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Biologie structurale d’hétéropolyosides :cas des arabinogalactane-protéines degomme d’Acacia (Acacia senegal)
Christian Sanchez, ENSAIA-INPL, NancyLaurence Lavenant, Cédric Gaillard, Marie-Christine Ralet,Denis Renard, BIA-INRA, NantesAlain Lapp, LLB-CEA-CNRS, SaclayChristophe Schmitt, Nestlé, Lausanne
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Origine de l’exsudationproduit au niveau des troncs et branchesaprès atteinte physiologique en saison sèche.Production déclenchée lorsque les tissus sontmis en contact avec l’extérieur par suite de lasaignée à des fins commerciales, ou de blessurescausées par le vent (silice), sécheresse, animaux,plantes parasites, attaque d’insectes foreurs—> réaction de défense pour limiter laperte en eau et l’invasion parasitaire
Lieu de BiosynthèseNodule de gomme formée sur arbre à maturité
(5-7 ans) dans la zone du cambium(pas au niveau de l’écorce interneni du xylème)
Polysaccharides identifiés de partet d’autre de la saignée identiquesà ceux de la gomme purifiée(Joseleau & Ullmann, Phytochemistry, 1990)—> comment se fait le transport ?(au niveau des cellules du cambium,pas de gradient pour le transport au pointd’exsudation)
Acacia senegal(localisation : nord-nord/est Afrique)
Exsudat de gomme d’Acacia
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Motivations de l’étudeContextecompréhension des transitions structurales et de phaseslors de la complexation électrostatique protéine-polysaccharide
Objectifen l’absence de données cristallographiques sur les biopolymèresissus de la gomme d’Acacia, nécessité reconstruction modèles à basserésolution pour appréhender les structures tri-dimensionnelles—> positionnement dans l’espace des charges portées par les biopolymères
Démarchefractionnement, purification (chromatographies)évaluation degré de pureté (HPSEC-MALLS)composition biochimique (oses, acides aminés)études structurales (diffusion neutrons, lumière)reconstruction 3d (calculs)comparaison modèles 3d - microscopie
Relation structure-fonction(biologique/propriété d’usage)
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Composition de la gomme d’Acacia (1)
Hétéropolyosides chargés de type arabinogalactane-protéines
GommeAcacia
AG(fraction I)
AGP(fraction II)
GP(fraction III)
Oses neutres (%)Arabinose, GalactoseRhamnose,
82.1 73.7 68.8 59.1
Oses chargés (%)Acide glucuroniqueAcide 4-O-methyl-glucuronique
15.4 15.6 11.8 8.8
Protéines (%)Riche en Hyp, Ser, Pro 2.4 1.1 9 24.6
AG : arabinogalactane (88%)AGP : arabinogalactane-protéine (10%)
GP : glycoprotéine (2%)
*Base du fractionnement : chromatographie d’interaction hydrophobe
Continuum d’espèces moléculaires différant entre elles par le ratio sucre/protéine et la densité de charge —> conséquence sur la structure ?
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Structure des ArabinoGalactane-Protéines (AGP) d’Acacia
Le modèle de la fleur d’acacia(«wattle-blossom model», Fincher, 1983)
—> conformation sphérique
Le modèle de la corde torsadée poilue(«twisted hairy rope model», Lamport, 1991)
—> conformation bâtonnet
Le modèle de la fleur d’acacia modifié(«modified wattle-blossom model»,
Kieliszewski, 1994)basé sur l’hypothèse Hyp-contigus
—> conformation sphérique
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Hypothèse de la contiguité des Hydroxyprolines (Hyp)et modèle associé du motif consensus de l’AGP (Kieliszewski, 2000)
Substitution Arabinosides sur Hyp ( P ) contigusSubstitution polysaccharidiques sur Hyp non contigus
Arrangement palindromique des résidus Hyp le long de la chaîne(Ser-O, centre palindromique) et distribution symétrique des
substitutions arabinosides et polysaccharidiques
—> arrangement tri-dimensionnel ?
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Structure de la fraction I (AG)Relation [η]=f(M)
—> affinité solvant —> conformation
Mw (g/mol) 2.86.105
Mw/Mn 1.28Rg (nm) 6.6*
[η] (mL/g) 16.2Exposant α 0.46
11 12 13 14 15 16 17 180.0
5.0x10-5
1.0x10-4
1.5x10-4
Ve (ml)
C (g
/ml)
104
105
106
Mw (g/m
ol)
Profil d’élution HPSEC-MALLS—> masse, polydispersité
Affinité solvant moyenne
*neutrons
Distribution gaussiennepeu asymétrique
—> faible polydispersité
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Structure de la fraction I (AG)Diffusion neutrons petits angles
Forme du polymère —> P(q) Caractère polyélectrolyte —> P(q)*S(q)
Écrantage totale des chargespour FI=50mM—> polyélectrolyte faible
—> Rg= 6.4 nm (Guinier)—> exposant = 2.03 (régime intermédiaire)—> exposant = 2.61 (début Porod)
Guinier régime Porodintermédiaire
Petit disque d’affinité moyenne pour le solvantà structure interne relativement dense
mais ajustement théorique de I(q) délicat
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Structure de la fraction I (AG)Analyse des données de diffusion et reconstruction 3d de l’objet isolé
P(r) = f(r) —> distribution des distances I(q) = f(q) —> recalculée à partir de P(r)
Calculs ab initio —> modèles 3d basse résolution (Svergun, 1999)
Dmax
Transforméede Fourier
Forme de P(r) dépendentièrement de la formede l’objet
sphère
disque
Calcul de P(q) à partir dumodèle 3d et comparaisonavec l’expérience
Moyenné le plus probable
Imposer uneasymétrie et/ou une forme pourles objets hétérogènes
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Ellipsoïde oblatea=b=9.6 nm c=1.0 nm
Rg=6.4 nm
Différentes vues du modèle le plus probable
(sur la base de 12 modèles analysés)
Structure de la fraction I (AG)
Structure ouverte à mettre en relation avec la faible densité de la molécule (1.007 g/mL)
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aStructure de la fraction I (AG)
Comparaison modèlecalculé - MET
20 nm
Microscopie électronique à transmission (marquage acétate d’uranyle)
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aStructure de la fraction I (AG)Résumé
•21 acides aminés•Absence de Trp, Cys•COOH (Asp, Glu)
exposés au solvant•Tyr en surface•Pas ou peu de structure II
Disque ou ellipsoïde oblate2a=2b=19.2nm; e=2nmRg=6.4nmMw=286000g/molAffinité solvant moyenne
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Structure de la fraction II (AGP)Relation [η]=f(M)
—> affinité solvant —> conformation
Mw (g/mol) 1.86.106
Mw/Mn 1.33Rg (nm) 30
[η] (mL/g) 70.7Exposants α
0.36 (petites Mw) 0.69 (moyennes Mw) 1.13 (hautes Mw)
Profil d’élution HPSEC-MALLS—> masse, polydispersité
Distribution asymétriquePrésence de deux populations
—> polydisperse
12 14 16 180.0
5.0x10-5
1.0x10-4
1.5x10-4
Ve (ml)
C (g
/ml)
106
AGP (97%)
Mécanisme perméationanormal ( Mw avec Ve)
—> lien avec la conformation*
1000000 1.5E6 2E6 2.5E6 3E6 3.5E6 4E6 4.5E6
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
[η] ~ Mw
1.13
[η] ~ Mw0.69
Mw (g/mol)
[η] ~ Mw0.36
[η]
(ml/
g)
Affinité solvant avec Mw—> conformation de plus
en plus étendueavec l’augmentation de Mw
*démontré dans le cas de polymère de forme cylindrique(Gerle, Macromolecules, 1999)
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Structure de la fraction II (AGP)
—> combinaisons de deuxformes théoriques approchantes(intermédiaire cylindre-disque)
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0.010
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
q (nm-1)
I(q) q
2
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0.010
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
q (nm-1)
I(q) q
2
Diffusion neutrons petits anglesForme du polymère —> P(q) P(r)=f(r) —> distribution des distances
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0 10 20 30 40 50 60 70
r (nm)
P(r
)
Dmax
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0 10 20 30 40 50 60 70
r (nm)
P(r
)
Dmax
ellipsoïde
disque
Cylindreelliptique
Molécule plutôt allongée avecdes hétérogénéités le long de celle-ci
Nécessité du calcul ab initio
—> forme de courbe avec nombreusesfluctuations s’apparentant àun objet allongé + hétérogénéités
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Cylindre elliptiquea=7.7nmb=34nm
c=1.5 nm
Différentes vues du modèle le plus probable
(sur la base de 20 modèles analysés)
Structure de la fraction II (AGP)
Structure peu dense en deux sous-unités reliées entre elles par une structure spécifique de type hélice
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aStructure de la fraction II (AGP)
Comparaison modèlecalculé - MET
Microscopie électronique à transmission (marquage acétate d’uranyle)
Sous-unité 1
Sous-unité 2
Forme moins allongée—> déshydratation ?
Ségrégation de la moléculeen deux sous-unités
—> ségrégation en relation avecl’affinité pour le solvant
(sucre-protéine)
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aStructure de la fraction II (AGP)Résumé
Cylindre elliptique à 2 sous-unités2a=15.4nm2b=68nme=3nmRg=30nmMw=1860000g/molAffinité solvant médiocre
•529 acides aminés•Trp exposés au solvant•Absence de Cys•COOH (Asp, Glu)
exposés au solvant•Tyr en surface•pas d ’hélice α•27% PP2 (hélice gauche, 3 rés./tour)
•brin β, random coilOses féruloylés par monomère et dimère acide férulique(acide trans férulique et acide 8-5’ non cyclique diférulique)
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a
b
Conclusions
AG : 99% sucres / 21 aa (proche de la séquence palindromique)—> Branches sucres très grosses et limitées —>structure centrale complexe
AGP : 90% sucres / 529 aa —>séquence palindromique répétée n fois (?)—> Branches sucres courtes et nombreuses —> structure centrale simple
Séquence palindromique : 15 aa, 62 sucres (M~11100 g/mol)Structuration en hélice (protéine)
Structuration en hélice (sucres)
Moteur de la structuration serait liée à la formationdes hélices «protéines» et/ou des hélices «sucres»
entre deux molécules différentes ou au sein de la même molécule
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Relations structure-fonction
Conséquences de la symétrie dans le motif glycopeptidique—> compaction moléculaire—> reconnaissance potentiellement accrus—> auto-assemblage/auto-organisation
Lien avec les propriétés fonctionnelles de la gomme—> viscosité anormalement faibleen lien avec la petite taille et la très faible densité de la fraction majoritaire (AG)—> adhésion forte sur surface hydrophobe
en lien avec la chaîne polypeptidique ? A priori non, car celle-ci est hydrophile (Hyp)et mise en évidence d’une exposition au solvant de résidus supposés hydrophobes
en lien avec les substituants polysaccharidiques ? Peut être, car le squelette β-1,3galactane est une hélice amphipatique
en lien avec la structure dont l’épaisseur fine favoriserait l’adhésion
Fonction biologique : agit en tant qu’enduit d’étanchéité (après saignée)