biologÍa molecular erase una vez… dr. gerardo daniel deluca laboratorio de aplicaciones...
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BIOLOGÍA MOLECULARErase una vez…
Dr. GERARDO DANIEL DELUCALaboratorio de Aplicaciones Moleculares
Facultad de Medicina-UNNE
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Los primeros pasos …
ADN
ARN
PCR
DOT BLOT
Electroforesis
RFLP
Hibridación Secuenciación
NASBA
Clonación
ARRAYS
HIBRIDACIÓN REVERSA
QUENCHER
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El gran ninguneado de la microbiología se toma revancha…
Molar •mMolar - uMolar
L /mL/uL •uLitro
Grs/mgrs •nGrs / fGrs.
Moles •mMoles /nMoles
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DNA RNA PROTEINASF. Crick
Dogma central de la biología molecular
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El código genético
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• 1960 Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa
Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA.
• 1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restricción.
• 1967 Se descubre la ADN ligasa
• 1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación
• 1975 Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas
• 1977 Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert)
• 1981 Primeros animales transgénicos
• 1985 Invención de la PCR (Kary Mullis)
• 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos
• 2001 Secuenciación del Genoma Humano
• 1960 Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa
Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA.
• 1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restricción.
• 1967 Se descubre la ADN ligasa
• 1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación
• 1975 Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas
• 1977 Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert)
• 1981 Primeros animales transgénicos
• 1985 Invención de la PCR (Kary Mullis)
• 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos
• 2001 Secuenciación del Genoma Humano
Principales descubrimientos y avances de la era molecular
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Aplicaciones de la Biología Molecular
¿Cuál será la influencia probable de la biología molecular sobre el porvenir de la medicina?
1. Los virus y las enfermedades virales
2. Desórdenes metabólicos hereditarios
3. Malformaciones adquiridas, congénitas y estructurales
4. Cáncer
Edward L. Tatum, Atomes 1968
• Biotecnología (industria, animales, vegetales, microorganismos)
• Clonación de órganos y animales
• Medicina humana y veterinaria (diagnóstico y terapia génica)
• Medicina Personalizada
• Identificación de personas huella genética
• Paleontología
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PRINCIPALES APLICACIONES DE LA PCR
INVESTIGACIONES PALEONTOLÓGICAS Y DE FÓSILES
INVESTIGACIONES FORENSES
MEDICINA HUMANA
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PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
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TIPOS DE PCR CONVENCIONAL
• PCR común• Nested PCR• Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos)
• Heminested PCR• PCR de baja astringencia (RAPD PCR)
• RT-PCR
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AMPLIFICACIÓN
PCR
• Más ampliamente utilizada
• Distintos formatos caseros y comerciales
NASBA
• Comercial
• Cargas virales y monitoreo
bDNA
• Comercial
• Cargas virales y monitoreo
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MANUALES
Con solventes
Sin solventes
AUTOMATIZADOS
Robotizados
Magnéticos y de vacío
EXTRACCIÓN DE ADN O ARN
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DETECCIÓN
Electroforesis
Hibridación con sondas marcadas
LIPA
Fluorescencia
RLB
ELISA
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HC VMetodología utilizada:
• RT-PCR anidada de la región 5´no codificante (5´NC) del
genoma viral combinada con el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP)
251pb
AGAROSA / BrEt
100pb
ACRILAMIDA / Nitrato plata
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HPV PCR-RFLP
PCR
RFLP
E z d e r e s t r i c c i ó n
GENOTIPO
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Micobacterias PCR-RFLP
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RT-PCR MÚLTIPLE VIRUS RESPIRATORIOS
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HIBRIDACIÓN REVERSA RLB
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Inno-Lipa Micobacterias
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Curva de amplificación PCR
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Real time PCRVentajas
• No se hace corrida• Detección objetiva
del amplicón• Más sensible
• Multiplex• Más rápida
• Menor tamaño amplicones
• Cargas virales
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Real time PCR
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Curva de melting
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Curva de melting
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TaqMan probes
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Molecular beacon probes
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DETECCIÓN
MÉTODO DE
AMPLIFICACIÓN
EXTRACCIÓN
DE ADN O ARN
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Amplificación isotérmicaEj: Bayer Quantiplex – NASBA (HIV – HCV)
Lectura por electroquimioluminiscencia
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Branched DNA
Quantiplex bDNA Signal Amplification System, de Chiron Corporation (VIH – VHC –VHB)
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Hibridación de captura
HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria
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Secuenciación
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Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.
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DNA CHIPMICROARREGLOS DE
DNA
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