biologie moléculaire

Biologie Moléculaire

Compétences TechniquesCompétences Techniques

CompétencesCompétences

Micropipetage Micropipetage Préparation de solutionsPréparation de solutions Travailler avec les concentrationsTravailler avec les concentrations DilutionsDilutions QuantitésQuantités Électrophorèse sur gel d’agarose Électrophorèse sur gel d’agarose

Micropipetage- Mesurer de Micropipetage- Mesurer de petits volumespetits volumes

Permet la mesure de microlitres Permet la mesure de microlitres (µL)(µL) 1 000 X moins que 1 millilitre1 000 X moins que 1 millilitre

2-20 µL 50-200 µL 100-1000 µLMax. 0.02 mL 0.2mL 1mL

Réglage du volume- P20Réglage du volume- P20

Dizaines (0, 1=10 or 2=20)

Unités (0-9)

Décimale (1-9 = 0.1-0.9)

Réglage du volume- P200Réglage du volume- P200

Centaines (0, 1=100 ou 2=200)

Dizaines (0, 1-9=10-90)

Unités (1-9)

Réglage du volume - Réglage du volume - P1000P1000

Milliers (0, 1=1000)

Centaines (0, 1-9=100-900)

Dizaines (0, 1-9=10 - 90)

Utilisation du Utilisation du micropipetteurmicropipetteur

Étape 1Insérer embout

Étape 2Peser piston jusqu’au Premier arrêt

Étape 3Insérer embout dans la solution a être prise

Étape 4Aspirer l’échantillon en relâchant lentement le piston

Étape 5Retirer pipetteur

LivraisonLivraison

Commencer à livrer 1er arrêt =livrer 2e arrêt = expulsion

Directives pour Directives pour reproductibilité optimalereproductibilité optimale

Utiliser le pipetteur dont le volume se Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désirérapproche le plus de celui désiré

VITESSE et FORCE consistante pour peser VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTONet relâcher le PISTON

PROFONDEUR D’IMMERSION consistante PROFONDEUR D’IMMERSION consistante 3-4mm sous la surface3-4mm sous la surface

EVITER les bulles d’airsEVITER les bulles d’airs Ne jamais aller au-delà des limites du Ne jamais aller au-delà des limites du

pipetteurpipetteur

Préparation des Préparation des SolutionsSolutions

DéfinitionsDéfinitions

SolutionSolution Mélange de 2 substances ou plus dans Mélange de 2 substances ou plus dans

une phase uniqueune phase unique Solution composée de deux composantesSolution composée de deux composantes

SolutéSoluté– Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la

plus petite quantitéplus petite quantité Solvant (OU Diluent)Solvant (OU Diluent)

– Partie de la solution dans laquelle le soluté est Partie de la solution dans laquelle le soluté est dissout – Habituellement le plus grand volumedissout – Habituellement le plus grand volume

Concentration = Quantité de soluté Quantité de solution (Pas

solvant)

Trois façons d’exprimer les concentrations: Concentration Molaire (Molarité) Pourcentages Masse par volume

ConcentrationsConcentrations

Molarité

No de Moles de soluté/Litre de solution

Masse de soluté/PM de soluté = Moles de

soluté

Moles de soluté/vol en L de solution =

Molarité

PourcentagesPourcentages

Les concentrations en pourcentage Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que :peuvent être exprimé en tant que : V/V – volume de soluté/100 mL de solutionV/V – volume de soluté/100 mL de solution M/M – Masse de soluté/ 100g de solutionM/M – Masse de soluté/ 100g de solution M/V – Masse de soluté/100 mL de solutionM/V – Masse de soluté/100 mL de solution

Tous reprTous représentent des fractions de ésentent des fractions de 100100

Pourcentages Pourcentages (suite)(suite)

%V/V%V/V Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5%Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5%

Doit avoir les mêmes unités en haut et en Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas!bas!

%M/V%M/V Ex. 16g soluté/50mL solution =32%Ex. 16g soluté/50mL solution =32%

Dois avoir des unités du même ordre de Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas!grandeur en haut et en bas!

% M/M% M/M Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9%Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9%

Dois avoir les mêmes unités en haut et en Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas!bas!

Les DilutionsLes Dilutions

La Réduction d’une La Réduction d’une ConcentrationConcentration

Une FractionUne Fraction

DilutionsDilutions

Dilution = produire des solutions Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus faibles à partir de solutions plus fortesplus fortes

Exemple : Faire du jus d’orange à Exemple : Faire du jus d’orange à partir de concentré. Mélanger une partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus cannette de concentré de jus d’orange congelé avec trois (3) d’orange congelé avec trois (3) cannettes d’eaucannettes d’eau

Dilutions (suite)Dilutions (suite) Les dilutions sont exprimées comme Les dilutions sont exprimées comme

le volume de la solution étant diluée le volume de la solution étant diluée par le volume total final de la dilutionpar le volume total final de la dilution

Dans l’exemple du jus d’orange, la Dans l’exemple du jus d’orange, la dilution serait exprimée comme 1/4, dilution serait exprimée comme 1/4, pour une cannette de jus à un TOTAL pour une cannette de jus à un TOTAL de quatre cannettes de jus dilué. de quatre cannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vous Quand on parle de la dilution, vous diriez pour l’exemple du jus : « un diriez pour l’exemple du jus : « un dans quatre ».dans quatre ».

Dilutions (suite)Dilutions (suite)

Un autre exemple :Un autre exemple : Si vous diluez 1 ml de sérum avec Si vous diluez 1 ml de sérum avec

9 ml de salin, la dilution serait 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux).de la dilution (10 ml totaux).


Un autre exemple :Un autre exemple : Une (1) partie d’acide concentré Une (1) partie d’acide concentré

est diluée avec 100 parties d’eau. est diluée avec 100 parties d’eau. Le volume total de solution est 101 Le volume total de solution est 101 parties (1 partie d’acide + 100 parties (1 partie d’acide + 100 parties d’eau). La dilution est parties d’eau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite “un écrite comme 1/101 ou dite “un dans cent un ”.dans cent un ”.


Remarquez que les dilutions n’ont Remarquez que les dilutions n’ont pas d’unités (cannettes, ml, ou pas d’unités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombrerapport à un autre nombre Exemple : 1/10 ou « un dans dix»Exemple : 1/10 ou « un dans dix»


Les dilutions sont toujours exprimées Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus diluée comme étant un (1). Si plus d’une partie de la substance d’une partie de la substance originale est initialement utilisée, il originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée.quand la dilution est exprimée.

Dilutions (suite)Dilutions (suite)Exemple:Exemple:

Deux (2) parties d’un colorant sont diluées avec huit (8) Deux (2) parties d’un colorant sont diluées avec huit (8) parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la substance originale doit être exprimée comme étant un substance originale doit être exprimée comme étant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliser (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliser une équation de rapport et de proportion. Rappelez-une équation de rapport et de proportion. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose :quelque chose :

____2 parties de colorant 2 parties de colorant = ___ = ___1.0___1.0___ Volume total de 10 parties xVolume total de 10 parties x

2 x = 102 x = 10 x = 5x = 5

La dilution est exprimée comme étant 1/5.La dilution est exprimée comme étant 1/5.

Dilutions (suite)Dilutions (suite)La dilution n’est pas toujours comme des nombres La dilution n’est pas toujours comme des nombres

entiers.entiers.Exemple:Exemple:Deux parties (2) de sang sont diluées avec cinq (5) Deux parties (2) de sang sont diluées avec cinq (5) parties de saline. Le volume total de solution est sept parties de saline. Le volume total de solution est sept (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore une fois, ceci est calculé en utilisant une équation de une fois, ceci est calculé en utilisant une équation de rapports et de proportions. Rappelez-vous que les rapports et de proportions. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose: chose:

____2 parties de sang_____2 parties de sang_____ = ___ = ___1.0___1.0___ Volume total de 7 parties xVolume total de 7 parties x

2 x = 72 x = 7 x = 3.5x = 3.5

La dilution est exprimée comme 1/3.5La dilution est exprimée comme 1/3.5

Qu’est que cela veut Qu’est que cela veut dire??dire??

Si une solution possède une dilution de Si une solution possède une dilution de 1/10 le nombre représente 1 partie de 1/10 le nombre représente 1 partie de l’échantillon ajouté à 9 parties de diluant. l’échantillon ajouté à 9 parties de diluant.

Si cette solution était préparée à un Si cette solution était préparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvent doivent être utilisés? soluté et de solvent doivent être utilisés?

Ceci représente 1 partie d’échantillon Ceci représente 1 partie d’échantillon ajoutée à 9 parties de diluant.ajoutée à 9 parties de diluant.

En autres mots, quel est le volume de 1 En autres mots, quel est le volume de 1 partie et de 9 parties?partie et de 9 parties?

Facteur de DilutionFacteur de Dilution EXEMPLE: Quel est le facteur de dilution EXEMPLE: Quel est le facteur de dilution

si vous ajoutez 0.1 mL d’un spécimen à si vous ajoutez 0.1 mL d’un spécimen à 9.9 mL de diluant?9.9 mL de diluant? Le volume final est égal au volume de Le volume final est égal au volume de

l’échantillon PLUS le volume du diluent: l’échantillon PLUS le volume du diluent: 0.1 mL + 9.9 mL = 10 mL0.1 mL + 9.9 mL = 10 mL

Le facteur de dilution est égal au volume Le facteur de dilution est égal au volume final diviser par le volume de l’échantillon : final diviser par le volume de l’échantillon : 10 mL/0.1 mL = Facteur de dilution de 100X 10 mL/0.1 mL = Facteur de dilution de 100X

Exemple d’un ProblèmeExemple d’un Problème

Quel est le facteur de dilution Quel est le facteur de dilution quand 0.2 mL est ajouté à 3.8 mL quand 0.2 mL est ajouté à 3.8 mL de diluant? de diluant?

Dilutions en sérieDilutions en série

Si une dilution de 1/8 d’une Si une dilution de 1/8 d’une solution mère est faite suivie par solution mère est faite suivie par une dilution de 1/6 quelle est la une dilution de 1/6 quelle est la dilution finale?dilution finale?

La dilution finale est: 1/8 x 1/6 = La dilution finale est: 1/8 x 1/6 = 1/481/48

DilutionsDilutions

Moyen de réduire une concentrationMoyen de réduire une concentration Dilution: Une fraction du facteur de dilutionDilution: Une fraction du facteur de dilution

Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et désirez une solution de 5mg/mL

Facteur de dilution = Conc. que j’ai Conc. que je veux

Facteur de dilution = 25mg/mL 5mg/mL

= 5X

Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties Totales

ExempleExemple

Comment est-ce que vous Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL d’une solution prépareriez 25 mL d’une solution de 2mM à partir d’un mère de de 2mM à partir d’un mère de 0.1M0.1M

QuantitésQuantités

Les quantité ne sont PAS égales Les quantité ne sont PAS égales aux concentrations!aux concentrations! Ex 1. Ex 1.

Deux pommes par sac = une Deux pommes par sac = une concentrationconcentration

Deux pommes = une quantitéDeux pommes = une quantité

Ex 2.Ex 2. 10g par 100 mL = une concentration10g par 100 mL = une concentration 10g = une quantité10g = une quantité

D’une concentration aux D’une concentration aux quantitésquantités

La concentration indique la La concentration indique la quantité dans un volume donnéquantité dans un volume donné Ex. 1mM = 1millimole par chaque litreEx. 1mM = 1millimole par chaque litre Donc la quantité dans 1 L est 1 Donc la quantité dans 1 L est 1

millimolemillimole Quel volume de la solution auriez Quel volume de la solution auriez

vous besoin pour avoir 0.05 vous besoin pour avoir 0.05 millimoles?millimoles?

Électrophorèse sur Gel Électrophorèse sur Gel d’Agarosed’Agarose

Séparation de molécules d’acides Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins nucléiques simples ou doubles brins d’après leur taille et leur d’après leur taille et leur conformationconformation Sépare les fragments entre 100pb et 10 Sépare les fragments entre 100pb et 10

KbpKbp Pouvoir de résolution entre fragments Pouvoir de résolution entre fragments

≥100pb≥100pb

Migration Sur Gel Migration Sur Gel d’Agarosed’Agarose

Puit

Direction de migration

Haut (-)

Bas (+)

Super enroulé

Relâché

Linéaire

Que peut-on déterminer d’une Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel électrophorèse sur gel d’agarose?d’agarose?

Est-ce qu’il y a de l’ADNEst-ce qu’il y a de l’ADN Combiens de conformationsCombiens de conformations Combien de fragmentsCombien de fragments

Taille des fragmentsTaille des fragments Taille totale des molécules d’acides Taille totale des molécules d’acides

nucléiquesnucléiques Nombre de coupuresNombre de coupures

Linéaire?Linéaire? Circulaire?Circulaire?

Profil de Migration sur Profil de Migration sur AgaroseAgarose

Distance de Migration

Log

de

la ta

ille

1.0%

1.5%

Résolution

Résolution

Taille (pb) Distance (mm)Taille (pb) Distance (mm)23,00023,000 11.011.0 9,4009,400 13.013.0

6,5006,500 15.015.0

4,4004,400 18.018.0

2,3002,300 23.023.0

2,0002,000 24.024.0

Déterminer les taillesDéterminer les tailles

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