biologia molecolare 1 07-08
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Testi consigliati
-Biologia Molecolare del Gene, Watson et al. Zanichelli
- Genetica, Russell, EdiSes
-Gene VIII , Lewin, Zanichelli
il controllo dell’espressione genica permette ad una cellula uovo indifferenziata di formare un individuo adulto e differenziato
...e solo conoscendo le regole del controllo dell’espressione genica possiamo realizzare prodotti biotecnologici
1.2%
La maggioranza delle differenze fenotipiche dipende dalle differenze di espressione genica
La trascrizione
La RNA polimerasi catalizza la formazione del legame
fosfodiesterico
la direzione di sintesi è sempre 5’ > 3’
Componenti e funzioni della RNA polimerasibatterica; e i geni che le codificano
Esiste un’ulteriore subunità la subunità ω (10kD) codificata dal gene rpoZ che ha un ruolo nell’assemlaggio del “core”enzimatico
L’RNA polimerasi batterica e quella eucariotica
.β = viola; β’ = blu
.α = giallo e verde
.ω = rosso
Il fattore σ
La RNA polimerasi del batteriofago T7 ècostituita da una sola proteina
Il fattore sigma e il “core” enzimatico vengono riciclati in fasi differenti della trascrizione
un tipico promotore procariotico ha tre componenti:
le sequenze di consenso -35 e -10 e il punto di inizio
CONSENSO
rispetto alla trascrizione nel DNA dobbiamo distinguere l’elica stampo (template) dall’elica codificante (coding)
l’ RNA è complementare allo stampo e identico al codificante
come si studia la trascrizione
si deve identificare l’ RNA messaggero
ecco un esempio “storico”di come si può fare attraverso la marcatura del RNA con nucleotidi radioattivi e ibridazione con il DNA complementare
La tecnica del “Northern blotting” consente di evidenziare gli RNA presenti nelle cellule
L’RNA si mette in evidenza ibridandolo con una sonda marcata di DNA complementare
Watson p.628; Russel p. 195
S1S1 mappingmapping -- identificazione del 5identificazione del 5’’ e/o del 3e/o del 3’’ delldell’’mRNAmRNA
Primer extensionPrimer extension
DNADNA
RNARNA
Si isolaSi isola ll’’RNARNA e si ibrida con e si ibrida con Una sonda (Una sonda (primerprimer) marcata) marcata
55’’
Si allunga ilSi allunga il primerprimer con trascrittasi con trascrittasi inversainversa
Si determina la lunghezza dellSi determina la lunghezza dell’’estensione estensione su gel disu gel di poliacrilamidepoliacrilamide ee autoradigrafiaautoradigrafia
La lunghezza del frammento ci dice direttamente dove La lunghezza del frammento ci dice direttamente dove inizia la trascrizione (il 5inizia la trascrizione (il 5’’ delldell’’mRNAmRNA))
RNA RNA polimerasipolimerasi
DNADNA footprintingfootprinting
Watson p. 475
Elettro
foresi
Il n° di bande
perse identifica la
lunghezza del sito
di legame
Il fattore sigma 70: alcuni domini proteici legano il DNA al promotore
Le interazioni tra fattore sigma, RNA polimerasi e DNA
Il fattore sigma70: il dominio 2.4 lega il promotore a -10
L’interazione specifica degli aminoacidi del fattore sigma conle basi del promotore si può studiare mediante l’uso di mutazioni sito-specifiche
Fattori sigma diversi riconoscono promotori con sequenze di consenso diverse
non sempre le sequenze -35 e -10 si trovano esattamente in quelle posizioni