biología molecular 1

Transcripciones de Cátedras

Química Fisiológica y Patología Integrada I

Díaz, H. Las Heras, M. Pinto, F. Reyes, M. Rivera, C. Romero, R.

Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

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17-05-2011

Biología molecular, genética y proteínas

Mario Chiong

Como sabemos, el material genético porta toda la información necesaria del organismo. Si

esta información se altera se puede producir un cambio en la estructura, que puede llevar a un

cambio en la función.

Estructura de un gen

En la imagen se muestra la

estructura básica de un gen.

Toda la información contenida

para la regulación de la expresión del

gen está contenida en el promotor,

luego del cual (río abajo) se encuentra

el gen estructural. El término de este

gen se conoce con el nombre de

terminador.

La hebra que es idéntica al

mRNA es la que va de 5`3` (la

superior en esta estructura), que se

conoce como hebra codificante y la

hebra complementaria, que va en

sentido 3`5` se denomina hebra no

codificante y es la que sirve de

templado a la RNA polimerasa para fabricar el mRNA.

La primera base de la hebra codificante recibe el nombre +1. La base inmediatamente

anterior se conoce como -1 (no hay un cero). Por nomenclatura, todas las secuencias negativas se

conocen como río arriba (río arriba del gen estructural se encuentra el promotor) y todas las

secuencias positivas se conocen como río abajo (río abajo del promotor se encuentra el gen

estructural y el terminador).

De acuerdo a la nomenclatura internacional al anotar las secuencias sólo se anota la hebra

codificante (en ella está codificada la secuencia aminoacídica).





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Cambios en el genoma

El genoma humano, a pesar de ser un 99,99% idéntico presenta diferencias entre cada

uno de nosotros.

La secuencia contenida en el DNA no es estática, es dinámica y cambia no solamente

porque se hereda y por recombinación homóloga, también lo hace porque a medida que uno

envejece ocurren mutaciones debido a factores ambientales, por ejemplo. Estos cambios en la

estructura del DNA producen cambios en la expresión de genes.

Pueden haber también alteraciones cromosómicas, como por ejemplo polisomías,

aberraciones cromosómicas, inserción y deleción de genes y mutaciones que son habitualmente

de bases únicas o pocas bases. Estas mutaciones pueden alterar secuencias promotoras, el

procesamiento de mRNAs, la estructuras de proteínas, la actividad enzimática, la estabilidad de

proteínas, etc.

Tipos de mutaciones

Puede haber mutaciones que producen inversión de genes, deleciones, translocaciones,

inserciones.

Missense: Ocurre un cambio en una base que implica el cambio de un aminoácido por otro

Nonsense: El cambio de una base implica el cambio de un codón que codifica para un

aminoácido por un codón de término

Frameshift: Ocurre un corrimiento en el marco de lectura (por inserción o deleción)





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Nomenclatura de las mutaciones

En el primer caso la adenina es positiva, por

tanto la mutación ha ocurrido en el gen estructural

o en el terminador.

Muchas veces aparece una c minúscula

delante de esta secuencia, que indica que la base 1

se considera a partir del cromosoma. Cuando no

tiene nada, como en este caso, corresponde a la

secuencia sin intrones.

Si la secuencia que se muestra es negativa,

la mutación ha ocurrido río arriba del gen

estructural, (zona promotora).

Esta misma nomenclatura es la que se usa

en proteínas

Estudios genéticos

Uno de los datos importantes

cuando se hace la anamnesis de un

paciente es saber si tiene antecedentes

familiares que puedan corroborar la

enfermedad que tiene. Hay varias

enfermedades que tienen un

componente genético relevante, como

la diabetes, la hipertensión y muchas

otras.

Los diagnósticos de estas enfermedades se hacen habitualmente por estudios genéticos y

se construye en la anamnesis un pedigree, que es un árbol genealógico.

En la herencia humana es muy difícil que existan genéticas mendelianas simples, aunque

existe lo que se llama la penetración incompleta del gen. Esto significa que una enfermedad puede

a veces saltarse una generación debido a que los genes pueden no expresar la dominancia en

todas las generaciones.

En el pedigree que se muestra a la derecha, se observa claramente un gen dominante,

también hay penetración incompleta.





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Distribución del genoma

Los procesos de replicación, transcripción y

traducción ocurren en un 22% del genoma.

Estructura-función

Existe una asociación entre enfermedades y mutaciones (relación entre estructura y

función).

Sólo a modo de ejemplo de enfermedades genéticas vamos a ver tres casos particulares.

Probablemente estos ejemplos abarcan cerca de un 90% de todas las enfermedades de origen

genético.

Pérdida o ganancia de actividad enzimática

Alteración de estructura tridimensional de proteínas

Cambios en la estabilidad de proteínas

*Pérdida o ganancia de actividad enzimática

En la tabla se muestran

algunos ejemplos de enzimopatías.

Una mutación de una

enzima particular puede provocar

una disminución notoria o

desaparición de su actividad. Esta

mutación podría ocurrir, por

ejemplo, en el gen estructural o en

el promotor de un gen que codifica

una enzima.





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Primer conceptoMutaciones que llevan a distintos niveles de un metabolito pueden dar lugar a

enfermedades clínicamente distintas. Esto se puede evidenciar con los ejemplos que se muestran

a continuación.

Gota

Es muy frecuente, la padecen 800 personas por cada 100000 habitantes y aparece más

temprano en varones.

Causas: aumento de la ingesta de carnes rojas, falla en la eliminación renal

Hay una alteración en el metabolismo de las purinas con acumulación de ácido úrico

plasmático.

Se asocia a obesidad, dislipidemia y diabetes. De hecho, cuando una persona tiene el primer

síntoma de hipertensión, de diabetes y/o hipercolesterolemia, uno de los marcadores que se

toman de la persona en el análisis sanguíneo es el contenido de ácido úrico. Mientras más alto

el contenido de éste es peor predictor en su patología.

La xantina oxidasa es una enzima que utiliza agua y oxígeno para generar peróxido de

hidrógeno, por lo que genera estrés oxidativo. Altos niveles de ácido úrico están asociados

entonces a altos niveles de estrés oxidativo endógeno.

Hay una alteración en el metabolismo de las purinas con acumulación de ácido úrico

plasmático.

La xantina oxidasa oxida el anillo de las purinas, generando ácido úrico, que se acumula en

la sangre. Cuando el ácido úrico alcanza una concentración crítica precipita principalmente en

las articulaciones, produciendo un efecto físico abrasivo que gatilla los procesos inflamatorios

en las articulaciones mayores. El proceso inflamatorio crónico produce remodelación de las

articulaciones y destrucción de las estructuras, causando gran dolor.

Tratamiento: alopurinol, un inhibidor competitivo de la xantina oxidasa.





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Enfermedad de Lesch-Nyham

Enfermedad hereditaria ligada al cromosoma X, causada por una deficiencia en la enzima

hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HPRT).

Las bases nitrogenadas pueden ser recicladas para la

síntesis de nucleótidos. La enzima responsable de esto

es la HPRT. Por tanto, cuando esta enzima no existe se

produce una gran acumulación de bases nitrogenadas

libres, las que empiezan a ser eliminadas como ácido

úrico.

A diferencia de la gota, aquí se produce una GRAN

acumulación de ácido úrico en todo el cuerpo, lo que

lleva a la aparición de gota severa y en estados muy

tempranos del desarrollo de la persona, es decir, en

niños. En el adolescente se puede desarrollar artrosis

debido a que el efecto del ácido úrico es tan grande que

produce deformación ósea con alteración en el control

muscular y retardo mental moderado producto de la

acumulación de purinas y pirimidinas en el cerebro.

Incidencia: 1:380000

Tratamiento paliativo con alopurinol





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Inmunodeficiencia combinada severa

En células con deficiencia en la adenosina deaminasa hay acumulación de desoxiadenosina y

conversión de desoxiadenosina a dATP.

En estos pacientes, debido a que hay falla en esta enzima, hay muy bajos niveles de ácido úrico,

pero hay acumulación de desoxiadenosina y desoxi ATP. La acumulación de estos dos metabolitos

afecta la proliferación de linfocitos y altera su función, produciendo una grave inmunodeficiencia.

Esta enfermedad es conocida como la enfermedad del niño burbuja.

Segundo conceptoMutaciones de distintas enzimas de una misma ruta metabólica pueden dar

origen a distintas enfermedades.

Aquí tenemos una ruta metabólica clásica que es la de fenilalanina a ácido meleilaacético.

En este caso, la primera mutación es en la fenilalanina hidroxilasa (permite transformar

fenilalanina en tirosina). Esta mutación hace que el paciente acumule fenilalanina y produzca poca





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tirosina. La acumulación de fenilalanina produce ácido fenilpirúvico, que causa neurotoxicidad.

Esto es característico de la enfermedad de la fenilcetonuria.

La fenilcetonuria es una de las tres enfermedades genéticas que en Chile se diagnostican

en niños recién nacidos en forma obligatoria. Cuando los niños recién nacen se les hace un

pinchazo en el talón del pie, se les saca una gota de sangre y se le miden los niveles de fenilalanina

plasmática. Los niveles elevados de ésta en el niño indican fenilcetonuria.

A un niño que se le detecta la enfermedad inmediatamente se le hace un tratamiento por

control de ingesta de fenilalanina tratando de disminuirla al máximo para que no se acumule, ya

que su acumulación es neurotóxica y provoca problemas de retardo mental.

La fenilcetonuria es una enfermedad no poco frecuente en Chile.

Como estos niños tienen poca tirosina y ésta es sustrato para fabricar melanina, pueden

ser albinos. Una mutación en esta enzima produce albinismo y también, como la tirosina es

sustrato para fabricar las hormonas tiroideas T3 y T4, se puede producir cretinismo.

Tratamiento: disminuir al máximo el consumo de fenilalanina y usar un suplemento de tirosina.

Alteración de estructura tridimensional de proteínas Agregación de proteínas

Las proteínas con estructura alterada tienden normalmente a agregarse.

Las enfermedades más estudiadas por

agregaciones son las de tipo

neurodegenerativo. Probablemente la

enfermedad de este tipo más conocida es

la causada por la acumulación del péptido

β-amiloide en el cerebro, que corresponde

a la enfermedad de Alzheimer. Otra muy

conocida, es la enfermedad de las vacas

locas, que en humanos se conoce como la

enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, y que

se caracteriza por la acumulación de una

proteína prion en el cerebro generando

acumulación de placas de amiloides

llamadas variantes Creutzfeldt-Jakob. Esta





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enfermedad produce una demencia senil precoz que lleva finalmente a la muerte por

neurodegeneración.

Enfermedad de Parkinsonacumulación de alfa-sinucleína

Encefalopatía familiaracumulación de neuroserpina

Enfermedad de Huntingtonacumulación de proteínas ricas en glutamina

Estas son proteínas que han sufrido una mutación, por lo que pierden estructura y se

agregan. La formación de agregados es muy importante porque generalmente es tóxico para la

célula y al tenerlos dentro de su estructura citoplasmática muere, por eso se produce la

neurodegeneración.

Degradación de proteínas intracelulares

La degradación de proteínas puede ocurrir por: el sistema lisosomal (endosomas-

lisosomas) y el sistema ubiquitina-proteosoma (basado en la proteína ubiquitina). Todas las

proteínas del organismo dentro de una célula son degradadas por estos dos únicos sistemas, no

hay otros.

Mecanismo de ubiquitinación

Ubiquitinaproteína muy ubicua, se encuentra en todos los organismos, de ahí el nombre.

Una serie de enzimas (E1, E2, E3 y

E4) marcan una proteína uniéndole

covalentemente ubiquitina. Las proteínas

que están ubiquitinadas se marcan para

degradación y son reconocidas por el

sistema ubiquitina-proteasoma (todas las

proteínas que tienen ubiquitina son

degradadas por el sistema proteasoma).

E1activa la ubiquitina, utiliza ATP. La

ubiquitina se activa y se une

covalentemente a E1

E2enzima conjugadora de ubiquitina.

Toma la ubiquitina unida covalentemente

a E1, la une a E2 y el que reconoce el

sustrato a ser degradado es la E3.





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E3enzima ubiquitin-ligasa, que reconoce al sustrato, une a la E2 que tiene ubiquitina ligada y

hace que ésta (la E2) transfiera la ubiquitina a la proteína blanco.

E4enzima poliubiquitin-ligasa. Una vez que está ubiquitinada la proteína la poliubiquitina

Las enzimas E1 y E2 son muy pocas en el organismo. Sin embargo, existen muchas E3,

debido a que éstas reconocen al sustrato de manera muy específica. Existe prácticamente una E3

por cada proteína a ser degradada por el sistema ubiquitina-proteasoma.

Una vez que la proteína está poliubiquitinada ésta es llevada al proteasoma, que es un

complejo muy grande (se ve por microscopio electrónico), que está formado por muchas

subunidades y que degrada proteínas por una actividad semejante a quimiotripsina, requiere para

esto ATP.

Este complejo de proteasoma se conoce con el nombre proteasoma 26s por el peso

molecular que tiene (es del tamaño de un ribosoma, más o menos).

En el proteasoma se liberan las ubiquitinas para ser recicladas.





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Autofagia (Sistema lisosomal)

Una doble membrana,

proveniente de la membrana

plasmática o del retículo

endoplásmico crece englobando

parte del citoplasma y luego se

fusiona con el lisosoma para

degradar todo el contenido que

hay en su interior (se forma una

vesícula de doble membrana).

El lisosoma se fusiona con

la vesícula externa, mientras que

la membrana interna con todo el

contenido citoplasmático es degradado mediante las enzimas del lisosoma.

Membrana pre-autofágicaformación de una vesícula autofágica (autofagosoma)fusión con el

lisosoma y formación de un autolisosoma.

Cuando se forma la vesícula autofágica, el contenido engloba todo el citoplasma y este es

un método para degradar organelos, por ejemplo. Se puede tener una mitocondria y alrededor de

ella se puede formar esta vesícula autofágica para luego fusionarse con lisosomas, destruyendo la

mitocondria completamente.

Proteínas individualesdegradadas por el sistema ubiquitina-proteasoma

Agregados proteicos, organelos o muchas proteínasdegradadas por autofagia (se engloba

completo y se digiere con proteasas).

Hay un compuesto que fue encontrado y aislado en la isla de pascua (rapa nui), el

compuesto se llama rapamicina. Éste, induce autofagia a través del control de la Tor quinasa.

Cuando se dio rapamicina a ratones en bajas cantidades, los ratones fueron más longevos, debido

a que este compuesto induce la autofagia y se sabe que este mecanismo de degradación produce

un aumento de la expectativa de vida mediante la degradación de mitocondrias disfuncionales.

Cuando las mitocondrias no funcionan bien producen radicales libres a través de la cadena

transportadora de electrones, lo que produce exceso de estrés oxidativo. Si esas mitocondrias son

eliminadas por autofagia se reducen los niveles de estrés oxidativo, ocurre menos daño y por

tanto, los ratones viven más tiempo.

Es por eso que la restricción calórica, que induce autofagia es un método para prolongar la

vida.





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Enfermedades neurodegenerativasHay un mal

funcionamiento del sistema del sistema

proteosoma, que degrada mal las proteínas y éstas

se agregan. Si las proteínas son removidas por

autofagia no pasa nada, pero si además hay una

alteración de la autofagia se produce la

acumulación de estos agregados (agresomas) y eso

produce las enfermedades

Hay varias mutaciones relacionadas con el

Alzheimer que son hereditarias. Algunas de éstas

corresponden a mutaciones de las enzimas del

sistema ubiquitina-proteasoma, otras se asocian

con alteración en la vía autofágica. Por tanto, alteración o disminución de los sistemas de

remoción de proteínas producen enfermedades neurodegenerativas





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Terapia Génica

Consiste en hacer una corrección del genoma. Si hay información genética que está errada

se podría modificar esa información y corregir con ello la función.

Se usan vectores para introducir DNA de manera eficiente a una célula

Vectores usados (lo va a preguntar en la prueba)

El DNA puede ser administrado desnudo, en forma de liposomas o en forma de partículas

virales (virus adenoasociados, adenovirus, retrovirus)

El DNA desnudo generalmente corresponde a un plasmidio, en el cual se inserta el gen de

interés para sobreexpresar una proteína en un determinado organismo, por ejemplo. El problema

es que el DNA desnudo es muy sensible a las nucleasas. Por tanto, si tomáramos un tubo con DNA

desnudo en una jeringa y lo inyectáramos en un vaso sanguíneo para que se disperse en el

organismo, lo más probable es que de las 1023 moléculas que logre inyectarme, puede que 1 entre

a la célulamuy ineficiente (la mayoría se degrada y el DNA no entra espontáneamente a la

célula)

La única aplicación que se le da al DNA desnudo en terapia génica es para fabricar vacunas

genéticas. Para eso, se toma DNA desnudo y se inyecta en el músculo. Unas pocas moléculas de

esas logran llegar a entrar a las células musculares y fabrican la proteína foránea codificada por el

gen que se inyectó y el sistema reconoce como extrañas esas proteínas que se acaban de





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sisntetizar y fabrica anticuerpos celulares, de manera que se produce inmunidad. La gracia que

esto tiene es que se requieren pocas proteínas para producir inmunidad global (estas proteínas se

sintetizan endógenamente y luego producen respuesta inmune).

Cuando se produce una proteína intracelular, la respuesta inmune que se gatilla no es la

humoral con anticuerpos, sino que es una respuesta celular mediada por células linfocitos T

citotóxicos natural killer (es un sistema muy importante para la eliminación de células

cancerígenas y de células infectadas por virus).

Liposomas catiónicos

Lípidos que neutralizan las cargas negativas del DNA desnudo y aumentan 100 veces la entrada

de DNA a las células (respecto al DNA desnudo).

No pueden ser usados in vivo, pues son “secuestrados” por proteínas plasmáticas, impidiendo

que éstos entren a la célula.

Corresponden a una doble membrana lipídica que en el interior cotiene DNA.

no pueden ser usados in vivo por las proteínas plasmáticas, ya que éstas también interaccionan

con los liposomas y los secuetsran, impidiendo que entren a las células.

Generalmente se usa a nivel tópico (tratamiento de DNA en la piel)

En los últimos 2 años varios grupos han estado trabajando en liposomas que puedan

resistir las proteínas plasmáticas para desarrollar un vehículo de administración vía venosa, sin

embargo no se tiene nada aún a nivel clínico.

Viruseficiencia 10 o 100 millones mayor

Se usan básicamente 3 (aunque hay un cuarto que no aparece en la tabla, el virus herpes)

ʘ Adenovirus

- Es un virus del resfrío (muy inmunogénico) que posee una estructura hexamérica.

- Posee DNA de doble hebra

- Está recubierto con proteínas de cubierta y tiene fibras unidas a un pentón. La fibra es la

proteína que reconoce la célula blanco.

- La gracia que tienen los adenovirus es que son capaces de infectar cualquier tipo celular.

- Tiene dos ITR que son zonas promotoras que permiten el encapsidamiento del virus,

también controlan la regulación de la expresión génica del virus

- Poseen una zona de secuencia phi, que es la secuencia de empaquetamiento viral.

- Para terapia génica, se toma todo el genoma del adenovirus y se elimina parte de éste

para reemplazarlo por el gen de interés. Entonces a este adenovirus, cuyo genoma

completo es de se le saca el gen E1 (E viene de early, temprano), que es el primer gen que





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se expresa cuando entra el virus. Este gen E1 es un

factor transcripcional que regula la expresión de todo

el resto de los genes virales.

- Al primer adenovirus que se fabricó se le eliminó el

gen E1 y se le reemplazó por el gen de interés. Este

nuevo virus, como no tiene el gen E1, al introducirlo

dentro de la célula no se puede replicar (porque para

esto requiere E1), por tanto es inerte.

- A éstos se les llama virus de primera generación

- Cuando se empezaron a usar in vivo los virus de

primera generación, se dieron cuenta que era

importante eliminar E3, que es un gen que inhibe la apoptosis (se expresa para que la

célula no se muera y el virus se alcance a replicar).

- Para evitar hacer estos virus más seguros, se eliminó E3. De tal manera que si se escapa el

virus del laboratorio y entra a una célula, ésta hará apoptosis y morirá (esto los hace

seguros).

- Fabricación de estos virus: Se toma un plasmidio que tiene todo el genoma viral y un

plasmidio pequeño (al cual se le pone el gen de interés) y se hace que éstos recombinen

para formar el virus. Este virus de primera generación se fabrica entonces por

recombinación entre un vector que porta el transgén y otro que porta el genoma del

adenovirus.

- El problema de usar estos adenovirus de primera generación se presentó cuando en el año

1999 un paciente en estudio de fase 2 fue inyectado con un virus de primera generación y

se murió producto de una respuesta inmunológica alérgica desencadenada por estas

proteínas exógenas. Este evento hizo que se parara todo el estudio de terapia génica por 5

años, con el objetivo de solucionar el problema inmunológico. Durante esos 5 años se

desarrollaron nuevos vectores y se desarrolló el adenovirus de tercera generación.

- En el caso del individuo que murió es porque si bien es cierto que el virus no tenía E1, el

promotor todavía tenía niveles bajos

de expresión y estas células

infectadas con el adenovirus podían

producir antígeno viral en cantidades

bajas pero suficientes como para

gatillar respuesta inmune.

- Virus de tercera generación Se

eliminó todo el gen viral, de manera

que se dejó un DNA vacío, sólo con el

gen de interés.





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- Se hizo un estudio con adenovirus y se vio que en el caso de los de primera generación, a

las 20 semanas el sistema inmune elimina las células que tienen el virus, por tanto la

terapia génica desaparece. En el caso de los de tercera generación, como no producen

proteínas virales, el sistema inmune no los reconoce y pueden permanecer largo tiempo

en el organismo y por tanto pueden ser usados en terapia génica. El problema que tienen

es que el DNA no se integra al

genoma (DNA episomal),

quedando fuera del

cromosoma, por lo que se

van perdiendo cuando la

célula se divide (una de ellas

se queda con el adenovirus y

la otra no), de manera que al

haber divisiones sucesivas se

va perdiendo (pérdida del

adenovirus por división

celular). Por eso se observa

en el gráfico una pendiente

negativa.





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- Un ejemplo de cómo se usa: cáncerglioma cerebral (cáncer inoperable). Esta fue una

terapia génica muy exitosa, es el único tratamiento que existe actualmente para el

tratamiento del glioma cerebral.

- Los gliomas están comunicados célula-célula mediante gap junctions. Entonces, con una

micro jeringa se inyecta en el centro del glioma un adenovirus que sobreexpresa la enzima

timidina kinasa, que transforma el aciclovir o ganciclovir, fosforilándolo. Una vez que esto

ocurre éste puede ser usado para fabricar nucleótidos que servirán en los procesos de

replicación y/o transcripción de genes. Como sabemos, aciclovir y ganciclovir se usan

como terapia para el virus herpes porque éste tiene una timidina kinasa que le permite

utilizar el aciclovir para la replicación viral y, una vez que el aciclovir se incorpora en las

bases nitrogenadas del virus, éste deja de replicarse. Por tanto lo que ocurre en el caso de

este tratamiento es: se le inyecta el adenovirus que expresa timidina kinasa al glioma, de

manera que éste comienza a producir timidina kinasa. Luego, se infunde en el líquido

cefalorraquídeo gancilovir, el que va a ser captado por estas células que están expresando

timidina kinasa para fabricar nucleótidos y como todos los gliomas están conectados por

gap junctions este nucleótido se reparte en todo el glioma y es usado para replicación. Al

incorporarse al DNA, el glioma deja de replicarse y se detiene el crecimiento del tumor.

- Como las células neuronales normales como los astrocitos no tienen timidina kinasa y por

lo tanto no pueden ocupar el ganciclovir, no hay daño neuronal (esto es selectivo a las

células del glioma por incorporación de la timidina kinasa).

ʘ Retrovirus

- Los retrovirus se caracterizan por ser muy patogénicos y muy poco inmunogénicos (tiende

a escaparse del sistema inmune).

- Como el problema del adenovirus es que no se integra, se diseñaron 2 virus extras: el

retrovirus y el virus adenoasociado, que sí se integran al genoma y por tanto pueden

perpetuarse (se puede hacer con ellos una terapia génica permanente).

- Un ejemplo del uso del retrovirus: actualmente, se están usando retrovirus para el

tratamiento de los niños burbuja con adenosina deaminasa. Este es un tratamiento ex

vivo, que consiste en tomar al niño con la deficiencia genética, extraerle médula ósea para

cultivarla in vitro. Las células madres aisladas de este niño se infectan con un retrovirus

que posee el gen que codifica para la adenosina deaminasa. Como ésta va en un retrovirus

se integra al genoma. Luego, se seleccionan las células que son adenosina deaminasa

positivas (stem cells) y se cultivan nuevamente. Posteriormente, se toma al niño y se

irradia para destruirle toda la médula ósea original, con el objetivo de reimplantarle la

médula ósea tratada ex vivo (médula con células adenosina deaminasa positivas). De esta





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manera, se coloniza nuevamente la médula ósea y se recupera, eliminando la enfermedad

inmune.

- Los niños burbujas no viven más de 12 años, se mueren por algún problema del sistema

inmune. El tratamiento actual sin terapia génica es trasplante de médula ósea por un

dador compatible (el mismo tratamiento que se hace para la leucemia)

- El éxito de la terapia génica es de entre un 60 a un 70%. El problema que tiene esta terapia

génica con retrovirus es que en 2 de los primeros 17 casos de niños burbuja tratados

desarrollaron leucemia, lo que se debe a que el retrovirus se inserta al azar dentro del

genoma y como hay inserción al azar se pueden prender oncogenes.

ʘ Virus adenoasociados

- No se le conoce ninguna enfermedad asociada y es extremadamente poco inmunogénico.

- No se replica solo. La única manera de contagiarse con un virus adenasociado es

contagiándose antes con adenovirus (de ahí el nombre).

- Utiliza la maquinaria del adenovirus para replicarse.

- Se integra al genoma específicamente en el brazo corto del cromosoma 19 en una zona

donde no hay replicación, ni transcripción génica. Es una zona inerte del brazo corto del

cromosoma 19. Por lo tanto, a diferencia del retrovirus que se integra al azar, éste se

integra en una zona muy específica del DNA genómico.

- AAVtiene 2 ITRs, es un DNA de hebra simple, tiene 2 proteínas de cubierta y varias

proteínas Rep. Éstas son las encargadas de insertar el virus al cromosoma 19.

- En la imagen se muestra la estructura de un adenoasociado recombinante donde se

preservan los 2 ITRs y se

cambia todo el genoma viral

por el transgén. El problema

que tiene el adenoasociado es

que es muy pequeño. El

tamaño máximo de este

transgén es del orden de 3,8

kb. Genes más grandes que

eso no entran en el virus.

- Como requiere genes de

adenovirus para replicarse, se

utiliza un plasmidio que tiene

los genes adenovirales (se





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llama AAV helper)E2, E4 son genes de replicación adenoviral.

- También están las proteínas Rep y Cap del adenoasociado.

- Se coloca también un plasmidio con el gen de interés y las zonas ITR. Se introducen estos

tres plasmidios dentro de una célula para fabricar toda la maquinaria replicativa del virus y

encapsidarla. Luego se rompen las células y se purifica el vector adenoviral y éste es el que

se usa. Son entonces 3 vectores los que se usan en una célula para producir esta partícula

viral.

- Ejemplo: tratamiento de la hemofilia con AAV aportando el factor IX. Se pone una

inyección intramuscular del AAV portando el factor IX de la coagulación. Esto se integra y

las células comienzan a producir el factor IX que va a la sangre y estas personas se

recuperan de la hemofilia.

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