FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y

BIOQUIMICA

“ANALISIS CUANTITATIVO DE

ENZIMAS”

CURSO: bioquímica

DOCENTE: Dr. Herles MENDOZA CESPEDES

ALUMNA:

MARCELO BONILLA ANGELA TURNO: noche

AULA: 2X

LIMA –PERU

2016

RECONOCIMIENTO ANALISIS CUANTITATIVO DE ENZIMAS

I. INTRODUCCION

La vida de diferentes seres unicelulares o pluricelulares dependen de una serie compleja de reacciones químicas perfectamente ordenadas. Este orden es debido a que esas reacciones químicas están catalizadas por proteínas denominadas enzimas, cuyas propiedades permiten modular las velocidades de estas reacciones. 

Muchas de las enzimas se encuentran en el citoplasma de la célula. Otras están unidas a otras células como las enzimas respiratorias que catalizan el metabolismo del ácido láctico y también las sustancias derivadas al ácidos aminados y ácidos grasos. Hay otras que intervienen en la síntesis de la proteína y son parte integrante de partículas citoplasmáticas llamadas ribosomas.

Las enzimas contienen los mismos aminoácidos que el resto de las proteínas. Unas enzimas se presentan en forma soluble y otras forman parte de la estructura de las diferentes membranas celulares o de las agrupaciones proteicas que constituyen las fibras o las partículas. 

En algunos, casos la enzima y el sustrato, sustancia que se convierte en producto, constituyen el conjunto funcional mínimo que no requiere de ninguna sustancia para ser activo. Sin embargo, para muchas enzimas su actividad como catalizadores depende de la presencia de las moléculas orgánicas no proteicas y que se conocen con el nombre de coenzimas. Si forman parte de la estructura de la enzima de modo estable se denominan "grupos prostéticos". Muchas enzimas requieren también de la presencia de metales.

Determinadas enzimas existen en las células en una forma prácticamente inactiva (proenzimas o zimógenos) y pasan mediante proteolisis limitada - en que se rompen selectivamente determinados enlaces peptídicos - a la forma activa.

Algunas enzimas existen en más de una forma molecular, catalizando todas ellas la misma reacción. La pluralidad de las formas puede darse dentro de una misma célula o en los diversos tejidos de un organismo. Estas diferentes formas moleculares se denominan "isoenzimas".

II. OBJETIVOS

Determinar la presencia de enzimas en productos de origen animal o vegetal mediante reacciones químicas específicas.

Identificar la acción de la catalasa, peroxidasa y tirosidasa

III. FUNDAMENTO TEORICO

Las enzimas cumplen las dos leyes comunes a todos los catalizadores: la

primera es que durante la reacción no se alteran, y la segunda es que no

desplazan la constante de equilibrio para que se obtenga más producto, sino

que simplemente favorecen que la misma cantidad de producto se obtenga en

menos tiempo.

Las enzimas, a diferencia de los catalizadores no biológicos, presentan una gra

nespecificidad, actúan a temperatura ambiente y consiguen un aumento de

la velocidad de reacción de un millón a un trillón de veces.

En toda reacción química se produce una transformación de unas sustancias

iniciales, denominadas reactivas o sustratos (S), en unas sustancias finales o

productos (P). Esta transformación no se verifica directamente, ya que es

necesario un paso intermedio en el cual el reactivo se active, de forma que sus

enlaces se debiliten y se favorezca su ruptura.

Este paso intermedio recibe el nombre de complejo activado y requiere un

aporte de energía, generalmente en forma de calor, que se conoce como

energía de activación.

Las enzimas, una vez que han realizado la transformación del sustrato o

sustratos en productos, se liberan rápidamente de ellos para permitir el acceso

a otros sustratos.

Algunas enzimas no son activas hasta que sobre ellas actúan otras enzimas o

iones. Estas enzimas se denominan zimógenos o pro enzimas. Por ejemplo, el

pepsinógeno, que el HCl transforma en pepsina.

En la cadena polipeptídica de una enzima se pueden distinguir tres tipos de

aminoácidos:

Aminoácidos estructurales, sin función dinámica.

Aminoácidos de fijación, encargados de establecer enlaces débiles

con el sustrato. Constituyen el centro de fijación de la enzima.

Aminoácidos catalizadores, que se unen al sustrato mediante enlaces

covalentes, de forma que en dicho sustrato se debilita la estructura

molecular favoreciendo su ruptura. Constituyen el centro catalítico de la

enzima.

Las enzimas alostéricas suelen estar constituidas por varias subunidades o

protómeros. Cada protómero posee dos centros: un centro regulador y otro

centro catalítico o activo. Al unirse a este centro una molécula, el activador,

modulador o ligando, la conformación

delprotómero varía, haciendo funcional al centro catalítico. De esta forma, la en

zimaalostérica pasa de un estado inhibido (T) a un estado catalítico o activo

(R). La variación en la conformación de un protómero se transmite a los otros

protómeros asociados haciéndolos activos, efecto que se denomina

transmisión alostérica.

La CatalasaEs una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y

vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque

durante al metabolismo celular se forma una molécula toxica que es el peróxido

de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada).

La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el

agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como

muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no puede vivir con

oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la

catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada.

Es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la

descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. El

peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos

organismos vivos y tiene entre otras una función protectora contra

microorganismos patógenos, principalmente anaerobios. Esta función la

efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno.

Además la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido

de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes

de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno

La PeroxidasaEs una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de

hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-

fenilendiamina) por medio de peróxidos. El sustrato oxidable más usado es el

guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetra guayacol en

presencia de peroxidasa.

Las enzimas peroxidasas (POXs) están ampliamente distribuidas en animales,

plantas y microorganismos. Éstas presentan múltiples formas isoenzimáticas

que difieren tanto en la secuencia de sus aminoácidos como en sus

propiedades químicas. La POXs está involucrada en procesos fisiológicos

relevantes de las plantas superiores tales como lignificación, catabolismo de

auxinas, resistencia a patógenos, como así también en diversos mecanismos

de respuesta a situaciones de estrés.

La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción

oxidante de laperoxidasa sobre el sustrato bencidina en presencia de peróxido 

de hidrógeno, formándose un color café oscuro en el sitio de la actividad de la

enzima. La reacción positiva se visualiza por la formación de gránulos café

oscuro en el citoplasma de los tejidos a analizar.

La TirosinasaLa enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre depolife

noloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se

hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal sustrato.

También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de

vegetales. La polifenoloxidasa tiene dos actividades enzimáticas, una

hidroxilando monofenoles (“cresolasa”) y otra oxidando difenoles a quinonas

(“catecolasa”). Dependiendo de la fuente, la actividad “cresolasa” es mayor o

menor, incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas las

enzimastienen actividad “catecolasa”. La característica estructural más importa

nte de estasenzimas es la presencia en su centro activo de dos átomos de

cobre, unidos cada uno de ellos a tres histidinas, que se han conservado a lo

largo de la evolución en todas las enzimas de este tipo, desde las bacterias al

hombre. En su entorno se sitúan una serie de aminoácidos hidrofóbicos, con

anillos aromáticos, que también son importantes en

suactividad, para la unión de los sustratos. Los sustratos de la reacción pueden 

ser monofenoles o difenoles. La tirosina es el sustrato principal de la

polifenoloxidasa en los crustáceos, y también se encuentra presente en

vegetales como la lechuga o en los champiñones. En los vegetales, el sustrato

más extendido es probablemente el ácido clorogénico, en el que el grupo

fenólico se encuentra unido a un resto de azúcar, que se encuentra, entre

otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, paltas y

papas.Las polifenoloxidasas son también en muchos casos capaces de oxidar 

aminasaromáticas para formar o-aminofenoles

IV. MATERIALES Y REACTIVO

MUESTRA MATERIAL DE VIDRIO REACTIVOS Zanahoria Tomate Papa Naranja Pollo

Tubos de ensayo Gradilla Bureta Mechero Cocina eléctrica Vaso precipitado de

250 ml Mortero, pipetas

Peróxido de hidrogeno

V. DESCRIPCION DE LA PRÁCTICA

4.1 RECONOCIMIENTO DE CATALASA

TUBO 1 TUBO 2

Cronometrar el tiempo de cada muestra

4.2.- DESNATURALIZACION DE

LA CATALASA

Llevamos todas las muestras a baño maría por

5 minutos

TUBO 3 TUBO 42ml de tomate

2ml de pollo

2ml de zanahoria

2ml de papa

2ml de naranja

TUBO 5

Añadir 5ml de agua oxigenada (al mismo tiempo)

DETERMINACION DE LA PEROXIDASA

En un mortero rallar una papa

fresca

4.3.2.- PRUEBA DE PIROGALOL

Añadir unos ml de pirogalo l al 1% y 2 gotas de peróxido de hidrogeno al 2%

Tomar una pequeña cantidad de la papa sin exprimir colocar en un

tubo de ensayo

Observar la aparición de un

precipitado

Echar en un tubo de ensayo 1ml de extracto de rabano

4.3.1.- PRUEBA DE LA

BENCIDINA

Agregar 2 gotas de peróxido de

hidrogeno al 0.5 %

Añadir 5 gotas de solución

alcohólica de bencidina

Agitar suavemente y

observar

VI. RESULTADOS

RESULTADOS DE ORDEN DE REACCION

4.4.- DETERMINACION DE LA TIROSINASA

Exprimir y filtrar el extracto

Rallar una papa

Colocar en un tubo de ensayo la muestra

Agitar el tubo y llevar a baño maria

Añadir 3 gotas de tirosina

Tomate Papa Zanahoria Pollo Naranja

xxxx xxx xxx xx x

Orden de reacción

Tomate Papa Zanahoria Pollo Naranja

En caso de los vegetales la catalasa se inactiva en presencia de calor, por lo tanto en los vegetales su reacción es mucho más rápida en calor.

En carnes la catalasa se activa en presencia de calor, por ende las carnes su reacción es más lento en frio

VII. CONCLUSIONES

Los agentes precipitantes inhiben la actividad enzimática por desnaturalización

de la enzima.

La velocidad de una reacción enzimática depende de varios

factores. Entre éstos está el pH. Cada enzima tiene un rango de pH en

el que su actividad enzimática es óptima. Fuera de este rango la

enzima por ser una proteína empieza a desnaturalizarse por la

protonación o desprotonación de sus aminoácidos constituyentes.

La temperatura es otro factor importante en la actividad enzimática. Se

puede decir que a mayor temperatura aumenta la velocidad de la

reacción hasta que llega un punto en el que la velocidad disminuye con

el aumento en el calor.

Otro factor fundamental en la velocidad a la que se realiza una reacción

es la concentración de enzima y de sustrato. Esto se sabe teóricamente

debido a que todas las reacciones cumplen con la reacción de Michaelis-

Menten, donde si la concentración de sustrato o de enzima es muy

baja, la velocidad aumenta proporcionalmente al aumento de

concentración