Tema 9. Energía libre de reacciones de transferencia de grupos químicos y de electrones. Las reacciones de oxido-reducción (transferencia de electrones o hidrógenos; incorporación de oxígeno) y las de sustitución nucleofílica (transferencia de grupos electrófilos) son las de mayor importancia energética en Bioquímica. Las últimas incluyen las reacciones de hidrólisis, en donde el nucleófilo aceptor del electrófilo transferido es el agua. La direccionalidad de estas reacciones y su capacidad para realizar trabajo útil vienen medidas por el cambio de energia libre. 9.1 Direccionalidad y reversibilidad de las reacciones y valor de ΔGo' La relación estudiada en el capítulo anterior entre ΔG y carácter espontáneo de las reacciones así como entre ΔGo' y Keq (constante de equilibrio) permite predecir la direccionalidad y reversibilidad de las reacciones metabólicas. Precisamos a menudo las condiciones de reacción hablando de "condiciones fisiológicas" para indicar las concentraciones de substratos y productos que pueden encontrarse normalmente en las células, "in vivo", y no concentraciones arbitrarias sólo posibles teoricamente o en experimentos "in vitro" en el tubo de ensayo. En la tabla 9.1 se recoge la relacion entre valores de ΔGo' y valores de Keq (partiendo de la ecuacion ΔGo' = -5.7 log Keq). Para que una reaccion metabólica "S"--->"P" pueda ocurrir en una determinada direccion en condiciones fisiologicas debe tener una constante de equilibrio (en la direccion considerada; [P]eq/[S]eq) mayor de 10-3. De esta forma, una concentracion fisiologica de "S" en rango de 10-3 a 10-2 M (1-10 mM) puede llegar a formar por lo menos10-6 -10-5 M (1-10 µM) de "P", que puede ser suficiente para la union a la siguiente enzima de la ruta metabolica que tenga que actuar sobre "P". Al consumirse "P" se desplazaria el equilibrio se conseguiria el funcionamiento continuado de la reacción durante el metabolismo. Para valores de la constante de equilibrio inferiores a 10-3 no se podrian formar cantidades suficientes de "P" para ser utilizadas por la siguiente enzima de la ruta, que por tanto sería inviable en la direccion considerada.

Tabla 9.1 . Relacion entre ΔGo' (cambio de energia libre en condiciones standard) y Keq (constante de equilibrio) . Se ha utilizado la ecuación ΔGo' = -5.7 log Keq. ------------------------------------------------------- ΔGo' (kJ/mol) Keq (sin dimensiones o unidades molares) ------------------------------------------------------- 0 1 -5.7 10 -11.4 102 -17.1 103 -22.8 104 -28.5 105 -34.2 106 -39.9 107 -45.6 108 -51.3 109 -57.0 1010 ------------------------------------------------------- Las afinidades de las enzimas por sus sustratos, medidas por el valor de su Km, estan en el rango de 10-6 a 10-2 M y el valor concreto de Km de la enzima que tenga que hacerse cargo de "P" puede modificar ligeramente los valores de Keq ( [P ]eq/[S]eq) tolerados para el buen funcionamiento de una ruta metabólica en una determinada dirección. Los valores indicados (Keq > 10-3) no deben tomarse como absolutos sino como correspondientes a una situación frecuente de acuerdo con las propiedades cinéticas de la mayoría de enzimas involucradas. Si la Keq estuviera en el rango 10-3 a 103, la reacción podria ocurrir en ambas direcciones y la denominariamos "fisiologicamente reversible", representandola con doble flecha direccional: "S" <===> "P". Este tipo de reacciones permiten la operación de rutas metabólicas en ambas direcciones, dependiendo el sentido solamente de las concentraciones de los metabolitos situados al principio y final de la ruta (M1 y Mn): M1 <===> M2 <===> M3 <===>......<===> Mn-1 <===> Mn En la mayoria de las rutas metabolicas, sin embargo, suele haber reacciones fisiologicamente irreversibles, con Keq > 104 y ΔGo' < -23 kJ/mol, que fijan una direccion a la ruta y que obligan a un "bypass" de la reacción en cuestión cuando se haya de revertir la ruta. Por ejemplo: M1 <===> M2 ---> M3 <===>......<===> Mn-1 <===> Mn

en donde la reaccion entre M2 y M3 es irreversible y se representa con una flecha unidireccional en lugar de doble flecha bidireccional. Veremos más adelante el ejemplo de la glucolisis (ruta de la degradación de la glucosa a piruvato) y su inversa la gluconeogénesis (ruta de biosíntesis de glucosa a partir de piruvato), rutas que comparten etapas fisiologicamente reversibles ( valores de ΔGo' entre -17 y +17 kJ/mol; valores de Keq entre 103 y 10-3) pero que difieren en unas pocas etapas irreversibles (ΔGo' < -23 kJ/mol; Keq > 104). Estas etapas irreversibles imponen la direccionalidad de la ruta y, como veremos mas adelante, están catalizadas por enzimas reguladoras que responden a diversas señales. Las etapas reversibles de una ruta metabolica se autoregulan de acuerdo con las necesidades de utilizacion del producto final de la ruta: si éste (Mn en el esquema anterior) no se utiliza en una situacion fisiologica dada y se acumula, los valores relativamente pequeños de las Keq de las distintas etapas reversibles determinan que se pare la ruta estableciendose la situacion de equilibrio para cada una de sus etapas con concentraciones razonables de los distintos metabolitos intermediarios. Este tipo de regulacion se denomina "control termodinámico", ya que depende exclusivamente de la Keq y ΔGo' de las reacciones. Tipicamente, la actividad enzimatica de las etapas reversibles de una ruta suele ser alta, en exceso sobre los requerimientos de la ruta, cuyo flujo suele estar limitado por la velocidad de sus etapas irreversibles. Ello determina que durante el funcionamiento de la ruta las reacciones de las etapas reversibles estén cerca de su punto de equilibrio para acompasar la velocidad de estas enzimas tan activas a la baja actividad de las enzimas que catalizan las etapas irreversibles (la velocidad neta de reaccion disminuye al aproximarse al punto de equilibrio). La intercalación de etapas irreversibles entre otras reacciones reversibles permite un funcionamiento más eficaz de las rutas metabolicas pero genera una necesidad de regulacion de las enzimas implicadas. En efecto, el alto valor de Keq de las etapas irreversibles hace inviable una autoregulación de la ruta segun la utilizacion del producto final Mn. Por ejemplo, si deja de utilizarse Mn, la reaccion irreversible M2---> M3 no puede pararse espontaneamente por llegar a su punto de equilibrio, ya que el alto valor de la Keq determina que las concentraciones de M3 en el equilibrio sean demasiado altas para las condiciones celulares. Por ejemplo, si Keq es 105 y [M2] = 10-4 M, la reaccion se pararia por alcanzar su equilibrio solamente cuando [M3] = 10 M, valor intolerable para el equilibrio osmótico de la célula en primer lugar y para la economia de carbono del

metabolismo en segundo lugar. La estabilidad de las rutas metabólicas viene dada por la regulación de sus etapas irreversibles por señales más sofisticadas que el simple exceso o defecto del producto de la reacción en cuestión (M3 en el ejemplo anterior). Por ejemplo, la enzima que cataliza la reaccion M2---> M3 puede estar regulada alostéricamente por la concentracion de Mn, frenándose cuando este producto final de la ruta resulte acumulado. Este tipo de regulación se denomina "control cinético", ya que la reaccion se frena o acelera independientemente del punto de equilibrio termodinámico y de acuerdo con las propiedades cinéticas de la enzima (inhibición alostérica, regulación por fosforilación etc). En principio bastaria con regular la primera etapa irreversible de una ruta, lo que protegeria a las etapas irreversibles posteriores de una posible sobreacumulacion de productos. Sin embargo en muchas ocasiones las distintas etapas irreversibles estan en bifurcaciones o encrucijadas de la ruta y ello hace conveniente que, ademas de la primera etapa irreversible, tambien estén sujetas a "control cinético" las etapas irreversibles posteriores que actuan sobre metabolitos de "encrucijada", para así regular la partición del flujo de la ruta entre las distintas bifurcaciones. Todas estas ideas abstractas quedarán más claras cuando sean aplicadas al estudio de una ruta metabolica concreta como es la glucolisis-gluconeogénesis. Su discusión ahora en términos generales ha sido para aprovechar el enfoque termodinámico del presente capítulo y para justificar el estudio de los valores de ΔGo' en esta introduccion a las rutas metabólicas. Estos valores servirán para clasificar las reacciones de una ruta como fisiologicamente reversibles o irreversibles, para identificar las enzimas reguladoras y para establecer las necesidades de "by pass" cuanda la ruta haya de operar en direccion contraria. 9.2. Hidrólisis-condensación y transferencia de electrófilos El esquema general de las reacciones de transferencia de un electrófilo es el siguiente: Nu1-El + Nu2-H ---> Nu1-H + Nu2-El en donde "Nu1-" y "Nu2-" son grupos nucleófilos unidos o bien a un proton (H+) o al grupo electrófilo "El+". Un ejemplo concreto seria la transferencia del grupo fosforilo terminal del ATP a la glucosa:

ATP + glucosa ---> ADP + glucosa-6-fosfato en donde "Nu1-El" es el ATP (que podria representarse como ADP-O-PO32-), "Nu2-H" es la glucosa y "El+" es el grupo fosforilo (+PO32-), uno de los electrófilos más importantes en Bioquímica y que a veces se simboliza como "P" (por ejemplo, en glucosa-6-P). En muchas reacciones el nucleófilo aceptor (Nu2-) es el agua (HO-H) y se habla de hidrólisis: Nu-El + HO-H ---> Nu-H + HO-El La reaccion inversa, por la que se unen un grupo nucleófilo con otro electrófilo desprendiendo agua se llama condensación: Nu-H + HO-El ---> Nu-El + HO-H

Las reacciones de condensación son termodinámicamente desfavorables (ΔGo' > 0) porque aunque los enlaces formados (Nu-El y HO-H) sean de estabilidad similar a la de los enlaces rotos (Nu-H y HO-El), la concentracion del agua es mucho mayor que la de los otros reaccionantes. En condiciones standard (55.5 M) y en condiciones fisiologicas (más de 50 M) el agua está mucho más concentrada que cualquier otra molecula bioquímica (1 M en condiciones standard y en el rango 10-6 - 10-2 M en condiciones fisiológicas). Por tanto la hidrólisis es el camino termodinamicamente posible para descomponer moleculas biologicas pero la condensacion no es el camino bioquimico para construir molecular complejas a partir de otras más simples. Para ello se utilizan reacciones de transferencia de electrófilos a partir de formas de los mismos llamadas "activadas" (Nu1-El), es decir, unidas a nucleófilos (Nu1-) distintos al HO-, que genera agua al reaccionar. Por ejemplo, la formación de glucosa-6-P no puede hacerse por reaccion de condensación entre glucosa y fosforo inorganico: glucosa-6-OH + HO-PO32- ---> glucosa-6-OPO32- + HO-H (que tiene ΔGo' > 0), sino por transferencia de fosforilo desde el ATP, que es la forma activada de este electrófilo:

glucosa-6-OH (glucosa) + ADP-O-PO32- (ATP) ---> glucosa-6-OPO32- (glucosa-6-P) + ADP-OH (ADP) Las reacciones de transferencia de electrófilos pueden considerarse como la combinación de una hidrólisis y una condensación. Asi la reaccion: Nu1-El + Nu2-H ---> Nu1-H + Nu2-El puede considerarse como la suma de las dos reacciones siguientes: Nu1-El + HO-H ---> Nu1-H + HO-El (hidrólisis) HO-El + Nu2-H ---> Nu2-El + HO-H (condensación) En el ejemplo de la fosforilación de glucosa por ATP, se trataria de la suma de las dos reacciones siguientes: ATP + HO-H ---> ADP + HO-PO32- (hidrolisis) HO-PO32- + glucosa ---> glucosa-6-OPO32- (condensacion) Este analisis permite deducir que para que una reaccion de transferencia de un electrófilo "El+" (por ejemplo, el fosforilo +PO32-) desde un nucleofilo "Nu1-" a otro "Nu2-" sea termodinamicamente posible la energia libre desprendida en la hidrólisis de "Nu1-El" debe ser mayor que la desprendida en la hidrólisis de "Nu2-El". Por ejemplo, la reaccion de fosforilación de glucosa a partir de ATP es termodinamicamente posible porque las ΔGo' de hidrólisis de ATP y de glucosa-6-P son -28 y -14 kJ/mol, respectivamente. Es decir, la reaccion de transferencia descompuesta en hidrolisis y condensacion tendria ΔGo' = -28 + 14 = -14 kJ/mol. Por tanto, la energia libre de hidrólisis de moleculas del tipo "Nu-El" mide el "potencial de transferencia" del grupo "El+" y permite predecir la direccion en que ocurriran las transferencias entre distintos pares de nucleófilos donadores/aceptores (Nu-El/Nu-H).

9.3. Coenzimas portadores de electrófilos activados Una gran parte de las reacciones metabólicas consiste en la transferencia de electrófilos desde coenzimas portadores, que actuan como nucleófilos donadores, a intermediarios metabólicos o metabolitos que actuan como nucleofilos aceptores. En el tema 7 ya vimos los principales tipos de coenzimas, con sus formas cargada y descargada asi como el electrófilo que transfieren. El pirofosfato inorgánico (PPi) aparece como el portador más simple de grupos electrófilos activados, actuando en las células como portador de nucleotidilo en la síntesis de ácidos nucleicos y de fosforibosilo en la síntesis de nucleótidos. Una ventaja del PPi sobre otros nucleófilos portadores es que la forma descargada se hidroliza en las células a fósforo inorgánico (Pi), desplazando asi la reaccion de transferencia, que inicialmente era reversible: El-OPPi + Nu-H <===> El-Nu + HOPPi HOPPi + H2O ---> 2 Pi La enzima pirofosfatasa es la encargada de catalizar la hidrólisis de pirofosfato para desplazar el equilibrio de las reacciones reversibles que producen PPi. Como consecuencia, las concentraciones de PPi en las células son muy bajas , del orden de 10-5 a 10-4 M y esto explica que el PPi fuera desplazado por el ATP en el curso de la evolución como portador de fosforilo y como moneda energética. Sin embargo aun quedan en las células actuales unas pocas reacciones de transferencia de fosforilo en donde el PPi actua como donador en lugar del ATP. Se trata de vestigios evolutivos de un mundo primitivo basado en PPi. Aunque en el ATP sea el grupo final pirofosfato la parte activa, el resto del nucleotido sirve de "asa" para ser "cogido" por las enzimas correspondientes. Este es un tema muy general, pues las coenzimas tienen estructuras muy complejas aunque solo una parte de la molecula participa como nucleofilo en las reacciones de transferencia. Asi por ejemplo en la Coenzima A, solo el grupo sulfhidrilo final actua como portador de acilos, siendo irrelevante para la reaccion quimica de transferencia el resto de la complicada molécula. Sin embargo, todas estas partes de la coenzima A son importantes para el reconocimiento por las enzimas que catalizan la transferencia de acilos. Por ello se simplifica esta coenzima como "CoA-SH", recalcando la parte activa quimicamente (-SH) separada del resto (CoA). La enorme complejidad de la S-adenosilmetionina y del metil-tetrahidrofolato se reduce a un grupo nucleofilico portador de metilos (un tioeter

en el primer caso =S+- CH3; un amino secundario en el segundo caso =N-CH3) y todo el resto solo participa en el reconocimiento por las enzimas. El fósforo inorgánico debió ser el portador ancestral de glicosilos pero en la actualidad son los nucleosidodifosfato, en donde al fosfato nucleofilico que participa en la reaccion quimica se le ha añadido una estructuta nucleotidica para facilitar el reconocimiento por las enzimas de distintas coenzimas cargadas de distintos glicósidos. 9.4. Energia libre de hidrólisis de ésteres fosfóricos La transferencia de fosforilo es de gran importancia en bioquímica. Por una parte, la hidrólisis y síntesis de ATP (a partir de ADP y Pi) es el ciclo fundamental de la bioenergética (ver más adelante). Los ácidos nucleicos están formados por puentes fosfodiester entre unidades de pentosa y la transferencia de fosforilo a la pentosa es fundamental en la polimerización. Muchos intermediarios metabólicos están fosforilados, lo que les permite tener carga eléctrica negativa y ser impermeables a través de las membranas biológicas (salvo el transporte mediado por proteinas de membrana o permeasas). Por otra parte, muchos de ellos pueden transferir su fosforilo al ADP mientras otros lo reciben del ATP, participando en el ciclo indicado más arriba. En la tabla 9.2 se recogen los valores de ΔGo' de hidrólisis de una serie de ésteres fosfóricos que participan en el metabolismo. Tabla 8.3 . ΔGo' de hidrólisis de ésteres fosfóricos de importancia bioquímica Pi representa al fósforo inorgánico o fosfato, con estado de ionización HPO42- al pH standard 7.0 (por ello lo representamos como Pi2-). PPi representa al pirofosfato, con estado de ionización HP2O73- al pH standard 7.0 (por ello lo representamos como PPi3-). Las moléculas con grupos pirofosfato como ATP4-, ADP3- and PPi3- existen en condiciones fisiológicas (concentración de magnesio libre alrededor de 1 mM) en forma de complejos con Mg2+ y por tanto se representan en las reacciones como MgATP2-, MgADP- y MgPPi-. El Pi y los ésteres monofosfóricos no tienen afinidad por magnesio.

Reacción ΔGo' (kJ/mol) --------------------------------------------------------------------------------------- Fosfoenolpiruvato3- + H2O ---> piruvato- + Pi2- -62 1,3-Difosfoglicerato4- + H2O ---> 3-Fosfoglicerato3- + Pi2- + H+ -55 Carbamilfosfato2- + H2O ---> carbamato- + Pi2- + H+ -52 Acetilfosfato2- + H2O ---> Acetato- + Pi2- + H+ -48 Creatinafosfato- + H2O ---> Creatina+ + Pi2- -43 MgATP2- + H2O ---> AMP2- + MgHPPi- + H+ -31 MgATP2- + H2O ---> MgADP- + Pi2- + H+ -28 Glucosa-1-fosfato2- + H2O ---> Glucosa + Pi2- -21 Glucosa-6-fosfato2- + H2O ---> Glucosa + Pi2- -14 MgHPPi- + H2O ---> 2 Pi2- + Mg2+ + H+ -13 AMP2- + H2O ---> Adenosina + Pi2- -10 Glicerol-3-fosfato2- + H2O ---> Glicerol + Pi2- -9 Esta escala de ΔGo' premite predecir la dirección de transferencia de fosforilo. Por ejemplo, el fosfoenolpiruvato puede fosforilar al ADP pero en el caso de la glucosa-6-P es el ATP el donador de fosforilo. Para determinar la dirección de transferencia de fosforilo hay que decomponerla en dos etapas aditivas, la hidrólisis del donador y la condensación (inverso de la hidrólisis) del aceptor: Fosfoenolpiruvato3- + MgADP- ---> Piruvato- + MgATP2- ΔGo' = (hidrólisis fosfoenolpiruvato) - (hidrolisis MgATP) = (-62) - (-28) = -34 (negativo, luego termodinamicamente posible en la direccion indicada) MgATP2- + Glucosa ---> MgADP- + Glucose-6-P2- ΔGo' = (hidrólisis MgATP) - (hidrolisis Glu-6-P) = (-28) - (-14) = -14 (negativo, luego termodinamicamente posible en la direccion indicada) Un aspecto que necesita explicacion de la tabla 9.2 es que el ATP, el ADP y el PPi se representan como complejos con magnesio. En condiciones fisiologicas intracelulares hay una concentración de Mg2+ libre del orden de 1 mM. La

constante de disociación del complejo MgATP2- es de 30 µM (ΔGo' = -26 kJ/mol) mientras que las del MgADP- y MgHPPi- son 300 µM (ΔGo' = -20 kJ/mol). Ello determina que tanto el ATP como el ADP y el PPi existan en las células mayoritariamente como complejos con magnesio (MgATP2-, MgADP- y MgHPPi-). El Pi (fosfato libre o fósforo inorgánico) no compleja magnesio en condiciones fisiologicas porque la constante de disociacion del complejo MgHPi es 10 mM, muy por encima de la concentracion de magnesio libre existentes en las células (1 mM). Otro aspecto a tener en cuenta es el estado de disociacion acido-base de los compuestos considerados. Las cargas representadas en la tabla 9.2 se refieren al estado predominante al pH 7 de las condiciones standard bioquimicas. Los valores aproximados de pKa de los principales tipos de esteres fosforicos son: pKa1 pKa2 pKa3 pKa4 Pi (PO4H3)..................................... 2 7 12 PPi (P2O7H4)................................ 1 2 6 9 ATP (adenosina-P3O7H4)....... 1 2 4 7 ADP (adenosina-P2O5H3)....... 2 4 7 RO-PO3H2...................................... 2 6.5 Sin embargo, en presencia de [Mg2+] = 1 mM, el pKa proximo a neutro del PPi, ATP y ADP queda desplazado hacia valores más acidos debido a la union preferencial del magnesio a las formas disociadas ATP4-, ADP3- y HPPi3-. Las formas protonadas HATP3-, HADP2- y H2PPi2- no unen significativamente magnesio a la concentracion standard de 1 mM. El efecto de la formación del complejo con magnesio sobre el pKa depende de la constante de disociación del complejo, Kd (30 µM para el ATP y 300 µM para el ADP y el PPi). El cociente entre las forma complejada y libre se calcula de la siguiente forma: Kd = [X] [Mg]/[MgX] [MgX]/[X] = [Mg]/Kd Para el ATP este cociente sera 1000/30 = 33 mientras que para el ADP y el PPi sera 1000/300 = 3.3. Esto repercute en el valor aparente de pKa de acuerdo con su logaritmo (1.5 y 0.5 unidades de pKa). Es decir, en presencia de 1 mM magnesio, el cuarto pKa del ATP es aparentemente 5.5 (7-1.5), el tercer pKa del

ADP es aparentemente 6.5 (7-0.5) y el tercer pKa del PPi es aparentemente 5.5 (6-0.5), respectivamente. Ello determina que a pH 7 y con [Mg2+] = 1 mM, el ATP exista predominantemente (97%) como ATP4- unido a Mg2+ (MgATP2-) y el PPi exista predominantemente (97%) como HPPi3- unido a Mg2+ (MgHPPi-). Sin embargo en estas condiciones el ADP existe como mezcla de HADP2- (24%) y ADP3- unido a Mg2+ (MgADP-; 76%) y los esteres fosforicos de alcoholes como mezcla de RO-PO3H- (24%) y RO-PO32- (76%). La explicación de las diferencias en ΔGo' de hidrólisis de los diferentes ésteres fosfóricos se basa en varios factores: a) la inestabilidad de los anhídridos de ácido (dobles ésteres fosfóricos como el ATP o dobles esteres de ácidos fosfóricos y carboxílicos como los carboxilfosfatos) con respecto a los ésteres fosfóricos de alcoholes (como el AMP o el glicerolfosfato). En un éster simple, el O del alcohol puede satisfacer la demanda de electrones del grupo fosforilo estableciendo resonancia. En el caso de enlaces pirofosfato o carboxilfosfato (anhídridos de ácidos), el oxigeno puente experimenta una competencia por sus electrones por parte de los dos grupos ácidos enlazados (dos fosforilos o un fosforilo y un acilo) y al no establecer resonancia con ninguno de ellos la estructura resulta menos estable y por tanto libera mas energia libre al hidrolizarse que en el caso de ésteres simples. La misma explicacion vale para la creatinafosfato, en donde hay un nitrógeno puente experimentando la competencia por sus electrones en lugar de un oxígeno. b) En los casos en donde se disocia un proton en el curso de la hidrólisis, la energia libre desprendida en la disociacion (ΔGdiso', ver Tema 8) contribuye al valor global de la ΔGo' de hidrolisis. Por ejemplo, en el caso de un carboxilfosfato (pKa del carboxilico que se disocia en torno a 4) contribuye 17 kJ/mol ya que ΔGdiso' = 5.7 (pKa-7). En el caso del ATP esta contribucion es menor porque el pKa del ADP producto que se disocia es proximo a 7 (ver más arriba). Por tanto, la diferencia de ΔGo' de hidrólisis entre acilfosfatos y ATP (unos 15-20 kJ/mol) se explica casi totalmente por el mayor poder ácido del carboxilato resultante de la hidrólisis de acilfosfatos comparado con el fosfato resultante en el caso del ATP. c) la diferente afinidad por magnesio de substratos y productos de la reacción explica la gran diferencia de ΔGo' entre MgATP2- y MgHPPi-. Los valores de ΔGo'

para la hidrolisis del ATP libre y del PPi libre son casi iguales -34 y -33 kJ/mol, respectivamente. Sin embargo, en presencia de magnesio saturante, como es el fisiologico de 1 mM, los valores de ΔGo' son muy distintos, -28 kJ/mol para el MgATP2- y -13 kJ/mol para el MgHPPi- (tabla 8.3). La ΔGo' de hidrólisis del complejo con magnesio puede considerarse como la suma de la ΔGo' de disociación del magnesio y la ΔGo' de hidrólisis del compuesto sin magnesio. Por tanto, en el caso del pirofosfato tendriamos: ΔGo' hidrolisis MgHPPi- = ΔGo' disociación del Mg2+ + ΔGo' hidrólisis PPi- = +20 -33 = -13 kJ/mol En el caso de la hidrólisis del ATP hay un paso adicional, ya que el producto de hidrólis, el ADP, tambien compleja Mg2+, aunque menos fuertemente que el ATP: ΔGo' hidrólisis MgATP2- = ΔGo' disociación del Mg2+ del ATP + ΔGo' hidrolisis del ATP-4 + ΔGo' asociación del Mg al ADP = +26 -34 -20 = -28 kJ/mol El factor que establece la gran diferencia entre ATP y PPi en presencia de magnesio es que en el caso del ATP el producto de hidrolisis tambien compleja magnesio (aunque menos fuertemente y de ahi la pequeña caida en ΔGo' ), mientras que en el caso del PPi, el producto (Pi) no compleja magnesio, por lo que ΔGo' cae mucho al tener que vencerse la asociacion Mg-PPi sin ganar luego energia libre desprendida por asociacion del Mg2+ con el producto. En presencia de magnesio el ADP tendrá un valor de ΔGo' similar al del PPi ya que su producto de hidrólisis, el AMP, no compleja magnesio. Esto explica que sea el ATP y no el ADP el nucleotido de adenina con enlace pirofosfato utilizado como moneda energética por las células. d) en al caso del fosfoenolpiruvato, el enolpiruvato producido inicialmente en la hidrólisis sufre una isomerización espontanea a piruvato (CH2=COH-COO- ---> CH3-CO-COO-) cuyo gran valor de ΔGo' (del orden de -50 kJ/mol) explica el alto valor global de ΔGo' para la hidrólisis + isomerización.

e) la mayor ΔGo' de hidrólisis de la glucosa-1-P comparada con la glucosa-6-P (-21 frente a -14 kJ/mol) se debe a que el carbono-1 unido al oxígeno puente corresponde al grupo acetalico del azucar (carbono anomerico), unido a otro oxigeno (el del anillo) y por tanto con mayor electrogenatividad que el carbono-6 que corresponde a un grupo alcohol normal. Por tanto en el primer caso la resonancia estabilizadora por desplazamiento de electrones del oxigeno puente hacia el atomo de fosforo es menos fuerte, ya que el carbono-1 atrae tambien hacia sí esos electrones. f) Otro factor es la repulsion electrostática, en el caso del ATP, entre el fosfato liberado y el resto de la molécula. 9.5. Energia libre de otras reacciones bioquímicas importantes distintas de la hidrólisis de ésteres fosfóricos En la tabla 9.3 se recogen los valores de ΔGo' para la hidrólisis de otros enlaces distintos al éster fosforico. Es de destacar el alto valor de ΔGo' de hidrólisis de moléculas como la adeninafosfosulfato, tiosulfonato, acil-AMP y acil-SCoA que pueden considerarse anhidridos de ácido. El anhidrido de ácidos fosfórico y sulfúrico (adeninafosfosulfato) es el de mayor inestabilidad termodinámica por incluir el ácido más fuerte (segundo pKa del sulfúrico = 2). El grupo sulfhidrilo (R-SH) tiene acidez comparable (pKa = 7) al grupo fosfato (R-PO3H-) y por tanto los tioésteres y tiosulfonatos son tambien anhídridos de ácidos, con tensión inestabilizadora por no poder satisfacer a la vez la avidez de electrones de los dos grupos ácido enlazados. Los acil-AMP son anhidridos de ácidos carboxílicos y fosfóricos. Mención aparte merece el alto valor de ΔGo' de hidrólisis de moléculas del tipo del acetoacetato (ésteres de ácidos carboxílicos y metilcarbonilos). Los metilcarbonilos son potentes nucleófilos cuya forma ionizada resulta estabilizada por resonancia como enolatos: R-C-H2C-H ---> {R-C-H2C- <---> R-C= H2C} + H+ || || | O O O-

Tabla 9.3 . ΔGo' de hidrólisis de compuestos de importancia bioquímica que no liberan Pi. Reacción ΔGo' (kJ/mol) --------------------------------------------------------------------------------------- Adeninafosfosulfato2- + H2O ---> AMP2- + sulfato2- + 2 H+ -75 Acetoacetona + H2O ---> acetato- + acetona + H+ -65 Acetil-AMP- + H2O ---> acetato- + AMP2- + 2 H+ -55 Succinil-SCoA- + H2O ---> succinato2- + HSCoA + H+ -43 S-adenosilmetionina+ + H2O ---> S-adenosilhomocisteina + metanol + H+ -42 Acetil-SCoA + H2O ---> acetato- + HSCoA + H+ -35 Glicinato de etilo+ + H2O ---> glicina + etanol + H+ -35 Valil-OtRNA+ + H2O ---> valina + HOtRNA + H+ -35 UDP-glucosa2- + H2O ---> UDP3- + glucosa + H+ -30 Sacarosa + H2O ---> glucosa + fructosa -29 N5-metiltetrahidrofolato + H2O ---> metanol + tetrahidrofolato -26 Acetato de etilo + H2O ---> acetato- + etanol + H+ -20 Carboxibiotina- + H2O ---> biotina + CO3H- -19 Maltosa + H2O ---> 2 glucosa -17 Asparragina + H2O ---> aspartato- + NH4+ -15 Glicil-glicina + H2O ---> 2 glicina -15 Aunque los metilcarbonilos no sean ácidos fuertes (pKa = 20), el enlace acil-metilcarbonilo (R-CO-H2C-CO-R') es equivalente a un anhídrido de ácido, con el grupo -H2C- haciendo de puente entre dos carbonilos y hay desestabilización por no poderse satisfacer a la vez la avidez de electrones de ambos. La estructura de la acetoacetona (CH3-CO-CH2-CO-CH3) es equivalente a la del anhídrido del ácido acético (CH3-CO-O-CO-CH3; ΔGo' de hidrólisis -50 kJ/mol), con el grupo -CH2- haciendo de puente en lugar de -O-. Como veremos más adelante, la hidrólisis altamente exoergónica (ΔGo' muy negativo) de carboxilatos de metilcarbonilos es un proceso clave en el "despiece" metabólico de esqueletos carbonados. Es de destacar que los ésteres alcohólicos de aminoácidos tiene valores de ΔGo' de hidrólisis (-35 kJ/mol) mucho mayores que los ésteres alcohólicos de

ácidos carboxílicos simples (-20 kJ/mol). Ello se debe al efecto inductivo del grupo α-amino (-NH3+), que confiere mayor acidez al grupo carboxilato de los aminoácidos (pKa alrededor de 2) frente al de los ácidos carboxílicos simples (pKa 4-5). Ello crea inestabilidad cuando el carboxilato de los aminoácidos está esterificado y pierde la carga negativa pero tambien puede interpretarse el efecto en base a la mayor ΔGo' de disociación del H+ del ácido resultante de la hidrólisis. Los enlaces amida (asparragina) y péptidico (glicil-glicina) son de baja ΔGo' de hidrólisis (-15 kJ/mol) Otras reacciones de importancia bioquímica son las adiciones/eliminaciones en dobles enlaces C=C y C=O. En el caso del CO2 (reacciones de carboxilación/descarboxilación) el ΔGo' de la eliminación es de unos -30 kJ/mol, por lo que la adición al enlace C=O del CO2 es termodinamicamente desfavorable y las descarboxilaciones son irreversibles: O=C-OH ---> Nu-H + O=C=O | Nu La Keq de descarboxilación es de aldedor de 105 M (con dimensiones de concentración por tratarse de dos productos y un sustrato). En unidades mM, proximas al rango fisiológico, sería 108 mM, enfatizando aun más su caracter irreversible. La adición de nucleofilos al enlace C=O de un aldehido es termodinamicamente favorable (ΔGo'< 0) : Nu-H + R-CH=O ---> R-CHOH | Nu En el caso de metilcarbonilos como nucleofilos que se adicionan al aldehido se habla de condensación aldólica y ΔGo' es de -23 kJ/mol : R'-CO-CH2H + R-CH=O <===> R-CHOH | R'-CO-CH2 Aunque el alto valor negativo de ΔGo' implicaria a primera vista una adicion irreversible, el valor de la constante de equilibrio tiene dimension de concentración por haber dos sustratos y un producto (Keq = 104 M-1). Ello

determina que si la Keq se expresa en unidades mM, en lugar de M, entonces Keq = 10 mM-1 próxima a 1 y por tanto correspondiente a un proceso reversible. En todo caso, la diferencia entre la eliminación irreversible de CO2 y la eliminación reversible de un aldehido está en la relativa estabilidad del CO2/CO3H- comparado con el grupo aldehido (R-CHO). La adición a un aldehido resulta favorecida termodinamicamente (es decir, practicamente irreversible) si el nucleofilo es un alcohol de la misma molécula que al adicionarse forma un anillo estable de cinco o seis carbonos. Esta situación explica las estructuras cíclicas de los azúcares pentosas y hexosas, que son mucho méas estables que las estructuras abiertas con el grupo aldehido libre. Las reacciones de hidratación/deshidratación de dobles enlaces tienen ΔGo' proximo a cero y pueden por tanto ocurrir en ambas direcciones: R2C=CR2 + H2O <====> R2C-CR2 | | H OH 9 .6 . El papel central del ATP en Bioenergética y las formas de conservación de la energía bioquímica Como se indica en la tabla 9.2 la hidrólisis de MgATP tiene una ΔGo' del orden de -28 kJ/mol, que es intermedia entre el conjunto de reacciones de hidrólisis que intervienen en el metabolismo. En condiciones fisiológicas, el valor de ΔG' para la hidrólisis del enlace pirofosfato del ATP puede ser mucho mayor, porque en condiciones de alta "carga energética" celular las concentraciones de ATP (10-2 M), ADP (10-4 M) y Pi (10-3 M) determinan que el cociente: [ADP]x[Pi]/[ATP] (que llamábamos Knq) puede llegar a valer 10-5 M . Entonces: ΔG' = ΔGo' + 5.7 log Knq = -28 + 5.7 log 10-5 = -28 - 28.5 = -56.5 kJ/mol

Esto supone que en condiciones fisiológicas, el ATP puede fosforilar de forma relativamente reversible compuestos con ΔGo' de hidrólisis de hasta unos -55 kJ/mol. Por tanto se establecen tres tipos de enlaces hidrolizables durante el metabolismo: a) enlaces ricoenergéticos en equilibrio potencial con el enlace pirofosfato del ATP por tener ΔGo' de hidrólisis del orden de -30 a -50 kJ/mol. Se incluyen en este grupo los acil-P, la creatina-P, los acil-SCoA, la S-adenosilmetionina, los ésteres de aminoácidos, la UDP-glucosa y los dobles glicósidos como la sacarosa. La hidrólisis/formación (por condensación) de estos enlaces puede acoplarse facilmente durante el metabolismo con la hidrólisis/formación de ATP mediante reacciones fisiologicamente reversibles. b) enlaces mucho más ricoenergéticos que el enlace pirofosfato del ATP, con ΔGo' de hidrólisis mayor de -60 kJ/mol. Se incluyen en este grupo el fosfoenolpiruvato, la adeninafosfosulfato y la acetoacetona. La hidrólisis de estos compuestos puede acoplarse a la síntesis de ATP o de enlaces ricoenergéticos equivalentes, pero no al contrario, pues el enlace pirofosfato del ATP carece de energia suficiente para formar estos tres enlaces tan inestables termodinámicamente. c) enlaces pobres en energia, con ΔGo' de hidrólisis menor de -20 kJ/mol, como los ésteres fosfóricos de alcoholes, los glicósidos, las amidas, los péptidos y los ésteres simples de alcoholes. La formacion de estos enlaces por condensación puede acoplarse a la hidrólisis de ATP pero no al contrario, ya que la hidrólisis no libera energia libre suficiente para acoplarse a la formacion de un enlace pirofosfato. El ATP se ha calificado como la moneda de energía de las células, porque los procesos que liberan energía en muchos casos se acoplan a la síntesis de MgATP a partir de MgADP y Pi (reacción de condensación para formar enlace pirofosfato con ΔGo' = +28 kJ/mol). Estos procesos son en último término a) reacciones altamente exoergónicas de oxido-reducción. Las reacciones de oxido-reducción tienen dos mecanismos de acoplarse a la síntesis de ATP: a1) "fosforilación a nivel de sustrato", en donde la energía libre desprendida en la oxidación de un aldehido a ácido carboxílico se conserva inicialmente en la

formación de un enlace ricoenergético carboxil-fosfato o carboxil-tiol, cuya hidrólisis luego se acopla a la síntesis de ATP. Se llama "a nivel de sustrato" porque el aldehido sustrato de la oxidación forma un enlace ricoenergético al pasar a carboxilato unido a fosfato o tiol, es decir, el sustrato de la oxidación participa directamente en la conservación de energia. Todas las reacciones ocurren en la fase soluble de la célula, con la energia química de oxido-reduccion y de hidrólisis de distintos enlaces como unica forma que se interconvierte y sin necesidad de membranas como en el mecanismo siguiente. a2) "fosforilación a nivel de membrana", en donde la reaccion de oxido-reduccion está catalizada por una enzima de membrana que conserva la energia desprendida haciendo el trabajo osmotico de bombear protones de un lado a otro de la membrana. Las membranas implicadas son las de mitocondrias y de bacterias durante la respiración. Este tipo de enzimas se llaman "sistemas quimiosmóticos" porque catalizan una reacción en donde se acopla un proceso químico (la oxido-reducción) con otro osmótico (el transporte de protones a través de la membrana). Posteriormente, otro sistema quimiosmótico cataliza la utilización de la energía del gradiente de protones en sintetizar ATP. Por tanto hay una interconversión entre energia quimica de oxido-reduccion y de hidrólisis y energía osmótica que precisa de una membrana biológica separando dos compartimentos. Como los protones tienen carga eléctrica, al moverse a través de la membrana tambien hay una energía eléctrica y en conjunto se habla de la "energía del gradiente electro-químico de protones". La absorción de luz para sintetizar ATP se realiza en los centros de reacción de la fotosíntesis. Primero se convierte la energia luminosa en energía de oxido-reducción y posteriormente se sigue el mecanismo a2) anterior, es decir, la energía red-ox se convierte en gradiente electro-químico de protones, que luego se acopla a la síntesis de ATP. Por tanto en la fotosíntesis de los cloroplastos y bacterias fotosintéticas hay una "fosforilación a nivel de membrana" semejante a la que ocurre durante la respiración. La diferencia está en que la reacción de oxido-reducción de la respiración es espontanea mientras que en la fotosínresis está impulsada por la energía de la luz absorbida. El ATP producido por las reacciones anteriores se utiliza en realizar los trabajos varios que necesitan los seres vivos, que son de tipo químico (forzar reacciones de condensación y de carboxilación), mecánico (procesos de movimiento como en los músculos, los cromosomas en la mitosis, movimientos de las células, de los organelos intracelulares etc.), osmótico (transporte activo a través de las membranas, con un componente eléctrico si se trata de moléculas cargadas) y regulador o informático (fosforilación reguladora de proteinas). Es

destacar, que una parte importante del trabajo quimico que realiza el ATP es la carga de las coenzimas portadoras de electrofilos activados mediante reacciones de condensacion acopladas a hidrolisis cuyo mecanismo estudiaremos mas adelante. Aunque la hidrólisis/condensación del enlace pirofosfato del ATP ocupa el papel principal en las transacciones energéticas de las células actuales, otras moléculas como el PPi son todavía utilizadas para conservar energía en procesos de fosforilación a nivel de membrana. Es decir, que la hidrólisis/condensación del PPi tambien está acoplada en algunas membranas (algunas bacterias, vacuolas de las plantas) al transporte de protones, aunque es menos importante que el ATP. Probablemente esto refleja una situación ancestral de las células primitivas que utilizaban el PPi inorgánico como moneda energética antes de desarrollar la molécula orgánica de ATP. Asimismo, aunque la mayoría de trabajos químicos se acopla al ATP, hay algunas reacciones metabólicas en donde la hidrólisis/condensación de enlaces éster y tioéster (ésteres de coenzima A) participa en la transferencia de energía. Y en las reacciones de la fotosíntesis, un aspecto importante de la ribulosa-5-P carboxilasa es que acopla la carboxilación endoergónica a la hidrólisis exoergónica de un enlace acil-metilcarbonilo de la ribulosa-5-P. Hay que destacar que el ATP no es utilizado en las células para almacenar energía, ya que altas concentraciones (> 0.1 M) tendrían un efecto osmótico intolerable y además complejarían (quelarían) el magnesio celular. La presión osmótica de altas concentraciones de ATP, como de cualquier otro soluto intracelular, determinaria la entrada de agua a la célula y su ruptura o lisis. Incluso si la célula estuviera protegida por una fuerte pared de polisacáridos como en microorganismos y plantas, el exceso de turgencia sería perjudicial. En cualquier caso, altas concentraciones de ATP reducirian los niveles de magnesio libre intracelular por debajo de los requerimientos de muchas enzimas metabólicas que tienen el magnesio como cofactor. La mejor forma de almacenar energía sin efectos osmóticos y sin quelar magnesio es como polisacaridos insolubles de glucosa (almidon, glucogeno) y como gotas insolubles de grasa. Estos compuestos pueden movilizarse rapidamente y suministrar ATP durante su catabolismo cuando sea necesario. Asimismo, son reservas de carbono y de poder reductor.

9 .7 . Reacciones de oxido-reducción. Las reacciones de oxido-reducción se definen en un sentido amplio como reacciones de transferencia de electrones entre un donador o reductor que se oxida y un aceptor u oxidante que se reduce. Sin embargo, esta definición de la Química Inorgánica precisa modificaciones en el caso de la Química Orgánica ya que el carbono no existe como ion libre y por tanto no puede ganar o perder electrones. El nivel de oxidación de los conpuestos de carbono depende de su contenido en oxígeno, ya que este elemento, por su mayor electronegativad, desplaza hacia él los electrones que comparte en enlaces covalentes con el carbono. Por tanto el CO2 es la forma más oxidada del carbono, a la que se atribuye una carga formal 4+. Por otra parte, el hidrógeno tiene una electronegatividad algo menor que el carbono, por lo que se considera que la forma más reducida del carbono es el metano, CH4, con carga formal 4-. Por tanto, en el caso de compuestos orgánicos, aumentar el contenido en hidrógenos es reducir y aumentar el contenido en oxígenos es oxidar. Los compuestos de carbono sufren los siguientes tipos de reacciones de oxidación: 1) oxigenación o hidroxilación: R3C-H + 1/2 O2 ---> R3C-OH en este caso el carbono se oxida al unirse al oxígeno y cambia su carga formal de 1- a 1+. El oxigeno se reduce y cambia su carga formal de 0 a 2-. Por tanto, en términos de cargas formales, el carbono ha perdido dos electrones que ha ganado el oxígeno. Una peculiaridad de este tipo de reacción es que los dos sustratos, reductor y oxidante, quedan unidos en el producto. En todos los otros tipos de reacciones red-ox de compuestos del carbono el reductor y el oxidante permanecen como moléculas separadas y puede por tanto descomponerse en dos semireacciones, como en el caso de la Química Inorgánica. 2) Oxidación de alcoholes a carbonilos (grupos ceto de aldehidos o cetonas): R2C-H ---> R2C=O + 2 H | OH Los 2 H que formalmente libera el carbono justifica que se hable de "deshidrogenaciones", aunque normalmente no se desprenden como hidrógeno

gaseoso sino que son captados por el oxidante. Estos 2 H pueden representarse de dos formas convencionales: a) como (2 e- + 2 H+), para recalcar que se trata de una pérdida de dos electrones ("e-"), los H+ participando solamente para balance eléctrico. b) como (H- + H+), para indicar que la reacción puede considerarse como una substitución o eliminación nucleofílica en el carbono, siendo el hidruro (H-) el nucleofilo saliente y el H+ el electrófilo por defecto. En el caso anterior, se trataría de una eliminación de hidruro creándose el doble enlace C=O. 3) oxidación de aldehidos a ácidos carboxílicos: R-C=O + H2O ---> R-C=O + 2 H | | H OH esta reacción puede considerarse como una substitución nucleofílica en el carbono, en donde el nucleófilo entrante es el hidroxilo (HO- o H2O tras soltar un H+) y el nucleofilo saliente es el hidruro (H-). Sin embargo, como los aldehidos existen tambien en la forma hidratada, la reacción puede escribirse como: OH OH | | R-C - OH ---> R-C=O + 2 H | H que se interpretaría como eliminación de hidruro (y proton) generando el doble enlace C=O. 4) insaturación de enlaces carbono-carbono: R2C-CR2 ---> R2C=CR2 + 2 H | | H H se trata de una eliminación de hidruro y proton. En muchas reacciones de oxido-reduccion intervienen dos compuestos de carbono que intercambian hidrógenos segun los mecanismos anteriores. Pero en otras reacciones interviene un compuesto de carbono que sufre

deshidrogenación y un átomo inorgánico que sufre ganancia real de electrones. En todos los casos puede interpretarse la reaccion en terminos de transferencia de electrones. 9.8. Concepto de potencial de reducción bioquímico Al interpretar las reacciones de oxido-reducción como transferencia electrónica, podria plantearse una medida del "potencial de transferencia" de cada compuesto para predecir el sentido de las reacciones. En el caso de transferencia de fosforilo (capítulo anterior) se utilizaba el valor de ΔGo' de transferencia al agua (hidrólisis), lo que suponia considerar al agua como aceptor de referencia para comparar distintos donadores de fosforilo. En el caso de reacciones de transferencia de electrones se usa el hidrógeno gaseoso (H2) como donador de referencia para comparar el potencial de captar electrones de otros compuestos. En lugar de utilizar el valor de ΔGo' de la reaccion de transferencia de electrones, se utiliza el potencial eléctrico desarrollado por un montaje experimental que se describe a continuación. Se trata de dos semielectrodos voltaicos conectados por un puente salino líquido y por un cable eléctrico con un medidor de diferencia de potencial. Un semielectrodo (el izquierdo) es el llamado "electrodo normal de hidrógeno", en donde se produce la reacción: H2 (1 atm) ---> 2 H+ (1 M) + 2 e- con los reaccionantes en sus concentraciones "standard", 1 atmosfera de presion para el hidrógeno gaseoso y 1 M para los protones. Este es el donador standard de electrones frente al cual se compara la tendencia captar electrones de otros compuestos. El otro semielectrodo contiene el compuesto en cuestión cuya capacidad para ceder electrones quiere determinarse. La diferencia de potencial desarrollada (semielectrodo derecho menos izquierdo) se denomina potencial de reduccion (E) del par redox X/Xn- (EX). Cuanto más positivo sea el potencial de reducción, mayor será la tendencia termodinámica del compuesto X (más bien, del par X/Xn-) de ganar electrones. El potencial de reduccion del electrodo normal de hidrógeno se toma arbitrariamente como referencia igual a cero. Si se midiera una diferencia de potencial positiva (EX > 0) esto querría decir que los electrones migran por el cable hacia el electrodo de la derecha

porque el par X/Xn- tiene mas tendencia a reducirse que el electrodo normal de hidrógeno y por tanto le sustrae electrones: X + n e- ---> Xn- La reacción global será: (n/2) H2 + X ---> n H+ + Xn- (EX > 0) Si se midiera una diferencia de potencial negativa (EX < 0) esto querría decir que los electrones migran por el cable hacia el electrodo de la izquierda porque el electrodo normal de hidrógeno tiene más tendencia a reducirse que el par X/Xn- y por tanto le substrae electrones. En este caso la reaccion global entre los dos semielectrodos seria: n H+ + Xn- ---> (n/2) H2 + X (EX < 0) En muchas reacciones bioquímicas, por ejemplo las de compuestos de carbono, n = 2 y se aceptan tambien dos protones (reacciones de hidrogenación/deshidrogenación): X + 2 e- + 2 H+ ---> XH2 pero pueden encontrarse compuestos que acepten un solo electrón (por ejemplo, Fe3+ + e- ---> Fe2+), cuatro electrones (por ejemplo, O2 + 4 e- + 4 H+ ---> 2 H2O) u otras estequiometrias. Se hablara de potencial de reducción standard (Eo) cuando las concentraciones de X y Xn- sean 1 M. Finalmente, si en el semielectrodo de la derecha, donde está el compuesto X, el valor de pH es 7, se habla de potencial de reduccion standard bioquímico (Eo'), concepto análogo al de ΔGo', cambio de energia libre en condiciones standard bioquímicas. Hay una relación de equivalencia entre Eo' (diferencia de potencial desarrollada en el sistema de la figura 9.1) y ΔGo' de la reaccion de reduccion de X por el electrodo normal de hidrógeno: (n/2) H2 + X ---> n H+ + Xn-

ΔGo' = - n F Eo' en donde "n" es el número de electrones transferidos por molécula de X y F es la constante de Faraday, que relaciona moles de carga con unidades eléctricas (96.5 kiloculombios por mol de carga). El signo menos de debe a que si Eo' es positivo X se reduce a costa del electrodo normal de hidrógeno y por tanto la reaccion de arriba tendrá ΔGo' negativo. El movimiento de "n" cargas contra la diferencia de potencial Eo' representa el máximo trabajo electrico que puede obtenerse de la reaccion indicada y por tanto corresponde a la ΔGo' de la reacción. Al igual que las reacciones de transferencia de fosforilo se decomponian en dos reacciones parciales, primero de transferencia al agua (aceptor de referencia) desde el donador y luego de trabsferencia desde el agua al aceptor (condensacion), la transferencia de electrones entre dos pares X/Xn- y Y/Ym- puede descomponerse en dos reacciones parciales: primero la transferencia desde el par donador de elctrones al electrodo normal de hidrógeno y luego la transferencia desde éste al par aceptor de electrones. Así la reacción genérica: m X + n Ym- ---> m Xn- + n Y en donde el par Y/Ym- reduce al par X/Xn- puede descomponerse en dos reacciones parciales: n Ym- + mn H+ (1 M) ---> n Y + (mn/2) H2 (1 atm) m X + (mn/2) H2 (1 atm) ---> m Xn- + mn H+ (1 M) en la segunda ΔGo' = - mn F Eo'X (reduccion del par X/Xn-) y en la primera ΔGo' = mn F Eo'Y (signo + por ser oxidación del par Y/Ym- en lugar de reduccion). Por tanto la reaccion global tendra un cambio de energia libre de : ΔGo' = - mn F (Eo'X - Eo'Y)

Esto nos indica que el signo de ΔGo' depende de la diferencia (Eo'X - Eo'Y):

a) si Eo'X es mayor que Eo'Y, el par X/Xn- tiene mayor tendencia a ganar electrones (reducirse) que el par Y/Ym- y por tanto la reaccion ocurrira en la direccion indicada porque ΔGo' < 0. b) si Eo'X es menor que Eo'Y, el par X/Xn- tiene menor tendencia a ganar electrones (reducirse) que el par Y/Ym- y por tanto la reaccion ocurrira en direccion contraria a la indicada porque en esa direccion ΔGo' < 0. Indicabamos anteriormente que para que una reaccion fuese fisiologicamente reversible el valor de ΔGo' debe estar entre -17 y + 17 kJ/mol (Keq entre 103 y 10-3). En el caso de reacciones de oxidoreducción esto puede traducirse a diferencias de potenciales de reduccion de acuerdo con la ecuacion anterior. Para el caso mas corriente de que m = n = 2, la diferencia de potenciales de reduccion Eo'X - Eo'Y debe estar entre -0.09 y +0.09 voltios para que la reaccion pueda ocurrir en ambas direcciones en condiciones fisiologicas (17 kJ/ml dividido por 2 x 96.5). Estos principios nos permitirán interpretar los valores de potenciales de reduccion de distinto metabolitos y coenzimas para predecir la direccionalidad y caracter reversible o irreversible de las reacciones de oxidoreduccion. Asimismo, podremos predecir qué reacciones red-ox liberan suficiente energia libre para ser acoplada a trabajos químicos (síntesis de ATP) y electro-osmóticos (transporte de protones a través de las membranas). Un último aspecto es que el potencial de reducción a concentraciones distintas de 1 M puede calcularse con la expresion: E' = Eo' + (RT/nF) ln ([X]/[Xn-]) = Eo' + (0.06/n) log ([X]/[Xn-]) Si la reacción red-ox conlleva protones, entonces el pH influye mucho en el valor del potencial. Por ejemplo, si la reacción es: X + ne- + nH+ ---> XHn entonces se tiene: E = Eo + (0.06/n) log ([X] [H+]n/[XHn]) = Eo + (0.06/n) log ([X]/[XHn]) + 0.06 log [H+] = Eo + (0.06/n) log ([X]/[XHn]) - 0.06 pH

Esta ecuación indica que al subir el pH (menos concentración de H+) el potencial se hace menor (menos tendencia a reducirse X captando H+). En concreto la diferencia entre Eo (todos los reaccionantes incluidos los protones a 1 M) y Eo' (todos los reaccionantes a 1 M salvo los, protones a 10-7 M, pH = 7) sera Eo' = Eo - 0.42, es decir, 0.42 voltios de diferencia. 9.9. Valores de potenciales de reduccion de metabolitos y coenzimas más importantes La tabla 9.4. recoge los valores de Eo' de los pares red-ox de metabolitos orgánicos e inorgánicos más importantes. Sin embargo, antes de utilizar estos valores para predecir reacciones metabólicas, hemos de tener en cuenta que las reacciones red-ox intracelulares no se organizan como reaccion directa entre dos pares de metabolitos sino a través de coenzimas de oxido-reduccion. Estos actuan como intermediarios entre los pares de metabolitos que reaccionan, bien como coenzimas libres o como grupos prostéticos de las enzimas que catalizan reacciones de oxido-reducción. Asi la transformacion metabolica de oxidoreducción: XH2 + Y ---> X + YH2 se suele realizar en las células en dos etapas con la participacion de una coenzima red-ox que denominamos genericamente "Cor": XH2 + Cor ---> X + CorH2 CorH2 + Y ---> YH2 + Cor En la tabla 9.5 se recogen los Eo' de las coenzimas red-ox más importantes. Los nucleotidos de flavina (FAD y FMN) son grupos prostéticos de enzimas red-ox y no existen libres en las células porque en su forma reducida tienen tendencia a ser oxidados espontaneamente por el oxígeno, generando agua oxigenada (H2O2). Tanto el NAD+ como el NADP+, llamados conjuntamente piridin-nucleotidos, son estables en su forma reducida en presencia de oxigeno por lo que constituyen las coenzimas red-ox libres más importantes de las células. Les sigue en importancia como coenzima libre de la fase soluble de las células la ferredoxina. La plastocianina y el citocromo c son coenzimas de superficie de membranas

Tabla 9.4 . Potenciales de reduccion en condiciones standard bioquímicas (Eo' ) de los principales metabolitos inorgánicos y orgánicos. En el caso de compuestos orgánicos genéricos (aldehidos, alcoholes etc.) se indican valores aproximados ya que el valor exacto depende de cada compuesto particular. Par red-ox (X/Xn-) n Eo' (voltios) ------------------------------------------------------------------------------------- Compuestos inorgánicos H2O2/2H2O 2 +1.35 O2

.-/H2O2 1 +0.98 2 NO2-/ N2 6 +0.94 O2/ 2 H2O 4 +0.82 Fe3+/Fe2+ 1 +0.77 NO3-/NO2- 2 +0.42 NO2-/NH4+ 6 +0.33 O2/H2O2 2 +0.3 Cu2+/Cu+ 1 +0.15 SO32-/S 4 -0.04 AMP-sulfato/sulfito + AMP 2 -0.07 RS-SR/2 RSH 2 aprox. -0.1 SO32-/S2- 6 -0.3 N2/2 NH4+ 6 -0.28 O2/O2-.(radical superoxido) 1 -0.3 S/S2- 2 -0.3 2 H+/H2 2 -0.42 SO42-/SO32- 2 -0.46 Compuestos orgánicos R2C=CR'2/R2CH-CHR'2 2 aprox. 0.0 (y R2C(OH)-CHR’2/ R2CH-CHR'2) CH3OH/CH4 2 +0.05 R2C=O/R2CHOH 2 aprox. -0.2 H2CO/ CH3OH 2 -0.2 RCO-OPO32-/RCHO + Pi 2 aprox. -0.3 RCOOH/RCHO 2 aprox.-0.6 HCOOH/H2CO 2 -0.6 CO2/HCOOH 2 -0.6

Tabla 9.5 . Potenciales de reduccion en condiciones standard bioquímicas (Eo' ) de las principales coenzimas de oxido-reduccion (grupos prostéticos y coenzimas libres) Los nombres de las enzimas que contienen los grupos prostéticos se indican entre parentesis. P680 y P680* corresponden, respectivamente, a las formas normal y energizada por absorción de 1 foton del par de moleculas especiales de clorofila que constituyen el centro de reaccion del fotosistema II. P700 y P700* corresponden, respectivamente, a las formas normal y energizada por absorción de 1 foton del par de moleculas especiales de clorofila que constituyen el centro de reaccion del fotosistema I. PC: plastocianina. Cit: citocromo. Fd: ferredoxina. Q: ubiquinone o coenzima Q. Par red-ox (X/Xn-) n Eo' (voltios) -------------------------------------------------------------------------- Grupos prostéticos de sistemas red-ox P680+/P680 1 +1.0 (fotosistema II) P700+/P700 1 +0.4 (fotosistema I) Hemo a (Fe3+)/hemo a (Fe2+) 1 +0.3 (citocromo oxidasa) Hemo b (Fe3+)/hemo b (Fe2+) 1 +0.1 (UQ-cit c oxidoreductasa) Flavina/FlavinaH2 2 -0.2 (diversas deshidrogenasas, Eo' variable entre -0.5 y +0.2) P680+/P680* 1 -0.8 (fotosistema II) P700+/P700* 1 -1.2 (fotosistema I) Coenzimas libres de membrana PC (Cu2+)/PC(Cu+) 1 +0.4 Cit c (Fe3+)/cit c (Fe2+) 1 +0.25 Q (ubiquinona)/ QH2 (ubiquinol) 2 +0.05 QH2/QH-. 1 +0.24 QH-./Q 1 -0.14 Coenzimas libres de fase soluble NAD(P)+/NAD(P)H 2 -0.32 Fd (Fe3+)/Fd (Fe2+) 1 -0.42 Tioredoxina S-S/-SH –SH 2 aprox. -0.3

mientras que la ubiquinona, altamente hidrofóbica, actua como coenzima libre en el interior de la fase lipídica de las membranas celulares. Las coenzimas red-ox son moleculas complejas que contienen un pequeño centro activo donde ocurre la oxidación-reducción. Asi la plastocianina es una pequeña proteina con cobre en su centro red-ox activo y el citocromo c es una proteina con un grupo hemo donde el hierro desempeña el papel activo. En el NAD elcentro activo es el anillo de piridina y en el FAD el anillo de isoaloxacina. En la ubiquinona es el anillo de quinona. Sin embargo, en la clorofila del centro actico de la fotosintesis, el electron que participa en la reaccion red-ox es uno de los muchos deslocalizados por resonancia en el enorme anillo tetrapirrolico. 9.10. Acoplamiento energético entre reacciones de oxido-reducción y trabajos químicos y osmóticos Vamos a calcular los requerimientos termodinamicos para que una reacción red-ox pueda acoplarse directamente a la síntesis de ATP mediante procesos de "fosforilación a nivel de sustrato". Asumiendo que n = 2, se tendrá la reaccion global: X + YH2 + ADP + Pi ---> XH2 + Y + ATP Para que sea termodinamicamente posible, ΔG debe ser negativa. El cambio de energia libre de esta reaccion acoplada puede descomponerse en los cambios de energia libre de las dos reacciones que intervienen: la reaccion red-ox (X + YH2 ---> XH2 + Y; ΔGredox) y la condensacion para sintetizar ATP. Esta ultima equivale a unos +50 kJ/mol en condiciones fisiologicas. Por tanto: ΔGredox + 50 < 0 ΔGredox < -50 kJ/mol - 2 x 96.5 x (EX-EY) < -50 (EX-EY) > 0.26 voltios es decir, 50 kJ/mol de energia de hidrolisis del ATP en condiciones fisiologicas equivale a un trabajo electrico de dos cargas contra 0.26 voltios de diferencia de potencial (0.52 electron-voltios, e x V). Aunque este valor corresponda a la diferencia entre Eo' de dos pares red-ox que se acoplan a la sintesis de ATP, hay que indicar que esta situacion

corresponde a condiciones standard, es decir, concentraciones 1 M o, lo que es equivalente porque anula el logaritmo, igualdad de concentraciones de los dos miembros del par red-ox. El potencial de un par puede alterarse si las concentraciones son distintas segun la ecuacion: E' = Eo' + (0.06/n) log ([X]/[Xn-]) Asumiendo que n = 2 y que el cociente de concentraciones puede alterarse en condiciones fisiologicas por un factor de hasta 103, tenemos un desplazamineto posible respecto a Eo' de 0.09 V. Por tanto es posible sintetizar ATP con una reaccion red-ox en donde dos electrones sean transferidos entre dos pares red-ox que difieran en al menos 0.17 V. Esto se podria expresar como 0.34 e x V. Como en la fosforilacion a nivel de sustrato es el piridin nucleotido NAD+ el que participa como aceptor de electrones (Eo = -0.32), el par red-ox del intermediario metabólico debe tener Eo < -0.5 V para poder acoplar la reaccion red-ox a sintesis de ATP. Esto nos indica que solamente la oxidacion de aldehidos puede acoplarse a la sintesis de ATP pues el par R-COOH/R-CHO es el unico que alcanza valores suficientemente bajos de Eo' (alrededor de -0.6 V). De hecho, la reaccion basica de transformacion de energia durante la glucolisis es: R-CHO + NAD+ + ADP + Pi ---> R-COOH + NADH + ATP El mecanismo de este acoplamiento se basa en que la enzima que cataliza la oxido-reduccion, la gliceraldehido-3-P deshidrogenesa, no substituye el hidruro (H-) del aldehido (nucleofilo saliente) por HO- (lo que supondria una reaccion desacoplada) sino por fosfato como nucleofilo entrante, formando acil-fosfato, que posteriormente forma ATP: R-CO-H + NAD+ + PO4H2- ---> R-CO-OPO32- + NADH R-CO-OPO32- + ADP ---> R-CO-OH + ATP Por tanto el par red-ox que interviene en la oxidoreduccion no es (3-P-glicerato/3-P-gliceraldehido) con Eo' = -0.54 V sino el par (1,3-di P-glicerato/3-P-gliceraldehido + Pi), cuyo Eo' es mucho mayor, -0.26 V. Ello se debe a que la reaccion de reduccion que determina el valor de Eo' va acompañada de la

hidrolisis de un acil-fosfato que libera 55 kJ/mol (tabla 14.2). Esto supone para una reaccion red-ox con n = 2, 0.28 voltios de más (55/ 2 x 96.5), es decir, de mayor tendencia a la reduccion. Por tanto Eo' = -0.54 + 0.28 = -0.26 V. El par (1,3-di P-glicerato/3-P-gliceraldehido + Pi) es un ejemplo de par red-ox con una forma energizada, concepto desarrollado por el profesor español Manuel Losada, de la Universidad de Sevilla. Al estar energizada la forma oxidada (por el enlace acil-fosfato), el par se hace mas oxidante, es decir, el Eo' aumenta, ya que la reduccion va acompañada de la hidrolisis de acil-P. Otro ejemplo es el par (acetil-SCoA/acetaldehido + CoA-SH), con la forma oxidada energizada por el enlace acil-SCoA y con Eo' = -0.42 V. La version no-energizada de este par es el (acetico/acetaldehido), con Eo' = -0.60 V. La ΔGo' de hidrolisis del acetil-SCoA es -35 kJ/mol (tabla 14.3), que equivale a 0.18 V (35/ 2 x 96.5). En el caso del par (adeninafosfosulfato o AMP-sulfato/sulfito + AMP), la forma energizada del aceptor de electrones contiene un enlace fosfosulfato muy rico energia de hidrolisis. Los 75 kJ/mol desprendidos en la hidrolisis hacen al AMP-sulfato mucho mas oxidante, aumentando el Eo' del sulfato libre (-0.46 V) en 0.39 V ( 75 /2 x 96.5), resultando un Eo' = -0.07. Un ejemplo muy importante de par red-ox con un componente energizado es el de las dos clorofilas especiales de los centros de reaccion de la fotosintesis, aunque en este caso la energizacion no es por formacion de un enlace covalente sino por excitacion electronica. Como se indica en la tabla 9.2, la forma reducida de este sistema puede estar energizada por absorcion de un foton de luz, que eleva a uno de los electrones en resonancia de los anillos planos a un nivel excitado de mayor poder reductor. El cambio en Eo' en el fotosistema I (abreviado como PS I, con el grupo prostetico de las clorofilas especiales denominado P680) es desde +1.0 V en la forma no excitada hasta -0.8 V en la forma excitada por absorcion de un foton (1.8 V de disminucion). En el fotosistema II (abreviado como PS II, con el grupo prostetico de las clorofilas especiales denominado P700) el cambio es desde +0.4 hasta -1.2 V (1.6 V de disminucion). Para 1 electron esto supone ΔGo' = 1 x 96.5 x 1.8 = 174 kJ/mol para PS II (P680) y ΔGo' = 1 x 96.5 x 1.6 = 154 kJ/mol para PS I (P700). La energia en kJ de un mol de fotones de luz viene dada por el cociente (120/λ en µm). Para el rango de λ que llega a la superficie terrestre (320 - 1100 nm), esto supone de 110 a 375 kJ/mol. Es decir, no todo el espectro de luz que llega a la biosfera tiene energia suficiente para hacer la fotosintesis. Como es de esperar, la luz absorbida por los centros de reaccion (maximos de absorcion a 680 y 700 nm en los dos fotosistemas) tiene energia suficiente para el cambio de potencial de

reduccion de la clorofila (176 y 171 kJ/mol para P680 y P700, respectivamente). Los detalles de las reacciones fotosinteticas que permiten la oxidacion del agua y la reduccion de la ferredoxina se estudiaran mas adelante. Basta por ahora con el analisis de la suficiencia termodinamica de los procesos. En la fosforilación a nivel de membrana, las coenzimas aceptoras de los electrones pueden ser la quinona (Eo' = +0.05 V) y el citocromo c (Eo' = +0.25 V) en la mitocondria y la quinona y la plastocianina (Eo' = +0.4 V) en los cloroplastos. En la respiración mitocondrial los donadores de electrones para la ubiquinona pueden ser el NADH (Eo' = -0.32 V; salto de 0.37 V; energia de 0.74 e x V) y otras moleculas organicas que no pueden reducir al NAD+, como los enlaces saturados carbono-carbono (R2C=CR2/R2CH-CHR2; Eo' = 0 V; salto de 0.1 e x V). Es de destacar que solamente en el primer caso (NADH + UQ ---> NAD+ + UQH2) el salto de potencial es suficiente para sintetizar ATP (sitio I de la fosforilacion oxidativa). La oxidacion en membranas de enlaces saturados C-C por la ubiquinona no tiene suficiente salto de potencial para sintetizar ATP pero es la unica forma de realizar estas reacciones ya que el NAD+ de la fase soluble no tiene Eo' suficientemente positivo. El caso de la oxidacion de alcoholes ( Eo' = -0.2 V) es ambiguo, porque: a) pueden oxidarse, aunque con dificultad, por el NAD+, ya que la diferencia de Eo' (0.12 V en contra de la oxidacion de alcoholes) roza el limite que señalábamos para reacciones fisiologicamente reversibles. Es decir, eliminando metabolicamente el carbonilo producido en la oxidacion del alcohol se puede desplazar el equilibrio algo desfavorable y conseguir que en una ruta metabolica un alcohol sea oxidado por NAD+. Un ejemplo de esta reversibilidad nos lo proporciona la produccion de alcohol por la levadura en condiciones anaerobias (durante la fermentacion), en donde el acetaldehido es reducido por NADH segun la direccion mas favorable de la reaccion. Durante la utilizacion de alcohol por la levadura en condiciones aerobias (por ejemplo, durante el envejecimiento de ciertos vinos como los de Jerez y Montilla), en donde el alcohol se oxida por NAD+, el equilibrio desfavorable es vencido por la oxidacion metabolica de los productos de reaccion, acetaldehido y NADH. b) en algunos casos, la oxidacion de alcoholes se acopla a la ubiquinona mitocondrial para hacer mas favorable la reacion. Aunque el salto de potencial es grande (0.25 V y 2 e-, es decir, 0.5 e x V), normalmente no se acopla a la sintesis de ATP. El citocromo c resulta reducido normalmente por la ubiquinona, con un salto de potencial de 0.20 V (0.4 e x V), justo lo suficiente para acoplarse a la

sintesis de ATP (sitio II de la fosforilacion oxidativa). Finalmente, el citocromo c reducido es oxidado por el oxigeno, con un enorme salto de potencial (0.57 V; 1.14 e x V por dos electrones o un atomo de oxigeno). Esta reaccion constituye el sitio III de la fosforilacion oxidativa y es la mas irreversible y la que controla la respiracion. El esquema del movimiento de los electrones entre coenzimas libres durante la respiracion seria: I II III NADH ---> Q ---> cit c ---> O2 Las reacciones entre estas tres coenzimas libres estarian catalizadas por tres complejos enzimaticos (I, II y III) que contienen multiples coenzimas que actuan como grupos prosteticos red-ox. Estas tres reacciones estan acopladas a sintesis de ATP. El estudio de estas enzimas complejas se hara en el capitulo de respiracion. De nuevo nos detenemos aqui en el analisis de la suficiencia termodinamica de los procesos. En la "fosforilacion a nivel de sustrato" de la glucolisis, el aldehido que se oxida forma un acil-fosfato que conserva la energia red-ox en energia de hidrolisis. El sustrato de la reaccion por tanto participa en la conservacion inicial de energia. Posteriormente, este acil-fosfato transfiere su fosforilo "activado" al ADP para sintetizar ATP. Las transformacion de energia luminosa y red-ox en ATP durante la fotosintesis y la respiracion no ocurren mediante derivados activados de los sustratos. En estos casos no hay intermediarios químicos sino fisicos: la energia osmótica y electrica constituida por el gradiente electroquimico de protones. En la fotosintesis la energia luminosa se convierte en red-ox para permitir a la clorofila actuar como un potente reductor en su forma excitada ( Eo' = -0.8 V en el P680* y Eo' = -1.2 V en el P700*) y un potente oxidante (Eo' = +1.0 V en el P680 y Eo' = +0.4 V en el P700). El esquema red-ox de la fotosintesis es: PS II PS I H2O -----> Q ---> PC -----> Fd ---> NADPH En donde el donador inicial de electrones es el agua, que reduce secuencialmente a las tres coenzimas libres, Q y PC en la membrana y Fd y NADPH en fase soluble. El fotosistema II (PS II, P680) cataliza la reaccion entre H2O (Eo' = +0.82 V) y la quinona cloroplastica (Q, plastoquinona; Eo' = +0.05 V). El salto desfavorable de potencial (0.77 V) se compensa con la energizacion por la luz del P680 (1.8 V), resultando un salto global favorable de aproximadamente 1 V, que se acopla a

sintesis de ATP. La reaccion cloroplastica entre la quinona y la plastocianina es equivalente a la reaccion mitocondrial entre quinona y citocromo c catalizada por el complejo respiratorio II. Tiene un salto favorable de potencial de 0.35 V y se acopla a sintesis de ATP. Finalmente, la reaccion entre PC y Fd tiene un salto desfavorable de 0.8 V que se compensa con la energizacion por la luz de P700 (1.6 V), resultando un salto global favorable de 0.8 V que se acopla de nuevo a sintesis de ATP. Esta energia red-ox de la fotosintesis cloroplástica, al igual que la de la respiracion mitocondrial, se convierte en último término en gradiente (diferencia de concentracion) de protones a traves de las membranas. Para ello se acoplan las reacciones red-ox al transporte de protones de un lado al otro de la membrana segun un mecanismo que escapa del contenido de estos apuntes. Lo importante ahora es establecer las relaciones termodinamicas entre la energia red-ox, la energia del gradiente de protones y la energia del ATP. El gradiente electroquimico de protones tiene dos componentes: la diferencia de concentracion (trabajo osmotico o de dilucion) y la diferencia de potencial electrico entre un lado y otro de la membrana (trabajo electrico). Por cada proton que se transporta de un lado a otro de la membrana estos trabajos tienen la siguiente expresion: Energia del gradiente de protones (kJ/mol) = ΔGdil + ΔGel = 5.7 log ([H+]2/[H+]1) + 96.5 ΔE = -5.7ΔpH2-1 + 96.5 ΔE2-1 El signo menos en el termino de pH se debe a que el gradiente de protones es tanto mayor cuanto mayor es la concentracion de protones (opuesta al pH) y cuanto mas positivo es el potencial electrico en el lado externo de la mitocondria o en el lado interno de los tilacoides mitocondriales (lado 2) respecto al interior de la mitocondria o el exterior de los tilacoides (lado 1). En la mitocondria energizada durante la respiracion ΔE = 0.21 V (positivo fuera respecto a dentro) y no hay apenas diferencia de pH entre el interior y exterior. Por tanto la energia del gradiente de protones es fundamentalmente electrica y equivales a unos 20 kJ/mol. En los tilacoides de cloroplastos energizados durante la fotosintesis, no hay apenas diferencia de potencial electrico pero hay una diferencia de pH de unas 3.5 unidades (ácido dentro de los tilacoides). Esto supone una energia del gradiente de protones de unos 20 kJ/mol, similar al de la mitocondria. En ambos casos hace falta acoplar el movimiento de tres protones a favor de gradiente (liberando 3 x 20 = 60 kJ/mol) para sintetizar una molecula de ATP (que requiere al menos 50 kJ/mol).

Estos procesos de acoplamiento energetico entre reacciones red-ox y sintesis de ATP se pueden eliminar sin inhibir las reacciones red-ox mediante unos compuestos llamados "desacopladores". El más general de todos es el arseniato (Asi, AsO4H2-), que reemplaza al Pi en la reaccion de síntesis de ATP y da lugar a un producto (ADP-arseniato) que es inestable quimicamente y se hidroliza espontaneamente a ADP y arseniato. El desacoplamiento procede segun el esquema siguiente: Reaccion red-ox ---> energia libre ---> sintesis ADP-Asi ---> hidrolisis espontanea ---> perdida energia como calor El arseniato desacopla tanto la fosforilacion a nivel de substrato como a nivel de membrana. Otro tipo de desacoplador como el dinitrofenol es específico de la fosforilacion a nivel de membrana. Estos desacopladores hacen las membranas permeables para los protones por lo que la energia red-ox no puede conservarse como gradiente de protones y se pierde como calor: Reaccion red-ox ---> energia libre ---> gradiente de protones ---> permeabilidad a protones ---> disipacion del gradiente de protones ---> perdida de energia como calor Los desacopladores de membrana son acidos debiles hidrofobicos que son solubles en la fase lipidica de la membrana en sus formas no disociada y disociada (anionica). Cruzan la membrana en su forma no disociada transportando un proton, se disocian y sueltan el proton y la forma disociada (cargada negativamente) vuelve al otro lado a iniciar el ciclo: A- + H+ ---> AH ---------------->AH ---> A- + H+ | | A- <------------------|---------------- A- membrana El movimiento de la forma protonada deshace la diferencia de pH mientras que el movimiento de la forma disociada anionica deshace la diferencia de potencial electrico.

9.11. Historia evolutiva de la Bioenergética La vida necesita poder reductor: donadores de electrones o hidrogenos que permitan durante su oxidacion sintetizar ATP y reducir precursores metabolicos oxidados. Las oxidoreducciones son la fuente exclusiva de energia para realizar todos los trabajos biologicos. Con respecto al estado de reduccion del carbono, podemos establecer los siguientes niveles de más oxidado a más reducido: CO2 >>> ac. nucleicos > azúcares > proteinas >>> lípidos Es decir, la asimilación del CO2 y la biosintesis de lípidos son los procesos que mayores necesidades de poder reductor plantean,. siendo pequeñas las diferencias de estado red-ox de los otros componentes celulares. Las células primitivas tenian un metabolismo heterotrofo, basado en la utilizacion de compuestos orgánicos preformados durante la fase de sintesis química prebiotica. Los azúcares desempeñaron un papel fundamental en el metabolismo energético. La sintesis prebiotica de azucares probablemente siguio el camino siguiente: a) formacion de formaldehido por reaccion entre hidrogeno y anhidrido carbonico: H2 + CO2 ---> CH2O + H2O b) polimerizacion del formaldehido por adicion al doble enlace C=O: CH2=O + H-CHO ---> CH2OH-CHO Las primeras reacciones que generaron energia biologica fueron las oxidaciones de aldehidos (Eo' = -0.6 V) mediante reduccion de otros aldehidos o cetonas (Eo' = -0.2 V). Esta es la base de la ruta glucolitica actual, probablemente la ruta metabolica más primitiva de los seres vivos. Se trata de reacciones que ocurren en la fase soluble de las celulas y que plantearon un problema para la estabilidad de las macromoléculas celulares: la acumulacion de acidos carboxilicos derivados de la oxidacion de los aldehidos. La membrana lipídica que rodea a las células establece una barrera de permeabilidad y el pH intracelular, sino se eliminaban de alguna manera estos acidos, alcanzaria valores demasiado bajos. La descarboxilacion convierte acidos carboxilicos fuertes (pKa alrededor de 4) en acido carbonico mas debil (pKa = 6.3) y debio ayudar a evitar acidificacion excesiva. Pero la solucion final evolutiva fue el desarrollo de ATPasas bombeadoras de protones, maquinarias formadas por proteinas de membrana que utilizaban la energia de hidrolisis del ATP para expulsar el exceso de protones de las células. Tambien debieron desarrollarse en paralelo enzimas red-ox de

membrana que utilizan la energia de oxidoreduccion para expulsar protones de las celulas. La presencia en una misma membrana de dos tipos de bombas de protones, ATPasas y oxidoreductasas, permitio el acoplamineto entre ambas desarrollandose la fosforilacion oxidativa: Bombas de protones independientes: Oxidoreductasa de membrana ---> gradiente de protones ATPasa de membrana ---> gradiente de protones Acoplamiento para fosforilacion oxidativa a nivel de membrana: Oxidoreductasas ---> gradiente de protones ---> reversion de la ATPasa para sintesis de ATP La base de este acoplamiento esta en que las bombas red-ox tienen mas energia, bombean los protones con mas fuerza, que las ATPasas y forman un gradiente que fuerzan a estas a invertir su direccion,, sintetizando ATP. Las oxidoreductasas primitivas utilizaban donadores y aceptores de electrones organicos, que se fueron agotando por la rapida proliferacion de las celulas vivas. Un desarrollo que permitio ahorrar materia organica fue la aparicion de la respiracion anaerobia (en la atmosfera primitiva no habia oxigeno) con compuestos inorganicos como aceptores de electrones. Los mejores oxidantes inorgánicos distintos al oxigeno (tabla 9.1) son el hierro (Fe3+/Fe2+; Eo' = +0.77 V; problema de poca solubilidad), los nitratos (NO3-/NO2-; Eo' = +0.42 V) y los nitritos (NO2-/NH4+; Eo' = +0.33 V o NO2-/N2; Eo' = +0.94 V). Estos dos ultimos son los aceptores finales utilizados en la actualidad por las bacterias desnitrificantes del suelo, que terminan por convertir nitratos y nitritos en nitrogeno libre que se pierde a la atmosfera. Este es el origen biologico del nitrogeno atmosferico. El otro componente mayoritario de la atmosfera, el oxigeno, tambien es de origen biologico como luego veremos. El ahorro definitivo de materia organica se consiguio con la aparicion de organismos "quimiolitotrofos", que pueden vivir exclusivamente con materia inorganica. La energia la obtienen de oxidoreducciones totalmente inorganicas, respiracion anaerobia en que los aceptores son nitratos y nitritos (ver Eo' arriba y en tabla 9.1) y los donadores son sulfitos (el mejor reductor inorganico; SO42-

/SO32-; Eo' = -0.46 V), sulfhidrico (SO32-/SH2; Eo' = -0.12 V o S/SH2; Eo' = -0.2 V) y amoniaco (N2/2 NH4+; Eo' = -0.28 V). Estas reacciones proporcionan energia y poder reductor para convertir el CO2 en materia organica. Sin embargo los quimiolitotrofos dependen de compuestos inorganicos que no son abundantes

y las posibilidades de la vida en estas condiciones eran muy limitadas. Tras unos cien millones de años de historia de la vida sobre nuestro planeta surje ya la solucion definitiva: la fotosintesis. La fotosintesis originaria pudo parecerse a la de las actuales bacterias verdes del azufre: utilizan la energia luminosa para oxidar el SH2 (S/SH2; Eo' = -0.2 V) con ferredoxina (Eo' = -0.4 V). Es un pequeño salto de 0.2 V facilmente realizable con un cuanto de luz. Permitia utilizar un reductor debil, pero tampoco muy abundante. El desarrollo definitivo fue la aparicion de la capacidad de oxidar el agua (Eo' = +0.82 V) por la ferredoxina: un salto de potencial de 1.2 V pero que una vez superado gracias a la energia luminosa permitia acceder a una fuente inagotable de poder reductor como el agua. La enzima que cataliza la oxidacion del agua tiene manganeso como grupo prostético y esta acoplada al fotosistema II de los cloroplastos. La fotosintesis dio lugar en unos mil millones de años a la aparicion de altas concentraciones de oxigeno en la atmosfera, lo que trajo un problema pero tambien una ventaja El problema fue el estrés oxidativo que se discute en la seccion 9.5. La ventaja fue hacer posible la respiracion aerobia, pues dado el enorme poder oxidante del oxigeno cualquier compuesto organico o inorganico podia ahora oxidarse para extraer energia. Preguntas y problemas con respuestas Explíquese por qué la hidrólisis de la glucosa-1-P es más exoergónica que la de glucosa-6-P (ΔGo' -21 y -14 kJ/mol) Solución Los fosfoglicósidos como la glucosa-1-fosfato son un poco más inestables que los ésteres fosfóricos de alcoholes como la glucosa-6-fosfato por la mayor electronegatividad del carbono unido al oxígeno puente con el fosfato. Un organismo sintetiza enormes cantidades de ATP cada minuto pero su contenido en este nucleotido no experimenta apenas cambios. ¿Como se explica este hecho?. Solución Aunque el ATP en las células se está sintetizando continuamente por condensación de ADP y Pi acoplada a procesos que desprenden energía, también se está utilizando continuamente ATP mediante hidrólisis acoplada a distinto trabajos. Por ello su concentración celular apenas sufre cambios.

Las energias libres de hidrolisis en condiciones standard del fosfoenolpiruvato, acetil-P, ATP y glucosa-6-P son: -62, -48, -28 y -14 kJ/mol, respectivamente. Predecir si las siguientes reacciones ocurriran en la direccion indicada en condiciones standard de los reaccionantes y calcular el cambio de energia libre en la direccion indicada: a) ATP + acetato --> ADP + Acetil-P b) ADP + fosfoenolpiruvato --> ATP + piruvato c) Glucosa-6-P + ADP --> Glucosa + ATP d) fosfoenolpiruvato + glucosa --> piruvato + glucosa-6-P Solución La reacción de transferencia debe descomponerse en dos reacciones aditivas: la hidrólisis del donador de fosfato y la condensación del aceptor (inversa de la hidrólisis y con ΔGo' de signo opuesto), resultando: a) ΔGo' = -28 + 48 = + 20 kJ/mol; al ser positivo la reacción ocurrirá en la direccion opuesta a la indicada b) ΔGo' = +28 - 62 = - 34 kJ/mol; al ser negativo la reacción ocurrirá en la dirección indicada c) ΔGo' = -14 + 28 = + 14; al ser positivo la reacción ocurrirá en la direccion opuesta a la indicada d) ΔGo' = -62 + 14 = -48; al ser negativo la reacción ocurrirá en la dirección indicada Calcular la magnitud del trabajo osmótico y eléctrico que pueden realizar los sistemas quimiosmóticos celulares que utilizan la hidrólisis de ATP con unos valores de ΔG' en condiciones fisiológicas de unos -52 kJ/mol y asumiendo que mueven 1, 2 o 3 protones por cada ATP hidrolizado. Solución El trabajo osmótico o de dilución viene dado por la expresión: ΔG = n x 5.7 log (c2/c1) siendo c2 y c1 las concentraciones de un soluto bombeado de un lado 1 a otro lado 2 de la membrana y "n" la estequiometria o numero de moleculas de soluto transportado por cada ATP hidrolizado. Los 52 kJ/mol desprendidos por la hidrólisis de ATP en condiciones fisiológicas pueden acoplarse a la creación de una diferencia de concentración correspondiente a (c2/c1) = 109.1 = 1.25 X 109 si toda la energia del ATP se emplease en mover un solo proton (n = 1). Si mueve dos protones (n = 2), a cada uno le tocarían solamente 26 kJ y entonces (c2/c1) = 104.6 = 4 X 104. Si el sistema transporta tres

protones (n = 3) por cada ATP hidrolizado, cada uno tendria solamente 17.3 kJ/mol y el gradiente seria (c2/c1) = 103. Si en lugar de trabajo osmótico (diferencia de concentraciones a ambos lados de una membrana) se realizase trabajo eléctrico (movimiento de una carga como el proton a través de una membrana que tiene una diferencia de potencial eléctrico) la expresión sería: ΔG = n x F x ΔE siendo F = 96.5 kC/mol y ΔE la diferencia de potencial electrico en voltios (V) a traves de la membrana. Para n = 1, la hidrólisis de ATP puede generar un ΔE = 0.54 V, para n=2 seria 0.27 V y para n = 3 solamente 0.18 V. Expliquese en términos termodinámicos por qué la adición de un alcohol a un aldehido es reversible (ΔGo' = 0) si los grupos reaccionantes están en moleculas distintas y sin embargo es practicamente irreversible (ΔGo' << 0) si se trata de grupos de una misma molécula que al reaccionar forman un anillo estable. Solución La adición al enlace C=O de un aldehido tiene ΔS < 0 porque dos moleculas reaccionantes dan lugar a una sola de producto, perdiendose practicamente toda la entropia de traslacion de una molecula. Como ΔGo' = ΔH - TΔSo', la pérdida de entalpía (ΔH < 0) por formarse enlaces más estables tras la adición queda compensada por la pérdida de entropia y ΔGo' es próxima a cero. Sin embargo, si el grupo alcoholico que se adiciona está en la misma molecula que el grupo aldehido, se pierde mucha menos entropia tras la adicion porque una molecula de sustrato da lugar a una molecula de producto. Solamente se pierde entropia por el mayor ordenamiento del anillo resultante, pero esta perdida es menor que cuando dos moleculas forman una sola. ¿Cuales son las coenzimas portadoras de grupos metilo en el metabolismo? Solución Hay dos, la S-adenosilmetionina y el N5-metil-tetrahidrofolato. El primero tiene mayor potencial de transferencia del grupo metilo que el segundo y es el donador más general en el metabolismo. 8.7..7 ¿Por qué la carboxibiotina no es una coenzima libre sino que actua como grupo prostético sin abandonar el centro activo de las enzimas? Solución Las formas activadas del carboxilo tales como el carbonilfosfato o la carboxibiotina son muy inestables químicamente y por tanto solo se generan transitoriamente en el centro

activo de las enzimas. Si difundieran por el medio celular se descompondrian dando CO2 antes de encontrar las enzimas que los hubieran de utilizar y se perderia la energia empleada en generarlos.

Los potenciales de reduccion (Eo') de los pares red-ox nitrato/nitrito (+0.42 V), nitrito/amonio (+0.33 V), sulfato/sulfito (-0.46 V), sulfito/sulfuro (-0.12 V) y NADP+/NADPH (-0.32 V). Predecir si el NADPH puede reducir las formas oxidadas del nitrogeno y del azufre durante el metabolismo. Solucion El potencial de reduccion Eo' mide la tendencia a reducirse (ganar electrones) de un par red-ox. Tanto el nitrato como el nitrito tienen un Eo' mucho mayor que el NADPH, por lo que pueden ser reducidos directamente en reacciones termodinamicamente favorables. Lo mismo pasa con el syulfito, cuyo Eo' = -0.12 es más positivo que el Eo' = -0.32 del NADPH, por lo que es termodinamicamente favorable la reduccion de sulfito con NADPH. Sin embargo el sulfato tiene un Eo' = -0.46 mas negativo que el del NADPH, por lo que no es termodinamicamente posible reducir sulfato con NADP Aunque el potencial de reduccion del sulfato a sulfito es mas negativo que el del NADP+/NADPH, las celulas consiguen reducir sulfato con esta coenzima red-ox. ¿Cual es el mecanismo de acoplamiento energetico? Solucion La forma oxidada del par, el sulfato, se convierte en adenosinafosfosulfato, con un enlace fosfosulfato altamente energetico. De esta forma el sulfato se hace mucho mas oxidante (mayor Eo' ) ya que su reduccion va acompañada de hidrolisis del enlace fosfosulfato. Esto supone un gasto de dos enlaces pirofosfato del ATP: ATP + sulfato ---> adenosinafosfosulfato + 2 Pi adenosinafosfosulfato + NADPH ---> sulfito + AMP Reaccion global: ATP + sulfato + NADPH ---> AMP + 2 Pi + sulfito + NADP+ Los dos enlaces pirofosfato del ATP suponen 45 kJ/mol de enegia libre y equivalen a 0.23 V para una transferencia de 2 electrones. El Eo' efectivo del sulfato disminuye desde -0.46 hasta -0.23, mas positivo que los -0.32 V del NADPH. El mas reductor de los pares red-ox inorganicos es el sulfato/sulfito con Eo' = -0.46 V. En el caso de pares red-ox organicos tenemos como los mas reductores el par carbonilo/alcohol con Eo' = -0.2 V y el par aldehido/carboxilato con Eo' = -0.6 V. ¿Cuales de estas reacciones podrian ser utilizadas para procesos de

fosforilacion a nivel de sustrato con NAD+ como aceptor de electrones (Eo' = -0.32 V)? ¿Cuales podrian acoplarse a sintesis de ATP mediante respiracion con oxigeno como aceptor (Eo' = +0.82 V)? Solucion Se trata de reacciones de dos electrones que precisan un salto de potencial de al menos 0.17 V para acoplarse a sintesis de ATP Por ello solamente la oxidacion por NAD+ de aldehidos a carboxilatos (salto de potencial de 0.3 V) es utilizada en reacciones de fosforilacion a nivel de sustrato. Sin embargo, en el caso de respiracion con oxigeno como aceptor todos estos pares red-ox proporcionan un salto de potencial suficiente para acoplarse a sintesis de ATP: oxidacion de sulfito (salto de 1.28 V), oxidacion de alcoholes (salto de 1.02 V) y oxidacion de aldehidos (salto de 1.4 V). La gran ventaja energetica del oxigeno como aceptor de electrones queda de manifiesto por la magnitud de los saltos de potencial. ¿Por qué el arseniato desacopla totalmente la sintesis de ATP de una celula pero el dinitrofenol solo parcialmente? Solución El arseniato sustituye al Pi formando ADP-arseniato inestable y esto interfiere tanto con la fosforilacion a nivel de sustrato como a nivel de membrana. El dinitrofenol destruye el gradiente de protones en membranas y desacopla la fosforilacion a nivel de membranas pero no la fosforilacion a nivel de sustrato. ¿En qué se parecen y en que se diferencian, estructural y funcionalmente, las clorifilas y los grupos hemo? Solucion Todas son porfirinas con cuatro anillos de pirrol unidos y un metal complejado en el centro. En los grupos hemo el metal es Fe3+/Fe2+ y en las clorofilas es Mg2+. La gran cantidad de dobles enlaces conjugados (nube de electrones π en resonancia) hace que las porfirinas sea coloreadas por absorber luz visible. Las clorofilas son verdes y los citocromos rojizos. Los grupos hemo participan como coenzimas red-ox con su hierro aceptando y donando electrones. El magnesio de las clorofilas no es activo en reacciones red-ox. En el par especial de clorofilas de los centros de reaccion fotosinteticos, un electron de la nube de electrones π en resonancia puede ser excitado por la luz y convertirse en potente reductor. El radical cation de clorofila resultante es un potente oxidante. ¿Por qué la aparicion del oxigeno en el curso de la evolucion planteó ventajas pero tambien inconvenientes? ¿Como se resolvieron estos ultimos? Solucion

La ventaja fue su gran poder oxidante (Eo' = +0.82 V), que permitia obtener enormes cantidades de energia libre mediante la oxidacion de compuestos organicos e inorganicos. El invonveniente fue la aparicion del estrés oxidativo en forma radicales libres que destruian las moleculas organicas. Las celulas que sobrevivieron a este problema desarrollaron defensas antioxidantes contra los radicales libres, fundamente las vitaminas E y C, asi como enzimas que destruyen las formas activadas del oxigeno (superoxido dismutasa, catalasa, peroxidasas). Una flavina libre tiene Eo' = -0.2 pero cuando está unida a una enzima formando un grupo prostético el valor de Eo' puede variar desde -0.5 a +0.2 V. Explíquese como la union a una proteina puede variar el Eo'. Solución Si una flavina está unida a una proteina, puede haber una diferencia en la fuerza de unión de las formas oxidadas y reducidas. Si la forma reducida está más fuertemente unida, el Eo' aumentara y si la forma oxidada está más fuertemente unida el Eo' disminuirá. El rango de Eo' encontrado en las flavinas de distintos enzimas supone un cambio de Eo' respecto a flavina libre de hasta 0.3 V. Para 2 electrones esto supone una energia libre de 2 x 96.5 x 0.3 = 57.9 kJ/mol, es decir, que la forma oxidada o reducida está unida a la proteina con una energia 57.9 kJ/mol más fuerte que la otra forma. En términos de constante de disociación esto supone un factor de (57.9/5.7 = 10.1) unos 1010. Bibliografía Angel M. Relimpio, Jose M. Vega, Miguel G. Guerrero y Manuel Losada "Potenciometria y Bioenergética" Publicaciones de la Universidad de Sevilla (ISBN 84-7405-077-4), 1977. Esta obra del grupo del Profesor Losada expone con gran claridad los conceptos de potencial de reduccion y acoplamiento energetico, desarrollando la idea de pares red-ox con un componente energetizado.

Figura 9.1 . Esquema del sistema experimental utilizado para definir potenciales de reducción. A la izquierda está el electrodo normal de hidrógeno (intercambia electrones con el par 2 H+/H2; H2 a 1 atmósfera de presión y [H+] = 1 M) y a la derecha un electrodo que intercambia electrones con el par X/Xn-. Un cable conductor lleva los electrones y un puente salino (solucion salina en gel de agar) permite el paso de iones para balance electrico. La tendencia a moverse los electrones por el cable y a generar un potencial electrico (positivo el considerar el potencial del electrodo derecho menos el del izquierdo) es debida a la ΔG de la reaccion: (n/2) H2 (1 atm) + X ---> n H+ (1 M) + Xn- (EX > 0; ΔG < 0) Utilizando un generador de voltaje se frena el paso de electrones cuando el generador crea un potencial igual y opuesto al máximo que es capaz de desarrollar el sistema red-ox. En estas condiciones se consigue reversibilidad termodinámica, ya que la fuerza que se le opone al sistema es idéntica a la que desarrolla éste. Por tanto se consigue el máximo trabajo útil eléctrico (n x F x E) que será igual a la disminución de energia libre (-ΔG), si bien los electrones se moverán infinitamente lentos. Figura 9 .2 . Estructura de algunas coenzimas de oxido-reduccion. La parte activa en oxidoreduccion de la molécula se destaca en sus dos formas oxidada y reducida. A. Coenzimas libres: NAD(P), ubiquinona, citocromo c, plastocianina, ferredoxina, glutation y tioredoxina B. Coenzimas que son grupos prosteticos de enzimas red-ox (entre parentesis): FAD y FMN (flavoproteinas), ácido lipoico (descarboxilacion oxidativa de α-cetoácidos), clorofilas (centros de reaccion fotosintéticos), hemos (citocromos) y cobre (citocromo c oxidasa) Figura 9.3 . Esquema del estrés oxidativo celular y de las defensas antioxidantes. En en centro aparecen los radicales libres que destruyen las biomoléculas, arriba los procesos por los que el oxígeno da lugar a estos radicales, fundamentalmente

a partir del radical hidroxilo. Algunos intermediarios como el superoxido y el agua oxigenada son eliminados por enzimas antioxidantes (superoxido dismutasa, catalasa y ascorbato peroxidasa); parte mas alta). Los radicales son reducidos por las vitaminas E (tocoferol, fase membrana) y C (ascorbato, fase soluble). En ultimo termino, los radicales estables de estas vitaminas antioxidantes son reducidos por glutation y NADPH. Las flechas indican el flujo del poder oxidante, que termina en forma de NAP+ inocuo. Figura 9 .4 . Estructura de los principales antioxidantes biologicos y del BHT Las vitaminas C y E, la ubiquinona y el antioxidante sintético BHT, son donadores de átomos de hidrógeno para reducir radicales inestables de compuestos orgánicos y formar radicales estables del antioxidante mediante reacciones no enzimaticas. El glutation dona dos hidrogenos al dehidroascorbato y a puentes disulfuro de proteinas en diversas reacciones enzimaticas.