biomarker pencemaran insektisida · pdf fileisolasi dan identifikasi bakteri pendegradasi...

DAFTAR PUSTAKA

______________, 2005. Catatan koalisi Resistance and Solidarity Against

Agrochem TNCs/RESIST, Philipina.

Aaron, Peacock, D. 2004. Methods of sampling microbial communities and

apparatus therefore. The University of Tennessee Research Foundation.

Alexander, M. 1977. Soil Microbiology, Second Edition. John Wiley & Sons,Ind.,

New York.

BPLHD Jawa Barat. 2006. http://www.bplhdjabar.go.id/kategori/kehati/publikasi.

BPLHD. 2004. Pengembangan Biomarker Sebagai Indikator Kerusakan

LingkunganOleh Polutan Logam Berat. Propinsi Jawa Barat.

Connell, Des. Chemistry and ecotoxicology of pollution, A willey-intersciene

publication.

Cowan. S. T. 1974. Manual for The Identification of Medical Bacteria, Cambridge

university press.

Crossley Jr. DA, Mueller BR & Perdue JC. 1992. Biodiversity of Microarthopds

in Agricultural Soil: Relations To Processes. Agric. Ecosystem

Environment.

Departemen Kesehatan. 1998. Daftar Penggunaan Pestisida di Indonesia, Jakarta.

Doran, JW. Parkin. 1994. Definning and Assessing Soil Quality for Sustainable

Enironment. SSSA Special Publication 35. SSSA. Madison.

Fadliah, Anna. 2006. Analisis Kesetimbangan Massa Profenofos dan Klorpirifos

Di Persawahan Dalam Upaya Penentuan Potensi Residu di Air Permukaan.

Tugas Akhir Jurusan Teknik Lingkungan. Institut Teknologi Bandung.

Hadisantosa, Fajar. 2004. Analisa Kualitas Air Permukaan Sungai Citarum Hulu

Dihubungkan Dengan Tata Guna Lahan Dengan Menggunakan Biomarker,

Tesis S-2, Program Magister Kesehatan dan Keselamatan Lingkungan ITB.

Bandung.

Haug, G, Hoffmann. 1989. Chemistry of Plant Protection, Springer-Verlag Berlin,

Heidelberg.

Haque, R. 1975. Environmental Dynamic of Pesticides. Plenum Press, New York.

xii

http://www.bplhdjabar.go.id/kategori/kehati/publikasi

Holt, john G. 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology, Williams &

Wilkins.

Http://www.nap.edu. Diakses pada tahun 2007.

http://www.inchem.org/documents/jmpr/. Chemical Safety Information from

Intergovernmental Organizations. Chlorpyrifos

Jacob, Agustinus. 2001. Metoda dan Teknik Pengambilan Sampel Tanah dan

Tanaman dalam Mengevaluasi Status Kesuburan Tanah. Makalah Falsafah

Sains (PPs 702). IPB.

Komisi Pestisida. Metode Pengujian Residu Pestisida dalam Hasil Pertanian.

Departemen Pertanian. 1997

Loehr, R.C., 1984. Pollution Control for Agriculture, Second Edition. Academic

Press, Inc., Florida.

Michael, P. 1984. Ecological methods for field and laboratory investigations.

McGraw-Hill publishing Company Limited,

Michael J. Pelczar, Jr. Roger D. Reid. 1958. Microbiology. McGraw-Hill book

company, Inc.

Peakal, David. (1992), Animal Biomarkers as Pollution Indicators. Chapman &

Hall.

Paoletti MG, Favretta MR, Stinner SB, Purrington FF, & Bater JE. 1991.

Invertebrates as bioindicator of soil use. CAB International. Oxon.

Pracaya. 2003. Bertanam Sayuran Organik di Kebun, Plot, dan Polibag. Penebar

Swadaya, Jakarta.

Pustekkom. 2005. Bakteri. http://www.e-dukasi.net/modul_online/MO_86/

kb1_3.htm. Diakses pada tanggal 10 Mei 2007.

Rashed, M. Nageeb. (2000) Biomarkers as Indicators for Water Pollution With

Heavy metals in Rivers, Seas and Ocans. South Valley University, Egypt.

Rosliana, Nina. 2001. Bioremediasi Tanah Akibat Paparan Pestisida Klorpirifos.

Tesis Magister Jurusan Teknik Lingkungan. Institut Teknologi Bandung.

S, K, Agarwal, 2002. Pollution Management III, Pesticide Pollution. APH

Publishing Corporation. New Delhi.

Sa’id, E.G., 1994. Dampak Negatif Pestisida, Sebuah Catatan bagi Kita Semua.

Agrotek, Vol. 2(1). IPB, Bogor.

xiii

Salle, A.J. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology fifth edition. New York :

McGraw-Hill Book Company, Inc.

Sandi. 2004. Pemetaan Penyebaran Residu Insektisida Organofosfat dalam Tanah

di Desa Wangunharja, Kecamatan Lembang, Kabupaten Bandung.Tugas

Akhir Jurusan Teknik Lingkungan. Institut Teknologi Bandung.

Setiawan, Linda. 2001. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Pendegradasi Chlorpyrifos.

Laporan Tugas Akhir Teknik Lingkungan ITB.

Sherman, Cappuccino. 1987. Microbiology : A laboratory manual. The

Benjamin/cummings publishing company, Inc.

Sudarmono, S. 1991. Pestisida. Penerbit Kanisius, Yogyakarta.

Soemirat, J. 2003. Toksikologi Lingkungan. Yogyakarta : Gajah Mada University

Press.

Sofia, Diana. 2001. Pengaruh Pestisida Dalam Lingkungan Pertanian. Usu digital Library. Sumatera Utara.

Tarumingkeng, Rudy. 1992. Insektisida: Sifat, Mekanisme Kerja, Dan Dampak

Penggunaannya. UKRIDA Press: Jakarta.

Toledo, Martinez, M.V., V. Salmeron. J. Gonzalez-Lopez. 1993. Effects of

diazinon and quinalphos on some functional groups of soil microflora.

Toxicology Environment.

U.S Environmental Protection Agency. 1999. Environmental Risk Asessment for

Profenofos.

U.S Environmental Protection Agency. 2007. http://www.epa.gov/U.S.

Environmental Protection Agency.

Wit, R. 1992. Microbial Ecosystems in Spanish Coastal Salinas; an Ecological

and Geochemical Study of Biomarkers. Dept. of Environmental Chemistry.

Barcelona. Spain.

xiv

A-1

Lampiran A

Data Penelitian

A-2

Tabel hasil karakterisasi koloni bakteri

Characterization tests gram spore shape mot cat glu O F Growth MR VP CIT SAC MAN ARA INO SOR RHA NIT IND URE ADH ODC LDC H2S hydrolisis kode

50C 370C 420C SSA McCA GEL casein starch

A1 + - sphere - + - + - - + - - - - - - - - - - + - - - + - - - - + - - A2 + - rod + - + + - - + - - - - - + - + + - - - + - + - - - - + + + A3 + - rod + - + + + - + - - - - + + - - - - - - + - + - - + - + + + A4 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - B1 + - sphere - + + - + - + - - - - + - + + - - - + + - + + - - - + - - B2 + - rod + - + + + - + - - - - + + - - - - - - + - + - - + - + + + B3 - - rod + + + - - - + - - - - + + + - - + + - - - - - + + - + - - B4 - - rod + - + - - - + - - - - + + + + - - + - - - - - + - - - + - B5 - - rod + - + + - - + - - + - - + - - - - - - + - + + - - - - + - B6 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - C1 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + C2 + - rod + - + + - - + - - - - - + - + + - - - + - + - - - - + + + C3 + - sphere - + + + - - + - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - - - C4 - - rod + - + + - - + - - + - - + - - - - - - + - + + - - - - + - C5 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - C6 - - sphere + - + - - - + - - - - - + + - - - - - - + + - - - + + - - D1 + - sphere - + + - + - + - - - - + - + + - - - + + - + + - - - + - - D2 + + rod + + + - - - + - - - - - + - + - - - - + - - - - - - + + + D3 - - rod + + + - - - + - - - - + + + - - + + - - - - - + + - + - - D4 - - rod + - + - - - + - - - - + + + + - - + - - - - - + - - - + - D5 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - E1 + - rod + - + + - - + - - - - - + - + + - - - + - + - - - - + + + E2 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + E3 - - rod + - + + - - + - - + - - + - - - - - - + - + + - - - - + - E4 - - rod + - + + - - + - - + - - + + + - - - - + - + + - - - + + - E5 - - sphere + - + - - - + - - - - - + + - - - - - - + + - - - + + - - F1 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + F2 + - sphere - + + - + - + - - - - + - + + - - - + + - + + - - - + - - F3 - - rod + + + - + - + - - - - - + + + + - + + - - - - + + + - - - F4 - - rod + - + + - - + - - + - - + - - - - - - + - + + - - - - + - F5 - - sphere + - + - - - + - - - - - + + - - - - - - + + - - - + + - - G1 + - sphere - + + + - - + - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - - - G2 + - rod + - + + - - + - - - - - + - + + - - - + - + - - - - + + + G3 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + G4 - - rod + - - - + - + - - - - - + + - + + - + - - - - - - - + - - H1 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + H2 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + H3 + - rod + - + + + - + - - - - + + - - - - - - + - + - - + - + + + H4 - - rod + + + - + - + - - - - - + + + + - + + - - - - + + + - - - H5 - - rod + + - + - - + - + + - - + - + - - - - + - - - - - - - - - H6 - - sphere + - + - - - + - - - - - + + - - - - - - + + - - - + + - - H7 + - Rod + - + - - - + - - - - + - - - - - + - + - + - - - - + - -

A-3

Characterization tests gram spore shape mot cat glu O F Growth MR VP CIT SAC MAN ARA INO SOR RHA NIT IND URE ADH ODC LDC H2S hydrolisis kode

50C 370C 420C SSA McCA GEL casein starch

H8 - - Coco

bacillus + + - - - - + - - + - + + + - - - - + - - + - - - - - - + I1 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + I2 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + I3 + - rod + - + + + - + - - - - + + - - - - - - + - + - - + - + + + I4 + + rod + + + - - - + + - - - - - - + - + + - + - - - - - - + + - I5 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - I6 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - I7 - - rod + + - + - - + - + + - - + - + - - - - + - - - - - - - - - I8 - - sphere + - + - - - + - - - - - + + - - - - - - + + - - - + + - - J1 + - rod + - + + + - + + - - - + - - - - - + - - + - - - - - + + + J2 + + rod + + + - - - + - - - - - + - + + - - - + - - - - - - + + + J3 - - rod + + + - - - + - - - - + + - - - - - - - - - - + + - + - - J4 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - J5 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - J6 - - rod + - - - - - + - + + - - + - - - - - + - - - - + - - - - J7 - - rod + + + + - - + - - - + - + - + + - - + - - - + - - - - - - J8 + - sphere - + + + - - + - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - K1 + + rod + + + - - - + - - - - - + - + - - - - + - - - - - - + + + K2 + - sphere - + + - + - + - - - - + - + + - - - + + - + + - - - + - - K3 - - rod + - - - - - + - - - - - - + - - - - - - - - + - + - + - - K4 - - rod + - + + - - + + - + - - + - + - - - - + - + + - - - + + - K5 - - rod + - + + - - + - - + - - + - - - - - - + - + + - - - - + - K6 - - rod + - - - - - + - + + - - + - - - - - + - - - - + - - - - K7 + - rod + - + - - - + - - - - + - - - - - + - + - + - - - - + - - K8 - - rod + - - - + - + - - - - + - - + - - + - - - + - - - - + + - L1 + - sphere - + + - + - + - - - - + - + + - - - + + - + + - - - + - - L2 + + rod + + + - - - + - - - - - + - + - - - - + - - - - - - + + + L3 + + rod + + + - - - + - - - - - + - + + - - - + - - - - - - + + + L4 + + rod + + + - - - + + - - - - - - + - + + - + - - - - - - + + - L5 - - rod + + + - + - + - - - - - + + + + - + + - - - - + + + - - - L6 - - rod + - - - - - + - + + - - + - - - - - + - - - - + - - - - L7 + - sphere - + + + - - + - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - L8 - - rod + - + - - - + - - - + - + + - - - - - - - - - + - + + - -

A-4

Karakteristik bakteri hasil identifikasi

Karakteristik bakteri genus Alkaligenes sp.

Berbentuk batang dengan ukuran 0,4-0,5 x 2 μm

Gram negatif

Sel biasanya tunggal

Motil

Fakultatif aerob

Temperatur optimum 37oC

Karakteristik bakteri genus Bacillus sp.

Berbentuk batang

Umumnya gram positif

Membentuk endospora

Bergerak dengan flagella lateral

Hampir semua menghidrolisis gelatin dan casein

Aerob dan fakultatif anaerob

Karakteristik bakteri genus Enterobacter sp.

Berbentuk batang

Gram negatif


Motilitas tinggi

Karakteristik bakteri genus Erwinia sp.

Berbentuk batang atau lurus

Gram negatif

Sel umumnya tunggal

Bergerak dengan flagella

Sebagian besar spesiesnya tidak dapat mereduksi nitrat

Menghasilkan pigmen kuning yang tidak larut dalam air

Fakultatif anaerob

A-5

Temperatur optimum 20-30oC

Karakteristik bakteri genus Proteus sp.

Berbentuk batang

Gram negatif



Karakteristik bakteri genus Pseudomonas sp.

Berbentuk batang lurus atau kurva

Gram negatif

Habitatnya tunggal atau berpasangan

Bergerak dengan flagella polar

Menghasilkan pigmen nonflouresent

Tidak dapat melakukan denitrifikasi

Tidak mempunyai endospora


Umumnya terdapat ditanah dan di air

Menggunakan senyawa organik sederhana sebagai sumber karbon dan

energi

Karakteristik bakteri genus Micrococcus sp.

Berbentuk batang

Gram positif

Habitatnya berpasangan

Non-motil


Aerob

Karakteristik bakteri genus Staphylococcus sp.

Berbentuk batang

Gram positif

A-6

Habitatnya berpasangan

Non-motil



Karakteristik bakteri genus Citrobacter sp.

Berbentuk batang

Gram negatif


Umumnya ditemukan di tanah dan air

Karakteristik bakteri genus Seratia sp.

Berbentuk batang

Gram negatif

motil


B-1

Lampiran B

Prosedur Penelitian

B-2

Prosedur Ekstraksi Metode ekstraksi insektisida dari tanah yang digunakan adalah Metode Shaker

(Komisi Pestisida,1997).

Alat:

Timbangan

Rotary Evaporator

Oven 130 ºC

Shaker

Saringan Pasir

Pipet hisap 100 ml &25ml

Kolom florisil

Labu ukur 10 ml

Labu erlenmeyer

Filter

Botol vial

Spatula

Buchner

Bahan :

25 gr sampel tanah (berat basah)

Kapas tak berlemak

Aquadest

Na2SO4 anhidrant

Pelarut organik Aseton

Pelarut organik Heksan

Florisil

Cara kerja : Sebanyak 25 gram tanah pertanian dicampur dengan pelarut aseton 100 mL,

kemudian di kocok dengan Shaker selama 20 menit. Selanjutnya larutan aseton

dipisahkan dari lumpurnya dengan corong buchenert yang dilapisi celite. Larutan

aseton dicampur dengan pelarut heksan 50 mL. Insektisida organofosfat dari

aseton akan terikat dalam pelarut heksan, dengan menggunakan corong pemisah

aseton dan heksan dipisahkan. Lalu, untuk menghilangkan parikulat pengotor dan

mengurangi kandungan air, sampel dialirkan ke kolom florisil. Kemudian sampel

dievaporasi dengan suhu 500C sampai volumenya ± 1 mL. Berikut adalah diagram

cara kerja ekstraksi contoh tanah:

B-3

Diamkan&Saring dgn Buchenert+kertas saring+ celite

Shaker 20 menit , 150 rpm

Cairan Padatan dibuang

Evaporasi pd 40-50ºC hingga ½ nya

25 ml Hexan

Kocok dgn corong pisah

Supernatan

25 ml Hexan

Hexan

Kocok lagi dgn corong pisah selama 2 menit

Lapisan air dibuang Kolom Florisil 5 ml Hexan- Na2SO4-Florisil teraktivasi 3 gr-kapas

Bilas kolom dengan 5 ml Hexan

Evaporasi hingga 1-2 ml

Aseton hingga Vial 10 ml

Siap untuk Diinjeksikan

100 ml AcetonErlenmeyer 250 ml Keringkan &Ayak Sampel Tanah 25 gr Sampel Tanah

Upaya mengihindari kontaminasi :

1. Menghindari penggunaan sabun pencuci peralatan laboratrium

yang akan mengandung germisida.

2. Mengihindari penggunaan cairan penyemprot serangga, dan

berbagai jenis parfum.

B-4

3. Menghindari kemungkinan kontaminasi dari pengujian sebelumnya

yang tertinggal dalam:peralatan gelas, alat suntik, dan kolom

4.

ap dalam

5.

rluan analisis yang lain.

kromatografi, dengan jalan mencuci seluruh peralatan dengan

deterjen secara berulang, dan dilanjutkan dengan pembilasan

menggunakan aquades, kemudian dengan pelarut aseton.

Menghindari pemakaian alat yang terbuat dari polimer polivinil

klorida (PVC), karena sebagian besar pestisida terser

bahan ini. Peralatan yang digunakan sebaiknya terbuat dari gelas,

teflon (PTFE), atau karet silikon (silicone rubber), karena dikenal

tidak menyerap pestisida.

Memisahkan peralatan gelas untuk keperluan analisis pestisida dari

peralatan gelas untuk kepe

B-5

Prosedur Identifikasi Dan Perhitungan Jumlah Bakteri

A. Sterilisasi Alat

Otoklaf diisi air secukupnya, kemudian alat dan bahan yang akan disterilkan

disusun dengan baik dalam otoklaf. Otoklaf ditutup dan dikunci dengan rapat,

katup “release” dibiarkan terbuka. Setelah udara keluar semua, katup ditutup.

Temperatur dipanaskan hingga mencapai 121oC dan tekanan 1 atm (15 lbs),

maksimal 1,5 atm. Setelah itu waktu dihitung hingga 20 menit untuk alat dan 15

menit untuk bahan. Setelah itu, otoklaf dimatikan kemudian tunggu sampai

tekanan 0. Setelah selesai, kunci otoklaf dibuka. Alat – alat dapat dikeringkan

dioven dan bahan dapat disimpan.

B. Pengenceran

Sampel tanah seberat 10 gram diambil, lalu dimasukan kedalam tabung reaksi

yang telah diberi 100 ml NaCl fisiologis, lalu dikocok agar homogen. Dari tabung

tersebut diambil dengan menggunakan volume pipet sebanyak 1ml kedalam

tabung reaksi lain yang berisi 9 ml NaCl fisiologis untuk melakukan pengenceran

10-1.

Disiapkan beberapa tabung reaksi lain yang berisi 9 ml NaCl fisiologis untuk

pengenceran selanjutnya. Dari tabung reaksi hasil pengenceran 10-1 tadi , diambil

1 ml dengan menggunakan pipet 1 ml kedalam tabung reaksi kedua yang berisi 9

ml NaCl fisiologis agar mendapatkan pengenceran 10-2. Pengenceran terus

dilakukan hingga mendapatkan pengenceran 10-9.

C. Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri dan Pembuatan Biakan Murni

Sampel tanah yang telah diencerkan selanjutnya dilakukan penanaman pada media

agar nutrisi. Koloni bakteri yang tumbuh pada cawan petri diamati keadaan

morfologi baik itu bentuk, pinggiran, warna, ataupun permukaan koloninya.

Koloni yang memiliki ciri yang sama pada satu cawan petri, dianggap kedalam

satu spesies. Koloni yang terlihat berbeda pada saat melakukan pengamatan

morfologi koloni tadi diambil dengan menggunakan oose yang telah disterilkan

B-6

dalam api bunsen. Masing – masing jenis bakteri yang berbeda diisolasi. Setelah

diperoleh koloni yang mampu hidup pada media, maka setiap koloni yang

diperoleh dibuat tiga ulangan. Akhirnya dari beberapa kali pengulangan, minimal

lima kali ulangan untuk setiap strain, ditemukan isolat murni dari bakteri tanah

tersebut. Isolat murni tersebut kemudian di tanam dalam agar miring. Kemudian

dilanjutkan dengan identifikasi isolat. Penyimpanan koloni bakteri dilakukan pada

suhu 40C dan siap untuk digunakan pada pengujian selanjutnya.

D. Isolasi

Tujuan dari isolasi adalah memisahkan mikroorganisme dari biakan campuran

hingga diperoleh biakan murni. Prinsip kerjanya adalah mikroorganisme terdapat

dimana-mana sehingga mikroorganisme mampu tumbuh dengan baik bila tersedia

medium atau makanan sebagai substratnya. Dalam satu substrat dapat tumbuh

lebih dari satu jenis mikroorganisme, dengan demikian dikembangkan satu teknik

isolasi /pemisahan sehingga dalam satu biakan terdapat hanya satu jenis

mikroorganisme atau yang disebut biakan murni.

Teknik isolasi yang digunakan adalah teknik menuang (poured plate), dimana

mikroorganisme yang akan dipisahkan berada dalam suatu suspensi, untuk

memisahkannya dituang kedalam medium tertentu.

bahan dan alat :

1. tabung medium NA

2. Cawan steril

3. biakan bakteri

4. jarum inokulasi dan pembakar spirtus

5. penangas air

Prosedur :

1. medium agardicairkan kedalam penangas airi hingga suhu 40oC.

2. medium cair dituangkan kedalamcawan petri steril biarkan membeku.

3. diambil sedikit bakteri dari biakan dengan jarum inokulasi

4. kemudian digoreskan pada medium padat dalam cawan petri tadi.

5. inkubasi pada suhu kamar sampai terjadi pertumbuhan dan diamati

B-7

E. Pewarnaan Gram

Sampel diambil dari koloni yang telah dimurnikan pada tabung, dan dibuat apusan

pada kaca objek sehingga membentuk film yang tipis. Setelah itu dikeringkan dan

difiksasi. Preparat ditetesi kristal ungu dan didiamkan selama 30 detik, dibilas

dengan akuades. Setelah kering diberi lugol, dibiarkan selama 30 detik lalu dibilas

kembali dengan akuades. Kemudian preparat didekolorasi dengan alkohol 95%

selama 10-20 detik dan dibilas dengan akuades. Preparat dikeringkan dan diberi

zat warna pembanding, air fuchsin selama 30 detik. Kaca objek tersebut

dikeringkan setelah dibilas dengan akuades. Lalu diamati di bawah mikroskop.

Bakteri gram positif (+) akan terlihat berwarna ungu. Sedangkan bakteri gram

negatif (-) terlihat berwarna merah. Pemeriksaan dibawah mikroskop

menggunakan perbesaran hingga 1000x. Sebelumnya preparat ditetesi sedikit

minyak imersi.

F. Pewarnaan Spora

Spora dapat diwarnai sehingga dapat diamati lebih seksama dan dibedakan dari sel

vegetatif.

Bahan dan alat :

- Kaca objek yang bersih dan kering

- Jarum inokulasi

- Mikroskop

- Pembakar spiritus

- Kertasi isap

- Biakan bakteri

- Larutan malacheet green dan safranin

- Penangas air dan ram kawat

Cara kerja :

1. Buat apusan dari tiap bakteri lalu fiksasi

2. Teteskan malacheet green hingga seluruh apusan terendam lalu letakkan

diatas penangas dengan menggunakan ram kawat. Lakuakn pemanasan

selama 5 menit. Jaga apusan jangan sampai kering dengan cara meneteskan

pewarna.

B-8

3. Cuci dengan air mengalir. Keringkan dengan kertas isap.

4. Teteskan safranin pada seluruh apusan sehingga seluruh apusan tertutup.

Biarkan selama 1-2 menit.

5. Cuci dengan air mengalir lalu keringkan dengan kertas isap.

6. Amati dengan mikroskop dengan menggunakan minyak imersi. Sel vegetatif

akan berwarna merah muda dan spora berwarna hijau.

G. Identifikasi bakteri

Berdasarkan S. T. Cowan maka test yang dilakukan untuk identifikasi bakteri

adalah sebagai berikut:

1. Pewarnaan gram

2. Pewarnaan spora

3. Motilitas

Inokulasi tabung dengan cara menusuk biakan pada media motilitas, inkubasi

pada suhu 37oC.

Hasil : Positif : media menjadi keruh

Negatif : media keruh hanya pada bekas goresan

Media motilitas :

- 80 g gelatin

- 10 g pepton

- 3 g beef extact

- 5 g nacl

- 4 g agar

- 1 l aquadest

Rendam gelatin dalam aquadest selama 30 menit, tambahkan bahan-bahan lain,

panaskan hingga larut. Distribusi dalam tabung @ 5 ml. Sterilisasi pada 115oC

selama 20 menit.

4. Katalase

Inokulasi medium agar nutrisi dengan metoda gores. Inkubasi pada suhu kamar

selama 2 hari. Teteskan H2O2 pada koloni yang tumbuh.

Hasil : Positif : ada gelembung udara

Negatif : tidak ada gelembung udara

B-9

5. Fermentasi Glukosa

Masukan suspensi bakteri kedalam tabung yang berisi media glukosa. Inkubasi

pada suhu 37oC selama 24 jam.

Hasil : Positif : kuning

Negatif : ungu

6. Oksidasi

Masukan suspensi bakteri kedalam tabung yang berisi media OF. Inkubasi pada

suhu 37oC selama 14 hari.

Hasil : Positif : kuning

Negatif : ungu

Media OF

- 2 g pepton

- 5 g NaCl

- 0,3 g K2HPO4

- 15 ml larutan BTB 0,2 %

- 1 L aquades

larutkan padatan dengan pemanasan dalam air tambahkan indikator. sterilisasi

115oC selama 20 menit.

7. Fermentasi

Masukan suspensi bakteri kedalam tabung yang berisi media OF. Inkubasi pada

suhu 37oC selama 14 hari.

hasil : positif : kuning

negatif : ungu

8. Pertumbuhan pada suhu 5oC

Bakteri ditanam pada agar nutrisi kemudian ditanam pada suhu 5oC





B-10

11. Pertumbuhan pada media agar SS

Bakteri ditanam pada agar SS kemudian ditanam pada suhu 37oC

12. Pertumbuhan pada media agar Mc Conkey

Bakteri ditanam pada agar Mc Conkey kemudian ditanam pada suhu 37oC

13. Pemakaian sitrat

Inokulai dengan membuat goresan pada permukaan agar simon’s citrate miring.

Inkubasi dan periksa hingga 7 hari untuk pertumbuhan dan perubahan warna

Hasil : positif : biru dan adanya pertumbuhan pada goresan

negatif : tetap hijau

14. Fermentasi sukrosa

Inokulasi media sukrosa dengan suspensi bakteri, inkubasi selama 24 jam

Hasil : positif : kuning

negatif : ungu

Media sukrosa :

- 10 g pepton

- 5 g sukrosa

- 5 ml larutan BCP 0,2%

- 1 L auquadest

Masukan pepton kedalam air dan panaskan hingga mendidih. Setelah agak dingin

masukan sukrosa dan BCP, distribusi dalam tabung @ 2ml. sterilisasi.

15. Fermentasi manitol

Inokulasi media manitol dengan suspensi bakteri, inkubasi selama 24 jam


negatif : ungu

Media manitol :

- 10 g pepton

- 5 g manitol


- 1 L auquadest

B-11


masukan manitol dan BCP, distribusi dalam tabung @ 2ml. Sterilisasi.

16. Fermentasi arabinose

Inokulasi media arabinose dengan suspensi bakteri, inkubasi selama 24 jam


negatif : ungu

media arabinose :

- 10 g pepton

- 5 g arabinose


- 1 L auquadest


masukan arabinose dan BCP, distribusi dalam tabung @ 2ml. Sterilisasi.

17. Fermentasi inositol

Inokulasi media inositol dengan suspensi bakteri, inkubasi selama 24 jam


negatif : ungu

media inositol :

- 10 g pepton

- 5 g inositol


- 1 L auquadest


masukan inositol dan BCP, distribusi dalam tabung @ 2ml. sterilisasi.

18. Fermentasi sorbitol

Inokulasi media sorbitol dengan suspensi bakteri, inkubasi selama 24 jam


negatif : ungu

media sorbitol :

B-12

- 10 g pepton

- 5 g sorbitol


- 1 L auquadest


masukan sorbitol dan BCP, distribusi dalam tabung @ 2ml. sterilisasi.

19. Fermentasi Rhamnosa

Inokulasi media Rhamnosa dengan suspensi bakteri, inkubasi selama 24 jam


Negatif : ungu

media Rhamnosa :

- 10 g pepton

- 5 g Rhamnosa


- 1 L auquadest


masukan Rhamnosa dan BCP, distribusi dalam tabung @ 2ml. sterilisasi.

20. Reduksi Nitrat

1. Inokulasi nitrat broth, inokulasi selama lebih dari 5 hari. Tambahkan 1 ml NIT

1 dan 1 ml NIT 2

hasil : positif : merah

negatif : tidak berwarna

2. Pada tabung yang tidak memberikan hasil warna merah dalam 5 menit

ditambahkan serbuk Zn lalu biarkan sesaat.

hasil : positif : kuning/tidak berwarna

negatif : merah

nitrate broth:

- 1g KNO3

- 1 L nutrien broth

B-13

Larutan KNO3 dalam nutrien broth. Sterlilisasi dengan autoclave.

reagen NIT 1:

- 0,8 g sulfanilic acid

- 100 ml acetic acid 5 N

reagen NIT 2

- 0,6 g N-N-dimethyl-1-naphthylamine

- 100 mL acetic acid

21. Produksi Indol

Inokulasi air pepton dan inkubasi selama 48 jam, tambahkan 1ml xylol lalu kocok.

Tambahkan 0,5 ml pereaksi ehrlich melalui sisi tabung.

Hasil : positif : merah / pink

negatif : kuning/tidak berwarna

Air pepton

- 10 g pepton

- 5 g NaCl

- 1 L aquadest

Campurkan pepton dan nacl ke dalam aquadest. Panaskan hingga seluruh bahan

larut. Sterilkan dengan autoclave.

22. Aktivitas Urease

Inokulasi Suspensi Bakteri pada tabung yang berisi media urea. Inkubasi pada

suhu 37oC selama 24 jam.

hasil : positif : merah / ungu

negatif : kuning

kaldu urea

- 1g pepton

- 1 g dextose

- 1,2 g Na2HPO4

- 0,8 g K2HPO4

- 5 g NaCl

- 0,004 g phenol red

- 1 L aquadest

B-14

Campurkan Semua bahan, panaskan dengan sterilisasi, kemudian dinginkan

sampai dengan ± 55oC. Tambahkan 5 ml urea steril 40 % secara aseptik. bagi

kedalam tabung steril sebanyak 5 ml.

23. Hidrolisis gelatin

Inokulasi gelatin agar dengan biakan inkubasi selama 3 hari. Basahi permukaan

dengan 5-10 ml HgCl2.

hasil : positif : permukaan bersih, HgCl2 keruh

negatif : HgCl2 bening

agar gelatin

- 4 g gelatin

- 50 mL aquadest

- 1 L nutrient agar cair

Rendam gelatin dalam aquadest sampai lunak tambahkan nutrient agar cair, aduk

kemudian sterilisasi.

24. Hidrolisis casein

Inokulasi agar susu dengan biakan , inkubasi 24-48 jam. Amati adanya bagian

yang bening. Pada bagian yang bening menunjukan adanya hidrolisis casein oleh

bakteri.

25. Hidrolisis Pati

Inokulasi agar pati dengan biakan , inkubasi 24-48 jam. Setelah terlihat adanya

pertumbuhan tuangkan larutan lugol pada biakan biarkan selama 5 manit sampai

terlihat adanya bagian yang bening dan biru. Bagian yang bening menunjukan

adanya hidrolisis pati oleh bakteri.

26. Hidrolisis Arginin

Inokulasi arginin broth dan setelah inkubasi selama 24 jam tambahkan 0,25 mL

pereaksi nessler.

hasil : positif : coklat

negatif : kuning

B-15

arginin broth

- 5 g pepton

- 5 g yeast extract

- 2 g K2HPO4

- 0,5 g glukosa

- 3 g arginin monohidroklorida

- 1 L aquadest

Larutkan dengan pemanasan hingga mendidih. Distribusikan dalam tabung @

5 ml sterilisasi.

reagen nessler

- 8 g KI

- 11,5 g Hg I2

- 50 mL NaOH 6 N

- 50 mL aquadest

Larutkan KI dan Hg I2 dalam 20 ml aquadest dan tambahkan aquadest hingga

50 mL. tambahkan NaOH. Kocok dan biarkan selama 24 jam. Reagen ini

harus terlindung dari cahaya.

27. Reaksi dekarboksilasi ornitin

Inokulasi tabung yang berisi media falkow’s-ornitin, inkubasi dan periksa setiap

hari sampai hari ke-4

Hasil : positif : ungu

negatif : kuning

28. Reaksi dekarboksilasi lisin

Inokulasi tabung yang berisi media falkow’s-lisin, inkubasi dan periksa setiap hari

sampai hari ke-4

Hasil : positif : ungu

negatif : kuning

media Falkow’s-ornitin/lisin

- 5 g pepton

- 3 g yeast extract

B-16

- 1 g glukosa

- 10 mL BCP 0,2 %

- 1 L aquadest

- L-lisin hidroklorida

- L-ornitin hidroklorida

Semua bahan dilarutkan dalam aquadest dan tambahkan larutan indikator.

Sterilisasi dengan autoclave selama 20 menit. Bagi menjadi dua bagian yang sama

dan tambahkan masing-masing l-lisin hidroklorida 0,5 % dan l-ornitin

hidroklorida 0,5%. Distribusikan kedalam tabung lalu sterilisasi

29. Produksi H2S

Inokulasi biakan pada media agarsecara tusuk. Inkubasi dan periksa setiap hari

hingga 7 hari.

Hasil : positif : warna hitam

negatif : tidak berwarna

media agar

- 20 g pepton

- 1 g K2HPO4

- 0,5 g feeric acid

- 15 g agar

- 1 L aquadest

Semua bahan kecuali agar dimasukan ke dalam aquadest. Panaskan hingga hampir

mendidih. Tambahkan agar secar perlahan sambil diaduk sehingga tidak

menggumpal. Masukan kedalam tabung-tabung reaksi. Sterilkan dengan

autoclave.

30. reaksi MR/VP

Inokulasi media MR/VP dengan biakan. Inkubasi selama 24 jam. Untuk MR

teteskan metil merah pada permukaan suspensi melalui pinggiran tabung. Untuk

untuk VP tambahkan 1 mL larutan alfa naftol, 1 mL KOH 40 % dan kreatin 0,3%

melalui dinding tabung campurkan dengan sempurna dan biarkan slama 5-30

menit.

Hasil : positif : terbentuk cincin merah

negatif : kuning

C-1

Lampiran C

Gambar dan Foto Penelitian

C-2

Gambar A.1 Shaker Gambar A.2 Evaporator

Gambar A.3 Corong pisah Gambar A.4 Kromatografi gas

Gambar A.5 Penyemprotan Insektisida

C-3

Gambar A.6 Mikroskop Gambar A.7 Colony Counter

Gambar 8 Bahan Penelitian Gambar 9 Inkubator

Gambar 10 Isolasi Gambar 11 Pewarnaan

C-4

Gambar 12 Agar SS dan Mc conkey

Gambar 13 Uji Biokimia

D-1

Lampiran D

Hasil Kromatografi Gas

D-2

Gambar 1 Kromatograf

D-3

BALAI PENELITIAN LINGKUNGAN PERTANIAN LABORATORIUM RESIDU BAHAN AGRO KIMIA

Jl. Laladon Raya No. 240, Ciomas, Bogor 16610, Telp/Fax. (0251) 638987

LAPORAN HASIL PENGUJIAN RESIDU PESTISIDA

KLORFIRIFOS DAN PROFENOPOS

Konsentrasi residu (ppm) No. Kode Sampel Klorfiripos Profenopos 1 A - -

2 B - -

3 C - -

4 D - -

5 E - -

Keterangan: - = Tidak terdeteksi

Bogor, 6 Juni 2007 Kepala Lab.

Eman Sulaeman,SP.

NIP : 080.136.802

D-4

BALAI PENELITIAN LINGKUNGAN PERTANIAN LABORATORIUM RESIDU BAHAN AGRO KIMIA

Jl. Laladon Raya No. 240, Ciomas, Bogor 16610, Telp/Fax. (0251) 638987

LAPORAN HASIL PENGUJIAN RESIDU PESTISIDA

Konsentrasi residu (ppm) No Kode 1 2 3 1 A 0,013 0,028 0,001 2 B 0,022 0,011 0,008 3 C 0,015 0,200 0,002 4 D 0,009 0,013 - 5 E 0,023 0,180 - 6 F 0,004 0,029 - 7 G 0,014 0,070 0,002

Keterangan: - = Tidak terdeteksi

1. klorpirifos 2. profenofos 3. diazinon

Bogor, 4 Mei 2007

Kepala Lab.

Eman Sulaeman,SP.

NIP : 080.136.802

E-1

Lampiran E

Foto Bakteri Hasil Isolasi

E-2

Gambar 1 Koloni berbentuk batang Gambar 2 Koloni berbentuk batang-kokus

Gambar 3 Koloni bentuk batang kurus Gambar 4 Koloni bentuk kokus

Gambar 5 Koloni bentuk batang Gambar 6 Koloni bentuk batang

biomarker pencemaran insektisida · pdf fileisolasi dan identifikasi bakteri pendegradasi...

Documents