Biologie'Moléculaire'L3'Plan%général%des%cours%

1"V.2014.1"

Cours' Enseignant'

Réplica/on""(4h)" C"Vélot"

Stabilité"/"dymamique"des"génomes"(4h)" D"Gautheret"

Régula/ons"transcrip/onnelles"(5h)" ‘’"

Traduc/on"et"NMD"(3h)" ‘’"

Régula/on"par"les"ARN"(2h)" ‘’"

Synthèse"(2h)" ‘’"

2"

DLBI7374' 'Biologie'Moléculaire'L3'

Daniel'Gautheret'daniel.gautheret@u-psud.fr

V.2013.2"

La'régula<on'de'l’expression'par'les'ARN'non7codants'

3"

Rappel:'la'régula<on'de'l’expression'des'gènes'

•  Régula/on"="d’abord"régula/on"transcrip/onnelle"–  Facteurs"de"transcrip/on"(protéines)""

•  Ac/vateurs"•  Represseurs"•  Transduc/on"du"signal"

–  Chroma/ne"

•  Modifica/ons"

•  Remodelage""

4"

Les'régula<ons'post7transcrip<onnelles'

•  Sur"le"messager"en"cours"de"Tp"

–  Épissage"alterna/f"•  Sur"le"messager"mature"

–  NMD"/"Dégrada/on"du"mRNA"

–  Blocage"traduc/on"

Ces"régula/ons"sont"souvent"réalisées"par"l’ARNm"lui"même"

5"

Les'ARN'régulateurs'

•  Procaryotes"•  Eucaryotes""

6"

ARN'régulateurs'bactériens'

7"

•  Début"des"années"80:"–  Chez"Escherichia)coli,)de)pe/ts)ARN)(~100nt)"peuvent"se"lier"à"des"séquences"complémentaires"dans"les"

ARNm"et"réguler"leur"expression"

–  Aujourd’hui,"+100"cas"connus"d’ARN"an/sens"régulateurs"chez"E.)coli"

Les'sRNA'(small'RNAs):'la'principale'famille'd’ARN'régulateurs'chez'les'

bactéries'

•  80e200nt"de"long"•  Reconnaissance"sRNA"/"mRNA:"affecte"

l’expression"de"l’ARNm"ciblé"

8"

sRNA mRNA"ciblé

5’

L’ac<on'des'sRNA'nécessite'd’autres'facteurs'

•  Protéine"chaperone"Hfq"Intéragit"avec"régions"riches"en"AU"sur"le"sRNA"et"sur"la"cible"

–  Stabilise"le"sRNA"–  S/mule"appariement"entre"sRNA"et"cible"

•  Après"reconnaissance:"–  Soit"dégrada/on:"la"RNAse"E"dégrade"le"mRNA"ciblé"

–  Soit"répression"traduc/onnelle:"bloquage"du"RBS"

9"

sRNA'causant'la'dégrada<on'de'leur'cible'

sRNA

Rnase"E

mRNA"ciblé

Dégrada/on Premier"clivage

Hfq"et"le"sRNA"agissent"de"

concert"pour"recruter"la"

Rnase"E"sur"la"cible"

5’ La"RNAse"E"dégrade"

aussi"le"sRNA"

Hfq

11"

La'RNAse'E'

•  Chez"E.)coli:"une"des"deux"ribonucléases"essen/elles"avec"la"Rnase"P."

•  Endonucléase"impliquée"dans"la"dégrada/on"de"la"

plupart"des"ARNm"

•  Seule"ou"dans"un"complexe"mul/enzyma/que:"le"

dégradosome"

12"

Exemple'1:'Inhibi<on'de'la'synthèse'de'protéines'liant'le'fer'par'RyhB''

•  Répresseur:"Fur"(Ferric"uptake"regulator)."Reconnaît"le"promoteur"de"

Ryhb."

–  En"présence"de"fer:"FUR"ac/vé."Réprime"Ryhb"

–  Fer"limitant:"FUR"inac/f."Synthèse"de"Ryhb"

•  Ryhb"se"lie"avec"les"mRNA"de"5"opérons"de"protéines"liant"le"fer"

•  Conduit"à"une"rapide"dégrada/on"des"mRNA"

•  e>"Diminu/on"des"besoins"cellulaires"en"fer"e>"redirec/on"des"

ressources"en"fer"vers"protéines"essen/elles"

Storz"et"al."Curr."Op."Microbiol."2004"

13"

Caractérisa<on'de'Ryhb'(2002)'

•  Recherche"panegénome"

(bioinforma/que)"

•  26"sRNA"poten/els"

•  Complementarités"sRNA:mRNA"

–  Plusieurs"mRNA"u/lisant"le"fer"

•  Caractérisa/on"au"moyen"de"

souches"Rhybe;"fure;"avec"ou"sans"fer"

(iron"chelator+)"

•  Niveau"de"sdh"inversement"

propor/onnel"à"Rhyb"

Massé"&"Goresman"(2002)"Proc."Natl."Acad."Sci."USA"99,"4620e4625"

sdhCDAB:"opéron"succinate"dehydrogenase"

C,D,A,B"

Dégrada/on"

des"mRNA"

sRNA'bloquant'la'traduc<on'

sRNA

mRNA"ciblé

Hfq et le sRNA contribuent au blocage du RBS

5’

Hfq

Ribosome

RBS

Exemple'2:'Inhibi<on'de'QlA''par'l’ARN'OxyS%

•  Une"situa/on"de"stress"oxyda/f"fort"induit"l’expression"d’un"sRNA:"OxyS"

–  OxyS"se"fixe"sur"la"séquence"RBS"du"mRNA"de"slA"

•  slA"est"un"facteur"de"transcrip/on""

–  OxyS"cause"blocage"de"la"traduc/on"

15"

Salim"&"Feig,"PloS"One"2010"

sRNA'exerçant'une'régula<on'posi<ve'

Exemple'3:'Régula<on'posi<ve''de'RpoS'par'DsrA'

–  RpoS"est"un"facteur"Sigma"alterna/f"très"important"pour"

l’expression"de"nombreux"gènes"en"condi/ons"de"stress."

–  Etat"normal:"éteint."La"région"5’"est"repliée"sur"elleemême."

–  DsrA"se"fixe"sur"la"région"5’"et"libère"le"site"d’entrée"du"ribosome"

(RBS)"

•  Régula/on"posi/ve"par"ARN"(jamais"vu"chez"les"

eucaryotes)"

17"

Storz"et"al."Curr."Op."Microbiol."2004"

18"

Conclusion:'une'variété'de'mécanismes'

Storz"et"al."Curr."Op."Microbiol."2004"

19"

Les'sRNA'chez'Coli'sont'souvent'impliqués'dans'la'réponse'au'Stress'

Déclencheur'synthèse'sRNA'

Les'cibles'sont'souvent'des'régulateurs'de'transcrip<on' Susan"Goresman,"2005"

20"

Des'cibles'souvent'impliquées'dans'la'réponse'au'stress'et'la'communica<on'avec'l’extérieur''

Figure:"Gerhart"Wagner,"Uppsala"University"

21"

Les'régula<ons'par'les'ARN'en'cis%

•  Un"régulateur"présent"sur"l’ARNm"luiemême"

•  Chez"les"bactéries:"presque"toujours"dans"le"5’"UTR"•  Trois"grandes"familles"

–  Les"arénuateurs"–  Les"Tebox"–  Les"riboswitchs"

22"

Un'cas'classique,'l’aWénua<on'par'le'tryptophane%

En"présence"de"trp:""

• "Passage"du"ribosome"

• "Forma/on"d’une"structure"

terminatrice"

• Blocage"transcrip/on""

En"absence"de"trp:""

• "Blocage"du"ribosome"

• "Forma/on"d’une"structure"an/e

terminatrice"

• Poursuite"de"la"transcrip/on"

Pep/de"leader"avec"2"codons"trp

Les'T7box'

•  Contrôle"de"nombreux"gènes"de"biosynthèse"des"aminoacides"

•  Réagissent"à"la"présence"d’ARNt"nonechargés"

23"

ARNt"nonechargé:"stabilise"forme"

«"an/terminateur"»"et"donc"transcrip/on"

de"la"suite"du"gène"

Mandal"&"Breaker,"2004"

24"

Les'riboswitchs'

•  Con/ennent"des"«"capteurs"»"de"métabolites"

–  Aussi"appelés"«"aptamères"»"

–  Se"lient"directement"aux"ligands"

•  Deux"conforma/ons"alterna/ves"

–  Avec"ou"sans"ligand"•  Peuvent"bloquer"la"transcrip/on"ou"la"traduc/on"

SAM'riboswitch'

25"

2"modes"d’ac/on"selon"

espèces:"

"

a:"blocage"traduc/on"

b:"blocage"transcrip/on"

"

"

SAM)=)Seadenosylmethionine."

Un"des"ligands"

reconnus"par"les"

riboswitchs""26"

TPP'riboswitch'

Winkler"&"Breaker."Ann."Rev."Microb."2005"

Terminateur"transcrip/on"

Blocage"traduc/on"

Contrôle"épissage"Cas"par/culier:"riboswitch"

de"champignon."Dans"un"

intron."

Ligand"="TPP:"Thiamine"

pyrophosphate"

"

Ici"3"modes"d’ac/on"selon"

espèces"

"

27"

Les'ligands'reconnus'directement'par'les'riboswitchs'

•  Coenzyme"B12""

•  TPP"(dérivé"de"Thiamine)"

•  FMN"(flavin"mononucleo/de)"

•  SAM"(Seadenosylmethionine)"

•  Lysine"•  Guanine"•  Adenine"•  GlcN6P"(glucosaminee6ephosphate)"

•  Glycine"""

Les"ligands"sont"toujours"des"métabolites."La"cellule"bactérienne"

contrôle"ainsi"sa"propre"produc/on."28"

Les'riboswitchs'sont7ils'des'fossiles'du'RNA7world?'

•  Un"des"rares"ARN"à"se"trouver"dans"tous"les"domaines"du"vivant"

–  Bactéries,"Archae,"Eucaryotes"•  Capables"d’interagir"directement"avec"un"substrat"

–  Substrats"fréquents:"aminoacides""

–  Un"système"de"codage"ARNeaa"primi/f?"

29"

Les'riboswitchs'comme'cibles'thérapeu<que?'

•  Un"seul"Riboswitch"contrôle"plusieurs"voies"métaboliques"

•  Le"riboswitch"reconnaît"de"pe/tes"molécules"

–  Des"antagonistes"peuvent"être"modélisés"

•  Un"an/microbien"le"Se(2eaminoethyl)eLecysteine"

(AEC)"agirait"en"se"fixant"au"riboswitch"Lysine"

ARN'régulateurs'bactériens:'à'retenir'

•  Qu’estece"qu’un"sRNA"•  Principaux"modes"d’ac/on"des"sRNA:"répression"

traduc/onnelle"ou"dégrada/on"

•  Rôles"de"Hfq"et"RNAse"E"•  Qu’estece"qu’un"ciserégulateur?"•  Fonc/onnement"d’un"arénuateur"traduc/onnel"/"

transcrip/onnel"

•  Cas"par/culier"de"l’arénuateur"de"l’opéron"trp"•  Qu’estece"qu’un"riboswitch?"

30"

31"

ARN'régulateurs'eucaryotes'

32"

L’interférence'ARN'

33"

Au'début'étaient'les'ARN'an<sens'

•  Début"années"90"•  Effets"modestes"et"parfois"incohérents"

34"

Coenorhabdi;s%elegans%(www.wormatlas.org)" 0,1mm'

Ar<cle'de'Fire'&'Mello'1998'

35"

Ar<cle'de'Fire'&'Mello'1998'

The"unc:22"gene"encodes"a"myofilament"protein."Decrease"in"unc:22"ac/vity"is"known"to"produce"severe"twitching"movements"(convulsions)."Injected"doubleestranded"RNA,"but"not"

singleestranded"RNA,"induced"the"twitching"phenotype"in"the"progeny.""

Image:"Ber/l"Daneholt."hrp://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html"36"

Injec/on"of"singleestranded"or"doubleestranded"mex:3"RNA"into"the"gonad"of"C.)elegans.""The"extent"of"brown"colour"reflects"the"amount"of"mex:3"mRNA"present."mex:3"mRNA"

is"abundant"in"the"gonads"and"early"embryos."The"mRNA"was"lost"a}er"injec/on"of"

doubleestranded"RNA,"while"injec/on"of"an/sense"RNA"only"reduced"the"content"of"

mRNA"to"some"extent.""

Image:"Ber/l"Daneholt."hrp://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html"

37"

Observa<ons'importantes'

•  Le"silencing"ne"fonc/onne"qu’avec"une"séquence"de"cet"ARNm"

•  La"séquence"doit"provenir"d’ARN"mature"

–  Postetranscrip/on"/"cytoplasmique"

•  L’ARNm"ciblé"semble"être"dégradé"

•  Quelques"molécules"d’ARN"doubleebrin"suffisent"

–  Soit"amplifica/on,"soit"catalyse"

•  L’effet"peut"se"transmerre"entre"/ssus,"voire"à"la"

descendance"

–  Transmission"

38"

1999:'le'mécanisme'

•  Présence"de"pe/ts"ARN"de"20e25nt"contenant"les"deux"brins:"les"siRNA"(small"interfering)"

•  Ces"ARN"sont"produits"par"clivage"de"l’ARNds"•  Ce"sont"les"pe/ts"ARN"qui"interagissent"avec"l’ARNm"

2000:'découverte'de'la'machinerie''

RISC"

RISC"

Dicer"

dsRNA"

siRNA"

mRNA"

Dicer:"une"RNAse"III"

RISC:""RNA"induced"siliencing"complex:"

comprend"des"protéines"de"la"famille"

Argonaute/PIWI"

39"

Dicer:""

–  Coupe"un"segment"doubleebrin"de"21e25nt"

–  Asymetrique:"bouts"libres"de"2nt"

RISC:"

–  Un"des"deux"brins"est"sélec/vement"incorporé"dans"RISC"

–  Le"brin"incorporé"dans"RISC"semble"être"le"plus"instable"du"coté"5�"

–  RISC"dirige"le"clivage"du"mRNA"

complémentaire"" 40"

Généralisa<on'de'la'machinerie'RNAi'

•  Animaux"(métazoaires)"

–  Mammifères:"seulement"avec"ARN"de"21nt"

•  Plantes"•  Machinerie"absente"chez"S.)cerevisae,"mais"

présente"chez"d’autres"levures"et"champignons."

41"

Importance'de'la'découverte'

•  Protec/on"contre"les"virus""–  La"muta/on"de"RISC"compromet"la"résistance"des"plantes"aux"

virus"

•  Silencing"des"éléments"mobiles"

•  Main/ent"de"l’état"condensé"de"la"chroma/ne""

–  Interagirait"avec"l’ADN"•  Un"nouvel"ou/l"pour"réprimer"spécifiquement"les"gènes"

•  Répression"de"la"synthèse"protéique"–  Des"siRNA"naturels:"les"miRNAs"

Les'microRNA'

42"

43"

1993:'découverte'du'premier'microRNA'

•  4"stades"larvaires"de"C.)elegans:"L1"à"L4"•  Ambros"isole"un"mutant"qui"«"réitère"»"le"stade"L1"

•  Ce"mutant"présente"une"délé/on"du"gène"line4"

•  Lorsqu’on"insère"dans"un"animal"transgénique"un"fragment"d’ADN"contenant"le"gène"line4,"on"retrouve"le"phénotype"normal"

•  Curieusement"line4"ne"code"pas"pour"une"protéine"mais"un"ARN"de"22nt"

(Laboratoire de Victor Ambros)

44"

Lin74'et'lin714'

•  Le"phénotype"inverse"(passage"accéléré"au"stade"L2)"est"observé"avec"certaines"muta/ons"du"gène"line14"

(protéique)"

•  En"fait"c’est"la"répression"de"line14"qui"est"nécessaire"pour"le"passage"au"stade"L2.""

–  Mais"comment"une"muta/on"dans"un"gène"peuteelle"lui"faire"

échapper"à"la"répression?""

•  Ambros"propose"le"mécanisme"suivant:"

ORF"

Transcrit'de'lin'4'

Transcrit'de'lin714'

start"UTR"3’"UTR"5’"

stop"

45"

Répression'par'reconnaissance'de'l’UTR'3’'

•  Plusieurs"fragments"de"l’UTR"3’"de"line14"sont"complémentaires"à"line4"

•  En"mutant"line4"ou"l’UTR,"on"est"capable"d’abolir"ou"restaurer"la"

répression"du"gène"line14"

46"

Principales'étapes'de'la'régula<on'par'lin74'

•  Synthèse"à"par/r"d’un"

précurseur"

•  Excision"du"fragment"de"

22nt"

•  Appariement"imparfait"en"

plusieurs"points"de"l’UTR"

•  Blocage"de"la"traduc/on"

par"complexe"RISC"

"(Pas"de"dégrada/on"des"

ARNm)"

(He"&"Hannon,"Nature"reviews,"2004)"

47"

La'découverte's’amplifie'

•  Plusieurs"gènesecibles"de"line4"découverts"•  En"2000:"découverte"de"lete7,"un"autre"ARN"(21nt)"qui"gouverne"le"passage"L4e>adulte"

•  On"trouve"des"homologues"de"lete7"chez"les"

mollusques,"oursin,"mouche,"souris,"homme"

–  Présent"chez"tous"les"métazoaires!"

–  Suggère"un"rôle"très"important"

48"

Généralisa<on'des'miRNA'

•  Les"microRNA"existent"chez"les"plantes"et"les"animaux"

•  Absents"chez"les"eucaryotes"unicellulaires"(champignons,"pro/stes))

•  Taille"entre"21"et"25nt"•  +"de"1000"microRNA"chez"l’homme"

•  Chaque"microRNA"est"capable"de"réprimer"l’expression"de"plusieurs"dizaines"(centaines?)"de"gènes"

49"

Biogénèse"des"

miRNA"et""

jonc/on"entre"

miRNA"et"siRNA"

•  Deux"Rnase"III"

nécessaires"aux"miRNA"

–  Drosha"–  Dicer"

•  Les"deux"enzymes"

laissent"des"bouts"3’"

libres"de"2nt"

(He"&"Hannon,"Nature"reviews,"2004)" 50"

Dégrada<on'ou'blocage'de'la'traduc<on?'

•  siRNA:"principalement"dégrada/on"

–  Complémentarité"parfaite"

•  miRNA"animaux:"dégrada/on"et"blocage"traduc/on"

–  Complémentarité"par/elle"

•  miRNA"de"plantes:"complémentarité"parfaite"et"dégrada/on"

•  Des"complexes"RISC"différents"sont"recrutés"selon"le"type"de"complémentarité"

51"

Les'mul<ples'modes'd’ex<nc<on'(silencing)'

52"

La'voie'd’ex<nc<on'des'ARN'(RNA'silencing'pathway)'

Science"Magazine"

2006"RISC'complex'

Cytoplasm%

53"

La'voie'des'microRNA'

Cleavage'by'Dicer'

RISC'loading'complex'

RISC'complex'

Nucleus%

Science"Magazine"2006"

54"

RISC'loading'complex'

Le'complexe'RISC'vise'l’ARNm'

Silencing'au'niveau'chroma<ne.'Moins'bien'compris'

Science"Magazine"2006"

55"

Dicer'•  Domaines:"

–  PAZ:"interac/on"avec"3’"des"ARNss"(simple"brin)"

–  RNAse"III:"clivage"–  dsRNA"binding"domain:"liaison"à"l’ARN"doubleebrin"

–  Hélicase"•  La"drosophile"con/ent"2"dicer"

–  Un"est"u/lisé"dans"la"produc/on"des"miRNA,"un"dans"la"produc/on"des"siRNA"

(He"&"Hannon,"Nature"reviews,"2004)"

Les"domaines"de"différents"Dicer"56"

Dicer'chez'les'plantes'

•  La"plante"Arabidopsis)con/ent"4"dicers"–  DCLe1"à"4"–  Produisent"des"ARN"de"longueur"différente"

•  DCLe3:"Produit"les"siRNA."24nt"•  DCLe1:"Produit"les"miRNA."21nt"

•  Ne"con/ent"pas"Drosha"–  C’est"DCLe1"qui"joue"le"rôle"de"Drosha"""

57"

RISC'

•  RNAeInduced"Silencing"complex"

•  Composants"

–  Protéine"de"la"famille"Argonaute"

–  RNAebinding"proteins"–  Nucleases"

•  Il"y"a"probablement"des"RISC"alterna/fs"suivant"

les"condi/ons"

58"

Structure'd’Argonaute,'composante'du'complexe'RISC'

•  Liaison"à"la"coiffe"(cap)""

•  Domaine"Rnase"H"

•  e>"On"comprend"les"effets"possibles"

•  Il"existe"différents"Argonautes"avec"différents"domaines"e>"différents"complexes"RISC"

Filipowicz"et"al."Nature"Rev."Gene/cs"2008"

59"

Comment'fonc<onne'RISC'

•  Rappels"sur"l’ini/a/on"de"la"traduc/on:"

•  Reconnaissance"de"la"coiffe"et"

de"la"queue"polyeA"

•  Parcours"du"5’UTR"jusqu’au"

start"

•  Assemblage"du"ribosome"80S"

•  Elonga/on""

Filipowicz"et"al."Nature"Rev."Gene/cs"2008"60"

Un'modèle'pour'la'répression'de'la'traduc<on'

Risc""

(AGO2)"

61"

Les'microRNA's’expriment'spécifiquement'

(He"&"Hannon,"Nature"reviews,"2004)"62"

Un'miRNA'peut'réprimer'plus'de'100'transcrits'

–  Injec/on"de"miRe124"(cerveau)"dans"des"cellules"humaines"Hela"

–  Suivi"de"l’expression"par"puce"ADN"–  ~100"gènes"réprimés"

–  Le"miRNA"de"cerveau"réprime"des"gènes"qui"ne"doivent"pas"s’exprimer"dans"

le"cerveau"en"temps"normal.""

"

63"

Les'gènes'réprimés'ont'un'mo<f'commun'dans'leur'3’'UTR'

Séquence'de'778nt'«'seed'»'essen<elle'pour'la'reconnaissance'de'la'cible'

64"

miRNA'et'développement'

•  De"nombreux"nouveaux"rôles"développementaux"iden/fiés"depuis"

Line4…"

T."Dalmay."J."Int."Med."2008"

Reprogramma<on'des'cellules'soma<ques'en'cellules'IPS'par'les'miRNAs'

65"

(2011)"

66"

miRNA'et'cancer'•  Il"existe"des"miRNA"oncogènes"

•  et"des"miRNA"suppresseurs"de"tumeurs"

•  On"trouve"des"miRNA"fortement"surexprimés"ou"souseexprimés"dans"

les"cancers:"des"applica/ons"sont"recherchées"pour"le"diagnos/c.""

T."Dalmay."J."Int."Med."2008"

oncogènes"

Suppresseurs"de"

tumeurs"

Les'autres'familles'd’ARN'interférents'naturels'

•  piRNAs"(animaux)"

–  PIWIeassociated"RNA""

–  Piwi:"membre"de"la"famille"argonaute"

–  N’u/lisent"pas"Dicer,"n’ont"pas"besoin"d’ARNds"–  Protègent"le"génome"des"transposons"dans"la"lignée"

germinale"

–  Aussi"appelés"rasiRNA"(repeateassociated"RNAs)"

67"

Machinerie'miRNA'chez'les'eucaryotes'Grimson"et"al."Nature"455."2008."

Dicer"&"argonaute"+"miRNAs"

Dicer"&"argonaute,"pas"de"miRNAs"

"

68"

69"

RNAi'eucaryotes'et'sRNA'bactériens:'quelques'similitudes'

S."Goresman"

ARN'régulateurs'eucaryotes:'à'retenir'

•  Qu’estece"qu’un"siRNA?""•  Qu’estece"qu’un"miRNA?"

•  Biosynthèse"des"miRNA"(Drosha,"Dicer)"

•  Mode"d’ac/on"des"miRNA"et"siRNA:"voie"

d’interférence"ARN"(Dicer,"RISC/Argonaute)"

•  Ciblage"des"mRNA"par"les"miRNA"

•  Quelques"rôles"biologiques"des"miRNAs"

70"