biomedizinische anwendungen in der plasmatechnik · enzym katalase als katalysator und beschleunigt...

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Helmut H al fmann

Biomedizinische Anwendungen in der Plasmatechnik

H. Halfmann, P. AwakowiczLehrstuhl für Allgemeine Elektrotechnik und Plasmatechnik

Ruhr-Universität Bochum


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Inhalt

• Endosporen• Forschungsergebnisse


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EndosporenAufbau der Sporenhülle

Die äußeren Hüllen verschiedener Bacillus Arten unterscheiden sich leicht von einander. B. cereus hat eine einfache aus hauptsächlich einem Protein bestehende Hülle, während die für uns wichtige Art B. subtilis zwei äußere Wände und die für den Menschen gefährliche Art B. anthracis eine weitere Hülle (Exosporium) besitzt.

Die Sporenhüllen beginnen ihr Wachstum an den Polen / Enden der Spore und sind am Ende des Wachstums dort dicker als entlang der Spore. Ein weitere noch ungeklärte Beobachtung in diesem Zusammenhang ist, dass die Dicke der Sporenhülle auch vom Nährmedium abhängt. Es liegt die Annahme nahe, dass die Zelle auf ihr Umfeld reagieren kann und so abhängig vom Umfeld die Struktur ihrer Hülle verändern kann (Moir, A., E. H. Kemp, C. Robinson, and B. M. Corfe. 1994. The genetic, analysis of bacterial spore germination. J. Appl. Bacteriol. 77:9S–16S. und Zheng, L., and R. Losick. 1990. Cascade regulation of spore coat gene expression in Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 212:645–660).


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EndosporenAufbau der Sporenhülle

Bacillus subtilis Sporen umschließen zwei Hüllen – ein äußerer und ein innerer Mantel. Der innere Mantel ist ca. 70nm dick und erscheint streifenförmig aufgebaut aus zwei bis fünf Schichten. Diese Schichten setzen sich aus langen Proteinen zusammen ( Kornberg, A., J. A. Spudich, D. L. Nelson, and M. Deutscher. 1968. Origin of proteins in sporulation. Annu. Rev. Biochem. 37:51–78.). Der äußere Mantel ist in der Regel mit 70nm – 200nm dicker als der innere Mantel und ist nicht so geordnet aufgebaut wie der Innere.

Der äußere Mantel ist von einer weiteren Schicht – dem Exosporium - umgeben. So ist z.B. Bacillus anthracis vom Exosporium umgeben, das sich aus mehreren Lagen aufbaut und mit dem Mantel der Spore nicht verbunden ist. Beim B. subtilis ist das Exosporium eng mit dem äußeren Mantel verbunden und so funktionell nicht einfach von diesem zu trennen.


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EndosporenZusammensetzung der Sporenhülle

Die Sporenhülle setzt sich hauptsächlich aus Proteinen mit kleineren Mengen von Kohlenhydraten und Lipiden zusammen. Die Proteine der Hülle sind reich an den Aminosäuren Tyrostin und Cystein ( Hiragi, Y. 1972. Physical, chemical and morphological studies of spore coat of Bacillus subtilis. J. Gen. Microbiol. 72:87–99.; Hiragi, Y. 1972. Physical, chemical and morphological studies of spore coat of Bacillus subtilis. J. Gen. Microbiol. 72:87–99.; Murrell, W. G. 1969. Chemical composition of spores and spore structures, p. 215–273. In G. W. Gould and A. Hurst (ed.), The bacterial spore. Academic Press, Inc., New York, N.Y.; Tipper, D. J., and J. J. Gauthier. 1972. Structure of the bacterial endospore, p. 3–12. In H. O. Halvorson, R. Hanson, and L. L. Cambell (ed.), Spores—V. American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Warth, A. D., D. F. Ohye, and W. G. Murrell. 1963. The composition and structure of bacterial spores. J. Cell Biol. 16:579–592.). Die Hülle verschiedener Bacillus Sporen beinhaltet eine Vielzahl verschiedener Polypeptide. B. cereus enthält eine Polypeptid (Aronson, A. I., and D. Horn. 1972. Characterization of the spore coat protein of Bacillus cereus T, p. 19–27. In H. O. Halvorson, R. Hansen, and L. L. Campbell (ed.), Spores—V. American Society for Microbiology, Washington, D.C.) und B. subtilis bis zu 25 verschiedene Polypeptide.Studien haben gezeigt, dass einige Proteine auch zu einem hohen Grad vernetzt sind. In (Pandey, N. K., and A. I. Aronson. 1979. Properties of the Bacillus subtilis spore coat. J. Bacteriol. 137:1208–1218.) wurden 70% der Hüll-Proteine gelöst und gezeigt, dass 6% der Trockenmasse Polysaccharide und der Rest Proteine waren.


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EndosporenZusammensetzung der Sporenhülle

In ( Aronson, A. I., and P. Fitz-James. 1976. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat. Bacteriol. Rev. 40:360–402.) wird gezeigt, dass zwischen dem Aufbau bzw. der Zusammensetzung der Sporenhülle und der Fähigkeit zur Keimung ein Zusammenhang besteht. Nach Veränderung der Zusammensetzung der Sporenhülle wurden Probleme beim Keimen festgestellt. Allerdings ist diese Nachweis nicht frei von Kritik, da es noch keinen Nachweis gibt, ob und welcher Teil der Hülle einen Anteil an der Keimung hat.


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Übersicht der physikalischeSterilisationsverfahren

Ausglühen: Bunsenbrenner (oxidierender Flammenteil) für Nadeln, Kanülen, Impfösen

Feuchte Hitze: Autoklaven (15 Minuten bei mindestens 121°C und 1 bar) für Metalle

Pasteurisieren: Kurzes erhitzen für Milch bei 71-74°C für 40 Sekunden

Tyndallisierung: An drei aufeinander folgenden Tagen für je 20 Minuten bei 100°C

Trockene Hitze: Bei 160°C für zwei Stunden oder bei 180°C für 30 Minuten

Sterilfilter: Membran mit 0,2 μm Porendurchmesser für Flüssigkeiten (Antibiotika)

Ionisierende Strahlen: ionisierende Gamma-Strahlung

Strahlen: UV Strahlung bzw. daraus gebildetes Ozon (185 nm)


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Übersicht der chemischenSterilisationsverfahren

Etylenoxid: 400-800 mg/l EO bei 20-55°C und bis zu 7 bar

Alkohole: Ethanol oder Isopropanol, denaturiert Proteine und die Cytoplasmamembranfür Oberflächen aller Art

Halogene: Wirken stark oxidierend, chlorieren organische Verbindungen

Oxidationsmittel: H2O2, Peressigsäure


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SterilisationsverfahrenAutoklavieren

Autoklaven dienen vor allem zur Dampfdruck-Sterilisierung von Nährmedien, medizinischen Instrumenten, Operationswäsche, Tupfer und Ähnlichem.

Das Autoklavieren als Sterilisationsmethode wird unter feuchter Hitze durchgeführt. Die Feuchtigkeit lässt vor allem die Sporen der Bakterien quellen, dadurch sind sie weniger resistent als bei trockener Hitze. Die Prozedur gliedert sich in vier Abschnitte. Der erste Abschnitt ist die Steigzeit, hier erreicht der Autoklav selbst die eingestellte Sterilisationstemperatur. Danach beginnt die Ausgleichszeit, nach dieser Zeit erreicht auch das zu sterilisierende Gut an jedem Punkt die nötige Temperatur, dann beginnt die eigentliche Sterilisationsphase (Sterilisationszeit). Welche Dauer gewählt wird, hängt von der Sterilisationstemperatur, dem Typ des Autoklaven und den zu zerstörenden Mikroorganismen ab. Für eine erfolgreiche Sterilisation muss die gesamte Innenluft (Atmosphäre) durch Dampf bei mindestens 2 bar ersetzt werden. Abschließend wird das Sterilgut durch Vakuumphasen getrocknet. Nur trockene Gegenstände gelten bei Entnahme aus dem Sterilisator als steril.

Temperatur: mindestens 121° C; für Prionen 134° CDruck: 2 barProzesszeit: 80 Minuten


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SterilisationsverfahrenAutoklavieren



SterilisationsverfahrenGamma-Strahlen

Die Sterilisation mittels Gamma-Strahlen (γ-Strahlen) nutzt die hohe Energie der Strahlung aus, die von einer radioaktiven Quelle abgegeben wird. Als Quelle wird in den meisten Fällen Cobalt 60 benutzt, das Strahlung im Wellenlängenbereich von 0,001nm bis 0,01nm abgibt. Das Sterilisationsergebnis ist wesentlich von der Strahlendosis abhängig, die früher in in kGy angegeben wird, und nicht wie bei den anderen Verfahren die Behandlungsdauer.

Für die Anwendung im medizinischen Bereich ist die Eindringtiefe der Strahlen von großer Bedeutung, die für γ-Strahlen mehrere 10 cm betragen kann. Dadurch ist es möglich, Materialien auch in ihrer Verpackung zu behandeln. Viren sind besonders gegen die Strahlung resistent, gefolgt von grampositiven Bakterien und Pilzen.



SterilisationsverfahrenGamma-Strahlen

Um Sporen von Bacillus subtilis abzutöten, wird eine Strahlendosis von mindestens 0,6 kGy benötigt. Da die benötigte Strahlendosis in Abhängigkeit vom Keim, der Kontamination, Sauerstoffgehalt der Atmosphäre und anderen Parametern stark schwank, fordert die WHO, dass die zu sterilisierenden Produkte vor der Behandlung auf die Zusammensetzung und Menge der Kontamination geprüft wird. Bakterien sind z.B. in Gegenwart von Sauerstoff 2-3 mal leichter abzutöten als ohne Sauerstoff. Eine geringe Feuchtigkeit in der Zelle führt zu einer höheren Resistenz, da weniger Wasser (H2O) vorhanden ist, dass als Grundlage für Wasserstoffperoxid (H2O2) ein wesentliches Hilfsmittel bei der γ-Sterilisation ist. Bestandteile der Sporenhülle, die abhängig vom Keim sind, können die Strahlung absorbieren und schützen das Innere vor der schädlich Wirkung.

Die γ-Strahlung hat nicht nur Auswirkung auf die Mikroorganismen, sondern kann auch das Sterilisationsgut selbst schädigen. PVC ist für eine mehrmalige Sterilisation mit γ-Strahlen im Gegensatz zu PS nicht geeignet. PVC als Verpackungsmaterial wird durch die Strahlung bei einer Dosis von 25 kGy leicht verfärbt. Sogar Glas, das im Allgemeinen als sehr resistent gilt, verfärbt sich bei einer Strahlendosis von 40 kGy bräunlich.

Die Handhabung der γ-Strahlen bzw. der γ-Strahlen-Quelle ist gefährlich und erfordert eine entsprechende Apparatur. Die Anschaffung und Wartung ist kostenintensiv. Der für die Anwendung bedeutende Nachteil ist die Auswirkung der energiereichen ionisierenden Strahlung auf das Sterilisationsgut



SterilisationsverfahrenH2O2-Gas-Plasma

Die Sterilisations mittels Wasserstoffperoxid-Gas-Plasma nutzt die Vorteile des ETO Verfahrens ohne dessen Nachteile. Das patentierte Verfahren ist auch unter dem Namen Sterrad der Firma Johnson + Johnson bekannt und nach DIN/ISO14937 zertifiziert. Hierbei wird in eine Kammer H2O2 eingelassen und, um die oxidierende Wirkung zu beschleunigen, mittels eines Plasmas dissoziiert. Lebenswichtige Bestandteile der Mikroorganismen werden durch die Oxidation zerstört.

Ohne die dissoziierende Wirkung des Plasmas geht die metastabile Verbindung von H2O2 nur langsam in Wasser und Sauerstoff über. Im menschlichen Körper wirkt das Enzym Katalase als Katalysator und beschleunigt die Spaltung und damit den Abbau von H2O2, das (bzw. der atomare Sauerstoff als Zwischenprodukt) als Oxidationsmittel auch im menschlichen Körper Zellen schädigt.



SterilisationsverfahrenH2O2-Gas-Plasma

Der gesamte Prozess läuft in einer Niederdruckatmosphäre in zwei Zyklen ab. Bei Temperaturen bis 50°C benötigt ein Sterilisationsprozess bis zu 70 Minuten.

Die im Vergleich zum Autoklavieren geringe Temperatur ermöglicht die Behandlung von Kunststoffen wie UHMWPE, allerdings zieht der Wirkmechanismus der H2O2-Gas-Plasma-Sterilisation eine Materialveränderung von UHMWPE nach sich. Wie bei der Behandlung mit feuchter Hitze ist die Behandlungsdauer ein Parameter für weitere Optimierungen.



SterilisationsverfahrenEthylenoxid-Sterilisation

Ein wichtiges aber nicht weniger umstrittenes Verfahren ist die Sterilisation mit ETO (EO). ETO ist ein mikrobezides Gas, das in Verdacht steht, Krebs zu erregen und auch für den Menschen giftig ist. Die Toxizität und die leichte Brennbarkeit von ETO erfordert einen sorgsamen Umgang. Nach Empfehlungen des BGA dürfen in medizinischem Materialien vor der Verwendung bei einer Nachweisempfindlichkeit von unter 1ppm keine Ethylenoxid Rückstände mehr nachweisbar sein.

Der Verlauf des Sterilisationsverfahrens ist neben der Ethylenoxid-Konzentration (typisch 400-800mg/l) bestimmt durch die Prozesstemperatur (typisch 20°C bis 55°C), durch den Prozessdruck (typisch unter 1bar bis 7bar) und durch die relative Feuchte des Sterilisationsgutes. Neben einer möglichst kurzen Behandlungszeit ist das Ziel der Optimierung die Verringerung der ETO-Konzentration, um das Gefahrenpotential nach der Behandlung zu verringern.



SterilisationsverfahrenEthylenoxid-Sterilisation

Für den Menschen ist eine Konzentration von 100-200 mg ETO / l Atemluft in wenigen Augenblicken tödlich. Geringere Konzentrationen können auch durch die Haut aufgenommen zu Übelkeit, Kopfschmerzen und Erbrechen führen. Die Gesundheitsgefahr, die von Rückständen auf dem Sterilisationsgut ausgehen, ist daher nicht zu unterschätzen. Die Ausgasungszeit / Desorptionszeit ist Material und umgebungsabhängig. Bei PVC Materialien beträgt die Desorptionszeit in belüfteten Kammern bei Raumtemperatur bis zu vier Tagen.

ETO ist ein sehr reaktives Gas und reagiert nicht nur mit den Mirkoorganismen, sondern auch mit dem Sterilisationsgut selbst und und führt dort zu Materialveränderungen, die nicht nur positiv sind



Research

Research performed in the last years in the field of plasma sterilization uses plasmas differing in the applied pressure range and in the position of the sample in the discharge. Many plasma researchers focus on non-thermal plasmas. A first advantage over the common methods described above is that heat sensitive materials can be treated. A second advantage is that in all these discharge methods no toxic ingredients are required. The remaining task is to increase the efficiency (e.g. reduce the treatment time) and to control the change of the material characteristics in a positive direction. For this a knowledge of the sterilization mechanisms in a low pressure plasma is important

At atmospheric pressure, dielectric barrier discharges (DBD), resistive barrier discharges (RBD), cascaded dielectric barrier discharge (CDBD) or corona plasma discharges (CPD) are used where the samples are in direct contact with the discharge.

In atmospheric discharges with oxygen it seems that reactive species like atomic oxygen and ozone play a significant role. In the presence of hydrogen and oxygen the hydroxyl-radical OH also reacts with the surface of cells and leads to cell death. The role of UV photons in an atmospheric plasma is controversially discussed as opposed to low pressure processes, where radiation with a wavelength below 300~nm plays an important role.



Research



Research

In low pressure plasma sterilization we distinguish between direct and remote treatment of samples. For the case of a remote exposure to a flowing afterglow of a microwave plasma many results are presented. It is shown that UV radiation plays a key role in the deactivation of spores whereas adding oxygen to the plasma enhances the reduction of living spores. With respect to erosion by oxygen radicals the substrate temperature is important. A higher substrate temperature leads to higher erosion rate. Specially the feasibility of depyrogenation is examine by Kylian et al. in a direct microwave discharge exposure. Rossi et al. show the sterilization feasibility of a low pressure discharge ICP setup for direct treatment. Rossi et al. reveal the VUV/UV radiation as the only meachnism leading directly to spore death in the monolayer case.

Moreau et al. claim a two- (in the case of a pure argon discharge) and three- (argon with added oxygen discharge) step kinetics for the reduction of B. atrophaeus spores. The overall slow reduction needs next by the radiation oxygen radicals to deactivate B. subtilis spores. The first step is related to UV radiation breaking bonds in the outer coat of the spore and additionally the UV radiation damages the deoxyribonucleic acid (DNA). The oxygen radicals in combination with UV radiation effect a reduction by etching the surface. With oxygen a third phase is visible in the reduction kinetics. The oxygen enhances the deactivation of spores so that after a treatment time of 40 minutes for the deactivation of 10^6 spores is enhanced from 10^4 remaining colony forming units (CFUs) to 1 remaining CFU.



Research

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