biologiadelareproducció problemes - publicacions.uab.cat · per conèixer millor què controla...

Josep SantalóFrancesca Vidal

Biologia de la reproduccióProblemes

Universitat Autònoma de BarcelonaServei de Publicacions

Bellaterra, 2010

Primera edició: febrer de 1999Segona edició: juliol de 2008

Segona edició revisada: setembre 2009Tercer edició: novembre 2010

Edició i impressió:Servei de Publicacions

Universitat Autònoma de BarcelonaEdifici A. 08193 Bellaterra (Barcelona). Spain

[email protected]://publicacions.uab.es/

Imprès a Espanya. Printed in Spain

Dipòsit legal: B-35542-2008ISBN 978-84-490-2552-5

A Marta, Josep i Anna; per ordre d’aparició

Índex

Biologia de la reproducció. Problemes Materials 7

PRÒLEG .................................................................................................................... 9

FORMACIÓ DELS GÀMETES: 1 → 21 ........................................................................... 11

FECUNDACIÓ: 22 → 49 ............................................................................................. 43

DESENVOLUPAMENT EMBRIONARI PREIMPLANTACIONAL: 50 → 68 ............................. 89

TÈCNIQUES DE REPRODUCCIÓ ASSISTIDA: 69 → 88 .................................................... 115

Aquest recull de problemes de Biologia de la Reproducció està adreçat als alumnes, tantde llicenciatura com de 3r cicle i estudis de Postgrau, que cursen alguna assignatura ambaquesta disciplina científica.

El seu objectiu és el d’iniciar l’alumne en el raonament i la interpretació dels resul-tats científics, així com en l’elaboració i proposta formal de teories i dissenys experimentalsque permetin assolir determinats objectius que se’ls planteja.

D’altra banda, pretenen ser un instrument pel professor que els pot utilitzar per a re-alitzar una docència del tipus de “descobriment guiat”, de manera que l’alumne adqui-reixi determinats coneixements a partir de les conclusions que pugui treure de cadascundels problemes. Per últim, també aspiren a familiaritzar a l’alumne amb la interpretacióde gràfiques i taules i amb les notacions més habituals en la literatura científica.

Per aconseguir tots aquests objectius, hem optat per a desenvolupar la majoria delsproblemes a partir d’articles originals publicats en la literatura científica en els darrersanys dins de l’àmbit de la Biologia de la Reproducció, tot modificant-los adequadamentper a fer-los més entenedors i eliminant-ne les interpretacions que dels resultats en fanels propis autors, deixant aquesta feina per l’alumne. Aquest plantejament té el valorafegit de mostrar a l’alumne per on evoluciona en l’actualitat el coneixement científicen aquest camp i mostrar-li com, sovint, els resultats no s’ajusten exactament a allò qued’ells s’espera (ja que responen a situacions reals).

Esperem haver-ho aconseguit i que la seva utilització resulti profitosa.

Els autors.

Pròleg


En el Servei de Microscòpia Electrònica s’han processat, per fer-ne l’estudi ultraes-tructural, quatre mostres d’espermatozoides corresponents a quatre individus infèrtilsamb problemes de motilitat en els seus espermatozoides. En tots quatre casos, s’han fetseccions ultramicrotòmiques dels espermatozoides que s’han estudiat mitjançant mi-croscòpia de transmissió.

Les figures A, B, C i D són imatges representatives dels resultats observats en cada cas.

A B

C D

A. Comenta cadascuna de les figures.B. Quina creus que és la causa de la motilitat anormal d’aquests espermatozoides?C. Un dels pacients presentava l’anomenada "síndrome de Kartagener". Quin era?D. Quin tipus d’anomalia(es) en la motilitat observaries si fessis una preparació en fresc

d’espermatozoides d’aquests quatre individus.

Raona les respostes.

Problema 1

Formació dels gàmetes: 1 → 21


A partir de teixit testicular provinent de biòpsies i amb l’ajut de la citometria de flux s’ha avaluat l’eficiència de l’espermatogènesi. La citometria de flux permet dur a termela valoració del contingut de DNA de cada cèl·lula (haploide, diploide, o tetrapolide) ila selecció de cada tipus cel·lular. Per tant, permet la quantificació dels diferents tipuscel·lulars, quant a ploïdia, presents en un homogenat cel·lular.

1. D’acord amb el contingut de DNA,A. Quins tipus cel·lulars presents en una biòpsia de teixit testicular podrem dife-

renciar? (considera només les cèl·lules que formen part dels túbuls seminífers)cèl·lules haploides (n) = cèl·lules diploides (2n) =cèl·lules tetraploides (4n) =

2. Els resultats obtinguts de la quantificació cel·lular han estat: el 46% de les cèl·lulesobtingudes amb la selecció eren haploides; el 39%, diploides, i el 15%, tetraploides. B. Què t’indiquen aquests resultats respecte a l’eficiència de l’espermatogènesi?


Josep Santaló i Francesca Vidal12 Materials

Problema 2

Quina influència tenen els nivells hormonals sobre l’espermatogènesi? Per esbrinar-hofem una administració diària a rates mascle adultes d’una combinació de 8 mg/kg/dia demedroxyprogesterona (progestagen) i de 1 mg/kg/dia de testosterona durant 55 dies.Després del tractament, analitzem el nombre de cèl·lules germinals presents en els tú-buls seminífers. Si comparem aquestes dades respecte al nombre de les mateixes cèl·lu-les observades en mascles control obtenim els següents resultats:

SG: espermatogonis; PLS: espermatòcits en proleptotè; PS: paquitens; RS: espermàtides rodones; SZ: es-permatozoides.Nota: Les diferències són estadísticament significatives (P < 0,01)

A. Descriu quin efecte s’observa sobre els diferents tipus cel·lulars analitzats.

B. Quin efecte tenen les dosis hormonals administrades sobre l’espermatogènesi?A quin nivell actuen?

C. Com justificaries les dades observades en PLS?

D. Quin sentit poden tenir aquests estudis de cara a una aplicació pràctica?


Biologia de la reproducció. Problemes

Problema 3

Materials 13

La condensació del material genètic de l’espermatozoide implica la substitució de les his-tones per proteïnes més bàsiques: les proteïnes de transició (TP1 i TP2), les quals seranseguides després per les protamines.

Vols saber si aquestes proteïnes són sintetitzades immediatament abans de ser utilitza-des o bé si són emmagatzemades en el citoplasma per, posteriorment, ser importades alnucli.

Per esbrinar-ho, incubes in vitro les espermàtides incloses dins del tub seminífer amb [35S]-Cys durant 6 hores, les aïlles i les soniques, separant-ne per centrifugació el nuclis in-tactes (SRN –sonication resistant nuclei–) de les estructures citoplasmàtiques que no lasuperen (SSS –sonication sensitive structures–). Després n’extreus les proteïnes i en fasuna electroforesi en gel de poliacrilamida.

N’obtens els resultats següents:

A. A la vista d’aquests resultats, quin et sembla que és el patró de síntesi i importacióal nucli de les TP1 i TP2 i de les protamines?


Marcador SSS SRN

TP2

TP1

protamina


Problema 4

En general s’accepta que el patró de metilació que correspon al senyal d’imprinting enels gàmetes s’esborra en els estadis fetals (poc després de la migració de les cèl·lulesprimordials germinals —PGC, Primordial Germ Cells— a la cresta germinal) i és mo-dificada i reposada durant la gametogènesi.

Vols conèixer si aquest patró és vàlid per a tots els gens imprintats o bé si pot presentaraltres perfils. Per fer-ho utilitzes un protocol que permet determinar el patró de metila-ció de les citosines de les CpG-islands basat en la seqüenciació del gen després d’unadesaminació induïda mitjançant bisulfit, la qual transforma les citosines no metiladesen uracils, cosa que, òbviament, canvia la seqüència observada del gen.

El gen que has triat és un gen imprintat molt estudiat: l’H19; és un gen que, en teixit somà-tic, té una expressió bial·lèlica, en la que només s’expressa l’al·lel matern, mentre queel patern està silenciós. Et proposes doncs estudiar l’espermatogènesi en el ratolí, totutilitzant dues soques que presenten polimorfismes gènics en aquest gen de forma queet permeti determinar l’origen patern o matern dels al·lels analitzats.

Concretament analitzes dues regions del promotor del gen H19: una distal a l’extrem 5’del promotor amb 16CpGs i l’altra proximal que conté 9CpGs.

Per determinar els canvis en el grau de metilació analitzes la regió proximal comparantels patrons de les PGC en un embrió a mig termini i els espermatozoides d’animalsadults. Els resultats apareixen el la gràfica:

A) Què et suggereixen aquests resultats?

Per afinar encara més, i determinar en quin moment es produeixen els canvis, ara ana-litzes el grau de metilació de les dues regions pel que fa a l’al·lel matern en diferents es-tadis de la gametogènesi masculina, però com que el mètode de purificació de cadascundels tipus cel·lulars no és perfecte i algunes cèl·lules somàtiques es barregen amb elsgàmetes, tens en consideració també el percentatge de puresa de cadascuna de les mos-tres analitzades. Els resultats es sumaritzen en la taula:


Problema 5

Materials 15

%m

etila

ció

%m

etila

ció

% metilació

Tipus cel·lular Regió distal Regió proximal % de puresa

Espermatogònia primitiva 56 44 90Espermatogònia A 56 28 92Espermatòcits preleptotènics 69 36 93Espermatòcits paquitènics 80 92 79Espermàtides rodones 94 100 85Espermatozoides 100 93 97

B. Per què analitzes l’al·lel matern només?

C. Per què tens en compte el grau de puresa en interpretar els resultats? Quina conse-qüència tenen les lectures de puresa efectuades?

D. Què pots deduir dels resultats obtinguts?

Raona les respostes


Et trobes estudiant la unió dels espermatozoides amb la zona pel·lúcida (ZP) de l’oòciti com s’adquireix aquesta capacitat durant l’espermatogènesi i la maduració. D’altrabanda, també t’interessa esbrinar quan i com es determina l’especificitat de reconeixe-ment entre els gàmetes.

Per fer-ho, poses en contacte en un medi adequat espermatozoides i oòcits, i determinesel percentatge d’unió entre els espermatozoides i la ZP, en funció de l’origen dels es-permatozoides. Primer fas un experiment d’unió intraespecífica, entre espermatozoidesi oòcits de be, i després un d’unió interespecífica entre espermatozoides de be i oòcitsde rata.

Els resultats que n’obtens són els següents:

Nota: Les diferències només són significatives en el grup d’espermatozoides ejaculats.

A. Què t’indiquen aquests resultats pel que fa a l’adquisició de la capacitat dels esper-matozoides d’unir-se als oòcits de la pròpia espècie? Com et sembla que podria fun-cionar?

B. I pel que fa a l’adquicisió de l’especificitat de reconeixement?

Per conèixer millor què controla aquest procés, fas el mateix experiment però utilitzantoòcits de rata, i espermatozoides de la cua de l’epidídim de rata dies després de la cas-tració. N’obtens el resultat següent:

10864200

20

40

60

80

100

% espermatozoides units a Zp

ddiieess ddeesspprrééss ddee llaa ccaassttrraacciióó

%%

ee sspp ee

rr mmaa tt

oo zzoo ii

dd eess

uu nnii tt

ss aa

ZZ pp

testicle cap epid. cos epid. cua epid. ejaculats0

20

40

60

80

100

esp. be x oòc. be

esp. be x oòc. rata

OOrr iiggeenn

%%

ee sspp ee

rr mmaa tt

oo zzoo ii

dd eess

uu nnii tt

ss aa

ZZ pp


Problema 6

Materials 17

Esp. be × oòc. be

% e

sper

mat

ozoi

des

units

a Z

P%

esp

erm

atoz

oide

s un

its a

ZP

% espermatozoides units a ZP

Dies després de la castració

Esp. be × oòc. rata

Testicle Cap epid, Cos epid. Cua epid. Ejaculats

Aquest resultats t’indiquen que és el testicle qui controla el procés. La qüestió és sabersi és a causa d’un control hormonal del testicle sobre la secreció de l’epidídim, o bé sia causa d’una secreció del testicle directament al fluid epididimal.

C. Proposa un disseny experimental que et permeti distingir entre les dues possibili-tats. Quins resultats esperaries observar en cada supòsit?



Durant la maduració dels espermatozoides es produeixen canvis important en la sevapotencialitat de moviment. Quins són els mecanismes que controlen i disparen aquestscanvis? D’una banda, s’han proposat mecanismes de transmissió de senyals intracel·lu-lars i, de l’altra, un efecte de dilució del fluid epididimal.

Per estudiar aquest fenomen, dus a terme l’experiment següent: Obtens microgotes de25-30 nl de fluid de l’epidídim caudal d’unes quantes rates i les situes sota oli de para-fina en un porta excavat. Aquest el poses sobre la platina escalfada a 37 °C d’un mi-croscopi invertit i controles la mobilitat dels espermatozoides pel moviment de lamicrogota. Aleshores hi vas afegint microgotes (1,5 nl) de diferents compostos i en com-pares els resultats amb un control sense afegir-hi res.

Els resultats obtinguts són els següents:

Compost Motilitat

Control –

CaCl2 +

MgCl2 –

Dibutiril GMPc +

AMPc +

Dibutiril AMPc ++

Cafeïna +

Ionòfor A23187 –

DAG –

Àcid araquidònic –

Nota: El dibutiril AMPc és una variant permeable a la membrana de l’AMPc. El ionòfor A23187mimetitza l’acció de l’IP3.

A. Per què utilitzes aquest disseny experimental quan n’hi ha d’altres que serien moltmés simples de dur a terme?

B. Per què fas un assaig amb CaCl2 i un altre amb MgCl2? Què t’indiquen els resul-tats?

C. A la vista dels resultats, quines vies de transmissió de senyals intervenen en els can-vis en el patró de motilitat dels espermatozoides durant la maduració i quines no?



Problema 7

Materials 19

Les espermadhesines són proteïnes secretades pels fluids seminals que s’uneixen als es-permatozoides durant l’ejaculació. Estudies quin és el seu paper en els mecanismes defecundació, per la qual cosa realitzes un assaig de competició d’unió amb diferents pro-teïnes de la línia germinal femenina.

Analitzes la corba d’unió de dos grups de proteïnes marcades (biotinilades) (provinentsde la zona pel·lúcida –ZP– i provinents del Cumulus –CC–) amb 0,6 µg d’una esper-madhesina (AWN-2) immobilitzada en pouets d’ELISA i després ho compares amb lacorba obtinguda en presència de concentracions creixents de proteïnes no marcades(marcada + no marcada).

Obtens els resultats següents:

Nota: Les diferències són estadísticament significatives (P < 0.01)

Nota: Les diferències no són estadísticament significatives (P > 0.05)

0

20

40

60

80

100

% unió

0 1 2 3 4log [CC] pg

Unió AWN-2 - CC

BiotiniladaMarcada+no marcada

0

20

40

60

80

100

% unió

0 1 2 3 4log [ZP] pg

Unió AWN-2 - ZP

BiotiniladaMarcada+no marcada


Problema 8

A. Quines conclusions en pots treure d’aquests resultats? Quina seria la possible fun-ció de les espermadhesines en els mecanismes de fecundació?

D’altra banda, és ben conegut que les espermadhesines interaccionen amb els lactosa-minoglicans, els quals són secretats pels fluids epididimals i seminals durant la madu-ració i l’ejaculació dels espermatozoides.

B. Quin tipus d’experiment et sembla que podries dur a terme per saber si la funciód’AWN-2 té algun tipus de relació amb els lactosaminoglicans? Quins resultats es-peraries trobar en cas que la resposta fos afirmativa?

C. Què t’indicaria aquest darrer experiment pel que fa al paper dels lactosaminoglicansen els esdeveniments que tenen lloc durant la maduració i ejaculació dels esperma-tozoides?



Existeix una Forward Motility Protein (FMP) a l’espècie humana? La FMP és una pro-teïna descrita en el toro que canvia el patró de moviment dels espermatozoides durantla maduració i que fa que passin de tenir un moviment circular a un de progressió capendavant. És considera per tant que és una proteïna cabdal en la funció epididimal, peròmalgrat això no s’ha descrit encara en l’espècie humana.

T’interessa conèixer si existeix en l’home una proteïna que tingui una funció similar,però no pots treballar amb fluid i espermatozoides epididimals humans perquè no es po-den obtenir fàcilment. Per tant fas una primera aproximació que consisteix en aïllar pro-teïnes d’un ejaculat humà mitjançant columnes d’intercanvi amb concanavalina A i veuresi s’afecta el tipus de motilitat dels espermatozoides de toro derivats d’epidídims bo-vins obtinguts a l’escorxador. Es tracta d’avaluar l’índex de motilitat cap endavant (FMI —Forward Motility Index—) entès com el quocient entre la motilitat de progressió capendavant respecte de la motilitat en general (les mesures de motilitat i de progressió lesobtens mitjançant un analitzador automatitzat del semen CASSA).

Per fer-ho compares les dades de la motilitat i el FMI dels espermatozoides de dues zo-nes de l’epidídim (proximal i caudal), els dels espermatozoides de l’epidídim proximalincubats amb teofilina (un inhibidor de la fosfodiesterasa de l’AMPc) i amb els que ob-tens d’incubar els espermatozoides de l’epidídim proximal amb les proteïnes de l’eja-culat humà. Els resultats que obtens apareixen en la taula:

Origen espermatozoides [Proteïnes ejaculat] Motilitat FMI(µg/ml) (%±SD) (%±SD)*

Epidídim caudal 0 53 ± 5,4a 44 ± 5,7Epidídim proximal 0 0,5 ± 0,5b 0,3 ± 0,5

20 13,8 ± 2,8c 13,8 ± 1,4200 56,1 ± 8,7a 31,4 ± 5,6

Epidídim proximal + teofilina 0 27,3 ± 2,8d 2,8 ± 0,220 24,1 ± 3,7d 3,7 ± 0,6

200 55,5 ± 5,8a 5,7 ± 0,8

Nota: a-d Diferents superíndex indiques diferències estadísticament significatives entre files.* Les diferències entre files són estadísticament significatives per aquesta columna.

A. Per què fas un control utilitzant un inhibidor de la fosfodiesterasa de l’AMPc? Quinefecte té en aquest cas?

B. Interpreta tots els resultats de la taula i respon a l apregunta de l’inici de l’enunciat.



Problema 9

Durant la maduració els espermatozoides experimenten canvis importants en la fosfo-rilació dels residus de Tyr de les proteïnes. Aquests canvis serien els responsables de lesmodificacions en el patró de moviment que experimenta l’espermatozoide durant el tràn-sit per l’epidídim. Sembla ser que en aquest procés també hi intervé el Ca2+ exercint unpaper regulador.

Et proposes estudiar aquest procés i per fer-ho avalues el grau de fosforilació dels resi-dus de Tyr en les proteïnes de tres regions diferents de l’espermatozoide: la peça prin-cipal, la peça mitja i la regió acrosòmica mitjançant tècniques immunocitoquímiques, totcomparant aquests nivells en els espermatozoides provinents del testicle (T), de 7 re-gions diferents de l’epidídim i dels vasos deferents (VD).

Aquestes regions epididimals s’agrupen a grans trets en 3:

— 1-3 epidídim proximal (caput o cap)— 4a-b epidídim mig (corpus o cos)— 5 epidídim distal (cauda o cua)

Compares els resultats obtinguts en un medi control (BWW) i en un que conté dibutirilAMPc (dbcAMP) (el dbcAMP és un derivat de l’AMPc que no és degradat per la fos-fodiesterasa). Finalment repeteixes cada experiment en presència o absència de Ca2+ encada medi per tal de conèixer la influència d’aquest ió en el grau de fosofrilació.

Els resultats que obtens apareixen en les gràfiques següents:


Problema 10

Materials 23

BWW control

dbcAMP

BWW control

dbcAMP

+Ca2+ –Ca2+

A. Què pots dir de l’efecte de l’AMPc sobre el grau de fosforilació en les diferents zo-nes de l’espermatozoide? Quin mecanisme creus que hi deu estar implicat?

B. I de l’efecte del Ca2+, què se’n pot deduir?

C. Explica com creus que evoluciona el grau de fosforilació en cadascuna de les 3 re-gions de l’espermatozoide estudiades al llarg del trànsit per l’epidídim.

D. Quines estructures citoplasmàtiques creus que pot afectar el grau de fosforilació deles Tyr en la peça mitja i en la peça principal dels espermatozoides?



BWW control

dbcAMP

BWW control

dbcAMP

BWW control

dbcAMP

BWW control

dbcAMP


Problema 11

Materials 25

Quin és l’efecte del fluid seminal en la reacció acrosòmica (RA) dels espermatozoides?La resposta la tens en aquest senzill experiment:

Incubes una mostra d’espermatozoides en un medi de cultiu que conté un 1% (v/v) defluid seminal i compares el nombre de RA (analitzades amb una tinció fluorescent) ambles d’un control d’espermatozoides cultivats en un medi sense fluid seminal. Encaramés, passades 24 hores de cultiu, rentes els espermatozoides i una meitat els tornes aincubar amb fluid seminal (FS2), i l’altra meitat, no (FS0).

Els resultats que n’obtens són els següents:

Nota: Les diferències del grup control respecte a la resta són estadísticament significatives (P < 0,01) a par-tir de les 12 hores de cultiu. Les diferències del grup FS2 respecte a la resta són estadísticament significa-tives (P < 0,01) a partir de les 38 hores de cultiu.

A. Quines conclusions en pots treure?


0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50

rentat

temps cultiu (h)

controlFS2FS0

% e

sper

mat

ozo

ides

am

b R

A

Temps de cultiu (h)

biologiadelareproducció problemes - publicacions.uab.cat · per conèixer millor què controla...

Documents