Biologia molekularna

ćwiczenia

Zakład Wirusologii

2

Zakład Wirusologii

Instytut Mikrobiologii

p. 440 A

tel. 55-41-419 lub 55-41-421

Prowadzący:

ćwiczenie 1 dr Monika Radlińska

ćwiczenie 2 dr Agnieszka Kwiatek

ćwiczenie 3 dr Monika Radlińska, dr Monika Adamczyk-Popławska

ćwiczenie 4 dr Monika Adamczyk-Popławska

3

ĆWICZENIE 1

Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA in vitro

Część teoretyczna

Zjawisko restrykcji – modyfikacji Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach

pięćdziesiątych zeszłego wieku (Luria i Human, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano,

że namnażanie się bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zależności od rodzaju

szczepu bakteryjnego podlegającego infekcji. Biochemiczne podłoże i enzymy odpowiedzialne

za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussoix (1962). W 1978 r. Werner Arber, Hamilton O.

Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyna za odkrycie enzymów

restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA.

Ryc. 1.1 Zjawisko restrykcji-modyfikacji.

W systemie RM wyróżnia się dwie aktywności enzymatyczne: endonukleolityczną

(endonukleaza restrykcyjna, ang. restriction endonuclease, REaza) oraz modyfikującą

(metylotransferaza DNA, metylaza DNA, ang. methyltransferase, MTaza), które rozpoznają w

DNA tę samą, specyficzną sekwencję. MTaza modyfikuje określoną zasadę w sekwencji

rozpoznawanej. Jeśli sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, REaza przeprowadza cięcie

endonukleolityczne DNA (Ryc. 1.1 i 1.2).

Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadającej system RM, nie jest

substratem dla REazy z tego systemu. Natomiast obcy DNA (np. infekującego faga) zostaje

rozpoznany przez REazę i strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym

DNA np. bakteriofagowym jest główną postulowaną funkcją systemów RM (Arber i Dussoix,

1962). Według innej hipotezy są one samolubnymi elementami genetycznymi, których

utrzymanie w genomie jest warunkiem przetrwania - rodzaj systemu „trucizna-odtrutka”

(Kobayashi, 2001). Sugeruje się też ich udział w utrzymywaniu tożsamości gatunkowej bakterii

(Jeltsch, 2003) oraz, to, że przez indukowanie rearanżacji genomowych przyczyniają się do

zróżnicowania genetycznego (Arber, 2000).

Chromosom

prokariotyczny

CH3

CH3

CH3

CH3

REaza

REaza REaza

MTaza

MTaza

MTaza

MTaza

fragmenty zdegradowanego

fagowego DNA

4

Ryc. 1.2 Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA – różne

produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy.

Ze względu na różnorodność i mnogość przedstawicieli REaz oraz towarzyszących im

MTaz, systemy RM zostały podzielone na cztery typy (Roberts i wsp., 2003; Tabela 1). Do Typu

I zaliczono kompleksy białkowe złożone z trzech rodzajów podjednostek: rozpoznających

specyficzną sekwencję (S), endonukleolitycznych (R) i modyfikacyjnych (M). Enzym do cięcia

wymaga obecności ATP. Sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna i składa się z dwóch

krótkich odcinków zasad o określonej specyficzności, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi

parami nukleotydów (np. EcoKI AACN6GTGC). Systemy Typu II stanowi najliczniejszą grupę,

składającą się najczęściej z dwóch oddzielnych białek: monomerycznej MTazy i dimerycznej

ENazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i często palindromiczna. Systemy

Typu III RM składając się z dwóch rodzajów podjednostek: modyfikacyjnej (Mod) i

endonukleolitycznej (Res). Miejsce rozpoznawane przez te enzymy, o długości 5-6 par zasad,

jest niepalindromiczne (do cięcia wymagane są jego dwie kopie), a także ATP. Natomiast do

Typu IV zaliczono REazy, które trawią tylko zmetylowany DNA.

Tabela 1. Najważniejsze charakterystyczne cechy różnych typów enzymów restrykcyjnych i

metylaz DNA.

Cecha Typ I Typ II Typ III Typ IV

Podjednostki

strukturalne

Trzy Dwie Dwie Dwie (lub jedna)

Aktywność

enzymatyczna

Endonukleaza

Metylotransferaza

ATPaza

Endonukleaza

Metylotransferaza

Endonukleaza

Metylotransferaza

ATPaza

Endonukleaza

GTPaza

Kofaktory

niezbędne do cięcia

ATP

AdoMet

Mg2+

Mg2+

ATP

Mg2+

GTP

AdoMet

Mg2+

Kofaktory

niezbędne do

metylacji DNA

ATP

AdoMet

Mg2+

AdoMet AdoMet

Mg2+

-

Rozpoznawana

sekwencja

Asymetryczna

dwuczęściowa

Zwykle

symetryczna

Asymetryczna Dwuczęściowa

zmetylowana

Miejsce cięcia Losowe, co

najmniej 1000 pz

od sekwencji

rozpoznawanej

W obrębie, albo

tuż obok

sekwencji

rozpoznawanej

25-27 pz od

miejsca

rozpoznawanego

W różnych

miejscach pomiędzy

zmodyfikowanymi

zasadami

Zdolność do

translokacji DNA

Tak Nie Tak Tak

5’ – G↓AATTC – 3’

3’ – CTTAA↑G – 5’

CH3

CH3

REaza MTaza

5

Typ I i III charakteryzuje brak ścisłej kontroli nad położeniem miejsca cięcia względem

rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy Typu II przecinają DNA w sekwencji

rozpoznawanej albo blisko niej. Wynikiem trawienia określonej sekwencji DNA jest

powtarzalny zestaw fragmentów o przewidywanej długości. Właściwość ta spowodowała

szerokie wykorzystanie enzymów restrykcyjnych Typu II jako narzędzi w manipulacjach DNA.

Endonukleazy restrykcyjnye typu II

Obecnie w bazie danych REBASE (http://rebase.neb.com), katalogującej enzymy

restrykcyjne, metylotransferazy DNA i pokrewne białka, znajduje się ponad 3890 ENaz Typu II

rozpoznających 305 rodzajów specyficznych sekwencji (dane z 09.2012). Komercyjnie

dostępnych jest 241 różnych specyficzności REaz. Enzymy należące do tej grupy są najczęściej

homodimerami lub tetramerami, wymagającymi tylko jonów Mg2+

jako kofaktora. Nić DNA jest

cięta wewnątrz krótkiej sekwencji rozpoznawanej lub w pewnej stałej odległości od niej. Mimo

wspólnych cech, przedstawiciele tego typu są dość różnorodną grupą endonukleaz i dlatego

wprowadzono podział na podtypy, uwzględniając przy tym budowę białek, rodzaj sekwencji

docelowej, sposób cięcia DNA i inne cechy (Tabela 2). To samo białko może należeć do różnych

podtypów, gdyż nie wykluczają się one wzajemnie (Roberts i wsp., 2003).

Tabela 2. Podział enzymów restrykcyjnych Typu II na podtypy.

Podtyp Opis Przykładowe

enzymy

A niepalindromiczna sekwencja rozpoznawana; często jeden gen

koduje REazę a dwa geny kodują MTazy FokI, HphI

B dwuniciowe cięcia po obu stronach sekwencji docelowej AloI, HaeIV

C obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym

polipeptydzie GsuI, HaeIV

E do cięcia potrzebne dwie kopie sekwencji docelowej, jedna cięta,

druga działa jako efektor allosteryczny FokI, Sau3AI

F interakcja z dwiema kopiami sekwencji rozpoznawanej i obie cięte BspMI, Cfr10I

G obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym

polipeptydzie; AdoMet działa stymulująco na aktywność AloI, Eco57I

H podobna struktura genów do Typu I AhdI, BcgI

M sekwencja rozpoznawana cięta gdy zmetylowana BisI, DpnI

P palindromiczna sekwencja rozpoznawana EcoRI, NgoPII

S cięcie poza niepalindromiczną sekwencją rozpoznawaną FokI, Eco57MI

T heterodimery Bpu10I, MlyI

Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych: stosowane są literowe skróty (np. HindIII, EcoRI).

Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a

kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie

odpowiadają kolejnym enzymom wyizolowanym z określonego szczepu.

HindIII - Haemophilus influenzae Rd

Mph1103I - Moraxella phenylpyruvica RFL1103

Izoschizomery – enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą

sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia.

Przykład: HaeIII, BsuRI, BshFI, PhoI, BsnI - GG↓CC CC↑GG

6

Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję

w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia.

Przykład: SmaI Cfr9I Acc65I KpnI

CCC↓GGG C

↓CCGGG G

↓GTACC GGTAC

↓C

GGG↑CCC GGGCC↑C CCATG↑G C↑CATGG

Jedna jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza taką jego ilość, która katalizuje kompletną

hydrolizę wiązań w markerowego DNA o masie 1g w czasie 1 godziny i w temperaturze i

warunkach właściwych dla danego enzymu.

REazy pozostawiają w rozciętej cząsteczce DNA dwa rodzaje końców (Ryc. 1.3):

tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na

końcach są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici;

5’-GG↓CC-3’ 5’-GG–3’ 5’-CC-3’

3’-CC↑GG-5’ 3’-CC–5’ 3’-GG-5’

lepkie końce - 3` lub 5` - jednoniciowe odcinki występujące na obu końcach przeciętej

niesymetrycznie cząsteczki (Rys. 3).

HindIII Mph1103I

A↓AGCTT ATGCA

↓T

TTCGA↑A T↑ACGTA

5’-A–3’ 5’-AGCTT-3’ 5’-ATGCA T-3’

3’-TTCGA-5’ 3’-A-5’ 3’-T ACGTA–5’

Ryc. 1.3 Enzym restrykcyjny HindIII generuje jednoniciowe wystające (lepkie) końce 5’ a

enzym Mph1103I jednoniciowe wystające (lepkie) końce 3’.

Rodzaj pozostawianych końców ma znaczenie przy manipulacjach przeprowadzanych przy

klonowaniu:

warunkuje połączenie końców zgodnych (kompatybilnych)

wymusza konieczność przekształcenia lepkich końców w tępe, np. przez zastosowaniu

polimerazy DNA

Sekwencja palindromiczna – sekwencja czytana w kierunku od 5’ do 3’ końca jest taka sama

jak na nici komplementarnej.

5’- AAGCTT -3’ 3’- TTCGAA -5’

Czynniki wpływające na aktywność enzymu restrykcyjnego

1. Bakterie, z których izolowane są enzymy restrykcyjne bytują w różnych, często

ekstremalnych, środowiskach. Stąd wynikają różne preferencje warunków reakcji związane

np. z temperaturą inkubacji. Inne elementy, które różnią bufory wykorzystywane do

przeprowadzenia reakcji z danym enzymem to: siła jonowa (stężenie soli), główny kation

(sód lub potas) i pH. Każdy enzym restrykcyjny wymaga obecności kofaktora Mg2+

!

2. Czasami w buforach do reakcji dostarczane są dodatkowe związki chemiczne, które

wspomagają działanie niektórych enzymów restrykcyjnych - np. detergent (Triton-X-100 do

7

redukcji napięcia powierzchniowego), BSA (ang. bovine serum albumin, albumina z grasicy

cielęcej) zwiększa ogólne stężenie białka.

3. Obecność zanieczyszczeń pozostałych po preparatyce izolacji DNA (EDTA, fenol, etanol,

proteinazy itd.) może inaktywować enzym restrykcyjny.

4. W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji może pojawić się

niespecyficzna aktywność enzymu - tzw. star activity. Czynniki sprzyjające:

zbyt długi czas reakcji (zmiana stężenia buforu w wyniku odparowywania wody z

mieszaniny reakcyjnej)

nieoptymalna temperatura reakcji,

zbyt wysokie stężenie enzymu,

nieoptymalne stężenie soli,

nieoptymalne pH,

obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn2+

, zamiast Mg2+

(jony Mg2+

są niezbędne

dla aktywności endonukleaz);

obecność rozpuszczalników organicznych,

zbyt wysokie stężenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20C w 50% glicerolu

jednak, aby enzym działał prawidłowo końcowe stężenie glicerolu nie powinno

przekraczać 5%).

Endonukleazy restrykcyjne są wrażliwe na obecność zmetylowanej zasady w obrębie

sekwencji DNA przez nie rozpoznawanej, co wyraża się nie rozpoznaniem jako substratu

sekwencji docelowej. Zmetylowane zasady występujące w DNA to: N6-metyloadenina, N6mA,

m6A), N4-metylocytozyna (N4mC, m

4C) i 5-metylocytozyna (5mC, m

5C) (Ryc. 1.4)

Ryc. 1.4 Zmetylowane zasady w DNA oraz kofaktor grup metylowych S-adenozylometionina

(AdoMet).

AdoMet

adenina cytozyna

N6-metyloadenina N4-metylocytozyna 5mC -metylocytozyna

8

Nieomal wszystkie szczepy Escherichia coli używane w laboratoriach zawierają, co najmniej

dwie metylotransferazy DNA:

Dam metylazę (M.Dam), która dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC

(produkt Gm6ATC)

Dcm metylazę (M.Dcm), która modyfikuje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCWGG (W=A

lub T) CC(A/T)GG do Cm5C(A/T)GG

Praktyczną konsekwencją tego zjawiska jest fakt, że wiele endonukleaz nie będzie trawić DNA

zmetylowanego przez w/w metylazy DNA. Poniżej kilka przykładów.

Metylaza Dam E.coli, modyfikując w DNA adeninę w sekwencjach GATC, czyni je nie

wrażliwymi na trawienie enzymem MboI, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż

substratem dla enzymu Sau3AI.

Metylaza Dcm E.coli, modyfikując w DNA drugą cytozynę w sekwencjach CCWGG, czyni je

nie wrażliwymi na trawienie enzymem EcoRII, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie

wciąż substratem dla enzymu MvaI.

Miejsca rozpoznawane przez niektóre enzymy mogą zawierać się lub pokrywać się częściowo z

sekwencją GATC np TCGA (TaqI), ATCGA (ClaI). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane

przez M.Dam, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami. Podobna sytuacja ma miejsce

w przypadku nakładania się sekwencji docelowej danego enzymu z sekwencją CCWGG

modyfikowaną przez M.Dcm np AGGCCT (StuI); TGGCCA (MscI). Gdy sekwencje te zostaną

zmetylowane przez M.Dcm, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami.

nnTCGAtcnn

nnAGCTagnn

nnATCGATcnn

nnTAGCTAgnn

nnTGATCAnn

nnACTAGTnn

nnTCGAtcnn

nnAGCTagnn

nnTCGAtcnn

nnAGCTagnn

nnATCGATcnn

nnTAGCTAgnn

nnATCGATcnn

nnTAGCTAgnn

nnTGATCAnn

nnACTAGTnn

nnTGATCAnn

nnACTAGTnn

nnAGGCCTggnn

nnTCCGGAccnn

nnTGGCCAggnn

nnACCGGTccnn

nnAGGCCTggnn

nnTCCGGAccnn

nnAGGCCTggnn

nnTCCGGAccnn

nnTGGCCAggnn

nnACCGGTccnn

Jeśli (nieoczekiwanie) DNA nie został pocięty przez użyty przez Ciebie enzym restrykcyjny

lub trawienie jest tylko częściowe, sprawdź, czy ten enzym nie jest wrażliwy na metylację!

9

Inaktywacja enzymów restrykcyjnych po reakcji enzymatycznej Nieodwracalna:

inaktywacja termiczna (zwykle w temperaturze 65C lub 80C);

denaturacja białek poprzez dodanie mieszaniny fenol:chloroform lub każdego z nich

oddzielnie (po odbiałczeniu preparatu należy poddać go precypitacji);

denaturacja białek poprzez dodanie HCl

Odwracalna:

dodanie EDTA do stężenia końcowego 12,5 mM (następuje wymiareczkowanie jonów

Mg2+

)

Połączenie fragmentów DNA w reakcja ligacji

Ligacja jest przeprowadzana przez enzymy ligazy, które łączą dwa fragmenty DNA poprzez

wytworzenie wiązania kowalencyjnego - fosfodiestrowego między końcem hydroksylowym 3'

jednego nukleotydu a końcem 5' z grupą fosforanową drugiego nukleotydu przy wykorzystaniu

energii z hydrolizy ATP (adenozynotrifosforanu). np ligaza faga T4 lub NAD+ np ligaza E.coli.

Dezaktywację ligazy przeprowadza się w temperaturze 65oC przez 20 minut.

Analiza zrekombinowaneo DNA - elektroforeza

Elektroforeza – jest techniką, w której wymusza się ruch cząsteczek za pomocą pola

elektrycznego. W przypadku DNA służy do identyfikacji, rozdziału i izolacji.

Cząsteczki kwasów nukleinowych posiadają ładunek negatywny wynikający z ich szkieletu

fosforanowego i migrują w kierunku anody (+).

Agaroza - polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy otrzymywany z glonów.

Agaroza zawieszona w wodzie w temperaturze pokojowej tworzy koloid - żel. Służy do

rozdziału nawet bardzo dużych cząsteczek, ale posiada relatywnie małą rozdzielczość. Typowe

stężenia do rozdziału DNA to 0,5-2%. W standardowych warunkach poprzez użycie różnych

stężeń agarozy mogą być rozdzielone fragmenty DNA między 50 a 20000 pz (Tabela 3).

Tabela 3. Zależność pomiędzy stężeniem żelu agarozowego a zakresem długości rozdzielanego

liniowego DNA.

Stężenie agarozy (%) Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA (kpz)

0,3 5 - 60

0,6 1 - 20

0,7 0,8 - 10

0,9 0,5 - 7

1,2 0,4 - 6

1,5 0,2 - 3

2,0 0,1 - 2

Elektroforeza w żelach agarozowych prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a

rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze:

TBE1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub

TAE1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8.

Akryloamid - polimer z grupy poliakrylanów otrzymywany przez polimeryzację akryloamidu.

Ma niską zdolność rozdziału (fragmenty DNA do ok. 500 pz), ale bardzo wysoką rozdzielczość.

Do uwidaczniania DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek

etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo

EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Obecność związku interkalującego w żelu

agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. EtBr to bardzo silny

10

mutagen prawdopodobnie także karcynogen i teratogen! Dzięki właściwościom

fluorescencyjnym EtBr możliwa jest wizualizacja DNA w świetle UV (300 nm). Innym

odczynnikiem stosowanym do wizualizacji DNA jest np. SYBR Green, którego czułość jest 25

większa niż EtBr.

Z reguły nakładając próbkę DNA na żel agarozowy mieszamy ją uprzednio z tzw.

barwnikiem do nakładania na żel, lub krótko barwnikiem (ang. loading dye). Przyczyn jego

użycia jest kilka:

próbka DNA, która ma kolor jest wygodna w nakładaniu (łatwość wizualizacji),

glicerol (lub sacharoza, ficoll 400) będący składnikiem tego barwnika zwiększa gęstość

próbki i zapewnia, że znajdzie się ona na dnie dołka,

negatywnie naładowany barwnik migruje przez żel w tym samym kierunku co DNA i

stąd ułatwia śledzenie postępu rozdziału elektroforetycznego (Tabela 4).

Najpopularniejsze barwniki:

błękit bromofenolowy (ang. bromophenol blue)

cyjanian ksylenu (ang. xylene cyanol)

orange G

Różnią się kolorem, tempem migracji w danym żelu (stężenie agarozy, rodzaj buforu).

Tabela 4. Przykładowe „tempo” migracji w żelu z buforem1TAE.

Stężenie agarozy % Xylene cyanol Bromophenol blue

0,3 24800 2900

0,5 11000 1650

0,75 10200 1000

1 6100 500

1,25 3560 370

1,5 2800 300

1,75 1800 200

2 1300 70

Literatura: Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS Microbiol Rev. 2000.

24:1-7

Arber W, Dussoix D. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of

bacteriophage lambda. J Mol Biol. 1962. 5:18-36

Bertani G, Weigle JJ. Host controlled variation in bacterial viruses. J Bacteriol. 1953. 65:113-21

Ishikawa, K., Fukuda, E., Kobayashi, I. Conflicts targeting epigenetic systems and their resolution by cell death:

novel concepts for methyl-specific and other restriction systems. 2010. DNA Res. 17: 325-342

Jeltsch A. Maintenance of species identity and controlling speciation of bacteria: a new function for

restriction/modification systems? Gene. 2003. 317:3-6

Luria SE, Human ML. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J Bacteriol. 1952. 64:557-69

Kobayashi I.Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome

evolution. Nucleic Acids Res. 2001. 29:3742-56

Orlowski, J., Bujnicki, J.M. Structural and evolutionary classification of Type II restriction enzymes based on

theoretical and experimental analyses. 2008. Nucleic Acids Res. 36: 3552-3569

Roberts RJ et. al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their

genes. Nucleic Acids Res. 2003. 31:1805-12

11

Część eksperymentalna

Materiały:

DNA faga (stężenie 0,3 g/l)

enzymy restrykcyjne HindIII (10 U/l), Mph1103I (10 U/l)

bufor do trawienia enzymami restrykcyjnymi (10 stężony): 10 mM TrisCl (pH 8,5 w

37C), 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1mg/ml BSA

bufor TBE (10 stężony): 1M Tris, 0,9 M kwas borowy, 0,01 M EDTA

bufor do nakładania na żel (6 stężony): 15% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy,

0,25% xylene cyanol FF

bromek etydyny 10 mg/ml

ATP 10 mM.

Wykonanie:

Mapę restrykcyjną faga z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I oraz

HindIII prezentuje Ryc. 1.5. Kolejne etapy prowadzonego eksperymentu zostały przedstawione

w formie schematu (Ryc. 1.6).

1. Nastawienie trawienia DNA faga enzymem HindIII

Wykonanie: zmieszać 12,5 l mieszaniny H (zawiera bufor i enzym HindIII) z 12,5 l

mieszaniny 1 (zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37C, 10 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem HindIII):

2,5 l buforu do trawienia

2,5 l (0,9 g) DNA faga

19,5 l H2O

0,5 l enzymu restrykcyjnego HindIII

2. Nastawienie trawienia DNA faga enzymem Mph1103I

Wykonanie: zmieszać 5l mieszaniny M (zawiera bufor i enzym Mph1103I) z 5l mieszaniny 2

(zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37C, 40 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem Mph1103I):

1 l buforu do trawienia

0,5 l (0,15 g) DNA faga

8,3 l H2O

0,2 l enzymu restrykcyjnego Mph1103I

3. Inaktywacja termiczna enzymu restrykcyjnego HindIII

Inkubacja próbki w temperaturze 65C, 20 min.

4. Przygotowanie reakcji ligacji

pobrać 20 l pociętego enzymem HindIII DNA faga (4/5 reakcji trawienia z pkt.1)

dodać 10 l mieszaniny ligacyjnej

Reakcję inkubować w temperaturze pokojowej 15 min.

Skład mieszaniny ligacyjnej: bufor do trawienia – 1 l, 10 mM ATP - 1 l, H2O – 7,7 l,

ligaza – 0,3 l.

12

5. Inaktywacja termiczna ligazy

Inkubacja próbek w temperaturze 65C, 20 min.

6. Trawienie mieszaniny ligacyjnej (z pkt. 4) enzymem restrykcyjnym HindIII i Mph1103I

(oddzielnie).

Wykonanie:

zmieszać 10 l reakcji ligacji z pk.4 z 5l mieszaniny z enzymem HindIII

zmieszać 10 l reakcji ligacji z pk.4 z 5l mieszaniny z enzymem Mph1103I

Inkubacja próbek w temperaturze 37oC, 10 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

10 l reakcji ligacji

0,5 l buforu do trawienia

4,2 l H2O

0,3 l enzymu restrykcyjnego HindIII lub Mph1103I

7. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

przygotowanie żelu agarozowego (0,7% w buforze 1 TBE)

przygotowanie próbek DNA do naniesienia na żel (pobrać 10 l mieszaniny reakcyjnej i

dodać 2 l barwnika; nanieść na żel)

rozwijać elektroforezę przez 1 h, a następnie barwić żel w roztworze bromku etydyny

wizualizacja żelu w świetle UV (dł. fal 300 nm)

Próbki na żel:

N.C = Nie trawiony DNA faga

L = Próbka z ligacją (zligowane fragmenty DNA faga po cięciu enzymem HindIII)

LH = HindIII lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem HindIII

H = HindIII = Próbka strawionego DNA faga enzymem HindIII (z pkt. 1)

M = Mph1103I = Próbka strawionego DNA faga enzymem Mph1103I (z pkt. 1)

LM = Mph1103I lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem Mph1103I

Ryc. 1.5 Mapa restrykcyjna faga z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I

oraz HindIII.

13

Trawienie DNA enzymem HindIII

25 μl

5 μl zachować 20 μl

+10 μl Ligacja

=30 μl

10 μl zachować

20 μl

10 μl +5 μl HindIII

10 μl +5 μl Mph1103

Próbki DNA na żel

Dezaktywacja termiczna 65

oC 20 min

Dezaktywacja termiczna 65

oC 20 min

H

L

LH LM

Trawienie enzymem Mph1103I 10 μl

M

nc L H LH m M LM

Ryc. 1.6 Schemat doświadczeń przeprowadzanych w trakcie ćwiczenia 1. m - marker wielkości;

nc - nie cięty DNA faga ; L – produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII; H - DNA faga

strawiony enzymem HindIII; LH - produkty ligacji fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione

enzymem HindIII; M - DNA faga strawiony enzymem Mph1103I; LM - produkty ligacji

fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione enzymem Mph1103I.

14

Ryc. 1.7 Obraz rozdziału DNA w żelu agarozowym 0,7%.

N.C – nie cięty DNA faga ; L – produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII;

- DNA faga strawiony określonym enzymem (nazwa użytego enzymu znajduje się nad

symbolem ); Lig - produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII (patrz tor L), które

strawiono określonym enzymem (nazwa użytego enzymu znajduje się nad symbolem ).

Zwróć uwagę, że wzór restrykcyjny zrekombinowanego DNA faga (tory L) jest inny niż

wzór restrykcyjny natywnych cząsteczek DNA faga . (tory ). Wyjątkiem jest trawienie

enzymem HindIII (tor LigH), który wygenerował substratowe fragmenty restrykcyjne do

ligacji (tor H).

M – marker wielkości

N.C L. HindIII NdeI BamHI Eco130I BglII MphI1103I

H LigH M Lig Lig Lig Lig Lig

15

Przygotowanie do Ćwiczenia 2

1. Nastawienie trawienie DNA wektora pUC19

Wykonanie: zmieszać 10 l mieszaniny HindIII_pUC (zawiera bufor i enzym HindIII) z 10 l

mieszaniny pUC (zawiera DNA wektora pUC19). Inkubacja w temperaturze 37C, 60 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 l):

2 l buforu

1 l DNA pUC19 (stężenie 50 ng/l)

0,2 l enzymu HindIII

16,8 l H2O

2. Nastawienie trawienia DNA bakteriofaga

Wykonanie: zmieszać 10 l mieszaniny HindIII_ (zawiera bufor i enzym HindIII) z 10 l

mieszaniny (zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37C, 60 min.

Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 l):

1 l buforu

2 l DNA faga (stężenie 0,3 g/l)

0,3 l enzymu HindIII

16,8 l H2O

16

ĆWICZENIE 2

Enzymy służące do modyfikacji DNA

Część teoretyczna

Obecnie stosuje się wiele różnorodnych, komercyjnie dostępnych enzymów służących do

modyfikacji i rekombinacji DNA. Są to m.in.: enzymy restrykcyjne (ćwiczenie 1), alkaliczna

fosfataza (AP, ang. alkaline phosphatase), kinaza polinukleotydowa, ligaza DNA, polimeraza

DNA I, fragment Klenowa, nukleaza S1, odwrotna transkryptaza, terminalna transferaza, RNaza,

DNaza, egzonukleazy (I, III), endonukleazy (IV, V), polimeraza DNA (Taq, Pfu),

topoizomeraza.

Alkaliczna fosfataza (EC 3.1.3.1) jest hydrolitycznym enzymem odpowiedzialnym za

usuwanie reszt 5’ fosforanowych z DNA, RNA oraz nukleotydów. Wszystkie alkaliczne

fosfatazy są metaloenzymami (Zn(II)). Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest

defosforylacją i przebiega z wytworzeniem produktu pośredniego zawierającego ufosforylowaną

serynę. Enzym ten wykazuje najwyższą aktywność w środowisku alkalicznym – stąd jego

nazwa. Możemy wyróżnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, pochodzących z różnych źródeł,

które odróżnia między innymi możliwość inaktywacji:

bakteryjna alkaliczna fosfataza (BAP – bacterial alkaline phosphatase) – wykazuje

najwyższą aktywność i jest najbardziej trwała (najtrudniej ją inaktywować po

zakończeniu reakcji defosforylacji). BAP jest wydzielana w postaci monomeru

(Mr = 47 kDa) do przestrzeni peryplazmatycznej Escherichia coli, gdzie dimeryzuje i

staje się katalitycznie aktywna. W obojętnym lub alkalicznym pH, dimer BAP zawiera

do 6 jonów Zn2+

, z których dwa są niezbędne dla aktywności enzymu. Tylko jedno z

dwóch miejsc katalitycznych dimeru jest aktywne przy niskim stężeniu sztucznego

substratu, podczas gdy oba stają się aktywne przy wysokim stężeniu.

alkaliczna fosfataza z jelita cielęcego (CIAP - calf intestinal alkaline phosphatase) –

najczęściej używana w laboratoriach biologii molekularnej. Wykazuje niewiele niższą

aktywność w stosunku do BAP, a można ją efektywnie inaktywować termicznie lub

poprzez trawienie proteolityczne. CIAP jest glikoproteiną zbudowaną z dwóch 514-

aminokwasowych monomerów. Aktywność enzymu zależy od stężenia jonów Mg2+

i

Zn2+

. Zn2+

wiąże się w centrum katalitycznym i jest wymagany do aktywności

katalitycznej. Mg2+

wiąże się do różnych miejsc enzymu i jest allosterycznym

aktywatorem.

alkaliczna fosfataza z krewetek (SAP - shrimp alkaline phosphatase) – izolowana z

krewetek Pandalus borealis, jest stosunkowo łatwa do inaktywacji termicznej.

Przy manipulacjach DNA alkaliczna fosfataza używana jest głównie do:

usuwania grupy 5´fosforanowej z plazmidów i wektorów bakteriofagowych, które

uprzednio zostały strawione enzymami restrykcyjnymi (Ryc. 2.1). Zapobiega to

ponownej cyrkularyzacji wektora, a tym samym wydajność klonowania jest większa

(Ryc. 2.2).

usuwania grupy 5´fosforanowej z fragmentów DNA poprzedzającego radioaktywne

znakowanie 32

P (przygotowanie DNA do radioaktywnego znakowania w reakcji z

wykorzystaniem polinukleotydowej kinazy faga T4) (Ryc. 2.1).

usuwania grupy 5´fosforanowej z RNA, rNTPs i dNTPs.

jako enzym reporterowy w nieradioaktywnych systemach do wykrywania i lokalizacji

kwasów nukleinowych i białek. AP jest skoniugowana z ligandem, który specyficznie

oddziałuje z cząsteczką docelową.

17

Ryc. 2.1 Usuwanie grupy 5´fosforanowej DNA/RNA. (A) struktura nukleotydu, zaznaczono

usuwaną grupę fosforanową; (B) i (C) reakcja defosforylacji.

Ryc. 2.2 Schemat klonowania insertu (powstałego po trawieniu enzymem restrykcyjnym) do

defosforylowanego wektora.

wektor nie poddany działaniu

alkalicznej fosfatazy może ulegać

ponownej cyrkularyzacji, co

prowadzi do otrzymania dużej

ilości „pustych” wektorów

defosforylowany wektor nie może

ulec cyrkularyzacji, bez insertu

3’ OH 5’ P

3’ OH 3’ OH

3’ OH

5’ P

5’ pDNA lub 5’pRNA 5’ OHDNA lub 5’OHRNA alkaliczna fosfataza

(A) (B)

(C)

18

Kinaza polinukleotydowa bakteriofaga T4 (T4 PNK) katalizuje przeniesienie -fosforanu z

ATP (Ryc. 4.3) na (patrz struktura nukleotydu po defosforylacji) koniec 5’ OH jedno- lub dwu-

niciowego DNA, RNA lub oligonukleotydów.

Ryc. 2.3 Struktura ATP (ang. adenosine triphosphate) i ADP (ang. adenosine diphosphate).

Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji: reakcji

podstawienia (ang. forward reaction) i reakcji wymiany (ang. exchange reaction) (Ryc. 2.4).

W reakcji podstawienia -fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy nukleotyd

nie posiada reszty fosforanowej na końcu 5’ (została ona usunięta w reakcji defosforylacji lub w

takiej postaci została zsyntetyzowana chemicznie). Reakcja ta jest odwracalna. W reakcji

wymiany, nadmiar ADP powoduje, że T4 PNK najpierw przenosi 5’-fosforan z

ufosforylowanego DNA, a następnie DNA jest ponownie fosforylowany przez przeniesienie -

fosforanu z ATP (np. [-32

P]ATP). W reakcji katalizowanej przez T4 PNK stężenie ATP

powinno wynosić 1M (reakcja podstawienia) lub 2M (reakcja wymiany). Ponadto enzym

posiada aktywność 3’ fosfatazy.

Ryc. 2.4 Aktywność enzymatyczna T4 PNK.

Oczyszczenie kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4 z zainfekowanych komórek

gospodarza jest niewydajne i trudne, dlatego też źródłem T4 PNK są komórki Escherichia coli

z wklonowanym genem pseT bakteriofaga T4. T4 PNK jest homotetramerem zbudowanym

z podjednostek o masie 28,9 kDa każda.

T4 PNK jest głównie wykorzystywana do:

radioaktywnego znakowania na końcu 5’ kwasów nukleinowych (reakcja podstawienia

lub wymiany), które następnie wykorzystywane są: (i) jako sonda hybrydyzacji; (ii) do

mapowania transkryptu; (iii) jako markery do elektroforezy żelowej; (iv) jako startery

w reakcji sekwencjonowania DNA; (v) jako startery do reakcji PCR lub w innych

metodach wymagających terminalnie wyznakowanego DNA.

5'-fosforylacji oligonukleotydowych łączników i DNA/RNA przed ligacją.

19

Termostabilne polimerazy DNA przeprowadzają zależną od matrycy syntezę DNA

w kierunku 5’→3’ (Ryc. 2.5). Proces ten polega na dodawaniu deoksyrybonukleotydów do

końca 3’ nowosyntetyzowanej nici. Do rozpoczęcia reakcji wymagany jest starter z wolną grupą

3´-OH oraz jony Mg2+

. Maksymalną aktywność katalityczną enzymy te wykazują w

temperaturze 75-80C. W temp. 37C osiągają jedynie około 10% aktywności maksymalnej.

Ryc. 2.5 Reakcja katalizowana przez termostabilną polimerazę DNA.

Tabela 5. Właściwości wybranych termostabilnych polimeraz DNA* (wg Sambrook, J.

i Russell, D.; 2001).

Enzym Organizm Optymalna

temperatura

(C)

Aktywność

egzonukleolityczna

Częstość

błędów

10-6

Stabilność Inne uwagi

Taq Thermus

aquaticus

75 - 80 5’→3’ 20 - 100 9 min w

97,5C

produkt PCR

posiada na

końcu 3’ dA**

94 kDa

monomer

Pwo Pyrococcus

woesei

60 - 65 3’→5’ 3,2 > 120 min

w 100C

Pfu Pyrococcus

furiosus

72 - 78 3’→5’ 1,6 240 min w

95C

produkt PCR

posiada tępe

końce

90 kDa

monomer

*poszczególne wartości mogą odbiegać od podanych w tabeli i różnić się w zależności od producenta

**polimeraza DNA Taq wykazuje aktywność transferazy nukleotydowej, ale nie ma aktywności proofreading

(egzonukleolitycznej 3’5’), co powoduje dodanie dodatkowej reszt/y adeninowych na końcu 3’ produktu PCR

Dostępne są również mieszaniny kilku termostabilnych polimeraz DNA np. High Fidelity

PCR Enzyme Mix czy Long PCR Enzyme Mix. Umożliwiają one amplifikację fragmentów

DNA o wielkości: (i) do 47 kpz z wirusowym DNA jako matrycą lub (ii) do 21 kpz

z genomowym DNA jako matrycą.

Zastosowanie termostabilnych polimeraz DNA:

amplifikacja fragmentów DNA w reakcji PCR;

znakowanie DNA;

sekwencjonowanie DNA;

wbudowywanie zmodyfikowanych nukleotydów (np. nukleotydów

znakowanych biotyną, digoksygeniną lub fluorescencyjnie);

mutageneza specyficzna wobec miejsca;

5’ DNAOH 5’ DNA – (pdN)n + nPPi

termostabilna polimeraza DNA

Mg2+

dATP, dTTP, dGTP, dCTP

20

Polimeraza DNA I (holoenzym) (PolI, polimeraza Kornberga) syntetyzowana przez E. coli

zbudowana jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 109 kDa,

kodowanego przez gen polA. Enzym ten posiada następujące aktywności: (i) polimerazy DNA

5’→3’; (ii) egzonukleazy 3’→5’; (iii) egzonukleazy 5’→3’ oraz (iv) RNazy H. Aktywność

RNazy H nie jest powszechnie wykorzystywana w biologii molekularnej. Poszczególne

aktywności katalizowane są przez odrębne domeny enzymu (Tabela 6).

Tabela 6. Domeny polimerazy DNA I kodowanej przez Escherichia coli.

Domena Aktywność

Karboksylowa, aminokwasy 543 – 928,

~46 kDa

polimeryzacyjna 5’→3’

Centralna, aminokwasy 326 – 542,

~22 kDa*

egzonukleolityczna 3’→5’

Aminowa, aminokwasy 1-325* egzonukleolityczna 5’→3’

*karboksylowa i centralna domena stanowią fragment Klenowa

Fragment Klenowa jest dużym fragmentem polimerazy DNA I kodowanej przez E. coli.

Posiada aktywność polimeryzacyjną 5’→3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’→5’

(aktywność naprawcza). W porównaniu z PolI nie posiada aktywności egzonukleolitycznej

5’→3’. Do przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5’→3’ wymagana jest obecność

jednoniciowej matrycy oraz startera. Niezbędnym kofaktorem reakcji katalizowanych przez

enzym są jony Mg2+

. Fragment Klenowa jest monomerem o wielkości 76 kDa. Enzym ten

można otrzymać poprzez proteolizę polimerazy Kornberga subtylizyną lub też poprzez

sklonowanie odpowiedniego fragmentu genu polA w komórkach E. coli.

Fragment Klenowa jest wykorzystywany w biologii molekularnej m.in. do:

wypełniania lepkich końców 5’ (Ryc. 2.6), powstałych po trawieniu enzymami

restrykcyjnymi pozostawiającymi tego typu końce. Enzym ten katalizuje w sposób

zależny od matrycy dodawanie trifosforanów nukleotydów do cofniętej reszty

hydroksylowej 3’. Synteza zachodzi w kierunku 5’→3’do momentu, aż wystający lepki

koniec zostanie całkowicie wypełniony.

Ryc. 2.6 Wypełnianie wystających lepkich końców 5’ przez fragment Klenowa.

wytępiania lepkich końców 3’, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi

zostawiającymi wystające końce 3’. Jednak wytępianie lepkich końców 3’ jest

wydajniej katalizowane przez polimerazę DNA faga T4, która ma większą

aktywność egzonukleolityczną. W niektórych przypadkach aktywność

egzonukleolityczna 3’→5’ fragmentu Klenowa jest niepotrzebna lub szkodliwa. Należy

wtedy zastosować fragment Klenowa exo-. Enzym ten zachowuje aktywność

polimeryzacyjną, nie posiada natomiast aktywności egzonukleolitycznej 3’→5’.

Fragment Klenowa exo- uzyskuje się poprzez wprowadzenie odpowiedniej mutacji

w genie kodującym fragment Klenowa.

5’ ...GTCCA 3’OH 5’ ...GTCCAAGCT 3’OH 3’ ...CAGGTTCGAp 5’ 3’ ...CAGGTTCGAp 5’

fragment Klenowa

dATP, dTTP,

dGTP, dCTP

Mg2+

21

Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest białkiem o wielkości 114 kDa kodowanym przez gen 43

colifaga T4. Otrzymywany jest z komórek E. coli niosących plazmid zawierających gen 43.

Enzym ten posiada aktywności zbliżone do aktywności fragmentu Klenowa, tj. aktywność

polimeryzacyjną 5’→3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’→5’. Nie posiada aktywności

egzonukleolitycznej 5’→3’.

Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest wykorzystywana w biologii molekularnej m.in do:

wytępiania lepkich końców 3’, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi

zostawiającymi wystające końce 3’ (Ryc. 2.7). Aktywność egzonukleolityczna w

stosunku do dwuniciowego DNA blokowana jest przez aktywność polimeryzacyjną

5’→3’.

Ryc. 2.7 Wytępianie lepkich końców 3’ przez polimerazę DNA bakteriofaga T4.

wypełniania lepkich końców 5’. Aktywność polimeryzacyjna 5’→3’ wymaga obecności

matrycy, startera, jonów Mg2+

oraz dNTP.

Aktywność egzonukleolityczną 3’→5’ polimerazy DNA bakteriofaga T4 jest ok. 200

razy silniejsza niż fragmentu Klenowa. Powoduje to, że enzym ten jest wydajniejszy w

wytępianiu lepkich końców 3’.

Literatura: Sambrook,J. and Russell,D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

5’ ...pCpGpCpApTpCpT 3’ ...pCpGpCOH 3’

3’ ... GpCpGp 5’ ... GpCpGp 5’

+

pA + 5’pC +

5’pT

polimeraza DNA

bakteriofaga T4

Mg2+

22

Część eksperymentalna

Materiały:

DNA faga trawiony enzymem restrykcyjnym HindIII

plazmid pUC19 trawiony enzymem restrykcyjnym HindIII

enzymy: CIAP (calf intestine alkaline phosphatase), ligaza DNA faga T4, Fragment

Klenowa

bufor do trawienia R 1×stężony (10 mM Tris-HCl pH 8,5; 10 mM MgCl2; 100 mM KCl;

0,1 mg/ml BSA)

ATP 10 mM

2 mM dNTP Mix

Wykonanie:

Część I

Defosforylacja wektora plazmidowego strawionego enzymem restrykcyjnym

1. Usuwanie reszt fosforanowych z DNA wektora

Próbkę pUC19 strawionego HindIII podzielić na cztery części.

Jedną część poddać działaniu alkalicznej fosfatazy mieszając ze sobą:

2 l DNA pUC19/HindIII

8 µl mieszaniny reakcyjnej (bufor do trawienia R – 0,8 l, alkaliczna fosfataza

(CIAP) – 0,5 l, H2O – 6,7 l)

Inkubować w temperaturze 37C, 30 min.

Pozostałą cześć próbki pUC19/HindIII zostawić w temperaturze 4°C.

2. Termiczna inaktywacja alkalicznej fosfatazy

Próbkę z pkt. 1 inkubować 15 min w temperaturze 85C.

3. Ligacja

Przygotować równolegle dwie mieszaniny ligacyjne (Tabela 7)

Tabela 7. Przygotowanie mieszanin ligacyjnych nr 1 i nr 2 w trakcie ćwiczenia 2.

Składnik Mieszanina ligacyjna nr 1 (wektor

poddany działaniu CIAP)

Mieszanina ligacyjna nr 2 (wektor

NIE poddany działaniu CIAP)

wektor

(pUC19/HindIII)

10 µl 2 µl

wstawka (/HindIII) 4 µl 4 µl

mieszanina reakcyjna mieszanina reakcyjna nr 1 (6 l) mieszanina reakcyjna nr 2

(14 l)

mieszanina reakcyjna nr 1: bufor do trawienia R (0,6 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM),

ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H2O (3,8 l)

mieszanina reakcyjna nr 2: bufor do trawienia R (1,4 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM),

ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H2O (11 l)

Mieszaniny ligacyjne inkubować w temperaturze pokojowej 1-16 h.

23

Część II

Wytępianie wektora strawionego enzymem pozostawiającym lepkie końce 5’

1. Wytępianie wektora

Próbkę pUC19 strawionego HindIII poddać działaniu Fragmentu Klenowa mieszając

ze sobą:

2 l DNA pUC19/HindIII

8 µl mieszaniny reakcyjnej (bufor do trawienia R – 0,8 l, Fragment Klenowa 0,2

l (2 u), 0,25 l dNTP Mix (stężenie końcowe 0,05 mM), H2O – 6,75 l)

Inkubować w temperaturze 37C, 15 min.

2. Termiczna inaktywacja Fragmentu Klenowa

Próbkę z pkt. 1 inkubować 15 min w temperaturze 75C.

3. Ligacja

Przygotować równolegle dwie mieszaniny ligacyjne (Tabela 8)

Tabela 8. Przygotowanie mieszanin ligacyjnych nr 3 i nr 4 w trakcie ćwiczenia 2.

Składnik Mieszanina ligacyjna nr 3

(wektor poddany działaniu

Fragmentu Klenowa)

Mieszanina ligacyjna nr 4

(wektor NIE poddany działaniu

Fragmentu Klenowa)

wektor (pUC19/HindIII) 10 µl 2 µl

mieszanina reakcyjna mieszanina reakcyjna nr 3

(10 l)

mieszanina reakcyjna nr 4

(18 l)

mieszanina reakcyjna nr 3: bufor do trawienia R (1 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM), ligaza

DNA faga T4 (0,6 l), H2O (7,4 l)

mieszanina reakcyjna nr 4: bufor do trawienia R (1,8 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM),

ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H2O (14,6 l)

Mieszaniny ligacyjne inkubować w temperaturze pokojowej 1-16 h.

24

ĆWICZENIE 3

Transformacja kompetentych komórek Escherichia coli

Część teoretyczna

Transformacja komórek bakteryjnych

Transformacja komórek bakteryjnych, obok koniugacji i transdukcji, jest jednym z

mechanizmów horyzontalnego transferu genów.

Transformacja bakterii polega na pobraniu wolnego egzogennego DNA ze środowiska.

Dalszym etapem jest ustabilizowanie pobranego DNA w komórce (w formie plazmidu lub

poprzez rekombinację z chromosomem) oraz zmiana w genotypie biorcy. Zdolność komórek

bakteryjnych do pobierania DNA w procesie transformacji nazywana jest stanem kompetencji.

Niektóre gatunki bakterii są naturalnie/spontanicznie zdolne do pobrania DNA ze środowiska.

Większość tych bakterii wchodzi w stan kompetencji w określonych (najczęściej

nieprzychylnych) warunkach wzrostu, np. kompetencję komórek wzmaga wysoki poziom

cAMP. Bacillus subtilis czy Haemophilus influenzae są bakteriami fakultatywnie

kompetentnymi. Tylko Neisseria gonorrhoeae jest bakterią konstytutywnie (zawsze)

kompetentną. U niektórych bakterii warunkiem zajścia transformacji jest obecność sygnałowych

sekwencji pobierania (ang. uptake-signal sequences) w substratowym DNA i/lub obecność

receptorów na powierzchni komórki. Gęstość populacji bakteryjnej przez „wyczuwanie

liczebności” (ang. Quorum sensing) wpływa na stan kompetencji bakterii. U Streptococcus

pneumoniae kompetencja jest związana z procesem transbłonowego transportu wapnia.

Wiele bakterii w naturalnych warunkach nie ulega transformacji. Stan kompetencji może

zostać wywołany w laboratorium poprzez działania czynników chemicznych lub fizycznych w

niskiej temperaturze. Metody te są szeroko wykorzystywane w inżynierii genetycznej, np. do

klonowania genów. W ten sposób transformowana jest E. coli. Uzyskanie stanu kompetencji ma

miejsce dzięki płukaniu komórek buforami zawierającymi dwuwartościowe kationy (np. Ca2+,

Mn2+

,

Rb2+

), które destabilizują błonę komórkową (mechanizm nie jest dobrze poznany).

Kluczowy jest stan fizjologiczny komórek bakteryjnych. Komórki muszą być młode – w

wykładniczej fazie wzrostu. Komórek w fazie stacjonarnej NIE da się wydajnie wprowadzić w

stan kompetencji! Wejście DNA do komórek, bezpośrednio z otaczającego je roztworu, ma

miejsce dzięki szokowi termicznemu. Wprowadzany DNA jest w formie dwuniciowego i

koliście zamkniętego plazmidu (zrekombinowanego plazmidu). Liniowy DNA nie utrzymuje się

w komórce i jest szybko degradowany.

Etapy transformacji chemicznej (Ryc. 3.1):

1. Komórki kompetentne muszą być stale inkubowane w lodzie.

2. Do komórek kompetentnych dodać DNA. Kontynuować inkubację w lodzie (do 30 min).

3. Przenieść próbki z łaźni lodowej do bloku grzejnego z temp. 42C (szok termiczny) 1-2

min.

4. Przenieść próbki z bloku grzejnego do łaźni lodowej na 2 min.

5. Dodać podłoże płynne (ok.1 ml) i inkubować w termostacie z temp 37C przez 30-60

min.

DNA może także zostać wprowadzony do elektrokompetentnych komórek poprzez

elektroporację. Proces ten także polega na destabilizacji błony komórkowej: silne pole

elektryczne (krótki impuls prądu elektrycznego o napięciu ok. 1,6-2,5 kV) powoduje powstanie

przejściowych porów w błonie, przez które mogą przenikać cząsteczki DNA. Komórki

elektrokompetentne uzyskuje się poprzez wielokrotne ich przemywanie ultraczystą wodą w celu

usunięcia śladów soli.

Im wyższe stężenie DNA tym wydajniejszy jest proces transformacji.

25

Uwaga: komórki kompetentne E. coli są niezwykle wrażliwe w tych warunkach, dlatego cały

proces należy przeprowadzić inkubując komórki w łaźni lodowej. Wszystkie pipetowania należy

przeprowadzać bardzo delikatnie.

Wydajność transformacji z wykorzystaniem chemokompetentnych komórek E. coli wynosi ok.

106-10

9 transformantów/μg DNA. Wydajność elektroporacji wynosi ok. 10

10 transformantów/μg

DNA.

Do komórek bakteryjnych wnika najczęściej tylko jedna cząsteczka DNA, ko-

transformacja E. coli dwoma plazmidami możliwa jest tylko w przypadku dwóch różnych ori

plazmidowych (grupy zgodności).

Ryc. 3.1 Schemat transformacji chemicznej.

Plazmidy i wektory plazmidowe

Termin plazmid wprowadził Joshua Lederberg w roku 1952. Plazmid to

pozachromosomowa cząsteczka DNA, występująca autonomicznie w cytoplazmie wielu

organizmów prokariotycznych, zdolna do samodzielnej replikacji niezależnie od chromosomu

bakteryjnego. Tworzą ją dwuniciowe, najczęściej koliście zamknięte, cząsteczki DNA, rzadziej

liniowe. Najbardziej charakterystyczną cechą plazmidów jest ich fizyczna odrębność od

chromosomu gospodarza oraz zdolność do trwałego utrzymywania się w komórce i replikowania

się w niej w kontrolowany sposób. Cechą charakterystyczną każdego plazmidu jest liczba kopii

jego cząsteczek w komórce, która jest ściśle zdefiniowana im mniejszy plazmid, tym liczba kopii

jest większa. Replikacja plazmidowego DNA jest regulowana na etapie inicjacji replikacji.

Wyróżnia się rozluźnioną (ang. relaxed) i zaostrzoną/ścisłą (ang. stringent) kontrolę replikacji.

Cząsteczki plazmidów stały się podstawą konstrukcji wektorów, które, tak jak plazmidy,

posiadają zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek. Wektory plazmidowe

wykorzystywane są do klonowania genów, a czasem także do nadprodukcji białka kodowanego

przez sklonowany gen.

Elementy funkcjonalne wektora

Systemy replikacyjne zawierające – ori (ang. origin) miejsce inicjacji replikacji oraz w

większości wektorów gen rep kodujący białko inicjujące replikację. Sposób regulacji inicjacji

26

replikacji decyduje o liczbie kopii plazmidu w komórce, dlatego wyróżniamy wektory wysoko- i

niskokopijne.

Geny markerowe, czyli geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy

fenotypowe, które umożliwiają identyfikacje komórek zawierających dany wektor.

Wektor powinien zawierać co najmniej jeden marker selekcyjny (gen oporności na

antybiotyk), który pozwala na wyselekcjonowanie komórek zawierających wektor, bowiem

uniemożliwia wzrost lub uśmierca komórki, które go nie mają. Szczep użyty do transformacji

musi być wrażliwy na ten antybiotyk!

Dodatkowy marker może pozwolić na odróżnienie wektora zrekombinowanego

(zawierającego wklonowaną wstawkę) od takiego, który jest „pusty” tj. nie zligował się z

żadnym fragmentem DNA.

Unikalne miejsca restrykcyjne, które służą do wprowadzania obcego DNA. W najnowszych

wektorach taką funkcję pełni tzw. polilinker, nazywany też MCS (ang. multicloning site). jest to

syntetyczny odcinek DNA, w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanych

przez różne endonukleazy restrykcyjne. Polilinker jest z reguły wstawiany w obrębie drugiego

markera.

Co najmniej jeden silny promotor pozwalający na ekspresję danego genu.

Antybiotyki jako markery selekcyjne stosowane w biologii molekularnej

Antybiotyki to substancje chemiczne mające właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze

produkowane przez organizmy żywe. Najszersza definicja mówi, że antybiotykami są także

związki syntetyczne, które wywierają negatywny wpływ na mikroorganizmy, a nie mają swoich

pierwowzorów wśród naturalnie produkowanych substancji

Mechanizmy oporności na antybiotyki mogą być różne, niżej wymieniono te, które są

wykorzystywane w biologii molekularnej.

Najpopularniejszymi antybiotykami wykorzystywanymi w biologii molekularnej są:

Ampicylina – antybiotyk -laktamowy hamujący biosyntezę ściany komórkowej przez wiązanie

z białkami PBP (ang. penicilin-binding proteins). Zasadniczo działa bakteriostatycznie, gdyż

zabija wyłącznie rosnące komórki, poprzez zaburzenie syntezy mureiny, co prowadzi do

rozerwania ściany komórkowej i lizy.

Mechanizm oporności na ampicylinę polega na enzymatycznej degradacji cząsteczki antybiotyku

poprzez enzym z grupy -laktamaz (np. kodowany przez gen bla).

Tetracyklina – antybiotyk poliketydowy. Działa na translację poprzez wiązanie się z miejscem

akceptorowym dla aminoacylo-tRNA w podjednostce 16S rRNA.

Mechanizm oporności na tetracyklinę polega na aktywnym usuwaniu antybiotyku z komórki

poprzez wyspecjalizowany transporter błonowy (kodowany przez gen tet).

Chloramfenikol – antybiotyk o działaniu bakteriostatycznym. Hamuje aktywność

peptydylotransferazy, wiążąc się z 23S rRNA.

Mechanizm oporności na chloramfenikol polega na enzymatycznej modyfikacji cząsteczki

antybiotyku poprzez acetylotransferazę chloramfenikolową (kodowaną przez gen cat).

Kanamycyna – antybiotyk z grupy aminoglikozydów. Działa na podjednostkę 30S rRNA,

hamując translację.

Mechanizm oporności na kanamycynę polega na enzymatycznej modyfikacji cząsteczki

antybiotyku, którą przeprowadza aminofosfotransferaza (kodowana przez gen aph).

27

Wektory komercyjne używane do klonowania

Wektory pierwszej generacji – pBR322 – długość 4361 par zasad (pz), geny oporności na dwa

antybiotyki (ampicylinę i tetracyklinę), na obszarze których znajdują się pojedyncze miejsca

restrykcyjne, system replikacyjny (pochodzi z plazmidu pMB1). Średnia liczba kopii związana

jest z białkiem Rop (kodowanym przez gen rop), który stabilizuje kompleksu RNAI-RNAII

(Ryc. 3.2).

Wektory drugiej generacji – pUC19 – mniejszy niż pBR322 (2868 pz), jeden gen oporności na

antybiotyk (ampicylinę). Ma ten sam ori replikacji co pBR322, ale zawiera punktową mutację w

RNAII i nie występuje w nim gen rop, stąd liczba kopii znacznie większa (nawet 700).

Natomiast posiada dodatkowo krótki segment DNA, na obszarze którego znajduje się też

polilinker (54 pz, miejsca restrykcyjne dla 21 enzymów restrykcyjnych). Ponadto wektor ten

zawiera elementy regulatorowe (promotor Plac, miejsce wiązania represora Lac, miejsce wiązania

białka CAP) oraz sekwencję kodującą pierwsze 146 aminokwasów -galaktozydazy (tzw.

fragment ) z genu lacZ’ E. coli (Ryc. 3.2). Polipeptyd kodowany przez ten fragment lacZ’

znalazł zastosowanie w prostym teście określającym czy obcy DNA został wstawiony w

polilinker (selekcja na tzw. białe-niebieskie, patrz ćwiczenie 4).

Ryc. 3.2 Schematy wektorów plazmidowych pBR322 i pUC19.

Plazmidy zawierające systemy replikacyjne pMB1 i ColE1 są niezgodne (ang.

incompatible), tzn. nie mogą stabilnie występować w jednej komórce bakteryjnej, lecz są w pełni

zgodne z replikonami zawierającymi system replikacyjny p15A (pACYC177, pACYC184).

Ilość otrzymywanego DNA po izolacji: plazmid wysokokopiowy 2-5 g DNA na 1 ml hodowli,

plazmid niskokopiowy 0,2-1 g DNA na ml hodowli.

Literatura: Tabor S, Richardson CC. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression

of specific genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82:1074-8.

Studier FW, Moffatt BA.Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression_ of

cloned genes. J Mol Biol. 1986. 189:113-30.

Lee N, Francklyn C, Hamilton EP. Arabinose-induced binding of AraC protein to araI2 activates the araBAD

operon promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987. 84:8814-8.

28

Część eksperymentalna

Materiały:

DNA: mieszaniny ligacyjne nr 1 - 4 z ćwiczenia 2

Szczep bakteryjny: E. coli Top10F´{lacIq Tn10 (Tcr)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)

Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG

Odczynniki:

bufor TFB1 (pH 7,4; JAŁOWY!!): 30 mM octan potasu; 100 mM RbCl; 10 mM

CaCl2; 50 mM MnCl2; 15% (v/v) glicerol

bufor TFB2 (pH 6,5; JAŁOWY!!): 10 mM MOPS; 75 mM CaCl2; 10 mM RbCl;

15% (v/v) glicerol

Uzupełnienia podłoży:

tetracyklina – roztwór w etanolu10 mg/ml

ampicylina – roztwór wodny 100 mg/ml

X-gal roztwór w dimetyloformamidzie (40 mg/ml)

roztwór wodny IPTG (1 M)

Podłoża:

LB płynne

LB stałe uzupełnione ampicyliną (100 g/ml), tetracykliną (10 µg/ml) X-gal (40

g/ml) i IPTG (1mM)

Wykonanie:

Przygotowanie komórek kompetentnych:

1. Do dwóch kolb zawierających po 100 ml płynnego podłoża LB dodać 0,5 ml nocnej

hodowli E. coli TOP10.

2. Inkubować 1,5 h w temperaturze 37C w wytrząsarce.

3. W dwóch eppendorfach odwirować 2 razy po 1,5 ml hodowli (1,5 min 6000 rpm w

temperaturze 4ºC).

4. Usunąć dokładnie pipetą supernatant i umieścić probówki w łaźni lodowej.

5. Zawiesić każdy osad w 1 ml buforu TFB1 (nie wyjmując probówek z lodu!!!).

6. Inkubować 15 – 20 min w łaźni lodowej.

7. Próbki odwirować (2 min 6000 rpm w temperaturze 4ºC).

8. Usunąć pipetą supernatant i zawiesić każdą próbkę w 200 l buforu TFB2 (nie wyjmując

probówek z lodu!!!).

9. Inkubować w łaźni lodowej przez 15 – 20 min.

Transformacja mieszaninami ligacyjnymi otrzymanymi w trakcie ćwiczenia 2:

Rozdzielić przygotowane komórki kompetentne do 4 probówek eppendorf po 100 l.

1. Dodać po 10 l odpowiedniej mieszaniny ligacyjnej do każdej porcji komórek

kompetentnych.

2. Utrzymywać komórki kompetentne w łaźni lodowej przez 30 min.

3. Przenieść probówki do temperatury 42ºC na 1,5 min.

4. Przenieść probówki z powrotem do łaźni lodowej na 2 min.

5. Dodać do każdej z probówek 900 l płynnego podłoża LB bez antybiotyku.

6. Mieszaniny komórek kompetentnych inkubować w temperaturze 37ºC przez 1 h.

7. Inkubowane mieszaniny wirować 6000 rpm, 1 min, pobrać pipetą automatyczną 100 l

podłoża, resztę podłoża zlać. Zawiesić komórki przez pipetowanie w pobranych 100 l

podłoża, a następnie wysiać na szalki z LB z Amp, Tet, X-gal, IPTG metodą wysiewu

powierzchniowego.

8. Inkubować szalki w temperaturze 37ºC 16-18 h.

29

ĆWICZENIE 4

Zastosowanie elementów operonu laktozowego Escherichia coli w klonowaniu

genów

Cześć teoretyczna

1. Kontrola ekspresji genów na przykładzie operonu lac Escherichia coli

Preferencyjnym źródłem węgla dla bakterii jest glukoza i w jej obecności zahamowana

jest ekspresja wielu genów kodujących białka biorące udział w katabolizmie innych cukrów, np.

laktozy, arabinozy lub maltozy.

Operon to zespół sąsiadujących genów prokariotycznych, zwykle powiązanych ze sobą

funkcjonalnie (np. genów jednego szlaku metabolicznego). Ekspresja tych genów jest

regulowana (indukowana lub hamowana) przez wspólne elementy kontroli (sekwencje

operatorowe, promotory, regulatory, efektory, itp.)

Najlepiej poznanym przykładem operonu indukowanego jest operon kodujący enzymy

niezbędne do hydrolizy laktozy u Escherichia coli. W skład operonu laktozowego1 E. coli

wchodzą trzy geny strukturalne: lacZ (β-galaktozydaza), lacY (permeaza β-galaktozydazy) i

lacA (transacetylaza β-galaktozydowa), których ekspresja jest możliwa ze wspólnego

promotora umiejscowionego przed genem lacZ (Ryc. 4.1). Ekspresja operonu laktozowego

regulowana jest na poziomie transkrypcji poprzez białko represorowe (produkt genu lacI),

które rozpoznaje sekwencję operatorową. Gen kodujący białko represorowe ulega

konstytutywnej ekspresji. Ekspresja genów strukturalnych wchodzących w skład operonu

laktozowego jest indukowana poprzez pojawienie się substratu: laktozy. Naturalnym

induktorem operonu lac u E.coli jest laktoza, a dokładniej allolaktoza, która powstaje w wyniku

aktywności -galaktozydazy lub spontanicznej izomeryzacji laktozy. Zatem -galaktozydaza

indukuje i utrzymuje ekspresję operonu lac (w tym własnego genu lacZ), jest to tzw. sprzężenie

zwrotne dodatnie.

Ryc. 4.1 Operon laktozowy E. coli.

Laktoza i allolaktoza ulegają enzymatycznemu rozłożeniu (katalizowanemu przez -

galaktozydazę), na dwa cukry składowe: glukozę i galaktozę (Ryc. 4.2).

1 http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/majorsbiology/lacoperon.html

30

Ryc. 4.2 Hydroliza laktozy przez -galaktozydazę.

Mutacje konstytutywne, elementy działające in cis i in trans

François Jacob opracował system tzw. częściowych diploidów w celu zidentyfikowania

elementów genetycznych mających wpływ/kontrolujących ekspresję genów strukturalnych w

operonie laktozowym. W tym celu, do komórek E. coli wprowadził na plazmidzie F’ drugą

kopię operonu laktozowego (lacI ze swoim promotorem oraz geny lacZYA z promotorem i

sekwencjami operatorowymi). Jacob odkrył, że istnieją dwie klasy mutacji konstytutywnych

(tzn. takich, których występowanie pozwala na konstytutywną ekspresję genów strukturalnych

operonu laktozowego). Pierwsza klasa to mutacje dotyczące sekwencji operatorowej (mutacja

oc). Te mutanty są cis-dominujące, ponieważ kontrolują tylko operon usytuowany na tej samej

cząsteczce DNA (nie mają wpływu na operon występujący w plazmidzie). W tym przypadku

zawsze ma miejsce ekspresja aktywnej formy -galaktozydazy, ponieważ wprowadzenie dzikiej

kopii operatora nie zmienia fenotypu bakterii:

Druga klasa mutacji konstytutywnych to mutacje w genie kodującym białko represorowe

(i-). W tym przypadku, monomery represora nie mogą utworzyć aktywnego tetrameru, wiec nie

są w stanie połączyć się z dzikim operatorem. Takie mutacje są trans-recesywne, ponieważ

monomer represora nie połączy się ani z operatorem występującym w plazmidzie ani w

chromosomie, efekt tej mutacji może być „zniesiony” poprzez wprowadzenie do komórki dzikiej

kopii genu lacI (Tabela. 9.).

31

Tabela 9. Wpływ mutacji w operonie lac na fenotyp E. coli2

Trzy poziomy ekspresji genów operonu laktozowego:

Gdy w środowisku obecna jest glukoza, a brak jest laktozy, białko represorowe łączy się

z operatorem i blokuje w ten sposób polimerazę RNA, zasłaniając część sekwencji

promotorowej. Nie dochodzi wtedy do transkrypcji genów strukturalnych.

W przypadku braku glukozy i obecności laktozy, jej niewielka ilość dyfunduje do

wnętrza komórki i łączy się białkiem represorowym, zmieniając jego konformację. Białko

represorowe nie może wtedy przyłączyć się do sekwencji operatorowej i możliwa jest ekspresja

genów strukturalnych. Permeaza odpowiedzialna jest za transport laktozy do wnętrza komórki,

zaś -galaktozydaza (EC 3.2.1.32) za hydrolizę wiązań O-glikozydowych w -D-galaktozydach.

Produkt genu lacA odpowiedzialny jest za acetylację tiogalaktozydów, lecz nie odgrywa żadnej

roli w katabolizmie laktozy.

Co się dzieje gdy komórka ma do wyboru dwa źródła węgla? Dla bakterii korzystniejsze

jest wykorzystanie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w

metabolizmie (glikoliza), a laktoza musi zostać najpierw zhydrolizowana. Ekspresja operonu

laktozowego jest hamowana w obecności glukozy: jest to tak zwana represja kataboliczna.

W wielu operonach uczestniczących w metabolizmie cukrów sekwencje promotorowe

odbiegają od sekwencji kanonicznej i są słabo rozpoznawane przez bakteryjną polimerazę RNA.

Mechanizm represji katabolicznej pozwala na aktywację transkrypcji z takich promotorów.

Polimeraza RNA łączy się wydajniej z promotorem obecnym w operonie laktozowym w

obecności specyficznego białka zwanego CAP (ang. catabolite gene activator protein) lub CRP

(ang. cyclic AMP receptor protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA

położonym w pobliżu sekwencji promotorowej, tzw. CBS (ang. CAP binding site). Białko CAP

wiąże się z CBS, jeśli do niego przyłączą się cząsteczki cyklicznego AMP (efekt

allosteryczny). Transport glukozy (w postaci glukozofosforanu) do komórki bakteryjnej wiąże

się ze spadkiem stężenia aktywnej (fosforylowanej) formy cyklazy adenylanowej

odpowiedzialnej za syntezę cAMP z ATP.

Jeżeli w pożywce znajduje się glukoza, poziom cAMP obniża się, a konformacja białka

CAP uniemożliwia wiązanie sekwencji CBS, polimeraza RNA słabo wiąże się z promotorem i

synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona. W efekcie, jeśli w podłożu obecna

jest glukoza i laktoza, metabolizowana będzie w pierwszym rzędzie glukoza, aż do wyczerpania

2 Uwaga: mutacje mogą także dotyczyć promotorów i/lub genu permeazy.

-galaktozydaza

Genotyp brak laktozy laktoza Komentarz

i+ o

+ z

+ y

+ (dziki) brak aktywna ekspresja indukowana

i+ o

c z

+ y

+ (mutant o

c) aktywna aktywna ekspresja konstytutywna

i+ o

c z

+ y

+ (mutant o

c)

i+ o

+ z

+ y

+ (w plazmidzie)

aktywna aktywna mutacja cis-dominująca

i+ o

c z

- y

+ (podwójny mutant) brak brak

-galaktozydaza eksprymowana,

ale nieaktywna

i+ o

c z

- y

+ (podwójny mutant)

i+ o

+ z

+ y

+ (w plazmidzie)

brak aktywna mutacja cis-dominująca

i- o

+ z

+ y

+ aktywna aktywna ekspresja konstytutywna

i- o

+ z

+ y

+

i+ o

+ z

+ y

+ (w plazmidzie)

brak aktywna mutacja trans-recesywna

32

się tego źródła węgla. Następnie zostaje uruchomiony operon laktozowy, dzięki kompleksowi

cAMP-CAP (oraz laktozie, która zmienia konformację represora LacI).

Kompleksy cAMP-CRP regulują (aktywują lub hamują) w ten sposób ekspresję genów

kodujących wiele szlaków metabolicznych oraz innych operonów, np. odpowiedzialnych za

syntezę rzęsek, produkcję antybiotyków, wirulencję itp. (regulony).

2. Operon laktozowy w biologii molekularnej

Gen lacZ wykorzystywany jest jako gen reporterowy, ponieważ aktywność -

galaktozydazy można łatwo wykryć, używając substratów chemicznych, które po hydrolizie

zmieniane są w barwne produkty reakcji. Struktura enzymu pozwoliła na wykorzystanie go w

wielu technikach biologii molekularnej, np. w klonowaniu genów, badaniu interakcji

białko/białko, badaniu ekspresji genów, badaniach zmienności fazowej bakterii, itp.

Substraty:

Istnieją chromogenne analogi strukturalne laktozy hydrolizowane przez -galaktozydazę

(Ryc. 4.3). Najczęściej stosowane są ONPG (o-nitrofenylo--D-galaktopiranozyd) w podłożach

płynnych oraz X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo--D-galaktopiranozyd) w podłożach stałych.

Żaden z tych związków nie indukuje jednak operonu laktozowego, do indukcji stosuje się IPTG

(izopropylo--D-tiogalaktopiranozyd). Jest to mała cząsteczka, która dyfunduje do wnętrza

komórki, ale nie jest metabolizowana przez bakterie.

-komplemetacja

Aktywna -galaktozydaza z E. coli działa jako oligomer, zbudowany z 4 identycznych

łańcuchów polipeptydowych, każdy o długości 1023 aminokwasów. Każdy polipeptyd może być

podzielony na 2 nieaktywne fragmenty: (N-koniec) i (C-koniec polipeptydu). Wykazano, że

ekspresja końców karboksylowych () pozwala na uzyskanie nieaktywnych dimerów. Aktywny

enzym, w formie tetrameru, może być otrzymany, jeżeli w komórce jednocześnie z fragmentem

będzie syntetyzowany peptyd , kodowany przez gen lacZ’ (Ryc. 4.4).

X-Gal

IPTG

ONPG

Ryc. 4.3 Wzory strukturalne substratów

-galaktozydazy i induktora operonu

lac

33

Selekcja na „białe-niebieskie” (ang. blue-white screening)

Aby móc przeprowadzić selekcję kolonii transformantów E. coli na „białe-niebieskie” należy

mieć do dyspozycji okreslony szczep bakterii, który:

nie może wyrażać genu lacZ, zazwyczaj zawiera mutację Δ(lac)X74 (delecja całego operonu laktozowego

wraz z otaczającym go DNA)3;

musi syntetyzować fragment : zazwyczaj zawiera mutację lacZΔM15 (gen lacZ z

delecją nukleotydów kodujących aminokwasy 11 do 41).

Ponadto wektor musi posiadać gen lacZ’ (Ryc. 4.5 i 4.6), kodujący fragment , zazwyczaj są to

92 kodony z końca 5’genu lacZ (Ryc. 4.6). W wektorach pUC18/19 sześć kodonów zastąpiono

w zgodnej ramce odczytu unikatowymi miejscami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne

(MCS: ang. multicloning site).

Wklonowanie obcego fragmentu DNA w MCS przerywa gen lacZ’ i nie dochodzi do

-komplementacji w komórkach E. coli (lacZM15). Na szalkach Petriego z X-Gal niebieskie

kolonie E. coli zawierają pusty wektor (dochodzi do -komplementacji), a kolonie białe-wektor

z klonowanym obcym fragmentem DNA.

3 Uwaga: komórki lacY nie kodują permeazy laktozowej

Ryc.4.4 -komplemetacji:

a. dzika -galaktozydaza z E. coli

b. dimer oraz tetramer uformowany przez

peptydy α oraz .

Ryc. 4.5 α-komplemetacja pomiędzy

fragmentami -galaktozydazy kodowanymi

przez komórki E. coli lacZΔM15 oraz gen

lacZ’, obecny w wektorze.

34

Inne elementy operonu laktozowego używane w biologii molekularnej

Promotor Plac i jego pochodne, np. promotor PlacUV5, w którym trzy mutacje punktowe

zmniejszają jego czułość w stosunku do stężenia cAMP. Promotor taki trudniej unika derepresji

w przypadku wyczerpania się glukozy w pożywce (co może mieć znaczenie w przypadku gęstej

hodowli); o takim promotorze mówi się, że „mniej przecieka”.

Represor LacI lub jego pochodna kodowana przez gen lacIq. Mutacja dotyczy

promotora genu lacI (w pozycji -35 z GCGCAA na GTGCAA: promotor jest lepiej

rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA). Mutacja lacIq1

, dzięki delecji 15 pz w

regionie promotora, pozwala na otrzymanie optymalnego promotora powyżej genu lacI. Dzięki

mutacjom możliwa jest wydajniejsza ekspresja represora operonu laktozowego. Zastosowanie

represora pozwala natomiast na ściślejszą kontrolę ekspresji genów sklonowanych w plazmidzie,

który posiada sekwencję operatorową rozpoznawaną przez LacI

Systemy dwuhybrydowe:

Jest to jedna z najpowszechniej stosowanych metod identyfikacji oddziaływań między

białkami. Dostępne są bardzo różne systemy dwuhybrydowe: te przedstawione poniżej (Ryc. 4.7

i Ryc. 4.8.) wykorzystują elementy operonu laktozowego.

Ryc. 4.6 Mapa plazmidu pBluescript II KS+/-: sekwencja CAP, promotor Plac, operator

rozpoznawany przez represor LacI i koniec 5` genu lacZ kodujący fragment -

galaktozydazy z wklonowaną sekwencją MCS (http://www.fermentas.com).

35

3. Izolacja plazmidowego DNA metodą minilizy alkalicznej

W metodzie służącej do do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych

wykorzystuje sie różnice w zdolności do renaturacji plazmidów oraz chromosomu bakteryjnego.

Opracowana została przez Birnboima i Doly`ego w 1979.

DNA plazmidowy izoluje się z nocnej hodowli płynnej pochodzącej, z jednej kolonii

bakteryjnej (pojedynczy klon), co zapewnia jednolitość genetyczną hodowli. Pożywka płynna

pozwala na uzyskanie dużej masy bakterii. Bakterie, które utraciły plazmid podczas podziałów,

giną (presja selekcyjna). Możliwe jest wyizolowanie DNA z kolonii bakteryjnej rosnącej na

szalce, jednakże otrzymamy wtedy bardzo mało DNA. Całonocna hodowla zawierająca około 2

109 komórek/ml, a kolonia z szalki tylko ok. 10

7.

Etapy procesu:

Zawieszenie komórek w roztworze I (glukoza, Tris, EDTA), który rozlużnia struktury

błony zewnętrznej bakterii przez chelatację jonów dwuwartościowych (np. Ca2+

, Mg2+

). oraz

hamuje DNazy. Obecność glukozy ma na celu zapewnienie odpowiedniego ciśnienia

osmotycznego, aby komórka nie pobierała wody (zapobiega przedwczesnemu pęknięciu

komórek), Tris-Cl zapewnia kontrolę pH.

Liza komórek bakteryjnych ma miejsce dzięki dodaniu silnie alkalicznego roztworu II

(NaOH/SDS). SDS (dodecylosiarczan sodu) rozpuszcza fosfolipidowe i białkowe komponenty

błon komórkowych, uwalniając zawartość komórek. W tych warunkach (alkaliczne pH)

zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych, a RNA ulega częściowej hydrolizie.

Preparat staje się przejrzysty i zwiększa się jego lepkość.

Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego,

ma miejsce dzięki neutralizacji pH (dodanie octanu potasu w roztworze III): tylko mały kolisty

Ryc. 4.8 Bakteryjny system

dwuhybrydowy.

Badane białka są w fuzji z fragmentami

T25 i T18 cyklazy adenylowej

odpowiedzialnej za syntezę cAMP; jeżeli

białka X i Y oddziałują ze sobą, aktywny

kompleks cAMP-CRP aktywuje

transkrypcję -galaktozydazy.

Ryc. 4.7 Bakteryjny system

dwuhybrydowy. Badane białka są w fuzji z

fragmentami i -galaktozydazy; jeżeli

białka A i B oddziałują ze sobą, -

komplementacja ma miejsce i

-galaktozydaza jest aktywna.

36

plazmidowy DNA renaturuje. Białka, zdenaturowany chromosomalny DNA oraz błony

komórkowe wytrącają się dzięki SDS i solom: powstaje nierozpuszczalny dodecylosiarczan

potasu (KDS) w postaci wytrąconego serowatego osadu, który jest usuwany poprzez wirowanie.

Po tym etapie, otrzymany preparat może być dodatkowo odbiałczany, np. mieszaniną

fenol/chloroform, lub oczyszczany na minikolumnach. Te czynności nie są uwzględnione w

przedstawionym niżej, przykładowym protokole.

Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można zagęszczać poprzez wytrącanie w

etanolu lub izopropanolu w obecności soli, a następnie zawiesić w odpowiednim buforze (TE lub

w H2O) z RNAzą.

Jakość wyizolowanego DNA może być sprawdzona poprzez: (i) pomiar

spektrofotometryczny (w ten sposób można określić także jakość uzyskanego DNA, czyli

stopień zanieczyszczenia białkami i/lub RNA), (ii) rozdział elektroforetyczny lub też (iii)

poddanie DNA trawieniom enzymami restrykcyjnymi. Szybkość migracji DNA w żelu

niedenaturującym zależy od gęstości żelu, wielkości fragmentów DNA oraz konformacji

kolistego DNA.

Ryc. 4.9 Obraz rozdziału elektroforetycznego (na żelu agarozowym)

plazmidowego DNA pBR322 wyizolowanego metodą minilizy

alkalicznej (Birnboim i Doly, 1979)

1. chromosomalny DNA

2. dimer pBR322

3. forma oc (ang. open circular)

4. forma ccc (ang. covalently closed circular)

5. nieodwracalnie zdenaturowana forma ccc

6. niskocząsteczkowy RNA

(Uwaga: formy oc, ccc i liniowa mają taką samą wielkość: 4361 pz)

37

Literatura Birnboim, Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic

Acids Res. 7, 1513-1523

Lewis M. 2005. The lac repressor. C R Biol., 328(6):521-48

Lewis, M., Chang G., i wsp., 1996. Crystal structure of the Lactose Operon Repressor and Its Complexes with DNA

and Inducer. Science 271:1247-1254

Matthews. 2005. The structure of E. coli -galactosidase. C R Biol. 328(6):549-56.

Oehler S, Amouyal M, Kolkhof P, i wsp., 1994. Quality and position of the three lac operators of E. coli define

efficiency of repression. EMBO Journal 13: 3348–3355

Sambrook, J., Fritsch, E. F. i T, M. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor,

NY

Szeberenyi J. 2004. cAMP Regulation of the Lactose Operon. Biochemistry and Molecular Biology Education 32

(3): 198–199

Ullmann A. 2010. Jacques Monod, 1910-1976: his life, his work and his commitments. Res Microbiol. 161(2): 68-

73

Ryc. 4.10 Obraz rozdziału elektroforetycznego (na żelu

agarozowym) plazmidowego DNA pBluescript KS(+)

wyizolowanego metodą minilizy alkalicznej

1. prawidłowa izolacja pBluescript KS II (+) z E. coli

XL1-Blue

2. jak 1, ale worteksowane po roztworze III

3. jak 1, ale worteksowane po roztworze II

4. jak 1,ale do roztworu II dodano 50 μl NaOH 5 mM

5. jak 1, ale po trawieniu EcoRI (forma liniowa plazmidu)

6. marker wielkości DNA

1 2 3 4 5 6

38

Część eksperymentalna

I : Izolacja DNA metodą minilizy alkalicznej

Materiały do doświadczeń

1. Nocne hodowle szczepu E. coli Top10F’ (pUC19 ze sklonowanymi fragmentami DNA faga

HP1)

2. Roztwór I (GTE): 50 mM glukoza, 25 mM TrisCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)

3. NaOH 5 M

4. SDS 10 %

5. Do zrobienia: Roztwór II: 0,2 M NaOH, 1% SDS.

6. Roztwór III: 3 M octan potasu, 2 M kwas octowy (stężenie reszty kwasu octowego 5 M), pH

4,8

7. Etanol 96% i 70%

8. H2O z RNazą 20 g/ml

9. Eppendorfy

10. Pipety automatyczne

11. Jałowe końcówki 10-200 l i 1 ml

12. Lód

13. Wirówka

Procedura eksperymentalna:

1. Bakterie osadzić poprzez jednokrotne odwirowanie (w tym samym eppendorfie) 1,5 ml

płynnej nocnej hodowli 6000 rpm, 1 min 4C.

2. Dokładnie pozbyć się supernatantu.

3. Osad z 3 ml hodowli dokładnie zawiesić w 100 µl jałowego, zimnego roztworu GTE.

4. Dodać 200 µl roztworu II, mieszać przez kilkukrotne DELIKATNE odwracanie probówki i

wstawić do lodu.

5. Dodawać 150 µl zimnego roztworu III, zamieszać.

6. Inkubować 5 minut w lodzie.

7. Wirować 10 min przy 13000 rpm.

8. Supernatant przenieść do nowego eppendorfa, nie pobierając białego osadu.

9. Do zebranego supernatantu dodać dwie objętości 96% etanolu, inkubować 5 min w

temperaturze pokojowej.

10. Ponownie wirować (10 min, 13000 rpm).

11. (Osad przemyć 200 µl 70% etanolu, i odwirować 1 min, 13000 rpm.

12. Usunąć resztki etanolu: pipetą automatyczną oraz papierowym ręcznikiem nie dotykając

osadu. Uwaga: w tym momencie osad łatwo się odkleja.)

13. Osad suszyć 10-15 min w 42°C.

14. DNA zawiesić w 40 µl jałowej wody z RNazą (końcowe stężenie 20 g/ml).

II: Sprawdzanie jakości wyizolowanego DNA na żelu agarozowym

Materiały do doświadczeń

1. Agaroza

2. TBE (89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA)

3. Aparat do elektroforezy

4. Grzebienie

5. Loading Dye Solution (0,25 % błękit bromofenolowy, 0,25% ang. xylene cyanol, 30% (v/v)

glicerol)

6. Jałowa H2O

39

7. Marker wielkości DNA

Procedura eksperymentalna:

1. Przygotować 0,7% roztwór agarozy w 1 TBE w objętości dostosowanej do używanego

aparatu.

2. Zamieszać i zagotować w kuchence mikrofalowej.

3. Uzyskany żel ostudzić do 50C.

4. Przygotowany żel wylać do kuwety aparatu.

5. Umieścić grzebienie.

6. Po stężeniu żelu wyjąć grzebienie, a żel umieścić w aparacie wypełnionym buforem TBE.

7. W 1,5 ml probówce umieścić 10 l wyizolowanego DNA z 3 l 6 Loading Dye Solution.

8. Zwirować w celu osadzenia próbek na dnie eppendorfa.

9. Przygotowane próby nałożyć do studzienek.

10. Elektroforezę prowadzić przy napięciu 5-6 V/cm przez ok. 30 min.

11. Wykonać zdjęcie żelu.

Genotypy kilku laboratoryjnych szczepów E. coli

1. E. coli K12: dziki szczep 2. E. coli Top10: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR nupG recA1

araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1 λ-

3. E. coli Top10 F’: F'[lacIq Tn10(Tc

r)] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74

deoR nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StR) endA1 λ-

4. XL1-Blue F'[Tn10 (Tcr) proAB

+ lacI

q (lacZ ΔM15]endA1 gyrA96 thi-1 recA1 relA1 lac

glnV44 hsdR17(rK- mK

+)

Uwaga: Komórki lacY nie kodują permeazy laktozowej