fosfoglicosidasa; mientras que las células B son, por exclusión, mutantes para la fosfotransferasa.

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TEMA 5 LA BIOGÉNESIS DE LOS PEROXISOMAS

Los peroxisomas contienen enzimas que producen peróxido de hidrógeno (H2O2),

producto tóxico; para su detoxificación tienen entonces la enzima peroxidasa, que cataliza la reacción H2O2 → H2O + ½O2. Son orgánulos de membrana sencilla que suelen ser esféricos, pero también pueden formar túbulos. Al observar preparaciones a microscopía electrónica, pueden observarse a veces cristales de la enzima urato oxidasa, que precipita al procesar las preparaciones. Las oxidasas intervienen en rutas anabólicas y catabólicas del organismo.

Tienen distintas baterías enzimáticas en distintos organismos, interviniendo en diferentes rutas. Los peroxisomas pueden adaptar su contenido enzimático a las necesidades de la célula, lo cual es destacable en levaduras, donde según el medio en el que crezcan, los lisosomas pueden llegar a desaparecer por total degradación y formarse de novo posteriormente por biogénesis. Además, se reparten entre las células hijas en la mitosis.

Los glioxisomas son los peroxisomas de las semillas de plantas oleaginosas, y en ellos se realiza el ciclo del glioxilato (lípidos → glúcidos). Cuando la semilla se transforma en una planta, se transforman en peroxisomas normales; sin embargo, cuando la planta envejece, algunos peroxisomas pueden revertir de nuevo a glioxisomas.

Los peroxisomas llevan a cabo reacciones metabólicas muy primitivas, por lo que en principio se pensó que eran organismos independientes incluidos por endocitosis, que con el tiempo transferirían su genoma al núcleo. Sin embargo, observaciones posteriores a microscopía electrónica demostraron que pueden formar un retículo con porciones tubulares y que hay conexiones morfológicas entre el RE y los peroxisomas, indicando entonces que se forman a partir del RE. Esta idea se mantuvo hasta que se pudieron marcar proteínas para seguirlas, viéndose entonces que los peroxisomas no tienen genoma y que las proteínas que van a los peroxisomas se sintetizan en ribosomas citosólicos libres, incluyéndose en peroxisomas preexistentes. En contra de esta formación peroxisomal en el RE estaba el hecho de que los peroxisomas se dividen y se reparten entre las células hijas en la mitosis. De esta forma, los peroxisomas no pertenecen al sistema de endomembranas, teniendo características de biogénesis similares a mitocondrias y cloroplastos.

ORGANISMO

Plantas Protozoos

Mamíferos Semillas Hojas

Levaduras Tetrahymena Trypanosoma

Nomenclatura (Micro) peroxisomas

Glioxisomas

Peroxisomas

Peroxisomas

Peroxisomas

Glicosomas

Sistema enzimático - Oxidasas (H2O2)

+

+

+

+

+

–*

- Catalasa + + + + + ± - β-oxidación + + + + + + - Ciclo del glioxilato – + – + + –* - Síntesis de éteres lipídicos

+

+

- Fotorrespiración – – + – – – - Glucolisis – – – – – +

A principios del siglo XXI, se vio que algunas proteínas de los peroxisomas se

insertan en el RE, del cual parten en vesículas para su transporte. Estudiando el proteoma de los peroxisomas, se vio que la mayoría de esas proteínas, incluidas las de su biogénesis, son de origen eucariota, estando muy relacionadas con las proteínas que

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eliminan del RE las proteínas mal plegadas para su degradación; sin embargo, muchos enzimas son de origen procariota (de α-proteobacterias), y se postula que provienen de la mitocondria, ya que de ésta pueden partir vesículas que se fusionan con el RE y los lisosomas.

Estudios más detallados indican que sólo se pueden formar peroxisomas de novo cuando la célula no tiene ninguno de ellos: si la célula ya tiene algún peroxisoma, éste crece y se divide.

• Funciones de los peroxisomas. - β-oxidación de los ácidos grasos de cadena larga. - Síntesis de lípidos con enlace éter (tejido nervioso y corazón). - Fotorrespiración (en organismos vegetales). - Glucolisis. Los peroxisomas pueden degradarse por autofagia, crecer, dividirse y cambiar su

contenido enzimático. • Biogénesis de los peroxisomas. Las proteínas peroxisomales se caracterizan en dos tipos:

- Peroxinas: Son las proteínas peroxisomales implicadas en la biogénesis, codificadas por los genes PEX. Las peroxinas son en su mayoría proteínas de membrana o asociadas a ella (ya que algunas ciclan entre el citosol y el interior de la membrana; son los receptores), estando implicadas también en procesos como la división y la fusión. Hay dos tipos:

◦ Peroxinas tempranas o de clase 1. ◦ Peroxinas tardías o de clase 2.

- Proteínas de la matriz. En condiciones normales, los peroxisomas se forman por

crecimiento y división de otros preexistentes; en ausencia de ellos, se produce su biogénesis a partir del RE. En levaduras, las peroxinas tempranas o de clase 1 (Pex2, 3, 16 y 19) se insertan en cualquier lugar del RE en el caso de las tres primeras (Pex2, 3 y 16); sin embargo, Pex19 se sintetiza en ribosomas citosólicos y se asocia posteriormente a Pex3.

Estas peroxinas tempranas tienen afinidad por las balsas lipídicas formadas por ergoesterol y ceramida, constituyendo una parte del RE denominada plantilla peroxisomal (peroxisomal template), que es capaz de formar vesículas que se separan del RE. La región del RE que forma las vesículas preperoxisomales no es la misma de la que parten vesículas al AG (elementos de transición).

Una vez formadas las plantillas peroxisomales, las peroxinas tempranas o de clase 1 son capaces de captar e incluir en la membrana las peroxinas tardías o de clase 2 (es así la maquinaria de importación de proteínas de la matriz y otras proteínas de membrana). Todas las proteínas de clase 2 se sintetizan en ribosomas citosólicos libres; posteriormente son importados a la membrana por las de clase 1; posteriormente se importan las proteínas de membrana y finalmente las proteínas de la matriz. Además, se deben añadir nuevos lípidos para que crezca el peroxisoma; éstos se sintetizan en el RE y llegan a los

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peroxisomas por puntos de contacto entre las membranas del peroxisoma y del RE. En mamíferos, la situación es similar, pero con diferencias a nivel de la inclusión

de las proteínas (peroxinas tempranas o de clase 1). Así, se ha comprobado que en mamíferos Pex16 tiene el péptido señal hidrofóbico, pudiéndose incluir en cualquier lugar del RE; pero luego se segrega en una región denominada extensión laminar del RE, donde parecen incorporarse las otras peroxinas tempranas o de clase 1. De ahí se liberan, más que vesículas, túbulos; éstos incorporan el resto de las proteínas de membrana. Estos túbulos pueden fusionarse entre sí para formar un retículo, se incorporan las proteínas de la matriz y de este retículo se desprenden los peroxisomas maduros.

En plantas, las peroxinas tempranas o de clase 1 sólo se incorporan en una porción especializada del RER, denominada retículo preperoxisomal. Así, distintos organismos han evolucionado vías para la inclusión de las peroxinas de clase 1 en el RE. Cabe hacer dos puntualizaciones:

- Las vesículas preperoxisomales en las que aún no se incluyeron las proteínas de la matriz o peroxisomas mutantes que carecen de las proteínas de la matriz (peroxisomas fantasmas) son capaces de dividirse y segregarse a las células hijas.

- Cada vez está más claro que hay un sistema peroxisomal con distintos componentes que forman vesículas con distintas funciones: hay así distintos estadíos de maduración. Hay pruebas de que, de forma previa a la incorporación de las proteínas de la matriz, puede haber reciclaje del material al RE.

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• Señales y moléculas implicadas. De entre las peroxinas tempranas o de clase 1, destaca Pex19, que es un receptor

para la señal del resto de las proteínas de membrana. La señal más común de importación a la membrana está formada por 4 aminoácidos básicos y un segmento transmembrana (el que luego quedará incluido). Las peroxinas Pex 2, 3 y 17 son maquinaria de importación para las proteínas de membrana.

Las peroxinas tardías o de clase 2 están implicadas en la importación de las proteínas de la matriz. Hay dos señales:

- PTS1, es la secuencia SKL o una variante de la misma en su extremo carboxi-terminal. Su receptor es la peroxina tardía Pex5, además de otras señales. Pex5 contiene 7 dominios tetratricopeptide repeat (TRP), que reconocen la señal. También se ha visto que reconoce otras señales por otros dominios.

- PTS2: una secuencia de nueve aminoácidos (R/K, L/V/I, X5, H/Q, L/A). Aunque la mayoría de las veces se encuentra en el extremo amino-terminal. La secuencia PTS2 también funciona en localizaciones internas. Su receptor es la peroxina tardía Pex7, aunque a veces necesita un correceptor. La peroxina Pex7 pertenece a la familia de proteínas WD40 que tienen una secuencia en cuyo centro está la secuencia Trp-Asp (WD). En levaduras funciona en asociación con otras peroxinas.

Todas estas moléculas forman dos subcomplejos:

- Subcomplejo de acoplamiento: Formado por Pex 13, 14 y 17. Pex13 y Pex14 son los acopladores que reconocen a los dos tipos de receptores con su carga. Pex5 y Pex7 reconocen a ambos. Al interaccionar con los acopladores, la carga se internaliza, separándose las proteínas de la matriz de sus receptores citosólicos mediante gasto de energía. Se presenta un problema: estudios electrofisiológicos indican que el transportador es un poro, pero no hay imágenes de microscopía electrónica que verifiquen su existencia, por lo que se

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piensa que son transitorios. Pueden pasar proteínas plegadas e incluso oligomerizadas, lo que es una diferencia significativa con la importación al RE, mitocondrias y cloroplastos. En el núcleo, entran y salen los receptores con sus cargas, siendo similar a la importación peroxisomal.

- Subcomplejo anillo-dedo: Contiene Pex 2, 10 y 12. Enlazado al anterior subcomplejo mediante Pex8, devuelve los receptores y correceptores al citoplasma con gasto de energía, ya que algunas proteínas son ATPasas o ubiquitina ligasas; para su salida al citosol, las proteínas se monoubiquitinizan. A veces puede haber poliubiquitinación, por lo que las proteínas van al proteosoma para su degradación.

Los mecanismos de fusión, proliferación y división finalizan con la producción del Pex11, que es capaz de reclutar moléculas y complejos que interaccionan con las proteínas Fsh1, que son capaces de reclutar a la dinamina.

Durante mucho tiempo, se pensó que los peroxisomas eran prescindibles; pero se ha demostrado que el déficit en funciones peroxisomales causa graves enfermedades. Las más graves son aquellas en las que fallan los componentes del sistema de importación, y se agrupan en tres categorías:

- Grupo 1: incluye las enfermedades más severas, que son aquellas caracterizadas por una pérdida generalizada de las funciones peroxisomales. Los peroxisomas de las células de estos pacientes carecen de varias enzimas de la matriz, de tal modo que el peroxisoma está constituido sólo por un fantasma formado por membrana, pero varias de las proteínas de la matriz se encuentran en el citosol, lo que indica que falla la capacidad de importar las proteínas de la matriz dentro del orgánulo. Son: síndrome de Zellweger, adrenoleucodistrofia neonatal, acidemia hiperpipecólica y la enfermedad infantil de Refsum. Los enfermos presentan malformaciones craneofaciales, anormalidades neurológicas, oculares y hepáticas y mueren en la primera década después del nacimiento.

- Grupo 2: Incluye enfermedades causadas por la pérdida de un pequeño grupo de funciones peroxisomales, debido a que los peroxisomas de estos pacientes carecen de los enzimas correspondientes.

- Grupo 3: Comprende enfermedades genéticas en las cuales una única enzima peroxisomal no es funcional.

El número de mutaciones posibles en la importación es mayor, aunque mutaciones en distintos componentes pueden provocar la misma enfermedad. Al no haber rutas del exterior celular a los peroxisomas, no tiene sentido inyectar preproteínas peroxisomales a la sangre; aún así, pueden partir vesículas de las mitocondrias a los peroxisomas, por lo que se estudia esa posibilidad.

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TEMA 6 TRANSPORTE BIDIRECCIONAL ENTRE EL NÚCLEO Y

EL CITOPLASMA

El núcleo está separado del citoplasma mediante la envuelta nuclear, componente que consta de la cisterna perinuclear (donde se distingue una membrana nuclear externa y otra interna) y los complejos del poro nuclear, orificios que permiten el intercambio de material entre el núcleo y el citoplasma en distintos puntos de la envuelta.

La membrana nuclear externa y la envuelta nuclear son extensiones del RE; de hecho, a la membrana nuclear externa se le pueden asociar ribosomas. La membrana nuclear interna tiene una composición específica, ya que en ella se encuentran proteínas que unen las laminas (de tipo A, B y C), que son filamentos intermedios que forman la lámina nuclear y le dan consistencia al núcleo.

• Complejo del poro nuclear. El complejo del poro nuclear es el lugar donde se realiza el transporte entre el

núcleo y el citoplasma. Tiene una simetría ortogonal: las proteínas que lo forman están en número de 8 o múltiplo de 8. En este complejo se distinguen distintas regiones:

- Filamentos citoplásmicos: Son estructuras perpendiculares a la superficie de la envuelta nuclear que se internan en el citoplasma de forma paralela entre sí. - Andamio. Consta de varias partes:

◦ Anillo citoplásmico: Del que parten los filamentos citoplásmicos. ◦ Columnas: Entre ambos anillos; los anillos cierran cada columna por arriba y por abajo. En el medio hay una estructura en forma de barril que contiene el transportador, insertado en el centro del andamio pero sin formar parte de él. Algunas proteínas de las columnas son proteínas transmembrana; otras forman la barriga que contiene el transportador central. Entre las barrigas de las columnas hay un hueco; hay así 8 orificios entre el andamio y el transportador central, que se denominan canales periféricos. En el transportador central, con forma de barril, hay dos diafragmas superior e inferior que, aunque esté totalmente cerrados, dejan un pequeño orificio: es el canal central, un noveno canal. A través de los canales periféricos y del canal central pasan de forma pasiva moléculas de bajo peso molecular, igualando las concentraciones núcleo/citoplasma: son nucleótidos, azúcares, etc. El resto de transporte se realiza por el canal central, y se trata de un transporte activo: se produce entrada y salida de proteínas (ya que en el núcleo los ribosomas no pueden unirse al mRNA), excepto las muy pequeñas; y en muchos casos se trata de proteínas que ciclan entre el núcleo y el citoplasma. ◦ Anillo nuclear: En la cara nuclear, del que parte la cesta nuclear.

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- Cesta nuclear: Es una estructura formada por filamentos nucleares que se disponen de forma oblicua sin llegar a confluir, terminando en una estructura anular; el conjunto es la cesta nuclear.

Los RNAs se transcriben en el núcleo, y muchos deben enviarse al citoplasma

(tRNA, rRNA, mRNA, etc.); trabajando unidos a proteínas, las cuales entran en el núcleo, se complejan con el RNA y salen ambos unidos. Los ácidos ribonucleicos nucleares pequeños o U’s salen solos al citoplasma, donde se unen a las proteínas correspondientes para formar las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas; y luego vuelven al núcleo para colaborar en el splicing. Lo más grande que entra o sale del núcleo son las subunidades ribosómicas, que son ribonucleoproteínas.

Lo que entra y sale por el transportador central lo hace por transporte activo, con gasto de energía. Este transporte activo es específico, lo que se contrapone a la inespecificidad del transporte pasivo. Así, el transporte activo depende de señales en las moléculas transportadas: el péptido señal hidrofóbico se elimina si la proteína va al interior del retículo; sin embargo, las señales que introducen la proteína al núcleo nunca son eliminadas, ya que la señal se debe usar más de una vez (en ciclos núcleo/citoplasma, etc.); en el RE, si la proteína sale, se va a degradar. Incluso si se va a quedar en el núcleo, la proteína no pierde la señal porque en la mitosis se produce la ruptura de la envuelta nuclear; esta señal permite que se puedan importar a posteriori las proteínas al núcleo.

Las proteínas de los filamentos citoplásmicos y la cesta nuclear juegan un papel como receptores, interaccionando con los complejos que entran y salen del núcleo. La N-glicosilación empieza en el RE y se completa en el AG; mientras que la O-glicosilación se produce en el AG: algunas proteínas del complejo del poro tienen un

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solo azúcar (vertebrados) u oligosacáridos (plantas), que siempre está O-enlazado; estas glicosilaciones se producen en el citoplasma.

Los diafragmas del transportador central son ATPasas (miosina); de forma tradicional, se pensaba que los componentes del citoesqueleto eran citoplásmicos, pero se ha visto que hay actina, miosina y filamentos intermedios en el interior del núcleo. Estos diafragmas se abren por interacción con la carga; para su apertura se gasta energía en forma de ATP. También se gasta energía por una proteína G monomérica (Ran). Los diafragmas se abren lo justo para que pase la molécula; así, el diámetro máximo de apertura es el de la subunidad mayor de los ribosomas. Cuando la carga que va a entrar o salir pasa al diafragma, éste se abre; la carga pasa al transportador, se abre el otro diafragma y la carga pasa al otro lado.

MOLÉCULA SEÑAL ADAPTADOR

(Carioferina α) RECEPTOR (Carioferina β)

OTROS

IMPORTACIÓN Proteínas. Ricas en aa+ - Bipartita. - Única. Otras.

Importina α. No.

Importina β. Transportina.

Filamentos citoplásmicos. Ran.

IMPORTACIÓN RNPnp. En las proteínas. Esnurportina. Importina β. Filamentos citoplásmicos. Ran.

EXPORTACIÓN Proteínas. Importina α.

Ricas en Leu.

Exportina 1/ CRM1. CAS.

Cesta nuclear. Ran.

EXPORTACIÓN Ribonucleo- proteínas (tRNA, miRNA).

En las proteínas. Exportinas. (T para tRNA).

Cesta nuclear. Ran.

EXPORTACIÓN npRNA. Capuchón de 5’ metil guanosina.

CBC. Exportina 1/ CRM1.

Cesta nuclear. Ran.

EXPORTACIÓN mRNA. En las proteínas. Proteínas. Exportador de mRNA.

Cesta nuclear. Ran.

EXPORTACIÓN Subunidades ribosómicas.

En las proteínas. Exportina 1/ CRM1.

Cesta nuclear. Ran.

Sin embargo, los ácidos ribonucleicos son más largos que el transportador

central, por lo que tienen varias señales de apertura. Una primera señal pasa por el transportador central, lo abre; y posteriormente una segunda señal interacciona con el transportador. De esta forma, el canal central se mantiene abierto mientras pasa el RNA.

El complejo de la ribonucleoproteína tiene señales de importación y exportación; la proteína no está en contacto con el complejo del poro, por lo que debe haber receptores que reconozcan la señal: éstas interaccionan con los filamentos citoplasmáticos o la cesta nuclear, de forma que los receptores también pasan.

• Componentes implicados en el transporte. Algunas proteínas necesitan adaptadores, que interaccionan con la señal y el

receptor. Éste, por otro dominio, debe relacionarse con los filamentos citoplasmáticos o la cesta nuclear. Los adaptadores son las carioferinas α; mientras que los receptores son las carioferinas β. Son así de la misma familia proteica. La responsable de la bidireccionalidad del transporte es la proteína Ran.

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Las moléculas que se

reciclan e intervienen en el transporte utilizan receptores especiales; esto es importante, porque así no tienen que competir con las moléculas importadas o exportadas del núcleo. De esta forma, adaptadores y receptores tienen su propio receptor, por lo que no compiten con los productos que

entran y salen del núcleo. La proteína Ran es una

proteína de unión a GTP monomérica que es reponsable de la direccionalidad del transporte. Como toda proteína de unión a GTP monomérica, Ran alterna entre un estado GTP-enlazado (activo) y otro estado GDP-enlazado (inactivo). La inactivación se debe a una GTPasa (Ran-GAP); mientras que la activación se debe a Ran-GEF. Estas dos proteínas tienen distinta distribución: Ran-GAP está en el citoplasma; mientras que Ran-GEF está en el núcleo. Así, Ran está activa en el núcleo e inactiva en el citoplasma.

Ran se une a los complejos que entran en el núcleo y los disocia. La molécula, con la señal de localización nuclear, el receptor y el adaptador, es el complejo que interacciona con los filamentos citoplásmicos y entra en el núcleo. Allí, se une a Ran-GTP, por lo que el complejo se disocia: primero se libera la molécula que entró; posteriormente, el adaptador; sin embargo, Ran-GTP se mantiene unido al receptor. El complejo proteico ya está en el núcleo, pero el adaptador y el receptor unidos a Ran-GTP no hacen nada.

Ran-GTP se une a los complejos que salen del núcleo, saliendo unidos a ella. En el citoplasma, el GTP enlazado a Ran se hidroliza a GDP, lo que provoca la disociación de los complejos. Lo que sale del núcleo es un complejo de la molécula con el receptor y Ran-GTP unidos. En el citoplasma, la hidrólisis del GTP de Ran provoca la disociación del complejo. Para poder salir, la proteína debe tener una señal de exportación nuclear; y estas señales nunca se eliminan, porque muchas ciclan entre el

Receptores y adaptadores

Importación

Exportación

Importinas

Exportinas

α β

α β

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núcleo y el citoplasma (incluso las histonas la mantienen, para volver al núcleo tras la mitosis).

Para la exportación, la molécula debe contener una señal de exportación,

uniéndose al adaptador (si es necesario), el receptor y a Ran-GTP, el complejo sale, se hidroliza el GTP de Ran en el citoplasma y se disocia el complejo. Ran-GDP es lo suficientemente pequeña como para atravesar los canales periféricos a favor de gradiente, transformándose en Ran-GTP en el núcleo.

Los RNAs van unidos a proteínas, excepto los RNAs nucleares pequeños, con un capuchón de 5-adenosil metionina. Los RNAs tienen sus propios receptores y adaptadores. En moléculas muy largas como los mRNAs, hay muchas señales que mantienen abierto el poro central.

Muchas veces, las moléculas que deben entrar en el núcleo son factores de transcripción (TFs) que regulan la transcripción de los genes que controlan: una forma de regular la transcripción del DNA es mantener los TFs en el citoplasma, donde no pueden actuar; esto se consigue de dos formas:

1. Asociación con otras proteínas: De forma que no puedan interaccionar con los receptores de la importación; son así inhibidores que bloquean la señal de localización nuclear. Por fosforilación del inhibidor, éste se degrada y el TF queda libre, pudiendo ser translocado al interior del núcleo para su actuación.

2. Equilibrios fosfo/defosfo: La fosforilación de la señal impide su reconocimiento por parte de los adaptadores o receptores, y por extensión también su entrada en el núcleo, manteniéndose así en el citoplasma hasta la llegada de una señal que active una fosfatasa que elimine el grupo fosfato (la forma fosforilada no es siempre la activa) para permitir su entrada al núcleo.

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1. Exporte nuclear.

2. Importe nuclear.

67

3. Exporte de los RNAs.

4. Regulación del transporte al núcleo.

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TEMA 7 LA BIOGÉNESIS DE LAS MITOCONDRIAS Y LOS

CLOROPLASTOS

Las mitocondrias y los cloroplastos son orgánulos limitados por doble membrana, aunque los cloroplastos existen también en formas con tres o cuatro membranas, siendo así producto de varias simbiosis consecutivas; esto sucede en ciertas algas.

Los cloroplastos son una familia de orgánulos conocidos como plastos, como son también los cromoplastos y los leucoplastos, separados también por doble membrana y conteniendo DNA pero estando peor caracterizados que los primeros. Unos plastos pueden además interconvertirse en otros.

Mitocondrias y cloroplastos son productos de simbiosis con procariotas: con una α-proteobacteria en el primer caso y de una fotobacteria en el segundo; y ambos tienen su propio genoma. Con el tiempo, la mayor parte del genoma de mitocondrias y cloroplastos ha sido transferido al núcleo; sin embargo, tanto unos como otros contienen sistemas genéticos completos: tienen su propio DNA y ribosomas y realizan la duplicación, transcripción y traducción. Son sistemas genéticos de tipo procariota; y aunque la mayoría de las enzimas de la duplicación, transcripción y traducción del DNA están en el genoma nuclear, al ser de tipo procariota, nunca transcriben los genes nucleares.

Los ribosomas son 70S y tienen afinidad a los antibióticos. En mitocondrias hay diferencias con procariotas y cloroplastos a nivel ribosómico, aunque también las hay entre unas mitocondrias y otras. El rRNA 5S sólo existe en ribosomas mitocondriales de plantas; y no es el rRNA 5S de eucariotas, sino que equivale al 5.8S de eucariotas.

GENOMA MITOCONDRIAL

Mamíferos Levaduras Hongos (Neurospora)

Plantas

Tamaño. 14-18 kb 78 kb 19-108 kb 200-2500 kb rRNAs: - Subunidad menor. - Subunidad mayor. - RNA 5S.

16S 12S –

21S 15S –

21S 15S –

26S 18S +

Número de tRNAs. 22 23-25 23-25 ≈ 30 Proteína ribosomal (var-1). – + + ?

Subunidades 1, 2 y 3 de la citocromo c oxidasa.

+ + + +

Subunidad b del apocitocromo del CoQH2- citocromo c reductasa.

+ + + +

ATPasa F0: - Subunidad 6. - Subunidad 8. - Subunidad 9.

+ + –

+ + +

+ + –

+ + +

Subunidad α de la ATPasa F1. – – – +

Número de subunidades de la NADH-CoQ reductasa.

7 0 6 6

El DNA es de tipo circular, habiendo varias moléculas por orgánulo. El tamaño

de una molécula de DNA mitocondrial es muy variable: algunos de plantas son muy grandes y en humanos es muy pequeño; sin embargo, las diferencias en el número de genes son muy pequeñas. Esto se debe a que los de plantas están formados en gran

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proporción por secuencias no codificantes; mientras que la secuencia del DNA mitocondrial humano es casi toda codificante. En humanos, de un único inicio de replicación, se transcriben a RNA sus dos cadenas: una es codificante casi al 100%; mientras que la otra apenas codifica algunos tRNA. El código genético es degenerado, empleándose 33-34 tRNAs para 21 aminoácidos; en la mitocondria, éste es menos degenerado porque no se tiene en cuenta la última letra del codón.

DIFERENCIAS ENTRE LOS CÓDIGOS GENÉTICOS NUCLEAR Y MITOCONDRIAL

Mitocondrias Codón Núcleo Plantas Levaduras Drosophila Mamíferos

UGA Stop Stop Trp Trp Trp AUA Ile Ile Met Met Met CUA Leu Leu Thr Leu Leu

AGA-AGG Arg Arg Arg Ser Stop

Hay ciertas diferencias en la universalidad del código genético; y esto se debe a que los cambios producidos en las mitocondrias no produjeron proteínas inviables, y probablemente esto se deba al bajo número de proteínas que codifican. En algunas especies, aunque no en humanos, el genoma mitocondrial codifica proteínas ribosomales. También codifica algunas subunidades de proteínas de la membrana mitocondrial interna, estando el resto de ellas codificadas en el genoma nuclear; esto implica una necesidad de regulación. En levaduras, se ha comprobado que en ausencia del genoma mitocondrial, se pueden mantener mitocondrias, aunque éstas no son funcionales. Algunos genomas mitocondriales de plantas tienen intrones, al igual que en cloroplastos; esto es llamativo porque en bacterias no hay intrones. Éstos parece que procede de intrones que catalizan su propio corte y empalme (splicing); la condición primitiva es la existencia de intrones autocatalíticos, aunque éstos se han perdido en las eubacterias y en muchas mitocondrias.

El genoma del cloroplasto es más procariota, manteniendo la universalidad del

código genético. Hay diferencias entre los cloroplastos de diferentes especies: codifican rRNA, tRNA; y RNA polimerasas y subunidades ribosómicas (siendo estas dos últimas dos diferencias con la mitocondria) y proteínas para la fotosíntesis (no sólo de la membrana tilacoidal, sino también subunidades de la Rubisco). También tiene genes de proteínas de la cadena respiratoria, que deberían estar en la mitocondria.

Durante mucho tiempo, se pensó que no había salida de material de estos orgánulos; sin embargo, en la apoptosis sale el citocromo c de la mitocondria; y de este orgánulo también pueden partir vesículas.

El 95% de las proteínas mitocondriales son codificadas por el genoma nuclear, aunque la mayor parte de ellas son de origen procariota; la biogénesis mitocondrial supone la contribución de dos genomas. En levaduras se ha visto que, en ausencia del genoma mitocondrial, se pueden formar mitocondrias, aunque éstas no son funcionales.

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Se importan todos los precursores lipídicos: en el caso de la cardiolipina (que confiere impermeabilidad a la membrana mitocondrial), sus ácidos grasos se importan del RE.

Mientras que los mRNA eucariotas son monocistrónicos (codifican para una sola proteína), los mRNA procariotas son policistrónicos; y eso es lo que ocurre en el caso de mitocondrias y cloroplastos. En los ribosomas del orgánulo se sintetizan proteínas en su mayoría de la membrana mitocondrial interna El codón de iniciación, AUG, codifica para la formilmetionina.

En el caso de las proteínas codificadas por el genoma nuclear (enzimas mitocondriales, enzimas de la β-oxidación y de la cadena respiratoria, etc.), se sintetizan en ribosomas citosólicos y se importan de forma postraduccional a la mitocondria. Irá así a algún compartimento mitocondrial: membrana externa, espacio intermembrana, membrana interna o matriz mitocondrial, por lo que las proteínas codificadas por el genoma nuclear tienen señales de importación mitocondrial en las que no sólo se especifica el destino “mitocondria”; sino también a cuál de sus compartimentos o membranas debe ir.

1. Señales de importación mitocondrial. - Señal matriz o presecuencia: Está formada por unos 20 aminoácidos

que forman una hélice α cerca del extremo N-terminal. Algunos de estos aminoácidos tienen carga positiva, y quedan hacia el mismo lado de la hélice en su estructura tridimensional. En proteínas que van a la matriz, esta secuencia va seguida de una señal de corte, ya que debe eliminarse; sin embargo, algunas proteínas de la membrana mitocondrial interna también emplean la señal matriz que, una vez eliminada, deja al descubierto otra señal que dirige la proteína a la membrana mitocondrial interna. En proteínas del espacio intermembrana, la importación comienza con la señal matriz; pero ésta tiene a continuación una señal de importación al espacio intermembrana. También tienen la señal matriz algunas proteínas de la membrana externa, donde va seguida de una señal de parada de transferencia e inserción en la membrana mitocondrial externa e interna.

- Señales internas: Forman parte de un segmento transmembrana de la proteína, por lo que no se eliminan.

2. Chaperonas que mantienen las proteínas desplegadas. - Para la señal matriz (hidrofílica): Hsp70 citosólica y Ydj para las

proteínas con señal matriz y proteínas pequeñas. - Para las señales internas (hidrofóbicas): MSF para las señales internas

de las proteínas de la membrana mitocondrial interna.

71

3. Receptores en la membrana mitocondrial externa. Son Tom20 para las presencuencias (señal matriz) y Tom70 para las señales internas. 4. Complejos de translocación para las membranas. - Tanto si las proteínas tienen señal matriz como señales internas, la

importación comienza en el complejo Tom de la membrana mitocondrial externa. Hay dos receptores para las señales matriz y las internas, pero el complejo translocador es el mismo. El complejo de translocación Sam se emplea para insertar proteínas con segmentos transmembrana. Para la inserción en la membrana mitocondrial externa, la proteína pasa de Tom a Sam.

- En la membrana mitocondrial interna se encuentra Tim, que se desdobla en Tim22 (para proteínas con señales internas) y Tim23 (para proteínas con la señal matriz). El complejo Oxa transloca las proteínas a la membrana, tanto para las que llegan de la matriz como para las que llegan del espacio intermembrana.

5. Chaperonas en el espacio intermembrana. Complejo Tim. 6. Peptidasas y chaperonas que ayudan al correcto plegamiento proteico en

la matriz.

Así, se configuran varias rutas a la matriz y a las membranas mitocondriales: - Membrana mitocondrial externa: Señal matriz → Receptor → Tom

reconoce la señal matriz y la transfiere al translocador, el cual detiene la transferencia e inserta la proteína en la membrana mitocondrial externa.

- Espacio intermembrana: Es la misma vía que la anterior, pero al llegar al espacio intermembrana la proteína interacciona con los componentes

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de Mia, maquinaria de importación y ensamblaje de las proteínas del espacio intermembrana, que ayuda a su correcto plegamiento.

- Membrana mitocondrial interna: Tom → Tim. De Tim pueden insertarse directamente del translocador a la membrana, o pasar a la matriz e insertarse más tarde.

- Matriz: En la matriz, el complejo ATPasa Pam tira de las proteínas contenidas en el complejo Tim hacia la matriz mediante ciclos de hidrólisis de ATP; posteriormente, una peptidasa corta la señal matriz. Las chaperonas de la matriz ayudarán al correcto plegamiento de la proteína.

Las proteínas con señales internas tienen otro receptor; en el espacio intermembrana hay chaperonas que las mantienen desplegadas y que las transfieren al translocador para las señales internas de la membrana mitocondrial interna, que la inserta en el espacio intermembrana. En el espacio intermembrana hay una elevada concentración de protones, por lo que se crea una diferencia de potencial a ambos lados de la membrana mitocondrial interna, con cargas positivas en el espacio intermembrana y cargas negativas en la matriz. Como la señal matriz tiene aminoácidos con carga positiva, esta señal es repelida por las cargas positivas del espacio intermembrana y atraída por las cargas negativas de la matriz; esto es también una fuente de energía para que la señal matriz atraviese la membrana mitocondrial interna.

Las proteínas con láminas β pasan por Tom, chaperonas las mantienen desplegadas, pasan a Sam para meterse en la membrana y finalmente otra chaperona ayuda a su correcto plegamiento.

El complejo Oxa se emplea para insertar proteínas de dos orígenes en la membrana mitocondrial interna:

- Codificadas por el genoma nuclear: Llegaron a la matriz por los complejos Tom y Tim; en la matriz se les cortó la señal matriz, quedando a la vista un péptido hidrófobo que reconoce el complejo Oxa, que lo inserta en la membrana mitocondrial interna.

- Codificadas por el genoma mitocondrial: Se sintetizan en la matriz, y también tienen la señal “membrana mitocondrial interna” (segmento hidrofóbico transmembrana), siendo así reconocidas por Oxa e insertadas en la membrana mitocondrial interna.

Las chaperonas citosólicas, que mantienen desplegadas las proteínas, gastan

ATP: es un primer gasto de energía. También se gasta energía en el paso de la

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membrana mitocondrial interna, pero esta energía es aportada por el gradiente de protones: éstos se acumulan en el espacio intermembrana, haciendo que éste tenga una carga positiva con respecto a la matriz, que tiene carga negativa: como la señal matriz tiene carga positiva, es repelida del espacio intermembrana y atraída a la matriz. En la matriz, vuelve a haber gasto de energía por una ATPasa que, por ciclos de hidrólisis de ATP, tira de la proteína para introducirla en la matriz; posteriormente, unas chaperonas ayudan al correcto plegamiento proteico, también mediante hidrólisis de ATP.

• Transporte y modificación de lípidos en la mitocondria. Los lípidos y sus precursores se sintetizan en el RE, y hay dos hipótesis para

explicar el transporte de lípidos del RE a la mitocondria: - Proteínas de intercambio de fosfolípidos:

Son proteínas citosólicas en cuyo interior hidrofóbico viajan los fosfolípidos. Estas proteínas toman los lípidos de las membranas del RE, en regiones donde los lípidos están más concentrados; de esta forma, se transportan por el citosol y se liberan en donde están en menor concentración, como es la membrana mitocondrial.

- Paso directo a la membrana mitocondrial: Se postula que los fosfolípidos vayan directamente de la membrana del RE a la membrana mitocondrial, ya que se han visto puntos de contacto entre la superficie de la mitocondria y la del RE mediante microscopía electrónica, postulándose que por ellos puedan pasar lípidos del RE a la mitocondria.

Los lípidos esenciales de la mitocondria son importados del RE, y son la fosfatidilcolina y la fofatidiletanolamina. A partir de esta última, en la mitocondria se sintetiza la fosfatidilserina por modificación. En la mitocondria también se sintetiza la cardiolipina a partir de sus precursores.

• Biogénesis de los cloroplastos. La biogénesis de los cloroplastos aún no es bien conocida aunque, al igual que

en la biogénesis mitocondrial, intervienen dos sistemas genéticos: el propio del orgánulo y el nuclear.

El cloroplasto es más complejo que la mitocondria porque tiene tres membranas y tres compartimentos, por lo que serán necesarias más señales de destino. La mayoría

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de las proteínas se sintetizan en ribosomas citosólicos, y luego se importan postraduccionalmente, entrando al estroma del cloroplasto por los translocadores Toc y Tic (equivalentes a Tom y Tim). A medida que se estudian más proteínas, se sabe que hay proteínas de la membrana cloroplástica interna que no son importadas por Toc y Tic, sino que emplean otros sistemas de translocación, aunque no se conoce gran cosa de esto. También se ha comprobado que algunas glicoproteínas del estroma, codificadas por el genoma nuclear, tienen el péptido señal hidrofóbico, que las dirige al RE; de allí irán al AG (donde se glicosilan), y serán vesículas del AG las que se fusionarán con la membrana externa del cloroplasto. Sin embargo, se desconoce cómo llegan al estroma. Asimismo, parece haber una ruta de inserción directa a la membrana externa.

Por la vía de Toc y Tic, las proteínas se dirigen a al espacio intermembrana, la

membrana interna (algunas veces, pasando antes por el estroma), al estroma, a la membrana tilacoidal o al lumen del tilacoide. Las proteínas codificadas por el genoma del cloroplasto se sintetizan en ribosomas del estroma y luego se importan (si es necesario) al tilacoide. Así, los componentes de la Rubisco sintetizados por el genoma del cloroplasto se mantienen en el estroma.

• Componentes implicados en la importación

de proteínas al cloroplasto. 1. Señales de importación.

- Presecuencias (señal estroma, péptido señal hidrofóbico) En las proteínas que emplean Toc y Tic. La señal estroma o presecuencia es muy compleja y variable (30-120 aminoácidos), conteniendo aminoácidos básicos (con carga positiva, igual que la señal matriz mitocondrial) y aminoácidos

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hidroxilados; estos últimos son fosforilados por la proteína quinasa 14-3-3. Los receptores de Toc reconocen la señal esté o no fosforilada, pero sólo pueden atravesar el canal las proteínas desfosforiladas. Los galactolípidos de la superficie de la membrana también pueden interaccionar con aminoácidos adyacentes a la señal, lo que facilita el reconocimiento de ésta por parte del receptor.

- Señales internas: Son ciertos segmentos transmembrana. 2. Chaperonas para mantener las proteínas desplegadas.

- Hsp70 citosólica; Hsp90 citosólica para las presecuencias. 3. Proteín quinasas (14-3-3).

- Fosforila la señal estroma. 4. Receptores en la membrana plastidial externa.

- Toc34 y Toc159. Son diferentes isoformas de los receptores; según la que haya se importarán unas u otras proteínas, lo que parece estar implicado en cambios de funcionalidad del cloroplasto. Reconocen la señal estroma.

5. Chaperonas en el espacio intermembrana. - Hsp70. Reciben las proteínas que asoman para mantenerlas

desplegadas y, si es necesario, pasarlas a Tic. 6. Translocadores en las membranas.

- Plastidial externa: Toc75. Gastan energía en forma de GTP cuando reconocen las señales proteicas.

- Plastidial interna: Tic110, Tic20 y/o Tic21. Tic tiene varios componentes: un canal (formado por varias proteínas), un complejo asociado al canal por el espacio intermembrana (que interacciona con las proteínas) y otro complejo por el lado del estroma (que une chaperonas). Se supone que el proceso es igual que en la mitocondria: una ATPasa tira de la proteína para introducirla en el estroma, una peptidasa corta la señal y chaperonas ayudan al correcto plegamiento de la proteína. Parece haber relación entre los componentes de Tic y la ferredoxina-NADH reductasa, que regula la importación proteica al cloroplasto según su potencial redox. Se gasta tanto ATP como GTP, pero no interviene el gradiente de protones que está presente en la mitocondria (dicho gradiente sólo está presente en el tilacoide): la energía proviene solamente de nucleótidos trifosfato.

7. Peptidasas y chaperonas en el estroma.

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• Importación al tilacoide. La importación de proteínas al tilacoide viene dada por cuatro rutas, que van del

estroma al tilacoide: - Ruta Sec: Son proteínas hidrofóbicas de inserción directa en la

membrana mediante una señal hidrofóbica (la señal es el péptido señal hidrofóbico combinado con lisina en la secuencia Lys-X-PSH). Debido a la hidrofobicidad de dicho péptido, se insertan en el tilacoide para estar en un estado de mínina energía. Se gasta ATP. Es una ruta equivalente a la ruta SecA de las bacterias (las proteínas se empujan al interior por gasto de ATP), y es similar a la inserción de proteínas en el RE (Sec61p), aunque sólo hay dos proteínas homólogas a las del RE.

- Ruta similar a las SRPs: Tiene SRPs (partículas de reconocimiento de la señal), siendo la señal sólo el péptido señal hidrofóbico. Se gasta GTP.

- Ruta TAT: Es una ruta específica del cloroplasto, y evolucionó tras la simbiosis. El único aporte de energía que necesita es el gradiente de protones (aunque dicho gradiente es una ayuda en las dos rutas anteriores, no es suficiente; en la ruta TAT sí lo es). La señal es el péptido señal hidrofóbico con dos argininas (Arg-Arg-X-PSH).

- Inserción espontánea.

• División y fusión mitocondrial. En las células, tres orgánulos se dividen y fusionan: son mitocondrias,

cloroplastos y peroxisomas. Se explicará sobre todo el proceso en mitocondrias. En los procariotas, se forma un anillo de división no observable por microscopía electrónica por ser translúcido, pero que se pone de manifiesto al agregar a la preparación anticuerpos contra los componentes de dicho anillo.

En las mitocondrias actuales, la mecánica y componentes son distintos a los de procariotas debido a la evolución. En origen, el anillo Fts de procariotas se forma por dentro para ayudar a la estrangulación; tras la simbiosis y con la evolución, aparecen dos anillos:

- Anillo mitocondrial: Citosólico y similar al anillo contráctil de las células animales, está formado por una proteína similar a la actina.

- Anillo de dinamina: Es responsable de la fusión de las membranas.

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Por la simbiosis, las mitocondrias aprovecharon las condiciones de las células. En las divisiones más complejas, intervienen tres anillos superpuestos espacialmente:

- Anillo Fts: Formado por proteínas similares a las tubulinas y situado en el interior.

- Anillo de dinamina: En el exterior. - Anillo mitocondrial: En el exterior. Según la mitocondria se estrangula, la dinamina atraviesa el anillo mitocondrial

y se asocia a la membrana. En los grupos más evolucionados, se ha perdido el anillo interno Fts, y ni siquiera está codificado en su genoma. En cloroplastos, la división se produce de forma similar, e intervienen la dinamina y el anillo Fts.

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CUESTIONES TEMAS 5, 6 Y 7

• Durante la evolución, se transfirieron muchos genes de las mitocondrias y los cloroplastos al genoma nuclear. ¿Crees que con el tiempo se acabarán por transferir todos estos genes al núcleo?

Mitocondria: Cada célula tiene muchas mitocondrias, cada una con muchas

copias de ácido nucleico, por lo que la transferencia al núcleo es posible. Hay sin embargo una restricción: el código genético mitocondrial es ligeramente distinto al nuclear; aunque se puede decir a favor de la transferencia al núcleo que la transferencia inversa no supuso ningún problema, ya que la proteína seguía siendo funcional. Sin embargo, habría que transferir también la DNApol de origen procariota al núcleo.

Cloroplasto: Tampoco debería haber problemas, ya que se han transferido la

mayoría de los genes y éstos siguen siendo funcionales.

Aminoácido A (Mitocondria)

Aminoácido B (Núcleo)

Posible

?

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TEMA 8 CICLO CELULAR

El ciclo celular, que siempre se considera en referencia a la división celular, se

define como el periodo transcurrido desde que una célula es formada por división de su célula madre hasta que ella misma completa su división. Con división, se refiere generalmente a la mitosis; aunque, con peculiaridades, también se aplica a la meiosis refiriéndose a su control.

La división es la característica principal de los organismos vivos. En organismos unicelulares (tanto procariotas como eucariotas) está regulada por factores como el crecimiento celular, la disponibilidad de nutrientes, etc.; pero la división de células de organismos pluricelulares está regulada en función de las necesidades del organismo como un todo (la pérdida de control del ciclo celular conduce al cáncer). Durante el ciclo celular se dan varios tipos de procesos: algunos son simultáneos (como el crecimiento celular y la duplicación del DNA); mientras que otros tienen lugar cuando ya se ha completado la duplicación del DNA. Generalmente, después de todos estos procesos ocurre la citocinesis.

Los primeros estudios sobre el ciclo celular eran de tipo morfológico; así, se dividió el ciclo celular en dos fases: interfase (no división) y M (división; o mitosis o meiosis). Las células realizan su actividad metabólica en la interfase, aumentando de tamaño (duplicación de muchos de sus componentes) y duplican su DNA para repartirlo entre sus células hijas. Aunque la interfase es morfológicamente homogénea, bioquímicamente se distinguen tres periodos.

El periodo de interfase en el que se duplica el DNA es la fase S (de síntesis): el anterior a éste es G1 (G de Gap, intervalo) y el posterior es G2. Durante la interfase también tiene lugar la duplicación de los centros organizadores de microtúbulos (centrosoma en células animales).

La duración de cada una de las etapas del ciclo celular depende de a qué dedican las células sus actividades. Por ejemplo, una célula típica de mamífero en cultivo tiene un ciclo de unas 24h, repartidas entre: G1, 11h; S, 8h; G2, 4h; y M, 1h. Las diferencias en la duración del ciclo celular se deben principalmente a la duración de G1. Hay células

no destinadas a la división (neuronas) y otras que no se dividen a no ser que el organismo lo necesite (fibroblastos y hepatocitos); en estos casos, la célula entra en una etapa denominada G0. Los ciclos cortos se dan en seres vivos unicelulares; en mamíferos se dan en las células de las primeras etapas de segmentación, en las que como no hay crecimiento celular y se emplean muchos orígenes de replicación, se alternan fases M y S.

Que el ciclo celular transcurra

80

correctamente depende de un control: si las células hijas no reciben copias completas del DNA, lo reciben dañado o se reparten los cromosomas antes de que se alineen en la placa metafásica, ocurren errores. Hay cuatro puntos de control del ciclo celular: tres en la interfase (uno en G1, otro en S y otro en G2) y uno en la fase M.

En la interfase se comprueba que no haya daños en el DNA. Si los hay, se para el ciclo celular; y éste no continúa hasta que se pongan en marcha los mecanismos de reparación del DNA; el ciclo no prosigue hasta su reparación. Según los daños producidos en el DNA, la célula puede ir por tres caminos (los dos últimos se explicarán en el último tema).

1. Detención del ciclo y correcta reparación del DNA → EL CICLO CONTINÚA.

2. El DNA no es reparable, pero los daños no comprometen la viabilidad del organismo: la célula no muere, pero tampoco se divide → ENVEJECIMIENTO CELULAR.

3. El DNA ha sufrido daños muy severos que pueden comprometer la viabilidad del organismo → APOPTOSIS (Muerte celular programada).

También es importante que las células hijas reciban genomas completos, por lo que en la fase S también se controla que todo el DNA sea replicado. Al final de la metafase, se controla el correcto alineamiento de los cromosomas en la placa metafásica.

• Puesta en marcha del ciclo de división celular. En la gemación de las levaduras (Saccharomyces cerevisiae), la decisión de una

célula de dividirse se toma durante la fase G1: el punto a partir del cual la célula se encamina irreversiblemente hacia la división se denomina Start (Inicio), y se encuentra al final de dicha fase G1. En este punto, la célula controla el tamaño celular y la disponibilidad de nutrientes (que permiten alcanzar el tamaño adecuado para pasar Start). Así, Start divide G1 en dos periodos: el anterior a Start, de duración variable; y el posterior. Otro factor que influye es la presencia de factores de apareamiento: levaduras y hongos pasan por fases haploides y diploides; por lo que, cuando una célula libera estos factores al medio, impide que las demás células haploides pasen Start antes del apareamiento.

En organismos pluricelulares, excepto en condiciones de ayuno extremo, no

suele haber problemas de falta de nutrientes, por lo que el control de división no responde a eso, sino a las necesidades del organismo como un todo. La decisión de división de una célula de un organismo pluricelular va a ser así controlada por factores de crecimiento producidos por otras células del organismo. Una vez que la célula recibe la señal de división, ésta se encamina irreversiblemente a la división. Se dice así que ha

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pasado el punto de restricción, equivalente al Start de las levaduras de gemación. De esta forma, los epitelios están sujetos a constante muerte y renovación; mientras que los fibroblastos no se dividen a no ser que les lleguen factores de crecimiento.

Las diferencias entre G0 y G1 antes del punto de restricción es que en G0 se destruyen moléculas de control del ciclo celular (aunque en principio pueden volver a sintetizarse si se requieren). Hay células en las que los factores externos influyen hasta la fase G2 (hay un punto de control en G2 por factores externos), y esto ocurre en seres unicelulares como las levaduras de fisión binaria (Saccharomyces pombe), o los oocitos que experimentan meiosis (en el resto de las células, una vez que se pasa Start o el punto de restricción, los factores externos dejan de influir). En mamíferos, los oocitos se hasta desde el quinto mes de vida fetal, quedando arrestados en la fase G2 (en el diploteno de la meiosis), y completando dicha meiosis a partir de la pubertad.

• Estructura de los reguladores del ciclo celular. Los reguladores del ciclo celular son proteínas heterodiméricas, con una

subunidad que es una ciclina y otra que es una quinasa dependiente de ciclina. Esta quinasa sólo es activa al tener la ciclina unida. Los primeros estudios de regulación del ciclo celular se hicieron en levaduras, y se llamó de distintas formas a la quinasa dependiente de ciclina: Cdc (control del ciclo de división), llamando a una Cdc28 y a otra Cdc2, aunque se ha comprobado que son la misma molécula y es la única que existe en levaduras.

En mamíferos, la molécula equivalente a la Cdc es la Cdk1 (quinasa dependiente de ciclina), aunque hay más tipos de Cdk. Al conjunto ciclina/quinasa se le denominó "Factor de control de la maduración" (MCF), ya que estimulaba la maduración de los oocitos. Sin embargo, luego se comprobó que también estimula la mitosis en todo tipo de células, por lo que también se llama "Factor de control de la mitosis". Así, en levaduras sólo hay Cdc (recuérdese que es lo mismo que Cdk1), aunque está unida a distintas ciclinas para formar los complejos reguladores:

- Ciclinas G1 (Cln). - Ciclinas S/M (Ciclinas B). En células de organismos pluricelulares, hay varias ciclinas y varias quinasas

dependientes de ciclinas: - G1 temprano: Cdk4, Cdk6; ciclinas D. - G1 tardío: Cdk2; ciclinas E. - S: Cdk2; ciclinas A. - G2: Cdk1, ciclinas A. - M: Cdk1, ciclinas B. Cdk1 es la única quinasa imprescindible en mamíferos, lo que se demostró

mediante individuos knock-out (suprimiendo genes): Cdk1 puede sustituir a las demás quinasas; sin embargo, si falta Cdk1, las demás no pueden sustituirla.

• Regulación de las quinasas dependientes de ciclina. Hay cuatro mecanismos distintos de regulación de las quinasas dependientes de

ciclina: 1. Unión con la ciclina: Ya que, sin la ciclina, la quinasa es inactiva. Las

ciclinas se sintetizan antes de que se requieran por las quinasas a las que regulan, por lo que hay mecanismos que regulan su actividad.

2. Fosforilación activadora: De un residuo de treonina, aproximadamente una Thr160.

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3. Fosforilaciones inhibidoras: De dos residuos Thr14 y Tyr15. Inhiben la actividad de la quinasa, por lo que para la activación de ésta deben desfosforilarse.

4. Asociación con inhibidores: Así, aunque se una la ciclina, los inhibidores son dominantes, por lo que la quinasa carecerá de actividad.

• Degradación de las ciclinas. Las ciclinas, como indica su nombre, se sintetizan y degradan cíclicamente. Por

ello, contienen una caja de destrucción, que es reconocida por el sistema de poliubiquitinación, por lo que pueden poliubiquitinarse para su degradación en los proteosomas.

La unión de cada ubiquitina requiere tres enzimas: E1 (enzima activante, activa la ubiquitina), E2 (enzima conjugante) y E3 (ubiquitina ligasa). Una vez con la señal de poliubiquitina, las ciclinas van a los proteosomas; así, al degradarse las ciclinas, la Cdk se inactiva.

• Fosforilaciones activadoras e inhibidoras. Para la unión de la ciclina, se fosforila una Thr160 en la quinasa Cdk; esto lo

lleva a cabo un complejo CAK (Cdk-activating kinase; quinasa activadora de Cdk), que es a su vez un complejo formado por la quinasa Cdk7 y la ciclina H.

Se pueden fosforilar además los residuos Thr14 y Tyr15; este paso lo lleva a cado Wee1 (Wee significa pequeño en escocés; los mutantes en esta enzima son de pequeño tamaño): se inactiva así la quinasa. La desfosforilación de estos residuos la llevan a cabo fosfatasas como Cdc25. De esta forma, la quinasa es activa hasta la degradación de la ciclina.

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• Inhibidores de las quinasas dependientes de ciclina. En respuesta a señales, se pueden sintetizar inhibidores, que bloquean las Cdk.

Hay dos familias de inhibidores, que en células animales son Ink4 (inhibe los complejos de G1) y Cip/Kip (inhibe prácticamente todos los complejos).

• Inducción de las ciclinas de tipo D. Sólo se produce en células animales. El control de esta inducción lo ejerce la

presencia de factores de crecimiento (GFs), cuyos receptores tienen actividad catalítica tirosina quinasa, activando la ruta de las MAP-quinasas:

GFs → Ras → Raf → MEK → ERK La señal puede llegar al núcleo, controlando la expresión génica. Finalmente,

ERK se transloca al núcleo y activa la síntesis de la ciclina D (complejos de G1); esta ciclina D es muy inestable, y sólo se sintetiza mientras los factores de crecimiento estén presentes (llegando incluso a niveles muy elevados) y activa así las quinasas de G1. Es entonces cuando se pasa el punto de restricción, por lo que no importa que se degrade la ciclina D (al no haber factores de crecimiento, no se sintetiza más; y, como es muy inestable, se degrada enseguida), ya que ya se superó dicho punto de restricción.

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Mutaciones en Rb y p53 están detrás de la mayoría de los cánceres humanos. La proteína Rb (Rb de retinoblastoma; los mutantes Rb padecen cáncer) es un inhibidor del factor de transcripción E2F (lo bloquea, manteniéndolo unido), que controla la transcripción de la ciclina E (de la fase G1 tardía, después del punto de restricción), que a su vez controlará la transcripción de los genes necesarios para la duplicación del DNA. Rb es fosforilado por el complejo Cdk4,6/CycD. Tras su fosforilación, Rb libera E2F, que se dirige al núcleo, y comienza la transcripción de la ciclina E (CycE, de la siguiente fase) y comienza la duplicación del DNA (fase S). El TGF-β activa el inhibidor de p15, que se une a los complejos de la fase G1 temprana, impidiendo que fosforilen a Rb y deteniendo el ciclo en G1.

Al sintetizar la ciclina E, se activan los complejos de la fase G1 tardía por pérdida del inhibidor. La quinasa activa entonces las proteínas MCM, que son helicasas (separan las dos cadenas del DNA): éstas dependen de los complejos de G1 tardío para su activación, por eso la replicación del DNA no comienza hasta que se supera el punto de restricción.

Asimismo, ¿por qué el DNA se duplica sólo una vez por ciclo celular? La célula controla esto también por medio de las helicasas MCM. Una vez que desenrollan el DNA, la fosforilación que las activó revierte por fosfatasas constitutivas, por lo que se inactivan. Como los complejos de la fase G1 tardía ya se habrán degradado, no podrán volverse a activar hasta que se complete el ciclo de división.

Hay que controlar también que no haya lesiones en el DNA; estas lesiones deben detectarse y, si están presentes, se detiene el ciclo celular. Las rupturas en la

doble hebra y el DNA sin replicar tienen la misma vía de señalización. Ante daños en el DNA, las células tienen mecanismos para evaluar los daños y poner en marcha programas de respuesta: los mecanismos de reparación, envejecimiento y muerte son posibles respuestas a los daños en el DNA.

Hay proteínas que reconocen y se unen al DNA dañado; a éstas se unen proteínas quinasas (ATR ó ATM), lo que es el inicio de una cascada de señalización: fosforilan respectivamente a CHK1 y CHK2. Finalmente, inactivan a Cdc25, la fosfatasa que elimina las fosforilaciones inhibidoras de Thr14 y Tyr15, por lo que el ciclo se detendrá.

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• Papel de p53 en la inducción de p21 y detención del ciclo celular en G1 por daños en el DNA.

La proteína p53 es un factor de transcripción que regula la formación de inhibidores. Se activa por fosforilación; así, p53 provoca la transcripción de genes que codifican inhibidores de los complejos quinasa/ciclina de la fase G1. Cuanto más complejas sean las vías de señalización, más posibilidades de regulación hay (una mutación puede contrarrestarse), lo cual es beneficioso para la célula.

• Dianas del FPM (Complejo Cdk1/CycB). La activación del complejo Cdk1/CycB va a traer

consigo la fosforilación de diversos sustratos, teniendo en cuenta los cambios en la profase; se ve que son cambios llevados a cabo directa o indirectamente por fosforilación por parte del FPM:

- Condensación de la cromatina: Por fosforilación de las condensinas. Las condensinas son proteínas estructurales de unión al DNA, al igual que las cohesinas; y juegan un importante papel en la mitosis. A medida que se duplica el DNA, las cohesinas se asocian al mismo, de manera que en G2 las cohesinas están unidas a lo largo de todo el DNA condensado, manteniendo unidas las dos copias. En la profase de la mitosis, las condensinas son fosforiladas y sustituyen a las cohesinas (excepto a nivel del centrómero), siendo así responsables de la formación de los cromosomas metafísicos (condensación de la cromatina).

- Ruptura de la lámina nuclear: Por fosforilación de las laminas. La lámina nuclear es la responsable de la integridad de la envuelta nuclear. La lamina B es el sustrato del FPM, lo que provoca la ruptura de la lámina y la envuelta nuclear. También se fosforilan proteínas del complejo del poro y de la membrana nuclear interna. Desaparece (pero no se fosforila) el nucleolo, zona donde se forman las subunidades ribosómicas mediante DNA que codifica los genes 45S (como este DNA se ha condensado, no se pueden formar nuevas subunidades ribosómicas). Se fosforilan también varias proteínas del nucleolo.

- Fragmentación del AG y el RE: Por fosforilación de proteínas de la matriz. Muchas veces, se fosforilan factores de enlace como GMI30, por lo que se detiene el transporte vesicular y se produce la desorganización del sistema de endomembranas. En la mayoría de las especies, el centrosoma se duplica durante la fase S; durante la profase, los dos centrosomas hijos se disponen en los polos y organizan el huso mitótico. Cambios en los centrosomas dependen de las proteínas Aurora y de la quinasa similar a polo (activadas por el complejo Cdk1/CycB o FPM).

- Inestabilidad de los microtúbulos: Por fosforilación de proteínas asociadas a los microtúbulos. Una vez se rompe la envuelta nuclear, se pasa a prometafase. • Control de la alineación de los cromosomas en la placa metafásica. Si a un mismo cinetocoro se unen microtúbulos de distintos polos o viceversa,

éstos se vuelven inestables. Como la fuerza realizada por cada microtúbulos depende de su longitud, los cromosomas acaban estando localizados en la línea media, con un microtúbulo de un polo unido a un cinetocoro y un microtúbulo del polo opuesto al otro

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cinetocoro. Los cinetocoros no unidos a microtúbulos están unidos a Bub (factor proapoptótico) y Mad; e interfieren con un regulador del complejo de la anafase APC (Cdc20 regula el APC). Así, mientras no se estabilicen los microtúbulos, el APC está desactivado. Cuando se forma la placa metafásica, Bub y Mad ya no inactivan a Cdc20, por lo que puede actuar APC, que es una ubiquitina ligasa con dos blancos principales:

- Indirectamente, la cohesina: se marca la securina (que forma un complejo con la separasa). Así, la securina se degrada, por lo que la separasa se activa, degradando así las cohesinas. Esto supone la separación de las cromátidas; se controla así la entrada en la anafase.

- Directamente, la ciclina B. Así, Cdk1 se inactiva: la activación del APC supone la inactivación del FPM. Las células tienen muchas fosfatasas constitutivas, que revierten las

fosforilaciones producidas por el FPM ó Cdk1/CycB (estas fosforilaciones sólo estarán presentes cuando dicho complejo esté activo). Cuando el complejo se inactiva, las fosfatasas tienen más peso, por lo que se invierten todas las fosforilaciones anteriores: se descondensan los cromosomas, se vuelven a formar la lámina y la envuelta nuclear, se forman el RE y el AG, etc.

• Regulación de la cadena ligera de miosina por el FPM.

El FPM también controla la citocinesis, en la que un anillo contráctil de actina y miosina estrangula el citoplasma. La miosina se regula por la troponina en células de músculo esquelético y por la calmodulina-Ca2+ quinasa en el resto de tipos celulares (que fosforila la cadena ligera de miosina).

La cadena ligera de miosina, además del lugar para una fosforilación activadora, tienen otro para una fosforilación inhibidora;

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se fosforilan ambos a la vez mediante el FPM. Cuando el APC inactiva el FPM, actúa una fosfatasa en el dominio inhibidor para activar la miosina y permitir que se produzca la citocinesis.

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TEMA 9 ENVEJECIMIENTO Y MUERTE CELULAR

El envejecimiento celular es un estado en el que las células ralentizan sus

funciones, y es una etapa en la que ya no es posible la división. Ninguna célula ni organismo es inmortal, pero hay diferencias entre los organismos que se dividen por mitosis y los que se reproducen sexualmente:

- Una célula que se divide por mitosis no envejece ni muere, pero sí que deja de existir: las células hijas no heredan las características individuales típicas de la célula madre, pero sí las de su especie; el programa genético vuelve a cero y se reinicia en cada división.

- Unas células que se dividen indefinidamente son las de la línea germinal, pero la célula producto de la fusión entre un óvulo y un espermatozoide también lleva su programa genético a cero; el nuevo individuo tendrá así las características de su especie, pero no tendrá las marcas individuales de sus células madres.

- En las células cancerosas, estos programas están desactivados. Así, tanto el envejecimiento como la muerte celular son programas genéticos. En

humanos, el tiempo de vida debería ser de unos 120 años (el periodo adulto se alcanza a los 25 años; y el tiempo de vida se estima multiplicando dicho valor por 5); no se alcanza por agresiones externas. En algunas células, como las epiteliales y las sanguíneas, unas células madre permiten que se dividan; sin embargo, células como las neuronas no se dividen nunca: cada célula tiene un programa genético con su duración.

Biológicamente, la reproducción sexual presenta ventajas: mayor variabilidad (por la meiosis), mayor supervivencia, etc. El envejecimiento y la muerte están asociados a la reproducción sexual. En humanos, el tiempo de vida se alargó debido a que el periodo de desarrollo de los descendientes es largo, y a que los ancianos han jugado un papel clave en la supervivencia del grupo. En cuanto a las células, su tiempo de vida está ligado a la especialización: las neuronas tienen que durar toda la vida porque el sistema de conexiones y de memoria no admite quitar unas células y poner otras en su lugar.

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• Causas del envejecimiento. Se consideran dos tipos de mecanismos como causas del envejecimiento:

- Mecanismos que perturban el funcionamiento de células y organismos y que terminan provocando la muerte celular o del organismo.

- Mecanismos que tienen en cuenta la edad de la célula o del organismo y que, pasado un tiempo relativamente fijo para cada tipo celular o especie, los conducen al envejecimiento o a la muerte. Las células en cultivo se dividen cada vez menos según transcurre el tiempo,

hasta que no se dividen y acaban muriendo. Los fibroblastos de una persona anciana pueden dividirse hasta 30-35 veces, lo cual demuestra que estamos programados para vivir más tiempo. No todas las células tienen la misma repercusión (no es lo mismo que muera una neurona, que muera un eritrocito).

• Mecanismos que perturban el funcionamiento de las células u organismos. - Acumulación de errores catastróficos: Implica que las moléculas funcionan cada

vez peor. Según el gen que se haya mutado, el daño será mayor o menor. Una teoría afirma que, cuando un gen está repetido en varias copias, se emplea sólo una; cuando ésta sufre daños, se inactiva y se pasa a utilizar otra (que se activa). Así, a mayor redundancia en el genoma, menor envejecimiento.

- Glucosa: La glucosa, además de participar en rutas metabólicas, tiene la propiedad de formar enlaces cruzados entre diversas moléculas de la célula. La formación de estos enlaces cruzados distorsiona las características de las moléculas sobre las que actúa. Por ejemplo, la formación de puentes de glucosa entre las cristalinas (proteínas del cristalino del ojo) provoca la opacidad celulas, siendo así la causa de las cataratas. La carne “vieja”, que no se reblandece al cocerse, debe esta característica a la formación de puentes de glucosa entre las fibras de colágeno de su tejido conjuntivo.

- Radicales libres: Son especies muy reactivas con electrones desapareados (ión superóxido O2

-, etc.), por lo que son altamente reactivas, interaccionando con las moléculas que se encuentran. Hay varios lugares de producción de radicales libres, destacando la mitocondria: en ella, la citocromo oxidasa transfiere los electrones de la cadena respiratoria al O2: si baja la concentración de O2 o de citocromo oxidasa, se producen muchos radicales libres, que interfieren con multitud de moléculas. Los radicales libres también se producen en reacciones inmunitarias, con efectos beneficiosos; pero normalmente son perjudiciales, eliminándose por un sistema antioxidante formado por las vitaminas C y E y la enzima superóxido dismutasa, que interacciona con los radicales libres para formar H2O2, que al ser tóxica será degradada por catalasas o peroxidasas. Estudios sobre la variabilidad genética de la superóxido dismutasa en poblaciones indican que en las familias cuya superóxido dismutasa funciona al 100% de su capacidad, sus miembros alcanzan edades muy avanzadas.

- Desregulación del Ca2+: Está ligada al funcionamiento de la mitocondria. El Ca2+ es un segundo mensajero que regula muchos procesos de la célula, por lo que sus niveles se mantienen bajos en condiciones normales, mediante bombas que lo expulsan al exterior o lo introducen en el RE o la mitocondria. Como dichas bombas gastan energía en forma de ATP, si disminuye la concentración de ATP, el Ca2+ no sale, pero puede entrar por canales de Ca2+, por lo que aumenta la concentración de Ca2+ en la célula. Este incremento en la concentración de Ca2+ activa la enzima xantina oxidasa, cuya actividad produce multitud de radicales libres.

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• Mecanismos que tienen en cuenta la edad de las células. - Acortamiento de los telómeros: En cada replicación, en uno de los extremos de

los cromosomas queda un trozo de DNA sin replicar, porque la DNA polimerasa necesita una cadena para continuar la síntesis: en cada división celular se pierde un trozo del extremo del cromosoma. La enzima telomerasa tiene un RNA complementario que se emplea como molde e impide el acortamiento de los telómeros; sin embargo, esta enzima se inactiva tras la diferenciación celular, por lo que los telómeros se acortan a cada división. El acortamiento de los telómeros lo detectan las células de la misma forma que las lesiones en el DNA; llegado un nivel de acortamiento, se detecta como daños en el DNA, por lo que el ciclo celular se detiene (célula envejecida).

• Tipos de senescencia. Es una clasificación artificial, ya que actúan ambas a la vez: es un proceso global.

A veces, un único daño señaliza el envejecimiento; otras, se necesitan varias señales. Se emplea el término “senescencia” (senescence) para el envejecimiento celular; y el término “envejecimiento” (aging) para el envejecimiento de los organismos.

- Senescencia extrínseca: Por factores externos a la célula. - Senescencia intrínseca: Por factores internos (acortamiento de los telómeros).

• Señales que activan la senescencia.

- Acortamiento de los telómeros. - Daños en el DNA (rayos X, H2O2, etc.). - Estrés oxidativo (radicales libres). - Actividad de oncogenes. - Falta de nutrientes o factores de crecimiento. - Formación de contactos inapropiados.

Durante el envejecimiento, las células experimentan cambios morfológicos en respuesta a los cambios externos: pierden su forma, aumentan su volumen, se aplanan, pierden las relaciones intercelulares correctas y sufren cambios en su metabolismo. La enzima β-galactosidasa sufre una considerable elevación de sus niveles durante el envejecimiento; como su actividad se puede detectar histoquímicamente, se trata de un marcador que indica cuándo una célula está envejecida.

• Activación de la senescencia por distintos estímulos. Las dos moléculas claves de control del envejecimiento (p53 y Rb) son también

moléculas clave en la detención del ciclo celular. Tiene lugar por respuesta a los factores que señalan el envejecimiento. A p53 se llega por ATM/ATR (quinasas). Las moléculas p19 y p16 son las moléculas sobre las que confluyen la mayoría de las rutas de señalización del envejecimiento.

ACTIVACIÓN DE LA SENESCENCIA ESTÍMULOS Factores de crecimiento Citoquinas, estrés celular QUINASAS ANTERIORES

Raf MEK

MEKKs MKKs

QUINASA MAP ERK JNK/p38 RESPUESTA Proliferación, diferenciación

y supervivencia celular Inflamación, muerte celular

Varias señales pueden producir el mismo efecto, y una señal puede tener

distintos efectos; esto es una redundancia que pretende asegurar la supervivencia del

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organismo. Si los niveles de p53 no disminuyen (las lesiones no se reparan), se activa la senescencia. Otros genes transcritos cuando se activa p53 también se activan en la apoptosis. Los genes para p19 y p16 están en el mismo locus: INK4, que es una familia de inhibidores de las Cdk.

La proteína p16 inhibe los complejos de G1 (Cdk4,6/CycD); mientras que p19 inhibe Mdm2, que a su vez inhibe p53 (p19 activa p53 por la inhibición de Mdm2). La diferencia fundamental entre una célula que ha detenido el ciclo celular en respuesta a daños en el DNA para repararlos y una célula envejecida es que el bloqueo del ciclo celular es permanente en la célula envejecida (no se volverá a dividir), porque las proteínas HT1 se unen al DNA en los genes E2F (genes que regulan el ciclo celular necesarios para que las células superen el punto de restricción, regulados por Rb), convirtiéndose en heterocromatina que no se podrá transcribir.

• Necrosis y apoptosis.

- Apoptosis: Es la muerte celular programada, e implica la puesta en marcha de un programa celular. Se produce en reacción a agentes moderados externos o internos, poniendo en marcha un programa celular. El núcleo y el DNA se fragmentan y loa célula se encoge, para terminar formando los cuerpos apoptóticos, que serán fagocitados por macrófagos (no hay daños en el tejido).

- Necrosis: Implica la muerte celular en respuesta a daños agudos que la célula no tiene tiempo a cuantificar. Se libera así el contenido celular al medio, como enzimas hidrolíticos, que causan una reacción inflamatoria en zonas próximas del tejido (no hay una única célula afectada).

• Contextos en los que sucede la apoptosis.

NECROSIS APOPTOSIS Agentes externos extermos Agentes externos o internos

extremos Al margen de la programación celular

Puesta en marcha de un programa celular

Hinchazón celular (edema) Condensación citoplasmática y nuclear

Estallido Fragmentación (cuerpos apoptóticos)

Liberación de enzimas proteolíticas

Sin liberación de enzimas proteolíticas

Reacción inflamatoria Sin reacción inflamatoria Modificación de la arquitectura tisular

Sin modificación de la arquitectura tisular

Células en áreas Células aisladas Sin fragmentación del DNA Fragmentación del DNA Sin fagocitosis Fagocitosis por macrófagos

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La apoptosis es un programa de la célula; de esta forma, se da: - Durante el desarrollo embrionario (cola de anfibios anuros, dedos humanos, etc.). - Como mecanismo para el mantenimiento de poblaciones de células adultas

sujetas a renovación (eritrocitos, epitelios, etc.). - Como mecanismo de defensa en las reacciones inmunitarias (linfocitos NK).

• Causas de la apoptosis. La apoptosis se debe a que las células:

- Ya han realizado por completo sus funciones. - Han sufrido daños irreparables (un linfocito T mata a una célula infectada por un

virus). - Carecen de actividades para mantener su actividad normal (neuronas que no

forman las conexiones correctas).

• Etapas de la apoptosis.

La apoptosis se puede dividir en las siguientes etapas: 1. Señalización de la apoptosis: Intervienen las señales que desencadenan la

apoptosis y sus receptores. Aunque hay señales que provocan la apoptosis, ésta suele estar regulada y se controla por integración de varias señales. Las señales que desencadenan la apoptosis pueden ser:

- Lesiones: radiación, toxinas, radicales libres, privación de oxígeno, etc. producen daños en la célula, siendo especialmente importantes los daños en el DNA.

- Privación de factores de crecimiento u hormonas. - Interacciones con señales de muerte, algunas provenientes de células del

sistema inmunitario.

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- Desestabilización de la membrana por linfocitos T o células asesinas naturales (NK).

2. Regulación: El regulador Ced-9 se descubrió en Caenorhabditis elegans, y

pertenece a la familia génica equivalente en vertebrados que es Bcl-2. Ambos son factores antiapoptóticos. En C. elegans sólo existe una caspasa, que es ya una caspasa efectora; en mamíferos, sin embargo, existen varias caspasas, que son de iniciación o de ejecución.

La familia Bcl-2 tiene distintos

miembros antiapoptóticos y proapoptóticos, habiendo dos tipos dentro de este último grupo: proapoptóticos multidominio (o de membrana) y proapoptóticos solo-BH3 (o citosólicos). Estos últimos pueden estar de dos formas: secuestrados en el citosol (entonces, los antiapoptóticos de membrana interaccionan con los proapoptóticos de membrana) o no (se unen entonces a los propapoptóticos de membrana). Los antiapoptóticos y los proapoptóticos multidominio son proteínas transmembrana que se localizan principalmente en la membrana mitocondrial externa, y se ve que ambas dimerizan en la membrana. Los antiapoptóticos siempre se unen a los proapoptóticos, pero en ellos hay dos tipos:

- Si se unen a los proapoptóticos multidominio, no se señaliza la apoptosis. - Si se unen a los proapoptóticos citosólicos, los antiapoptóticos de membrana

se podrán unir entre sí, formando canales que desestabilizan la membrana mitocondrial externa, por lo que el citocromo C puede salir de la membrana mitocondrial interna. Su salida activa los adaptadores; de esta forma, se enlaza la regulación con la adaptación.

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Los IAPs son inhibidores de la apoptosis; no están presentes en C. elegans pero sí en vertebrados (Drosophila). Interaccionan directamente con las caspasas, inhibiendo su actividad y marcándolas para su degradación.

3. Adaptación (Adaptadores): La salida del citocromo C activa los adaptadores.

De ellos, el más común es Apaf-1 (equivalente al Ced-4 de C. elegans). Se forman así unos complejos denominados apoptosomas, en los que varios adaptadores (activados por unión del citocromo C) enlazan a su vez la caspasa de iniciación (CitC + adaptador + caspasa).

4. Ejecución (Efectores):

Son las caspasas. Su nombre viene dado porque tienen cisteína (C) en su centro activo y rompen proteínas en sus residuos de aspartato (Asp). Se sintetizan como procaspasas, con un fragmento adicional que debe eliminarse para su activación. Una cascada de caspasas va degradando proteínas hasta que se activa una caspasa final o de ejecución, que:

- Inhibe la ICAD (un inhibidor de DNasas), por lo que se produce la fragmentación del DNA.

- Degrada las laminas nucleares, por lo que se fragmenta el núcleo. - Degrada el citoesqueleto, por lo que se produce una fragmentación celular. - Degrada las proteínas de la matriz del AG, por lo que se fragmenta el AG. 5. Eliminación de las células muertas: Se realiza por fagocitosis por parte de los

macrófagos. La fagocitosis es un proceso regulado que implica un reconocimiento entre el fagocito y la partícula fagocitada. Algunos lípidos sólo se encuentran en la hemimembrana citosólica, como es el caso de la fosfatidilserina, con carga negativa. La actividad de las caspasas hace que se rompa esta asimetría: este lípido pasa a la superficie celular, que aparecerá entonces con carga negativa; esto es un marcador que reconocen los receptores de los macrófagos. Entonces se produce el enlace y la fagocitosis de dichas partículas por modificación del citoesqueleto de actina en los macrófagos.

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• Vías de la apoptosis en mamíferos. Hay dos, la intrínseca (vía del citocromo C) y la extrínseca.

Intrínseca Extrínseca Señalización Lesiones.

Privación de factores de crecimiento u

hormonas.

Señales de muerte.

Regulación Bcl-2 (+). IAPs (–).

IAPs (–).

Adaptación Apaf-1. No (u otros). Ejecución Iniciación: Caspasa 9.

Ejecución: Caspasa 3. Iniciación: Caspasa 8.

Ejecución: Caspasas 3, 7. • Inducción de la apoptosis por lesiones en el DNA vía p53. Las MAP-quinasas que señalan muerte (p38) influyen en p53: según los niveles

de p53 (que dependen a su vez de los daños), puede producirse senescencia o pueden activarse los miembros proapoptóticos de reguladores (Bax, Noxa, PUMA, etc.).

• Señalización de la apoptosis por factores de supervivencia. Los factores de supervivencia se unen a receptores que, al recibir la señal, se

dimerizan. Los receptores tienen una parte intracelular con actividad tirosina quinasa, por lo que se produce una fosforilación mutua de ambas partes y se crea un sitio de unión para proteínas de la ruta de señalización (como, en este caso, fosfatidilinositol 3-quinasas), que al activarse fosforila el fosfatidilinositol 2-fosfato (PI2P) para formar el fosfatidilinositol 3-fosfato (PI3P).

De esta forma, pueden interaccionar la proteína Akt (quinasa), que para activarse debe estar unida a PI3P y debe estar fosforilada en dos lugares (mediante una quinasa de la membrana y mediante mTOR). Akt activada actúa sobre diferentes sustratos, teniendo efectos en la autofagia y el metabolismo; pero lo importante en este caso es que también fosforila factores proapoptóticos (Bad), secuestrándolos en el citoplasma

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para impedir la salida del citocromo C. Mientras secuestra los factores proapoptóticos, también interviene en la ruta de p53.

• Señalización de la apoptosis en ausencia de factores de crecimiento. Este proceso sirve, por ejemplo, para eliminar las neuronas que durante el

desarrollo no formaron las conexiones correctas. Las que sí los formaron, reciben factores de crecimiento y viven; las que no, morirán. De esta forma, la vía por defecto es la muerte celular.

Esto se debe a que Bad se asocia a factores proapoptóticos de membrana, formando canales en la membrana mitocondrial externa que permiten la salida del citocromo C. Los factores de crecimiento activan Akt, y éste fosforila a Bad; Bad fosforilado es secuestrado por las proteínas 14-3-3 citosólicas (chaperonas), por lo que no sale el citocromo C y la neurona sobrevive.

• Señalización de la apoptosis por señales de muerte. Se deben al receptor Fas (en células del sistema inmunitario), al factor de

necrosis tumoral (TNF), etc. Por un adaptador, Fas activa la caspasa de iniciación (caspasa 8), y ésta comienza la degradación proteolítica en cascada, culminando con la muerte celular.

• Vías alternativas de muerte celular programada. Se ha visto que, en ausencia de apoptosis (por ingeniería genética), pueden darse

dos rutas alternativas a la apoptosis: - Autofagia: Hasta que se destruya la propia célula. No es bien conocida.

Durante el desarrollo de las glándulas salivares en Drosophila, éstas no sufren apoptosis sino autofagia, por lo que la autofagia también es un programa normal del desarrollo.

- Necrosis regulada: Cuando la apoptosis está inactivada.