biotecnologia

BIOTECNOLOGÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOFACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Chacaltana Lozano Carlo

Biotecnología

A. H. Scragg

La federación Europea de Biotecnología definió a la biotecnología como “el uso integrado

de la ingeniería, la bioquímica y la microbiología para conseguir la aplicación tecnológica

(industrial) de la capacidad de los microorganismos, células de tejido cultivado y sus

partes”. En resumen la biotecnología es la aplicación de agentes biológicos ya sea en la

industria manufacturera o en operaciones de servicio. El termino biotecnología puede

significar que se trata de una disciplina individual, pero la esencia de la biotecnología en su

naturaleza multidisciplinaria, la cual requiere amplias aportaciones de la ciencia y la

ingeniería. Esto quizá se ilustre mejor en la figura 1.1 es debido a estos requerimientos

multidisciplinarios de la biotecnología que este libro, y el curso del cual se derivo, se

diseño para presentar el tema a los ingenieros quienes por lo general tienen muy poco

contacto con la biociencias. La terminología propia de cualquier materia puede ser

obstáculo para entenderla.

A menudo se piensa que la biotecnología consiste solo en la ingeniería genética y

anticuerpos monoclonales. Tener una definición tan simple sería un error puesto que ignora

la mayor parte de la biotecnología, incluyendo algunas de las áreas más exitosas.

En la tabla 1.1 se da una lista con ejemplos de algunos productos se la biotecnología.

En contradicción con la creencia popular, la biotecnología no es un tema de creación

reciente, sino que data de los sumerios y los egipcios, 6000 a 4000 años antes de Cristo.

La escala de tiempo en evolución de la biotecnología se ilustra bien en la tabla preparada

por Howink (1984), la tabla 1.2. la evolución de la biotecnología se puede dividir en cinco

eras.

1.1 LA ERA ANTERIOR A PASTER

Esta se basaba en los alimentos y bebidas fermentadas tradicionales sin ningún

conocimiento de biología. La producción de cerveza fue producida por los sumerios

hace aproximadamente 6000 años a. C. fueron los chinos quienes inventaron la

destilación en el año 14 d. C. para la producción de bebidas con alto contenido de

alcohol. El uso de levaduras para formar dióxido de carbono y, así, esponjar el pan, se

introdujo también en Egipto 4000años a. C. en esta época se crearon otros usos de los

microorganismos, en la formación del acido acético a partir del etanol (vinagre), la

elaboración de queso y yogurts. Sin embargo, no fue sino hasta el siglo XVII, que

Antonio van leeuwenhoek demostró por primera vez la presencia de microorganismos.

Tabla 1.1 Ejemplos de productos de diferentes categorías en la biotecnología (según

Cooney, 1983).

Masa celular Levadura de Baker, proteína celular.

Componentes celulares Proteínas intracelulares.

Productos biosintéticos Antibióticos, vitaminas, aminoácidos, ácidos orgánicos.

Productos catabólicos Etanol, metano y acido láctico.

Bioconversión Jarabe de maíz rico en fructosa, acido 6 amino penicilanico.

Tratamiento de

desechos

Lodo activado, digestión anaerobia.

Tabla 1.2 Biotecnología –calendario de eventos (según Houwink, 1984)

La era prepasteur, antes de 1985

Bebidas alcohólicas (cerveza y vino)

Productos lácteos (queso, yogurt)

Otros alimentos fermentados

La era de pasteur, 1865-1940

Etanol, butanol, acetona, glicerol

Ácidos orgánicos (acido cítrico)

Tratamiento aerobio de aguas residuales

La era de los antibióticos, 1940-1960

Penicilinas: tecnología de la fermentación sumergida

Gran variedad de antibióticos

Tecnología de la estructura de la célula animal, vacunas contra virus

Transformaciones microbiológicas de esteroides

La era post antibióticos, 1960-1975

Aminoácidos

Proteína celular (SCP)

Tecnología de las células y las enzimas inmovilizadas (glucosa isomerasa)

Tratamiento anaerobio de aguas de desecho (biogas)

Polisacáridos bacterianos (goma de xantán)

Gasohol

La era de la nueva biotecnología 1975-

Tecnología de los hibridosomas: anticuerpos monoclonales

Prueba diagnóstica con anticuerpos monoclonales (1980)

Ingeniería genética (1974)

Vacuna de origen animal contra la diarrea (1982)

Insulina humana (1982)

1.2 LA ERA PASTEUR

El trabajo de Pasteur mostro por primera vez que los microoranismos eran los agentes

activos en procesos como la producción de cerveza, vino y la descomposición de los

alimentos. A este trabajo lo secundaron escasos progresos en el estudio de los

microorganismos hasta el comienzo del siglo XIX, cuando se introdujeron los procesos

microbiológicos para la producción de acetona, butanol, glicerol y acido cítrico. Quizá

fue el descubrimiento de weizman, realizado en 1913-1915 en manchester, de un

proceso microbiológico para la producción de acetona y butanol por clostridium

acetobutylicum, el que anunció el comienzo real de la biotecnología. Este proceso solo

se optimizo en los años 50. Otro proceso importante creado en manchester fue el uso de

lodos activados para tratar aguas negras, el cual comenzó en 1914. La primera guerra

mundial impulso la producción microbiológica del glicerol a partir de la glucosa en

Alemania.

1.3 LA ERA DE LOS ANTIBIOTICOS

La investigación entre 1920 y 1940 gradualmente dio como resultado una mejor

comprensión de la biología, y se reconoció a las enzimas catalizan los procesos

biológicos. Así mismo, los estudios en genética introdujeron el concepto de que genes

individuales llevan información para formar enzimas particulares. Aunque Flemming

descubrió la penicilina en 1928, no fue sino hasta 1940 que los avances en su

aislamiento permitieron su producción en masa. Al principio la penicilina se produjo en

botellas, pero se aplicaron las tecnologías de los procesos químicos y de los alimentos,

las cuales permitieron que por primera vez el cultivo en gran escala de Penicillum en

fermentadores o birreactores. En la actualidad, cada año se producen unas 12 000

toneladas de penicilina. A la producción de penicilina le siguieron una amplia variedad

de antibióticos como la estreptomicina y la eritromicina.

1.4 LA ERA DE LOS POSTANTIBIOTICOS

Durante este periodo el reconocimiento del metabolismo microbiano permitió una

explotación mucho más amplia de las capacidades de una variedad de microorganismos.

Estos se usaron para producir las vitaminas B2 B12 y los aminoácidos lisina y acido

glutamico (glutamato monosodico), los últimos en volumen de 30 000 y 40 000

toneladas, respectivamente. Esta era también presencio la producción masiva de

enzimas para uso industrial, como la adición de las proteasas a los detergentes

domésticos y la transformación enzimática de la glucosa a fructosa para producir un

high-fructose syrup, HFS jarabe rico en fructosa.

En los inicio de los años sesenta se estuvo de acuerdo en que habría escases de

proteínas, en particular en los países de tercer mundo. Entonces, se buscaron otras

fuentes de proteínas; estas incluyeron microorganismos como algas, bacterias y

levaduras. En 1964 el profesor Wilson del instituto de tecnología de Massachusetts

(MIT) acuño la palabra single-cell protein, SCP “proteína celular” para denominar las

proteínas microbianas. Los microorganismos tienen la capacidad de crecer en una vasta

composición de compuestos. Estas fuentes se dividen en dos grupos principales,

renovables y no renovables. Los recursos renovables son mucho de los productos de

desechos agrícolas como el bagazo (residuo de la caña de azúcar), el almidón y la

celulosa. Muchas compañía grandes, participaron en la creación de estos procesos. La

mayoría de las investigaciones se enfoco al mejoramiento de estos desechos agrícolas

para producir alimentos para animales, pero una compañía, la Rank Hovis Mcdougall,

procedió a cultivar un moho para producir un alimento para humanos. Tuvieron que

pasar 20 años para asegurarse de que el producto conocido como microproteina fuese

apto para el consumo humano. Las fuentes no renovables investigadas para usarlas en la

producción de proteína celular fueron, principalmente, subproductos de la industria

petroquímica, como los alcanos, el metano o el metanol. De nuevo fueron las

compañías petroquímicas, quienes participaron en la investigación. La British

Petroleum (BP) investigo el uso de los alcanos en la obtención de proteína celular a

partir de levaduras (tropina), en tanto que las industrias Shell y la Imperial Chemical

Industries Lid (ICI), utilizaron metano y metanol respectivamente.

Solo el proceso ICI alcanzo una escala comercial con el cultivo de la bacteria

methilophilus methylotrophus en metanol, en un proceso continuo con un volumen de

1.5 millones de litros. El mejoramiento de este y otros procesos, condujera al avance

considerable en la tecnología de la fermentación. Sin embargo, la disponibilidad de

proteínas de soya barata ha hecho que el proceso SCP sea incontestable y, según parece,

el mundo actual no tiene déficit de proteína.

La era pos antibiótica también presencio el mejoramiento de la fermentación en la

producción de etanol para que fuera utilizado como combustible (gasohol), provocado

por la crisis del petróleo en 1974. Otros productos formados por microorganismos son

los polisacáridos extracelulares, como la goma de xantano, usada para reemplazar la

goma natural en los alimentos y en los lodos de perforación. Al mismo tiempo se ha

creado los cultivos de células vegetales y animales para la producción de compuestos

especiales. Los microorganismos se han usado también como auxiliares en la

lixiviación de minerales como el Zinc y el cobre a partir de minerales de grado menor.

1.5 LA NUEVA BIOTECNOLOGIA

Las nuevas biotecnologías se consideran a menudo como la biotecnología misma. Sus

principales avances han sido los anticuerpos monoclonales y la ingeniería genética. Los

anticuerpos monoclonales son los productos de la tecnología del hibridoma. Esta se

basa en la fusión de las células animales, las del sistema inmune que, por lo general, no

pueden ser cultivadas in vitro, con células cancerosas que si pueden hacerlo. Las líneas

de células hibridas que se forman, tiene la capacidad de crecer y producir anticuerpos

altamente específicos, los cuales se conocen como anticuerpos monoclonales. La

producción de anticuerpos monoclonales ha sido rápida, desde su descubrimiento en

1975 y, actualmente, hay más de 50 en el mercado. Se han utilizado en pruebas de

diagnostico rápido, fármacos de acción específica, purificación, y su comercialización

es cada vez mayor.

La ingeniería genética se puede definir en forma simple con la capacidad para transferir

genes de un organismo a otro, para cruzar la barrera que no se podrían mediante los

métodos genéticos ordinarios. El avance de esta técnica dependió de tres

descubrimientos independientes. El primero fue el descubrimiento de las enzimas de

restricción, las cuales pueden cortar el ADN en sitios específicos para producir

fragmentos discretos. El segundo descubrimiento fue al presenciar, en las bacterias, de

ciertas moléculas de DNA circular con reproducción independiente (plásmidos), las

cuales se pueden cortar con enzimas de restricción y posteriormente repararse (reunirse)

para incluir otros fragmentos de DNA. El tercer descubrimiento fue el método de tratar

las bacterias para que puedan captar el DNA de un plásmido y, por tanto, contener

nuevos genes (transformados). Estos tres descubrimientos han permitido la evolución

de la ingeniería genética, la cual ha mostrado tan rápido crecimiento que ha formado la

base de muchas compañías nuevas.

Tabla 1.3 Eventos principales en la comercialización de nuevas biotecnologías.

1973 Primer gen clonado

1974 Primera exposición de un gen clonado en diferentes especies de bacterias.

1975 Anticuerpos monoclonales.

1976 Primera firma (Genetech) en explotar la tecnología del DNA recombinante

(rDNA)

1980 Informe sobre biotecnología en el Reino Unido (Spink)

1981 Primer paquete de diagnostico con anticuerpos monoclonales aprobado en

los Estados Unidos.

1982 Primera vacuna de origen animal producida por rDNA (colibacilosis)

aprobada en Europa. Primer producto farmacéutico del rDNA, insulina

humana.

Tabla 1.4 Nuevas técnicas en el avance de la biotecnología (según Dunnhill y

Rudd1984)

Cultivo de tejidos, células vegetales y animales.

Fusión de protoplastos.

Modificación estructural de proteínas (ingeniería de proteínas).

Células y enzimas inmovilizadas.

Biosensores.

Uso de las computadoras en fermentaciones.

Nuevos diseños de biorreactores.

La técnica ha mostrado aplicación en el campo de la medicina en la generación de

muchos sistemas diagnósticos, la producción de insulina humana y la hormona de

crecimiento por bacterias y la producción de diversas vacunas. La ingeniería genética

también ha tenido influencia en la agricultura y en la industria alimentaria. En la tabla

1.3 se muestra algunos conceptos de los principales sucesos que ha tenido lugar en la

comercialización de la ingeniería genética.

En la figura 1.4 se muestran otras técnicas que se están investigando en áreas

importantes de la biotecnología. Estas incluyen: el cultivo de células vegetales y

animales, las células o enzimas inmovilizadas , los sensores biológicos, un sensor que

detecta materiales biológicos o una sonda que contiene materiales biológicos, la

modificación estructural de proteínas (ingeniería de proteínas), el uso de computadoras

en las fermentaciones y nuevos biorreactores.

Este libro está basado en un curso breve de “biotecnología básica para ingenieros”,

impartido en el wolfson institute of biotechnology (instituto de biotecnología de

Wolfson). El curso intenta, en una semana, presentar a los ingenieros, directores y a

otros profesionales no-biólogos, la caracterización principal de la biología y como se

relaciona con la biotecnología, e incluso con otras prácticas y conferencias de personas

eminentes que trabajan en la industria. No se debe esperar que el libro cubra la

biotecnología en su totalidad, por ejemplo, no incluye una sección sobre anticuerpos

monoclonales, pero debe servir como una introducción a un área fascinante y excitante

como lo es la biotecnología.

BIBLIOGRAFIA

Brown, C. M. Campbell, I., and Priest, F. G. (1987). Introduction to biotechnology.

Blackwell Scientific Publications, Oxford.

Bu`Cock, J. and Kristiansen, B. (1987). Basic Biotechnology. Academic Press, London.

Cooney, C. L. (1983).Bioreactors desing and operation. Science, 219,728.

Higgins, I. J., Best, D.J,. and Jones, J. (1985). Biotechnology. Blackwell Scientific

Publications. Oxford.

Dunnill.P. And Rudd, M. (1984). Biotecnology and British Industry. A report to the

Biotechnology Directorate, SERC, London.

Houwink (1984). A realistic view on biotechnology. European Federation of

Biotechnology. Dechema, Frankfurt.

Prave, p., Faust, U., SIttig, W., and Sukatsch, D. A. (1987). Basic Biotechnology. VCH,

Weinheim.

Smith, J. E. (1985). Biotechnology Principles. Van Nostrand Reinhold, England.

2.- ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR

2.1.- INTRODUCCION:

Todos los organismos vivientes, ya sean bacterias, levaduras, animales o vegetales,

comparten muchas características comunes. Todos los organismos con la posible excepción

de los virus, tienen una composición común que consisten en ácidos desoxirribonucleicos

(DNA), ácidos ribonucleicos (RNA) y proteínas.la molécula de DNA es la que

constitúyelos genes, los que a su vez contienen toda la información requerida para formar y

controlar el organismo. La información contenida en el DNA se transfiere al resto del

organismo para ejercer su función de la manera como la información almacenada en un

disco de computadora necesita ser leída. El flujo de información desde el DNA hacia el

resto de la célula esta mediada por moléculas de RNA, las cuales finalmente dirigen la

síntesis de proteínas que, como componentes estructurales o como enzimas, dirigen y

controlan muchas de las funciones del organismo. El proceso de transferir la información

genética del DNA a las moléculas de RNA se conoce como transcripción: la transferencia

de información desde la molécula de RNA a las proteínas se conoce como traducción.

Además de contener estos tres tipos de moléculas, los organismos realizan ciertas

reacciones químicas comunes conocidas colectivamente como metabolismo. Para crecer y

dividirse, se necesita un organismo para sintetizar sus propios constituyentes celulares a

partir de substancias químicas externas y, para lograr esto, a menudo organismos diferentes

tienen vías enzimáticas similares y una estructura celular básica.

2.2.- LOS COMIENZOS DE LA MICROBIOLOGÍA

La microbiología es el estudio de los organismos que son demasiado pequeños para verlos a

simple vista (menores de 0.1 mm) y que fueron descubiertos en el siglo XVII por Robert.

ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR.

ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO, DNA.

Transcripción

ACIDO RIBONUCLEICO, RNA.

Traducción

Proteínas

Tabla 2.1. Evolución de la microbiología

Hook publica la micrographia, en la cual describe e ilustra la estructura celular del cerebro.

Leeuwenhoek mejora las lentes del microscopio y descubre diversas formas de vida

unicelular.

Lázaro Spallanzani aporta evidencias de que los microorganismos no surgen

espontáneamente.

Wohler sintetiza la urea desmintiendo el punto de vista de que los compuestos orgánicos

solo pueden ser sintetizados por organismos vivos.

C. Cagniard-latour, th. Schwann y F. Kutzinzing proponen de manera independiente que las

levaduras que aparecen durante la fermentacion son plantas microscópicas y son las

causantes de esta.

Schileiden y Schwann dan argumentos convincentes para la doctrina celular.

Pasteur propone que todos los procesos fermentativos son el resultado de actividad

microbiana y descubre los organismos anaerobios.

Tyndall creó un método de esterilización por calentamiento discontinuo.

Roberto Koch demuestra la causa bacteriológica o etiología del ántrax.

Roberto Koch y su grupo introducen las técnicas de cultivo puro, incluyendo la caja de petri

inventadas por Ricardo Petri.

TIPOS DE ORGANIZACIÓN CELULAR

Hooke y Antony Van Leeuwenhock (tabla 2.1). Con el uso de microscopio simples.

Leeuwenhoek describió diversos microorganismos, incluyendo las bacterias, con

extraordinaria exactitud. Sin embargo, no fue sino hasta la mitad del siglo XVIII que

Spatlanzani concluyo que dichos organismos eran llevados por el aire hacia las infusiones y

que no se originaban espontáneamente. Pasteur demostró más tarde la presencia de

microorganismo en el aire y que al excluirlo, las infusiones podían mantenerse estériles por

periodos considerables. Antes de esto, Schwann y otros investigadores habían propuesto

que los organismos están constituidos por células y que la fermentación alcohólica era

causada por la presencia de células de levadura. Unos 20 años después, al estudiar un

número considerable de fermentaciones, Pasteur propuso que todos los procesos

fermentativos eran el resultado de la actividad microbiana y que podían proceder sin

oxigeno.

Mientras tanto, en Inglaterra, Tyndall había confirmado que los organismos provenientes

del aire eran las causantes de las infecciones microbianas y que estas no se formaban por

generación espontanea. Alrededor de 1876, Roberto Koch fundo la microbiología medico,

quien mostro la causa bacteriana o etiología del ántrax. Esto fue confirmado después por

Pasteur de manera independiente. Estos experimentos no solo demostraron que las bacterias

eran la causa de ciertas enfermedades, sino que cada tipo producía una enfermedad

específica, es decir, que existe especificidad biológica. El trabajo de kosh estableció

muchos de los fundamentos de las técnicas de esterilidad que son la base de la

microbiología moderna. La inoculación de bacterias sobre un medio solido, de modo que

cada colonia formada que se hubiese originado de una bacteria individual, permitiéndose el

uso y estudio de cultivos puros. Al principio el medio se solidificaba mediante la adición de

gelatina, pero más tarde esta substituyo por agar, un extracto por polisacáridos obtenido de

algas marinas. El medio solido de coloco entonces e una caja de petri, inventada por el

italiano Petri y que ahora es de uso universal.

2.3.- TIPOS DE ORGANIZACIÓN CELULAR

Los organismos vivos se pueden dividir en dos reinos, los vegetales y animales

multicelulares y los protistas y los virus (tabla 2.289). La estructura celular de ambos reinos

ha permitido la división de los tipos celulares en dos grupos (sin incluir los virus).

Tabla 2.2. Grupos componentes de los reinos de organismos

Plantas Animales

Multicelulares que muestran

amplias diferencias.

Semillas de plantas

Helechos

Musgos y hepáticas

Protistas

Vertebrados

invertebrados

Unicelulares, cenocíticos o

multicelulares sin diferencian.

Algas

Protozoarios

Hongos (levaduras)

Bacterias y virus

Tabla 2.3. Diferencias entre células procariotas y eucariotas.

PROCARIOTAS EUCARIOTAS

ESTRUCTURAS GENETICAS

Numero de cromosomas

Membrana nuclear

DNA nuclear unido a histonas

DNA en organeros

ESTRUCTURAS

1

-

-

-

>1

+

+

+

CITOPLASMATICAS

Naturaleza de los ribosomas

citoplasmáticos.

Naturaleza de los ribosomas de los

organelos.

Mitocondrias

CANTIDADES RELATIVAS DE DNA.

70s

Ninguna

-

-

-5x10-15 g (1)

80s

70s

+

+

3x1012 o 0.5 x 10 12

Estos grupos son los eucariotas y procariotas; la diferencia entre ellos depende

principalmente si los cromosomas (DNA) están contenidos en un núcleo bien definido. En

la tabla 2.3 se listan las principales diferencias entre los procariotas y los eucariotas en

términos de su estructura celular y de contenido de DNA. Los procariotas contienen un solo

cromosoma, en tanto que los eucariotas contienen muchos cromosomas, en tanto que los

eucariotas contienen muchos cromosomas en una estructura unida a una membrana. El

núcleo, en los eucariotas, el DNA contenido en los cromosomas esta unido a historias,

proteínas básicas ausentes en los procariotas. El DNA del núcleo en los eucariotas no es el

único DNA presente en la célula, puesto que otras estructuras unidas a membranas, los

mitocondrias y los cloroplastos, también contienen DNA, en estructuras rodeadas de

membrana, conocidas como organelos, no se encuentran en procariotas. Los organelos

también contienen a las estructuras capaces de sintetizar proteínas. Las cuales incluyen a

los ribosomas de los procariotas (70 s), en tanto que los ribosomas toplasmicos miden 80 s

(son unidades Svedberg). Los virus se incluyen con frecuencia en el grupo de los protistas.

Los virus fueron detectados en 1892 por Iwanowski, quien demostró que el virus del

mosaico de tabaco pasaba atreves de un filtro a prueba de bacterias y no podía ser cultivado

por la genética, pero dependen de las células huésped preexistentes para su reproducción.

En incapacidad para existir sin usar otras células, ha originado muchos argumentos cuanto

así los virus son o no organismos vivos. Los virus afectan vegetales, animales y bacterias.

2.4.- PROCARIOTAS

Los procariotas representas las células más pequeñas del reino protista, el cual consiste en

bacterias y algas verde- azules. El resto, algas, levaduras, hongos y protozoarios, son:

PROCARIOTAS

Tabla 2.4. Características físicas y químicas de las células bacterianas.

características bacterias levaduras mohos

Forma de las

células

Tamaño de las

células

Presencia de

esporas

COMPOSICION

Proteína(N x 6.25)

(nitrógeno total)

Acido nucleído

(RNA y DNA)

Carbohidratos y

li8pidos 1um=10-3

mm

Bastón, esferas y

espirales.

0.5-3 um

Por ejemplo

bacillus(aerobio)

Por ejemplo,

clostridium(anaeróbico

)

65-75%

15-25%

5-30%

Elipsoides, esferas,

micelios, cadenas.

1-5%

En algunas

45-55%

5-12%

10-50%

Micelios, esferas.

5-15um, de diámetro;

50-5000um de largo.

En algunos.

25-55%

5-10%

10-50%

Eucariotas. En la tabla 2.4. Se comparan los protistas, las bacterias, los mohos y las

levaduras, en cuanto a su forma, tamaño y composición. Las células bacterianas se

presentan como bastones, esferas, cadenas y espirales (figura 2.2), que en general son más

pequeñas que las levaduras y los mohos. Los tres grupos contienen organismos que pueden

formar esporas cuando las condiciones son desfavorables. La composición de las bacterias

nos muestra que contienen más proteínas y menos lípidos o carbohidratos que las levaduras

o los mohos.

Las diferentes formas de las bacterias se usan en las primeras etapas de la identificación,

pero debido a la falta de otras características, se usan las nutricionales para una

identificación más detallada. Según su fuente de energía, las bacterias y las algas verde-

azules se pueden clasificar en cuatro categorías:

1) Organismos fotoautotrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energía y

utilizan dióxido de carbono como una fuente de carbono. Este grupo incluye las

algas verde-azules, pero también ciertas algas fotosintéticas (bacterias sulfurosas

purpuras y verdes), así como plantas superiores y algas verdes eucarísticas.

2) Organismos foto heterótrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energía,

pero usan compuestos orgánicos como fuentes de carbono. Estos son las bacterias

purpuras no sulfurosas.

3) Organismos quimioautotrofos, que dependen de varios compuestos químicos para

obtener su energía, pero usan dióxido de carbono como una fuente de carbono. Esta

capacidad se asocia con la de usar compuestos inorgánicos reducidos como H2S o

HN3 para producir energía y está restringida a las bacterias.

4) Organismos quimiheterotrofos, que dependen y obtienen su energía su energía y

moléculas de carbono de fuentes orgánicas. Estos representan el grupo más grande

de bacterias y eucariotas y es muy diverso.

ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR

COCO DOS COCOS

Por ejemplo, Micrococcus Diplococcus cocos en cadena

Neisseria

Bacilo bacilo en cadena Espiroqueta Flagelos

Escherichia coli Bacillus megatrium Rhodospinllum

Desulfovibrio

Bacteria anclada Flagelo polar Flagelo multiple

Caulobacter Pseudomona fluorescencia Proteus vulgaris

Si se combinan las características estructurales, la forma de movimiento y los grupos

nutricionales, los procariotas se pueden dividir en cuatro grupos principales (tabla 2.5). De

estos, las eubacterias son el más grande y de mayor interés en la biotecnología. En la figura

2.3. Se muestra un diagrama representativo de las células procarioticas.

2.4.1.- PARED CELULAR

El citoplasma bacteriano está encerrado por una pared celular rígida altamente

Estructurada que determina la forma de la célula. La eliminación de esta pared provoca,

Tabla 2.5. Los cuatro grupos de procariotas.

Algas verde-azules mixobacterias Bacterias

espiroquetas

Eubacterias

Movimiento

Pared celular

CELULAR

Por desplazamiento

o ninguno gruesa,

rígida

Desplazamiento

delgada, flexible

Filamento

axial delgado,

flexible.

Mediante

flagelos o

rígida.

Organización

unicelular

filamentos micelio

FORMA DE LAS

CÉLULAS

Bastones.

Esferas

Espirales

Células en reposo

nutricional

Grupo

Fotoautotrofo

Fotoheterotrofos

Quimioautotrofo

Quimiheterotrofos.

+

+

-

+

+

-

Acinetas

+

-

+

+

+

-

-

+

-

-

Microquistes

-

-

-

+

+

-

-

-

-

+

Ninguno

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

Endosporas

+

+

+

+

Que la célula adquiera una forma esférica conocida como protoplasto cuando la membrana

celular tiene poca resistencia intrínseca. Si el protoplasma se coloca en un medio

hipertónico, una solución más diluida que el citoplasma, se provoca una rápita captación de

agua y, finalmente, la ruptura de la membrada.

En las algas verde-azules, la pared celular se compone básicamente de celulosa, en tanto

que en las bacterias la pared está formada por un polímero Único de amino-azúcar,

peptidoglucano o murena. La composición química y la estructura del peptidoglicano, se

muestran variaciones considerables entre diferentes organismos, aunque su estructura

básica es la misma.

detinción que divida a las bacterias en los grupos Gram-negativas. La composición general

de la pared de las Gram positiva y gran negativa se muestra en la figura 2.5. Las bacterias

Gram Positiva tienen una estructura básica de peptidoglucano unida a ácido teicoico, en

tanto que las bacterias gran negativas tienen una membrana fuera de la capa de

peptidoglunano que consiste en una bicapa de fosfolípidos con lipoplisacaridos y proteínas.

La difencia entre las bacterias gram negativa y gram positiva detectadas por la

tIntaciónGram, se puede correlacionar con otras características (tabla 2.7) como la

sensibilidad a la penicilina y a la digestión con lisozima. La penicilina es de muchos

antibióticos que se sabe inhiben la síntesis te peptidoglucano al unirse a la enzima

responsable del cruzamiento de las cadenas. Puesto que ninguna otra actividad biocinética

es afectada, el crecimiento de las células continua, pero son incapaces de producir paredes

celulares adecuadas y, por lo tanto, producen formas anormales y finalmente se lisan. Las

células humanas y animales no contienen peptidoglucano por lo que son afectadas. La

enzima lisozomaticas encontradas en la clara de huevo, las lágrimas y otras secreciones,

rompen el enlace entre las unidades de ácido N-acetilmuránico y N-acetilglucosamina

(figura 2.4).

En la parte exterior de la pared celular de algunas bacterias, se encuentran polisacáridos de

alto peso molecular formando un gel hidrofilico, conocido como capsula (figura 2.3).El

espesor de la capsula puede variar enormemente desde 10 nm hasta 1.o um, y puede varias

de acuerdo con el aspecto fisiológico de la célula. La capsula no tienen una función bien

definida, sin embargo muchos patógenos están encapsulados y os componentes de la

capsula pueden ser antigénicos.

N-acetilmuránico

N-acetilglucosamina lisozima

Figura 2.4

Table 2.6 Tintcion de Gram

Procedimeinto Tiempo Gram +

Gram –

*color cristal violeta y lavar 30s purpura purpura

con agua

*colocsr yoduro de gran y lavar 30s purpura

purpura

con agua, secar con papel secante

*aplicarle etanol al 95% y lavar con 20s purpura sin color

agua, secar con papel secante

*contrateñir con un color contraste, 15s purpura amarillo

por ejemplo amarillo

Tabla 2.7 Correlacionn de la tintacion de Gram con otras propiedades

Gram positiva Gram negativa

Sensibilidad a la penicilina + ±

Digetsion por lisozima + -

Espesor de la pared 20-80nm 10nm

Contenido de lípidos de la pared 0-3% 11-22%

Acidoteicoico + -

Gram variedad de aminoácidos en la pared - +

Ejemplo Bacillus

Escherichiacoli

(1nm = 10-6 mm)

2.4.2 Membrana citoplásmatica

Debajo de la pared celular bacteriana esta una membrana de unos 40-80 °A de espesor.

La membrana actúa como una barrera semipermeable que controla la captación y la

liberación de materiales, ayudando a determinar la composición del citoplasma.

Alrededor del año 1990 se descubrió el primer indicio de que los lípidos, moléculas

orgánicas pequeñas insolubles en agua que incluyen a las grasas y aceites puedan ser un

constituyente de las membranas biológicas. En las décadas de los años cincuenta, J.D

Robertson propuso que la membranaconsistía en una capa externa de polisacáridos, una

capa interna de proteínas, entre estas, una bicapa de lípidos conocida como unidad de

membrana. La bicapa lípido consistía en fosfolípidos, moléculas de glicerol con extremo

hidrófilo ( el fosfato) y un extremo hidrofilico (tallo de ácidos grasos), arreglados como una

capa doble (figura 2.6).

Hidrofilico (fosfatos)

BICAPA

LIPIDICA

Hidrofobic

FIGURA 2.6

Sin embargo, los adelantos de la microscopia electrónica (crio-fractura) revelaron un

cuadro más complejo con proteínas asociadas a la membrana. Además, aparentemente las

proteínas no están fijas en la capa de lípidos, sino que están libres para moverse en la forma

lateral. Estos descubrimientos surgieron el modelo actual para al membranas, el mosaicos

fluido (figura2.7), el cual se aplica a membranas de todos los tipos.

Figura 2.7.Modelo del mosaico fluido para la membrana celular

En las bacterias, las membranas citoplasmáticas es la única estructura membranosa real,

aunque existen una membrana similar en los eucariotas alrededor de estructuras como el

núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos.

2.4.3 Flagelos

Las bacterias pueden moverse en respuesta a varios estímulos o a compuestos químicos al

alejarse de los estímulos o al acercarse a ellos. Se ha demostrado que muchos nutrientes

simples, como los azucares y los aminoácidos provocan respuesta en las bacterias. El medio

de locomoción principal de las bacterias es el flagelo. Éste es un cuerpo basal embebido en

las membranas citoplasmática, una región en forma de gancho que se conecta a la base con

un eje flexible y delgado (figura 2.8).El flagelo se compone de hebras de una proteína

llamada flagelina. El ordenamiento de los flagelos en las bacterias determina s tipo de

movimiento, a menudo se puede usase en su clasificación.

Figura 2.8

Cuando son vistos en el microscopio electrónico, pueden observarse otros apéndices sobre

la bacteria, que consiste en delgados flagelos filamentosos conocidos como fimbrias o pilis,

los cuales participan en la transferencia de material genético.

2.4.4 Esporas

El citoplasma de las bacterias contiene muy poca estructura separadas de uno o dos

agregados de material nuclear. Sin embrago, se puede hallar una estructura que solo está en

las bacterias Gram-negativa, la endoesporas. Cuando la condiciones son difíciles, o bien, en

alguna etapa de ¿l ciclo de desarrollo, las bacteria forman una espora refractiva a partir de

una invaginación de la membrana citoplasmáticas. La gruesa pared de las esporas les

confiere resistencia al calor i a la desecación (figura 2.9).

Figura 2.9 Endoespora bacteriana

2.5 EUCARIOTAS

.La célulaeucarísticaestá representada por plantas, animales, levaduras, algas y hongos. A

pesar de la gran diversidad entre estas células, hay muchas características comunes a

ellas(figura 2.10), lo cual incluye un alto grado de complejidad interna. Las principales

carteristasson :

2.5.1 Pared celular

En los hongos, las levaduras y las algas. La celular está encerrada en una pared celular

rígida que consiste principalmente en polisacáridos, los cuales le confieren una forma fija y

la protegen del dalo mecánico y osmótico. La pared estabiliza la estructura celular y , en

cuanto a los procariotas, pueden usarse como una característica taxonomía. Las levaduras

pueden tener forma casi esférica u oblonga y se divide pro gemación o fisión ( figura 2.11) ,

en tanto que el crecimiento micelial se realiza por elongación, el cual puede incluir

ramificación.

2.5.2 Estructuras de la membrana

Las eucariotas están limitadas por una membrana de estructura similar a las de los

procariotas. En cuanto a los eucariotas varían mucho en tamaño de las estructuras que

rodena la membrana dentro de la célula (tabla 2.8).

2.5.3 Núcleo

Las características mas sobresalientes de las células eucariotas es el núcleo, el cual contiene

el DNA de la celular y esta limitado por la membrana. Dentro del núcleo se pueden ver

áreas más densas, ricas en RNA, conocidas como nucléolos.

Figura 2.10 Estructura general de lsd células eucariotas.

2.5.4 Mitocondrias

La célula eucariota contiene estas estructuras, las cuales, a menudo son grandes, cilíndricas,

encerradas por una membrana doble y contiene invaginaciones numerosas conocidas como

crestas. La mitocondrias es le sitios principal de generación de energía y contiene su propio

sistema sintetizado de proteínas y su propio DNA (figura 2.12)

2.5.5 Cloroplasto

El cloroplasto también es una estructura rodeada por una membrana y , al igual que las

mitocondrias. Contiene un sistema separado para la síntesis de pretinas y su propio

DNA. Como su nombre lo indica, los cloroplastos contiene el pigmento clorofila y en ellos

se lleva a cabo la fotosíntesis.

2.5.6 Otras estructuras membranosas

En la tabla 2.8. se describe un amplia variedad de otras estructuras membranosas, descritas

en la misma, seencuentra en asl eucariotas: su origen se describeen la figura 2.13.

El retículo endoplasma tico es una compleja de membranas que participan ne le

almacenamiento y transporte intracelular de varios productos. El retículo endoplasma tico

también puede tener muchos ribosomas unidos a su superficie y ser participe en la síntesis y

secreción de proteínas.

La mayoría de eucariotas contiene un complejo de membranas denominadas aparato o

cuerpo de Golgi, algunas veces nombrado dictiosoma. Al igual que el retículo

endoplasmático

Tabla 2.8 Estructuras membranosas en eucariotas

Estructura Función

Núcleo Contiene la información genética de la célula (DNA)

Retículo endoplasmático Una red complicada de membranas que funciona como sitio de

la síntesis de proteínas.

Aparato de Golgi Complejo de vesículas y membranas. Algunas veces llamado

dictiosoma, responsable de la secreción desde la célula.

Lisosoma Sacos membranosos que contienen enzimas digestivas.

Peroxisoma Vesículas limitadas por membranas que contienen catalasa

Mitocondrias Sitio de generación de energía, contiene su propio DNA

Cloroplastos Sitio de fotosíntesis, se presentan solo en las plantas verdes,

contiene su propio DNA

Plastidios Las estructuras membranosas de plantas pueden contener

aceites o pigmentos

el aparato de Golgi participa en la secreción de substancias de la célula en partículas

enzimas.

Las vacuolas se encuentran en muchos tipos de células, especialmente en plastas. A

menudo se usan para almacenar enzimas o productos que podrían se disruptivos o tóxicos

para la célula (las vacuolas pueden llegar a ocupar de 80 a 90% del volumen celular total).

Muchas de las estructuras citoplásmicas descritas están en equilibrio dinámico y son

sintetizadas y degradadas según sea requerido. Las diferentes estructuras parecen derivarse,

ya sea directa o indirectamente, del retículo endoplasmático de acuerdo con el esquema

mostrado en la figura 2.13.

Envoltura nuclear

Retículo endoplasmático

Aparato de Golgi

Membrana plasmatica

PeroxisomasLisosomas Vesículas endociticas

Figura 2.13 Origen de algunas estructuras membranosas

Figura 2.12 Mitocondria

PROCESOS QUIMICOS DE LA CELULA

3.1 Introducción

En el capitulo anterior se considero la estructura de los sistemas celulares y los diferentes

tipos de células que se encuentran en la naturaleza. Ahora es necesario considerar la

constitución química de los componentes celulares principales, y como se sintetizan las

unidades básicas de construcción de las estructuras a partir de los nutrientes disponibles en

un medio de crecimiento adecuado. En este capítulo se examinara la química de las células

vivas y se sentarán las bases para la comprensión de los capítulos posteriores, así como las

rutas para la generación de la energía por estas reacciones biosintéticas.

3.2 Composición elemental

Todas las células vivas, incluyendo los microorganismos, requieren ciertos nutrientes para

su crecimiento y desarrollo. Los nutrientes deben contener los elementos químicos que

constituyen los materiales y estructuras celulares, así como aquellos elementos que son

requeridos para el transporte a través de la membrana, la actividad enzimática y la

generación de la energía necesaria para los procesos biosintéticos.

El agua constituye el 80 y 90% del peso total. El resto de la célula se compone de carbono,

hidrogeno, oxigeno, nitrógeno, azufre y fosfato (en concentraciones mayores de 10-4M),

además de unos 18 elementos más que con frecuencia se presentan en cantidades mínimas.

La tabla 3.1 lista lo diez elementos principales encontrados en las células microbianas con

detalles sobre su origen y requerimiento de la célula.

El carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno, azufre y fosfato, constituyen la base de los

componentes celulares como proteínas, lípidos, estructuras de membrana y ácidos

nucleicos. Sin embargo, estos elementos forman parte de componente relativamente

estables y solo reaccionan lentamente con algun otro. Las reacciones químicas entre estos

compuestos necesitan catalizadores biológicos denominados enzimas. Estas son proteínas

que a menudo requieren de ciertos iones o elementos traza como componentes estructurales

para ser catalíticamente activo (tabla3.2) las enzimas se mencionan con un sufijo después

de la reacción o del sustrato.

La mayor parte de los elementos se presentan como sales en los medios naturales como el

suelo y el agua. Sin embargo, con frecuencia se necesita añadir fuentes solubles de estos

elementos a los medios de cultivo de laboratorio o industriales. Algunos microorganismos,

como por ejemplo Escherichia coli, pueden crecer en mezclas simples de estas sales junto

con una fuente de carbono y energía, mientras que otros, como Lactobacilli, necesitan otros

compuestos que no pueden sintetizar por sí mismo. Los constituyentes inorgánicos de

varios microorganismos se muestran en la tabla 3.3.

Los microorganismos muestran cierta diversidad en cuanto a los componentes que pueden

usar como fuentes de C, H, O, N y S. Así el azufre generalmente es tomado por las células

como sulfato y residuos de sulfuro para propósitos biosintéticos. Sin embargo, algunas

bacterias como Thiobacilli pueden crecer en compuestos con azufre reducidos como

sulfuro, azufre elemental o tiosulfato que las usan como donadores de electrones, en tanto

que los metanógenos crecen solamente en presencia de sulfuro de hidrogeno.

El nitrógeno se presenta en la naturaleza en muchas formas como el amoniaco (NH3),

nitrato (NO3-), nitrito (NO2

-), compuestos orgánicos que contienen nitrógeno y nitrógeno

molecular. La mayoría de los microorganismos pueden utilizar NH4+, el cual con frecuencia

es el substrato preferido. Algunos organismos pueden usar NO3- el cual primero debe ser

reducido a NH4+ antes de incorporarlo al material celular. El NO2

-, un producto de la

respiración anaerobia, que utiliza NO3- como aceptor de electrones (Nitrosomonas sp.),

pueden ser reducidos a NH4+ o a N2 por algunas bacterias desnitrificantes, o bien oxidado a

NO3- por Nitrobacter sp. Ciertas bacterias “fijadoras de nitrógeno” pueden usar nitrógeno

molecular como fuente de nitrógeno (Rhizobium sp.), mientras que muchos

microorganismos pueden utilizar complejos, fuentes orgánicas de nitrógenos, entre las que

están los aminoácidos, ácidos nucleicos y aminas metiladas.

Los microorganismos pueden usar C, H y O, ya sea en forma de compuestos orgánicos o

inorgánicos, incluyendo CO2, H2, H2S, NH4+, NO3

-, NO2-, SO4

2-, etc. Con la posible

excepción de liginica y ciertos polímeros orgánicos hechos por el hombre, casi todos los

componentes con carbono son substratos potenciales para el crecimiento de

microorganismos.

Elemento Fuente Función metabólica

C Compuestos orgánicos, Co2

Componentes principales del material

celular

O O2, H2O, compuestos orgánicos, CO2

H H2, H2O, compuestos orgánicos

N NH4+, NO3, N2, compuestos orgánicos

S SO42-, HS, S, S203, compuestos

orgánicos

Componentes de la cisteína,

metionica, pirofosfato de tiamina,

coenzima A, biotina y ácido α-lipoico.

P HPO42- Componentes de los ácidos nucleicos,

ATP y otros nucleótidos, y

fosfolipidos

K K+ Principal catión orgánico dentro de la

célula, cofactor de algunas enzimas.

Mg Mg2+ Cofactor de muchas enzimas

(particularmente cinasas), presente en

paredes y membranas celulares

Ca Ca2+ Cofactor de enzimas; presente en

exoenzimas importantes, por ejemplo,

amilasas, proteasas; componente

importante de las endosporas

Fe Fe2+, Fe3+ Componente de los citocromos;

proteínas fierro-azufres, por ejemplo,

ferredoxinas; cofactor de muchas

enzimas (por ejemplo, hidratasas)

Elemento Fuente Función metabólica

Zn Zn2+ Componentes de la alcohol deshidrogenasa, fosfatasa alcalina,

aldolasa, RNA y NA polimerasa.

Mn Mn2+ Componente de la superóxido dismutasa bacteriana, PEP,

carboxicinasa, citrato sintasa.

Na Na+

Requerido por bacterias halofílicasCl Cl-

Mo MoO42- Componentes de la nitrato reductasa, nitrogenasa, formato

deshidrogenasa.

Se SeO32- Componente de la glicina reductasa, formato deshidrogenasa.

Co Co2+ Componente de la vitamina B12 y enzimas con vitamina B12

(glutamato mutasa, metilmalonil CoA mutasa)

Cu Cu2+ Componente del citocromo oxidasa y oxigenasas

Cr CrO42+ Componente de algunas formato deshidrogenasas

Ni Ni2+ Componente de la ureasa y del crecimiento autótrofo de bacterias que

oxidan hidrogeno.

Elemento Bacterias Hongo (g/100Gg

de esp seco)

Levadura

P 2.0-3.0 0.4-4.5 0.8-2.6

S 0.2-1.0 0.1-0.5 0.01-0.24

K 1.0-4.5 0.2-2.5 1.0-4.0

Tabla 3.1 Elementos principales requeridos por las células microbianas

Tabla 3.2 Elementos trazas requeridos por las células microbianas

Mg 0.1-0.5 0.1-0.3 0.1-0.5

Na 0.5-1.0 0.02-0.5 0.01-0.1

Ca 0.01-1.1 0.1-1.4 0.1-0.3

Fe 0.02-0.2 0.1-0.2 0.01-0.5

Cu 0.01-0.02 - 0.002-0.01

Mn 0.001-0.01 - 0.0005-0.007

Mo0.001-0.01 -

0.0001-

0.0002

Total de cenizas 7-12 2-8 5-10

3.3 Los nutrientes como fuentes de energía:

Los nutrientes requeridos por microorganismos no son para reacciones biosintéticas que

dan lugar al crecimiento celular, sino también funcionan como fuentes de energía para

“alimentar” los procesos biosintéticos metabólicos que demandan energía. Los

microorganismos se pueden clasificar por la naturaleza de las fuentes de carbono y energía

que pueden utilizar.

Los organismos que utilizan luz como fuente de energía se denominan fotótrofos, mientras

que aquellos que obtienen su energía de reacciones químicas se denominan quimiótrofos.

3.3.1 Fotótrofos:

Tabla 3.3 Constituyentes inorgánicos de varios microorganismos

Es común que los fotótrofos utilicen CO2 como fuente celular de carbono, en cuyo caso se

denominan fotoautótrofos. Durante el crecimiento, el CO” debe ser reducido al nivel de la

materia celular usando donadores de electrones que con frecuencia son inorgánicos, tales

como el hidrogeno molecular o compuestos de azufre reducidos. Cuando los organismos

crecen de esta manera se denominan fotolitótrofos (tabla 3.4).

Alternativamente, algunos fotótrofos (tabla3.4) pueden usar la luz como fuente de energía

para su crecimiento y fuentes de carbono orgánicas como succinato o acetato. En este caso,

el substrato orgánico aporta los electrones para las reacciones de reducción y el organismo

crece como fotoorganótrofo. El substrato orgánico aporta también carbono celular en lugar

de CO2. En consecuencia, los organismos crecen como heterótrofos.

Así, la autotrofía y la heterotrofía reflejan la naturaleza de la fuente de carbono, en tanto

que el litótrofo y el organótrofo reflejan la naturaleza del aceptor de electrones.

Tipo Donador de

electrones

Fuente de

carbono

Organismo

Fotolitotrofía H2O, H2S, S, H2 CO2 Plantas, algas verde

azules, Chromatiaceae,

Chlorobiaceae

Fotoorganotrofía Orgánico CO2 Rhodospirillaceae

3.3.2 Quimiótrofos:

Muchos microorganismos obtienen energía (ATP) para su crecimiento mediante reacciones

de óxido reducción de la forma:

Tabla 3.4 Crecimiento fototrófico

Xred + Aox Xox + Ared

Donde un substrato se reduce a expensas del otro. La mayoría de las levaduras, hongos y

organismos superiores utilizan donadores de electrones orgánicos (Xred) y O2 como aceptor

de electrones. Las bacterias, sin embargo, pueden usar NO3-, SO4

2- o CO32- como aceptor de

electrones en lo que se denomina respiración anaerobia, compuestos orgánicos

(fermentación anaerobia) u O2 (respiración). El donador de electrones, Xred, puede ser

orgánico o inorgánico (por ejemplo H2, H2S, Fe2+, NO2- o NH4

+).

Los organismos que utilizan un donador de electrones orgánico se conocen como

quimioorganótrofos, en tanto que los que utilizan donadores inorgánicos se llaman

quimiolitótrofos (tabla 3.5).

Los quimiolitótrofos también son quimioautotrofos, ya que generalmente usan CO2 como

fuente de carbono y no metabolizan un compuesto organico. Sin embargo, también puede

crecer en forma aeróbica como quimioorganótrofos (por ejemplo las bacterias que oxidan

hidrogeno y algunos thiobacilli), mientras que Nitrosomonas y Thiobacillus Thiooxidans

son quimiolitótrofos obligados.

Tipo Donador de

electrones

Aceptores de

electrones

Organismo

Quimiolitotrofía H2S, S, H2, Fe2+ CO2,O2, NO3- Bacterias oxidantes del

hidrogeno, tiobacilos,

Th. Desnitrificantes,

Ntrosomas, metanogeno.

Quimioorganotrofía Orgánico O2, NO3-, SO4

2-,

Organico

Pseudomonads, bacillin

levaduras, bacillus

lincheniformis, bacterias

reductoras del sulfato,

bacilos del acido lactico

3.4 Otros requerimientos para el crecimiento:

La mayoría de las levaduras y las algas pueden sintetizar los componentes orgánicos

necesarios para su crecimiento a partir de la fuente de carbono. Muchas bacterias no pueden

hacer esto y necesitan la presencia de factores de crecimiento específicos en el medio,

además de una fuente de carbono y energía.

El requerimiento más común son las vitaminas, las cuales se necesitan en cantidades

extremadamente pequeñas como cofactores para varias enzimas. Así, Clostridium kluyveri

requiere un medio complementado con biotina y acido p-aminobenzoico. Ciertas bacterias lácticas

tienen necesidades muy estrictas de prácticamente todos sus aminoácidos, purinas, pirimidinas y

vitaminas. En consecuencia, estos organismos realmente pueden crecer en un medio en el que no

se conoce la concentración de uno de estos nutrientes necesarios para el crecimiento. El grado de

crecimiento esta relacionado directamente con la concentración del nutriente esencial. Esto

constituye la base del ensayo microbiológico.

En la tabla 3.6 se listan algunas vitaminas y compuestos relacionados que a menudo se necesitan

para el crecimiento.

Tabla 3.6 Vitaminas y compuestos relacionados requeridos para el crecimiento

Compuesto Función metabólica

Acido p-aminobenzoico Precursor del Tetrahidrofolato, utilizado en la transferencia de unidades de un

carbono.

Biotina Coenzima que participa en las reacciones de carboxilacion.

Acido fólico Tetrahidrofolato necesario en la transferencia de unidades de carbono.

Acido nicotínico Precursor de NAD y NADP.

Tabla 3.5 Crecimiento quimiotrófico

Acido pantoténico Precursor de coenzima A(portador de grupos acilo)

Piridoxina (vit. B₂) Fosfato de piridoxal usado en reacciones de transaminación y decarboxilación.

Riboflavina (vit. B₆) Componente de los grupos prostéticos FMN y FAD de las flavoproteínas.

Tiamina (vit. B₁) Componente del pirofosfato de tiamina en descarboxilasas, transaminasas y

transcetolasas.

Cianocobalamina (vit. B₁₂Coenzima que interviene en reacciones de rearreglo(glutamato mutasa).

Vitamina K Precursor de la menaquinona un portador de electrones (por ejemplo,

fumarato reductasa).

Coenzima M Interviene en la metanogénesis.

3.5 COMPONENTES ESTRUCTURALES BÁSICOS DE LA CÉLULA

Las células microbianas, como todos los sistemas vivos con excepción de los virus, se componen

de carbohidratos, grasas, lípidos y ácidos nucleicos. Estos materiales se forman a partir de las

unidades básicas de construcción o productos metabólicos primarios, a saber, monohidratos,

ácidos grasos, aminoácidos y nucleótidos (o nucleósidos) y, por otras reacciones metabólicas, se

convierten en los componentes estructurales principales de células, como paredes celulares,

membranas, enzimas, proteínas estructurales y DNA o RNA.

3.51 Carbohidratos

Son compuestos orgánicos con fórmula general (CH₂O)n, donde n>3. Existen dos formas

principales de carbohidratos, los monosacáridos y los polisacáridos. Los monosacáridos o azúcares

simples, son los carbohidratos más pequeños que contienen entre 3 y 9 átomos de carbono y son

las unidades de construcción de los polisacáridos. La D-glucosa (hace girar la luz polarizada en el

plano de la dirección +) es el monosacárido mas común. Se compone de 6 átomos de carbono y, al

igual que otros azúcares, es un derivado polihidroxialcohol (figura 3.1)

Para muchos microorganismos la D-glucosa es el compuesto base que se metaboliza para formar

los demás componentes celulares. La mayoría de los microrganismos (particularmente las

levaduras), pueden crecer en glucosa, la cual se transporta a través de la membrana hacia la célula

de difusión pasiva, transporte activo o translocación de grupo. Cuando hay polisacáridos en el

medio, es común que sean hidrolizados a unidades de glucosa por enzimas extracelulares

(invertasas, celulasas, amilasas, aminoglucosidasas) antes de ser transportados hacia la célula.

Los monosacáridos se clasifican como aldosas o cetosas (figura 3.1). Así, la glucosa es una

aldohexosa (aldo=azúcar aldehído; hexosa=6 átomos de carbono). Hay dos formas de glucosa (y

otros azucares) llamadas formas D- y L- (figura 3.2 (a)),

a) formas de cadena recta

α-D-glucosa β-D-glucosa

b) formas en anillo (piranosas)

Figura 3.2 Formas estructurales d e la glucosa

que son imágenes especulares entre si. Los azucares de origen natural por lo general son de la

forma D-. La D-glucosa se presenta principalmente como una estructura de anillo, denominada la

forma piranosa (figura 3.2 (b)), en la que α- y β- representan la posición del grupo –OH del átomo

de carbono 1.

La unión de otros grupos químicos a la estructura básica, da lugar a una variedad de derivados de

azúcar que incluye alcoholes (glicerol, sorbitol, etc.), ácidos (acido glucónico, acido glucorónico),

fosfatos (glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato), desoxiazúcares (desoxirribosa, figura 3.3) y

aminoazúcares (glucosamina, galactosamina, acido N-acetilmurámico). Estos son componentes

importantes comunes de la estructura de la célula microbiana.

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=es&langpair=en%7Ces&rurl=translate.google.com.pe&u=http://en.wikipedia.org/wiki/File:Alpha-D-Glucopyranose.svg&usg=ALkJrhjfA4htRIY-Pis4xbPl__lMrrV9RQ

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=es&langpair=en%7Ces&rurl=translate.google.com.pe&u=http://en.wikipedia.org/wiki/File:Beta-D-Glucopyranose.svg&usg=ALkJrhgWwv6dNSYsz0nzOtNHEa74hH-idw

Bajo la influencia de enzimas, los monosacáridos se pueden condensar entre si para formar

polisacáridos. El grupo –OH sujeto al átomo de carbono en la posición 1 de la molécula de

glucosa, es relativamente reactivo y se puede condensar con el grupo –OH en la posición 4 ó 6 de

otro azúcar par producir un disacárido con un enlace α- (o β-) 1,4 glucosídico (figura 3.4)

α-D-glucosa α-D-glucosa α-maltosa

Figura 3.4 Formación de enlaces (α-1, 4) glucosídicos

Si las unidades de glucosa se polimerizan aun más mediante la formación de enlaces α-1, 4-

glucosídicos se obtiene un polímero de cadena recta con un peso molecular de hasta 500.000,

denominado amilosa (un componente del almidón: figura 3.5). La amilopectina (el componente

principal del almidón) se compone de unidades de α-D-glucosa unidas por enlaces α-1, 6-

glucosídicos. La molécula completa de almidón (un polisacárido común de almacenamiento) es

una combinación de amilosa y amilopectina (figura 3.5).

El glicógeno, un polímero común de almacenamiento en bacterias y levadura, tiene una

composición similar al almidón, excepto que esta mucho mas ramificado que la amilopectina, con

ramificaciones α-1, 6 que aparecen cada 8-10 residuos de glucosa.

El dextrano es otro polisacárido importante de almacenamiento microbiano, similar al almidón y

al glucógeno, que esta formado de unidades de D-glucosa unidas principalmente por enlaces α-1,

6-glucosidicos. Sin embargo, los puntos de ramificación son característicos de las especies y

pueden ser enlaces α-1, 2, α-1, 3 o α-1, 4. Los dextranos forman soluciones viscosas que tienen

aplicaciones amplias en la industria como lubricantes, en la separación de moléculas orgánicas por

filtración y cromatografía de intercambio iónico, etc.

Un polisacárido estructural importante es la celulosa, la cual contiene más del 50% del carbono

orgánico total de la biosfera. La madera contiene aproximadamente 50% de celulosa, en tanto que

el algodón es casi celulosa pura. Se compone de unidades de D-glucosa unidas por enlaces β-1, 4

(figura 3.6) y es el componente principal de las células

Figura 3.6 Estructura de la celulosa.

vegetales y las algas. El potencial de la hidrolisis física o enzimática de la celulosa (papel de

desecho, periódico, viruta, residuos de cosecha) seguidas de una fermentación posterior para la

producción de biomasa o alcohol, representa uno de los mayores desafíos a la industria

biotecnológica.

Las paredes celulares bacterianas están formadas de un péptido polisacárido complejo llamado

peptidoglicano o mureína (figura 2.7). Esteconsiste en cadenas paralelas de polisacárido

compuestas de un disacárido de N-acetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurámico unidos por

enlaces β-1, 4-glucosidicos. En el grupo hidroxilo del acido láctico unido al ácido murámico, se

encuentra una cadena lateral de tetrapéptido compuesta de L-alanina, D-alanina, acido D-

glutámico y acido diaminopimélico o L-lisina (figura 3.7. La D-alanina terminal de la cadena

péptida lateral de un polisacárido

Figura 3.7 Componente peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas.

puede unirse con la cadena peptídica de otra cadena de polisacárido, ya sea directamente o a través

de otra cadena polipetídica corta (en Staphylococcus aureus, esta cadena de polipéptido se

compone de 5 unidades de glicina).

Por lo tanto, el peptidoglicano consiste en cadenas de polisacáridos paralelas con muchas uniones

entre las cadena que le confiere fuerza y rigidez a al pared celular.

La enzima lisozima hidroliza los enlaces β-1, 4 del peptidoglicano para producir disacáridos de N-

acetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurámico a los cuales están unidos los péptidos (figura 3.7).

Este es uno de los métodos usados para obtener protoplastos de bacterias gram +.

La penicilina, un antibiótico importante, inhibe la formación de los entrecruzamientos peptídicos

de las cadenas de polisacáridos, formando así paredes celulares débiles.

3.52 Grasas y lípidos

Los lípidos son compuestos orgánicos insoluble en agua localizados en todas las células vivientes,

pero son solubles en solventes no polares como el benceno y el éter.

Tienen cuatro funciones principales: 1)como componentes estructurales de las membranas: 2)

como materiales de almacenamiento intracelular cuya oxidación produce energía para el

crecimiento; 3) como fuente de combustible (energía) transportable; 4) como componente

protector de paredes celulares de las bacterias, las hojas de las plantas y la piel de los vertebrados.

Las grasas y lípidos se componen de ácidos grasos de los cuales se han aislado más de 70 tipos

diferentes. Los ácidos grasos se componen de una cadena larga de hidrocarburo con un grupo de

carboxilo terminal con la forma general mostrada en la figura3.8, donde n esta, por lo general,

entre 12 y 20. La cadena de hidrocarburo puede

Figura 3.8 Fórmula general de los ácidos grasos.

ser saturada (sin enlaces dobles) o insaturada (uno o mas enlaces dobles). Los ácidos grasos

difieren principalmente en la longitud de la cadena y en el número y en la posición de los dobles

enlaces. Algunos de los ácidos grasos más importantes y comunes se muestran en la tabla 3.7.

Casi todos los ácidos grasos naturales tienen un numero par de átomos de carbono y se llaman

saturados si no tienen dobles en laces. Los ácidos grasos insaturados presentan uno o más dobles

enlaces (tabla 3.7). Si bien las plantas y animales superiores tienen predominantemente ácidos

grasos insaturados de 14 a 22 átomos de carbono; los microorganismos, y en particular las

bacterias tienen tipos más simples de 12 a 18 átomos de carbono y ácidos grasos insaturados C₁₆ o

C₁₈. En las bacterias no se han encontrado ácidos grasos con más de un enlace doble.

Los ácidos grasos solo se encuentran en pequeñas cantidades en forma libre. Se localizan en

materiales estructurales y de almacenamiento como esteres de glicerol (glicéridos o acilgliceroles)

o como fosfoésteres de glicerol (fosfoglicéridos o fosfolípidos).

Los glicéridos son la forma de almacenaje principal de grasas en los microorganismos, plantas y

animales.

Tabla 3.7 Algunos de los ácidos grasos naturales comunes.

Estructura de átomos de carbono Nombre común Temperatura de ebullición (°C)

Saturado

12 CH₃(CH₂)₁₀COOH Acido láurico 44.2

14 CH₃(CH₂)₁₂COOH Acido mirístico 53.9

16 CH₃(CH₂)₁₄COOH Acido palmítico 63.1

18 CH₃(CH₂)₁₆COOH Acido esteárico 69.6

20 CH₃(CH₂)₁₈COOH Acido araquídico 76.5

24 CH₃(CH₂)₂₂COOH Acido lignocérico 86.0

Insaturados

16 CH₃(CH₂)₅CH=

CH₃(CH₂)₇COOH

Palmitoleico -0.5


CH₃(CH₂)₇COOH

Oleioco 13.4


CHCH₂CH=CH(CH₂)₇COOH

Linoleico -0.5

18 CH₃CH₂CH=CHCH₂

CH=CHCH₂CH=CH

(CH₂)₇COOH

Linolénico -11.0

20 CH₃(CH₂)₄CH=CH

CH₂CH=CHCH₂CH=

CHCH₂CH=CH(CH₂)₃

COOH

Araquidónico -49.5

Hay tres clases de glicéridos, dependiendo del número de ácidos grasos (o grupos acilo)

esterificados en la molécula de glicerol (figura 3.9):

1-monoacilglicerol (monoglicérido);

1, 2-diacilglicerol (diacilglicérido);

1, 2, 3-triacilglicerol (triglicérido).

Los más comunes en la naturaleza son los triacilgliceroles. La clase de triacilglicerol depende del

tipo y posición de los ácidos grasos esterificados en relación con el glicerol, por ejemplo,

triesteroilglicerol.

Los fosfoglicéridos se encuentran casi exclusivamente en las membranas celulares, siendo escaso

en grasas de almacenamiento. Son similares en estructura a los glicéridos excepto que uno de los

grupos alcoholes primarios del glicerol esta fosforilado mas que esterificado con un acido graso.

Así, el componente básico de los fosfolípidos es el glicerol-1-fosfato o el glicerol-3-fosfato, al

cual están unidos dos ácidos grasos.

Los fosfoglicéridos (figura 3.10) poseen una cabeza polar (hidrofílica) y otras dos cabezas

hidrocarbonadas no polares (hidrofóbicas) y, por tanto, se denominan lípidos antipáticos. Así, en

solución acuosa, es fácil que formen micelas con las regiones polares de un grupo de

fosfoglicéridos en contacto con el agua, en tanto que las cadenas

Procesos químicos de la célula

Laterales no polares se agrupan entre sí (figura 3.11.). En interfases aire-agua, los

fosfogliceridos formaran monocapas, mientras que en solución, particularmente en

aperturas que separan dos compartimentos acuosos, forman con facilidad bicapas de

aproximadamente 70 Å de espesor (figura 3.11). Estas bicapas son muy similares a las de

las membranas celulares, las cuales permiten el paso libre de agua pero son impermeables a

varios iones. En la tabla 3.8 se listan algunos de los fosfogliceridos más comunes de los

microorganismos.

3.5.3 Esteroides

Los lípidos complejos, los cuales no son saponificables, incluyen a la clase

bioquímicamente importante de los esteroides. Los esteroides se obtienen de una estructura

básica (figura 3.12). Los animales sintetizan un gran número de esteroides, los cuales tienen

diversos papeles fisiológicos y bioquímicos, incluyendo a su función como hormonas.

Algunos ejemplos son: colesterol, cortisona y testosterona.

3.5.4 Proteínas

Las proteínas son las moléculas orgánicas mas abundantes de las células vivas,

comprendiendo entre el 30% y el 70% del peso seco total de las células. Son componentes

celulares muy importantes puesto que son copiados de la información genética de la célula

y, posteriormente, dirigen la maquinaria metabólica de ella.

Componentes estructurales básicos de la célula

Las proteínas se componen invariablemente de carbono, oxigeno y nitrógeno; casi todos

contienen azufre. Además, algunas proteínas contienen otros elementos como fierro,

fosforo, zinc y cobre.

El peso molecular de las proteínas varía desde 5000 hasta más de 40 millones. Sin

embargo, ciertas cadenas peptídicas, como las que se asocian con el peptidoglucano,

constan de pocos aminoácidos con pesos moleculares tan bajos como 240. Las proteínas y

péptidos se componen de α-aminoácidos, los cuales representan las unidades de

construcción de las proteínas. Existen 20 α-aminoácidos comunes (tabla 3.9) unidos entre si

mediante enlaces peptídicos (figura 3.13) para formar polímeros grandes, no ramificados o

cadenas polipetídicas. Los enlaces peptídicos se forman por una reacción de condensación

entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de un segundo aminoácido

(figura 3.13). El numero y secuencia de los residuos aminoácidos en una cadena

polipeptídica (proteína) determinan la función y la actividad catalítica (si existe). El peso

molecular promedio de un aminoácido es 138. Sin embargo, puesto que se pierde una

molécula de agua en la formación de un enlace peptídico, el peso molecular promedio de un

residuo de aminoácido en una proteína es de 120.

Las proteínas se dividen en dos categorías principales: proteínas simples y conjugadas.

Las proteínas simples se componen solamente de aminoácidos con aproximadamente 50%

de carbono, 7% de hidrogeno, 23% de oxigeno, 16% de nitrógeno y más de 3% de azufre.

Las proteínas conjugadas contienen, además de los aminoácidos, otro material orgánico o

inorgánico llamado el grupo prostético de la proteína. Estas proteínas conjugadas se

clasifican de acuerdo a la composición química del grupo prostético.

Así, las nucleoproteínas contienen acido nucleico; las lipoproteínas contienen lípido o

fosfolípido; las glicoproteínas contienen carbohidratos; las hemoproteínas contienen una

estructura de porfirina asociada con fierro; las flavoproteínas contienen grupos flavin y las

metaloproteínas contienen iones metálicos.

La estructura y, en consecuencia, la función de una molécula de proteína, está gobernada no

solo por su composición de aminoácidos, sino también por su forma tridimensional

característica o conformación. Muchos de los aminoácidos tienen cadenas laterales ya sea

hidrofóbicas (no polares) o hidrofílicas (polares), que determina la manera en la cual se

dobla una molécula de proteína. Además, el aminoácido cisteína contiene un grupo

sulfhidrilo (- SH) que puede reaccionar con otra cisteína para formar un enlace sulfhidril

covalente (figura 3.14). estos enlaces, junto con fuerzas de van der waals, puentes de

hidrogeno e interacciones polares, son los causantes de la conformación tridimensional de

una proteína.

Existen dos conformaciones principales de las proteínas (figura 3.15):

1) Fibrosas

2) Globulares

Las proteínas fibrosas son más fuertes físicamente y son insolubles en agua o soluciones

acuosas diluidas. Se componen de cadenas polipetídicas arregladas en paralelo a lo largo de

un solo eje para formar fibras grandes o laminas (figura 3.15).

Representan los componentes estructurales básicos del pelo (queratina), cuero, uñas,

colágeno y tendones de los animales superiores, así como de los flagelos, cilios y pilis de

los microorganismos.

Las proteínas globulares consisten en cadenas polipetídicas estrechamente empaquetadas

dobladas en formas esféricas o globulares (figura 3.15). Por lo general, son solubles en

solución acuosa y se difunden con rapidez. En consecuencia, son bastante móviles en el

citoplasma celular y, a menudo, tienen una función catalítica (enzimas). Por lo tanto, la

mayoría de las enzimas y proteínas de transporte son proteínas globulares.

Se observa que hay tres niveles diferentes de estructura proteínica, las cuales se pueden

resumir como sigue:

Componentes estructurales básicos de la célula

1) estructura primaria. Secuencia de los residuos de aminoácidos unidos por medio de

enlaces peptídicos.

2) Estructura secundaria. Se refiere a la forma de la extensión o del enrollamiento

helicoidal de la cadena polipeptídica, en particular en las proteínas fibrosas, la cual

es resultado principalmente del establecimiento de puentes de hidrogeno entre los

aminoácidos.

3) Estructura terciaria. Se refiere al doblamiento y curvatura de la cadena para formar

proteínas globulares inducidas por enlaces disulfuro covalentes, puentes de

hidrogeno o enlaces salinos e interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas.

4) Estructura cuaternaria. Es la manera en la que las cadenas polipetídicas individuales

se reúnen para formar una proteína multimérica. Los enlaces responsables del

establecimiento de la estructura cuaternaria son similares a los mencionados en 3).

Las proteínas que tienen más de una cadena polipeptídica se denominan proteínas

multiméricas u oligométricas, y cada polipéptido se conoce como subunidad o protómero.

Procesos químicos de la célula

En general, la mayoría de las proteínas grandes tienen dos o más subunidades que pueden

o no poseer ningún enlace covalente entre ellas. Ejemplo de proteínas oligoméricas son

las enzimas, hexocinasa de las levaduras (4 subunidades), triptófano sintetasa (4

subunidades), lactato deshidrogenasa (4subunidades) y la sintetasa de ácidos grasos (21

subunidades), aunque la ribonucleasa y la lisozima poseen una sola subunidad. De

ordinario, las subunidades están asociadas estrechamente, aunque puede no haber enlaces

covalentes. En consecuencia, la proteína actúa como una sola molécula y, de hecho, casi

siempre se requieren todas las subunidades para el funcionamiento óptimo de la proteína.

En la tabla 3.10 se listan algunas de las proteínas que se encuentran más comúnmente en

la naturaleza y su función.

Una de las clases principales de proteínas son las enzimas, las cuales funcionan como

catalizadores biológicos. Esta clase de proteínas se considerara con más detalle en el

capítulo sobre “Cinética enzimática”.

3.5.5 Ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos se componen de nucleótidos y participan en el almacenamiento,

replicación, transcripción y transferencia de la información genética. Los nucleótidos

también tienen funciones importantes en el metabolismo, particularmente en reacciones de

transformación de energía. Los nucleótidos sirven como enzimas portadoras de energía,

como coenzimas en la transferencia de acido acético, azucares, aminas y otras moléculas y

como enzimas en reacciones de oxido reducción.

Los mononucleótidos se componen de una base nitrogenada, un azúcar de 5 carbonos y

acido fosfórico. Hay dos clases de bases nitrogenadas: las pirimidinas y las purinas.

En los nucleótidos se encuentran comúnmente tres bases pirimídicas: uracilo, timina y

citocina (figura 3.16) y, en una cantidad menor 5-metilcitocina y 5-hidroximetilcitocina.

Hay dos bases púricas principales, a saber: adenina y guanina (figura 3.16) y formas

menores como 2-metiladenina y 1-metilguanina.

Los nucleósidos son similares a los nucleótidos excepto que carecen del grupo fosfato

unido en la posición 5 del anillo de la ribosa (azúcar de 5 carbonos). Hay dos tipos de

nucleósidos: los ribonucleósidos que contienen D-ribosa como el componente azúcar y

los 2´-desoxirribonucleosidos, que contienen 2-desoxi-D-ribosa (figura 3.17). los cuatro

ribonucleósidos principales son la 2´-desoxiadenosina, 2´-desoxiaguanosina, 2´-

desoxicitidina y 2´-desoxitimidina. Estos nucleósidos no se encuentran en cantidades

apreciables en forma libre dentro de las células.

Los nucleótidos son ésteres de nucleósido con acido fosfórico y, otra vez, son de dos

tipos, a saber: los ribonucleótidos, que contienen D-ribosa y los desoxirribonucleótidos,

los cuales contienen 2´-desoxi-D-ribosa. Es común encontrar a los nucleótidos en forma

libre en el interior de las células. Los ribonucleótidos son los constituyentes principales

(“bloques de construcción”) de ácidos ribonucleicos (RNA) y los desoxirribonucleótidos

de los ácidos desoxirribonucleicos (DNA). El grupo de acido fosfórico, en general, se

encuentra unido en la posición 5 de la D-ribosa o de la 2´-desoxi-D-ribosa, pero puede

asociarse con las posiciones 2´o 3´e incluso formar grupos de acido fosfórico cíclicos, en

forma notable, la adenosina-3´, 5´-monofosfato (AMP cíclico), la cual es un compuesto

importante en la regulación del metabolismo (figura 3.18).

Los ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos pueden existir dentro de la célula como 5´-

monofosfatos (nucleótidos), 5´-difosfatos y 5´-trifosfatos (figura 3.19). Estos grupos

fosfato forman complejos con Mg2+ y Ca2+ dentro de la célula y tiene funciones muy

importantes. La ATP (adenosina-5-trifosfato) es el portador primario de energía en la

célula, que transfiere energía desde reacciones catabólicas (oxidativas) a reacciones

anabólicas (biosintéticas) (ver capitulo 6).

Los nucleósidos di- y trifosfatos sirven también como portadores de moléculas

especificas. Así, la UDP (uridina difosfato) es un portador específico de residuos azúcar

en la síntesis de polisacáridos, esto es, como UDP-glucosa para la biosíntesis de

glucógeno.

Los nucleósidos trifosfato funcionan también como precursores de unidades de

mononucleótidos para la síntesis de DNA y RNA.

Existe gran cantidad de otros mononucleótidos importantes que contienen bases que no se

encuentran en los ácidos nucleicos. La nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y su

forma fosforilada (NADP), así como la flavina mononucleótido (FMN) y la flavina

adenina dinucleótido (FAD) (figura 3.20 y 3.21), son compuesto cuya función

Proteína Localización o función

Enzimas

Ribonucleasa Hidroliza RNA

Citocromo C

Tripsina

Hexocinasa

Amilasa

Proteínas de almacenamiento

Ovoalbúmina

Lactoalbúmina (caseína)

Proteínas de transporte

Hemoglobina

Mioglobina

Albumina de suero

Proteínas contráctiles

Miosina

Actina

Dineína (flagelina)

Proteínas protectoras

Anticuerpos

trombina

Toxinas

toxina de clostridiumbotulinum

toxina diftérica

venenos de serpiente

Hormonas

Transfiere electrones

Hidroliza algunas proteínas

Fosforila glucosa y azucares relacionados

Hidroliza almidón y glucógeno

Proteína de la clara de huevo

Proteína de la leche

Transporta O2 en la sangre

Transporta O2 en el músculo

Transporta ácidos grasos en la sangre

Filamentos estacionarios en las miofibrillas

Filamentos móviles en las miofibrillas

Cilios y flagelos

Forman complejos con proteínas extrañas

Componente del mecanismo de coagulación

de la sangre.

Causas de envenenamiento de alimentos por

bacterias

Causa de la difteria

Enzimas que hidrolizan a fosfoglicéridos

Insulina

Hormona de crecimiento

Proteínas estructurales

Glicoproteínas

Proteínas de la estructura de la

membrana

α – queratina

esclerotina

proteínas de la cubierta viral

colágeno

Regula el metabolismo de la glucosa

Estimula el crecimiento óseo

Paredes y cubiertas celulares

Componente de las membranas

Piel, plumas, uñas, pezuñas, etc.

Exoesqueletos de insectos

Cubierta alrededor del cromosoma

Tejido conectivo fibroso (tendones, hueso,

cartílago)

Tabla 3.10 algunas proteínas comunes y su función.

Principal es actuar como cofactores o enzimas en reacciones de óxido reducción en el

interior de la célula.

Otro mononucleótido importante es la coenzima A (CoA-SH) (figura 3.22), la cual contiene

adenina y la vitamina ácido pantoténico. La CoA interviene en la transferencia de grupos

acetato y ácidos grasos en relaciones celulares, por ejemplo, en la formación de citrato

catalizada por la enzima citrato sintasa:

El DNA (ácido desoxirribonucleico) es un biopolímero no repetitivo que contiene toda la

información genética celular (en ciertos virus esta función la tiene el RNA). Durante la

división celular, cada célula hija recibe una copia exacta y completa de DNA parental. En

los procariotas (baterías, algas verde azules) hay una molécula de DNA única que forma un

solo cromosoma, el cual tiene un peso molecular superior a 2 x 109 y constituye

aproximadamente el 1% del peso seco de la célula. En los eucariotas (levaduras, hongos,

animales y plantas superiores) generalmente existen algunos cromosomas (moléculas de

DNA) los cuales, en células diploides, se presentan en el núcleo en forma combinada con

proteínas básicas llamadas histonas. Además del DNA nuclear, las células eucariotas

contienen DNA satélite, especialmente en las mitocondrias y en los

cloroplastos, el cual es diferente del DNA nuclear. El DNA procariótico de ordinario está

unido a un pliegue o invaginación de la membrana celular llamado mesosoma en la región

nuclear (los procariotas no poseen un núcleo verdadero). No hay proteínas asociadas con

DNA. Los procariotas también pueden tener material extracrosomal denominado plasmidos

o episomas, de los cuales se tratará en capítulos posteriores sobre biología molecular.

Todas las moléculas de DNA están formadas en cuatro unidades de mononucleótidos

principales unidas entre sí por enlaces 3’, 5’ –fosfodiéster (figura 3.23) para formar una

cadena de polinucleótido larga y sin ramificaciones. Dos de tales cadenas, las cuales son

complementarias una de la otra, se combinan para formar una estructura de doble hélice en

la que las dos cadenas permanecen juntas por la formación de puentes de hidrogeno entre

pares de bases complementarias. Así, la adenina de una cadena siempre está unida por

puentes de hidrogeno con la timidina de la segunda cadena y la citosina se une por puentes

de hidrogeno a la guanina. Los enlaces de hidrogeno estabilizan a la molécula de doble

hélice del DNA y, puesto que las bases G-C se unen por tres de tales enlaces en

comparación con dos entre las bases A-T, mientras mayor es la cantidad de pares de bases

guanosina-citocina (G-C), la molécula de DNA es más estable (figura 3.24).

Dentro de la célula el RNA (ácido ribonucleico) existe en tres formas, a saber: RNA

mensajero (mRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA ribosomal (rRNA). Todas

consisten en una cadena

individual de polirribonucleótido compuesta en cuatro ribonucleótidos principales (aunque

el tRNA contiene además algunos ribonucleótidos inusuales que incluyen a los ácidos

pseudouridílico y ribotimidílico). En los procariotas todos los RNAs se encuentran en el

citoplasma, en tanto que en los eucariotas el rRNA se localiza en el citoplasma (en los

ribosomas) y el mRNA y el tRNA se encuentran en el núcleo, mitocondrias, cloroplastos y

citoplasma.

El mRNA se sintetiza por transcripción enzimática de una hebra de la molécula de DNA.

Las bases que constituyen la hebra individual de mRNA son complementarias a dicha hebra

(excepto que el uracilo reemplaza a la timina). Después de la transcripción, el mRNA pasa

a los ribosomas donde sirve como molde para el ordenamiento secuencial de los

aminoácidos durante la síntesis de proteínas. Los tripletes de nucleótidos (codones) a lo

largo de la hebra de mRNA determinan un aminoácido específico.

Los tRNAs son moléculas pequeñas (23000 – 30000 de peso molecular) que actúan como

portadores de aminoácidos específicos. Durante la síntesis de proteínas, cada uno de los 20

aminoácidos más comunes tiene al menos un tRNA específico que lo conduce hasta el

mRNA que se encuentra unido al ribosoma. Una vez allí, el tRNA transfiere el aminoácido

correspondiente a la cadena polipeptídica en crecimiento.

El rRNA constituye hasta el 65% del peso de los ribosomas y se divide en tres tipos, a

saber: rRNA 23S, 16S y 5S, dependiendo de su capacidad para sedimentar en la

centrifugación. Durante la síntesis de proteínas, el mRNA se une al ribosoma, y un tRNA se

adhiere al mRNA y transfiere su aminoácido a la cadena polipeptídica en crecimiento; el

ribosoma se mueve entonces a lo largo

delmRNA hasta el codón próximo que da la información para el aminoácido siguiente. La

síntesis de proteínas se explicara con más detalle más adelante, sin embargo, la verdadera

función de los diferentes tipos de rRNA se desconoce aún.

BIBLIOGRAFÍA

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BIOLOGÍA MOLECULAR

4.1 LOCALIZACION Y ESTRUCTURA DEL MATERIAL HEREDITARIO

4.1.1. Introducción

El DNA es la ubicación de la información hereditaria y está contenido en estructuras

conocidas como cromosomas. Las células contienen cromosomas que se duplican antes de

la división celular. En este capítulo se analiza la estructura del DNA de procariotas y

eucariotas, y el mecanismo mediante el cual se duplica el DNA durante el crecimiento y

división celular. Se estudia la naturaleza del código genético, tal como es el mecanismo

mediante el que la estructura del DNA imparte la información que da como resultado la

síntesis de proteínas. Se explica también la base molecular del gen, los tipos de mutación y

los mecanismos de mutagénesis.

4.1.2. El material genético es DNA

En 1944, Avery demostró que el DNA (ácido desoxirribonucleico) es el material que

transfiere información genética de una herencia a otra. Ahora se sabe que, con pocas

excepciones, el DNA es la información hereditaria de los sistemas biológicos. El DNA es

un polímero cuyas unidades están constituidas por cuatro nucleótidos distintos. Cada

nucleótido consta de tres componentes: 1)Una unidad de desoxirribosa. 2)Un grupo

fosfato.3)una base nitrogenada que puede ser una purina (adenina o guanina) o una

pirimidina (citosina o timina).

La molécula de DNA tiene polaridad porque los nucleótidos están unidos por su residuo

fosfato, cada uno de los cuales une el átomo de carbono 3´de una molécula de

desoxirribosa, con el átomo de carbono 5´de la siguiente molécula de desoxirribosa. Lo

anterior de un enlace fosfodiéster 3´-5´y, por convención, las secuencias de DNA se

escriben con el radical fosforil libre a la izquierda. Las secuencias del lado 5´de un

nucleótido a menudo se denominan “cuesta arriba” y las del lado 3´se denominan “cuesta

abajo”. Además de las bases comunes descritas anteriormente, pueden surgir algunas bases

raras mediante la adición de grupos metil e hidroxi, como la base hidroximetilcitosina que

reemplaza a la citosina en algunos bacteriófagos.

4.1.3. Generalmente el DNA es una hélice doble

Los primeros experimentos químicos demostraron que la adenina y la timina, así como la

guanina y la citosina, se presentan en cantidades equimolares en el DNA. Con esta

información y con datos obtenidos por cristalografía de rayos X, Watson y Crick pudieron

proponer su modelo tridimensional para la estructura del DNA. Concluyeron que la cadena

de polinucleótidos es una doble hélice, el diámetro de la cadena es de 2nm, la cadena

cambia de dirección cada 3-4nm, la distancia entre bases es de 0.34nm y la hélice se

compone de dos cadenas de polinucleótidos.(figura 4.1 y 4.2).

El esqueleto de las dos cadenas que se enrollan entre sí están formadas por grupos azúcar-

fosfato de polaridad opuesta. Las bases están dispuestas en ángulos rectos con respecto al

esqueleto hacia el centro de la molécula, lo que permite la unión de la guanina con la

citosina y de la adenina con la timina mediante enlace hidrógeno. El hecho de que las bases

se unan sólo en estas combinaciones es una característica del DNA.

4.1.4. Las moléculas de DNA varían en longitud y empaquetamiento

Las moléculas deDNA sólo se pueden analizar con ayuda de un microscopio electrónico y

se ha encontrado que aparecen de diversas formas en diferentes organismos. El DNA de los

procariotas es de forma circular y se dice que estos organismos tienen un solo cromosoma.

El contenido de DNA en estas bacterias es bajo como en las células de Escherichia coli

(3.8X 103 pares de kilobases). Los eucariotas tienen complejidad genética mayor y grandes

cantidades de DNA. Las moléculas de DNA lineal tienen la forma de los cromosomas que

están ubicados en el núcleo. Los eucariotas inferiores, como los hongos, tienen poca

cantidad de DNA. Por ejemplo, la levadura Saccharomyces cerevisiae tiene 34 pequeños

cromosomas con aproximadamente 14 X 103pares de kilobases por célula. La cantidad de

DNA tiende a aumentar en los organismos más complejos, por ejemplo, las células del

hombre contienen 5.6 X 106 pares de kilobases, pero, en particular, las plantas y los

anfibios parecen tener mucho más DNA. La rana tiene 45 X 106 pares.

Los cromosomas de los eucariotas tienen estructuras características determinadas por las

proteínas (histonas) asociadas al DNA. Tanto las moléculas de DNA circular como las de

los cromosomas lineales, se enrollan varias veces sobre sí mismas, lo cual reduce la

longitud de la estructura, misma que es estabilizada por las proteínas asociadas. En las

células humanas el DNA se extenderá hasta 230nm de longitud, pero en el núcleo está

empaquetado en un organelo cuyo diámetro es de aproximadamente 5 X 10 -3nm.

El empaquetamiento del DNA de los cromosomas eucarióticos está asociado con muchas

proteínas, siendo las más estudiadas las histonas las cuales son responsables de la estructura

de la cromatina (fibras de nucleoproteínas) y en el transcurso de la evolución se han

conservado en gran medida.

Figura 4.1. Asociación de bases de dos cadenas de DNA( Tomado de Watson, J.D..Tooze.

J. y Kurtz.D.T.(1983).

4.2. LA REPLICACIÓN DEL DNA ES SEMICONSERVATIVA

Cuando una célula se divide en dos, cada una de las hijas contiene el complemento total de

información genética (excepto en las divisiones que originan óvulos y espermatozoides). El

DNA debe replicarse en forma precisa; lo cual se logra mediante la separación de las dos

cadenas, seguidas por la asociación de los nucleótidos de las hebras sencillas con las bases

complementarias mediante puentes de hidrogeno ( figura 4.2).

Esto significa la asociación de la guanina con la citosina y la de la cadena sencilla, los

primeros se unen entre sí. La síntesis del DNA nuevo la realizan las enzimas conocidas

como DNA polimerasas. El DNA se sintetiza en forma continua sobre una cadena del DNA

(cadena 3´- 5´) conocida como cadena principal, empero, la cadena 3´-5´está mal orientada

para la síntesis continua mediante la enzima DNA polimerasa. En esta cadena de DNA, la

síntesis ocurre en fragmentos de aproximadamente 100 nucleótidos, llamados fragmentos

de Okasaki (figura 4.3).

La replicación del DNA significa, por lo tanto, la asociación de una cadena original con una

nueva y se dice es semiconservativa. Hay otras enzimas que participan en la síntesis de

DNA. Entre éstas están el ácido ribonucleico (RNA), polimerasas y nucleasas, ya que las

moléculas de acido ribonucleico actúan como iniciadoras de la replicación del DNA, y la

DNA ligasa que sirve para unir entre sí fragmentos de Okasaki adyacentes. Hay otras

enzimas encargadas de relajar el enrollamiento del DNA para permitir la replicación en las

horquillas de replicación. El proceso de tal actividad es más complicado en los eucariotas

debido a la estructura cromosómica más compleja.

En E. coli, la replicación del DNA comienza en un sitio específico del cromosoma llamado

Ori C. Este es un tramo de 440 pares de bases (pb) cuya función normal da por resultado la

replicación del DNA lejos de este origen en ambas direcciones. El análisis de otros sitios de

iniciación de replicación de DNA procariótico han revelado regiones conservadas repetidas

de 12 pb con zonas espaciadoras de 16 pb. Probablemente éstas permiten la unión de las

proteínas al DNA en las secuencias conservadas y la iniciación de la replicación del DNA.

Aunque la replicación del DNA en los eucariotas se comprende menos, se han hecho

algunos adelantos mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiaecomo sistema

modelo. A partir de este organismo se han aislado secuencias que permiten replicar

pequeñas moléculas circulares de DNA llamadas plásmidos. Las secuencias se denominan

Autonomously Replicating Sequences, ARS, (Secuencias de replicación autónoma), es

posible que funcionen de forma similar a Ori C.

Figura 4.2. Mediante la replicación semiconservativa del DNA se generan hélices hijas

idénticas dobles. ( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).

Figura 4.3. Síntesis continua y discontinua de dos hebras de DNA durante la replicación.

4.3 ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA)

La expresión de la información genética contenida en el DNA es transmitida por una

molécula de RNA mensajero. Ésta transfiere la información del DNA al sitio donde se

efectúa la síntesis de proteínas, los ribosomas.la diferencia entre el RNA y el DNA es que

en el RNA la base uridina ésta en lugar de la timina, la azúcar ribosa reemplaza a la

desoxirribosa y, por lo general, es una molécula de una sola hebra, aunque sus bases se

pueden asociar mediante puentes de hidrógeno para dar origen a regiones internas de doble

hebra.

4.3.1. Transcripción del DNA

El RNA mensajero que transfiere la información genética es transcrito del DNA mediante

una enzima RNA polimerasa dependiente del DNA. Para que esto ocurra las cadenas de

DNA deben separarse sólo una cadena, se usa como molde con las bases de RNA unidas

por puentes de hidrógeno con el DNA. La RNA polimerasa dependiente del DNA, cataliza

la formación de enlaces fosfodiéster entre las unidades nucleotídicas que parten del extremo

5´del DNA (figura 4.4). E.coliposee sólo una de estas polimerasas, pero los eucariotas tiene

por lo menos cuatro clases, que posiblemente reconocen secuencias distintas de unión o

iniciación.

La RNA polimerasa de E. coli, que ha sido objeto de estudios detallados, es un tetrámero

(cuatro subunidades). Se necesita un polipéptido adicional denominado sigma para la

iniciación exacta; algunas veces, se requiere de un factor, rho, para terminar la

transcripción.

Figura 4.4. Una cadena de RNA se sintetiza ( transcribe) sobre una región local de hebra

sencilla de DNA.( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).

4.3.2. Tipos de RNA

El RNA mensajero (mRNA) es sólo uno de varios tipos de moléculas de RNA que se

encuentran en la célula. El tamaño del RNA varía entre procariotas y eucariotas. En los

primeros, a menudo se codifican varios mensajes en una sola molécula de m RNA, pero en

los eucariotas los transcritos primarios, los m RNA, a menudo son mucho más grandes que

el m RNA maduro final, el cual es el resultado del proceso del m RNA. Una característica

importante del m RNA es que no sólo contiene información para proteínas específicas, sino

también otras secuencias laterales que intervienen en el mecanismo de la síntesis de

proteínas.

El RNA ribosomal (r RNA) es el componente estructural principal de los ribosomas, que

son el sitio de la síntesis de proteínas. En los procariotas hay tres moléculas distintas de r

RNA, en tanto que en los eucariotas hay cuatro. Hay múltiples copias de las especies de r

RNA en el DNA, que junto con las proteínas conforman las subunidades grandes y

pequeñas de los ribosomas.

El RNA de transferencia (r RNA), es el más pequeño de los RNA, con aproximadamente

80 nucleótidos. En una célula existen alrededor de40 a 60 especies diferentes de t RNA.

Éste se distingue de los otro RNA por contener frecuentemente nucleótidos poco comunes.

Los t RNA tienen similitudes estructurales considerables; la estructura secundaria incluye

configuraciones asociadas internas. Cada t RNA contiene una secuencia característica

conocida como anticodón situada en el extremo de un lazo no asociado en un extremo de la

molécula. El anticodón se asocia con ciertas secuencias del m RNA. En el extremo 3´del t

RNA está una secuencia CCA, a la cual se pueden unir aminoácidos específicos. Las

moléculas de t RNA portadoras de aminoácidos, junto con el mensaje transcrito en el m

RNA, permiten que la información genética se traduzca en los ribosomas en una proteína.

4.4. EL CODIGO GENETICO

En la descripción del material hereditario, su replicación y transcripción y el sitio de la

traducción, no se hizo mención de la naturaleza del código genético en sí. La unidad

funcional del DNA es el gen y en este contexto el código genético de ( o clave genética) un

gen individual dirige la síntesis de una proteína especifica mediante la transcripción hacia

el m RNA, seguida por la traducción hacia una proteína en los ribosomas. Los genes

también llevan la información para las moléculas de RNA.

El código en si se determina por una secuencia de tres nucleótidos (un triplete) para cada

aminoácido. Como esto produce 64 combinaciones posibles y hay 20 aminoácidos,

entonces algunos aminoácidos son codificados por más de un triplete. El triplete que da la

clave a un aminoácido, como en el m RNA, se conoce como codón. Las posibles

combinaciones del código genético se muestran en la tabla 4.1 para los codones de los 20

aminoácidos presentes en las proteínas. Además, se usan tres codones como señales de

detención durante la traducción, los cuales se denominan codones sin sentido.

Los codones son llevados por el m RNA y la información complementaria, o anticodón, se

encuentra en la hebra transcrita del DNA y también en el t RNA. Los

A la izquierda se muestra la primera letra de cada uno de los 64 tripletes, arriba la segunda

letra y a la derecha la tercera letra. Los tres tripletes designados como terna son los de

terminación de la cadena. La tabla ilustra claramente de la degeneración del código se debe

en gran medida a la irrelevancia de la base en la tercera porción. (Tomado de Smith-

Keary(1977) Genetic structure and funtion. Macmillan.)

Codones indicados en la tabla 4.1 muestran que las dos primeras bases tienen el efecto

mayor al especificar un aminoácido particular, pero que la tercera base puede variar a

menudo sin afectar al sentido del codón. Por ejemplo, tanto el codón UUU como el UUC,

conducen a la incorporación del aminoácido fenilalanina.

El codón AUG para la metionina casi siempre se usa como codón de iniciación para que el

primer aminoácido sea incorporado en un polipéptido con una sucesión de tripletes que

especifica a los aminoácidos hasta que se llegue a un codón sin sentido y se termina la

traducción.

4.4.1 Traducción de la información genética

El codón de iniciación de la traducción es AUG, el cual es el único codón para la

metionina, pero hay dos moléculas de tRNA que tiene el anticodón para AUB ( es decir,

CAU). Uno de estos se usa siempre para la iniciación en los procariotas (RNAm met). El

cual lleva una N-formilmetionina; para insertar la metionina en posiciones internas en los

polipeptidos se usa un tRNA diferente (tRNA met). En los eucariotas también existen dos

moléculas de tRNA para la metionina, pero la forma de iniciación no está formulada. En

general el aminoácido N-terminal de las proteínas maduras no es metionina, lo cual indica

que este residuo es separado de la proteína despues de la traducción.

El proceso de iniciación incluye la unión de un tRNA de iniciación para la metionina con el

mRNA, junto con la presencia de cofactores (figura 4.5). a continuación el complejo se une

con la subunidad pequeña del ribosoma mediante la asociación de las bases de la región 5’

del mRNA y el rRNA 18S (en eucariotas) o 16S (en procariotas). La reacción de iniciación

va seguida por el periodo de elongación del polipéptido. Esto significa que la smoleculas

posteriores de tRNA se asocie con los codones subsecuentes. Cuando un codón nuevo se

asocia con el tRNA, el residuo de aminoácidos se tranfiere al grupo amino del aminoácido

entrante. Luego, el denominado tRNA previo sin carga se disocia y un tRNA se deja con un

polipéptido en crecimiento. Esta reacción se lleva a cabo a una rapidez de unos 100

residuos por segundo.

La fase final de la traducción ocurre cuando se llega a un codón sin sentido y no hay tRNA

correspondiente. Luego, el polipéptido es hidrolisado lejos del ultimo tRNA; se disocia el

mRNA y las subunidades ribosomales. En la práctica es común encontrar varios ribosomas

espaciados en una molecula de mRNA separados por unas 80-100 bases. Esas estructuras se

denominan polisomas.

4.5 MUTACIÓN

Una vez que se ha descrito el material hereditario, su código y su traducción, es más fácil

entender la naturaleza de las mutaciones. Estas se originan debido a perturbaciones en el

código genético y ocasionan cambios en la regulación o funcionamiento de las proteínas.

Por ejemplo, un tipo de mutación simple se origina cuando se altera la secuencia de

nucleótidos, ocasionando un cambio en el sentido del codón. Hay muchas formas de

clasificar la mutación, estas ilustran los mecanismos y efectos de las mutaciones. El estadio

de la mutación y el marco conceptual para comprender el proceso de la mutagénesis se

basan principalmente en el estudio de los procariotas y sus virus. Los eucariontes inferiores,

en particular Saccharomyces cerevisiae, también ha aportado evidencia moleculares

comparativas que muestran algunas diferencias entre eucariontes y procariontes.

Por ejemplo, diferentes sistemas celulares inician mecanismos de reparación de DNA, que

mantiene al DNA, si este se daña. Son útiles dos conceptos acerca del origen de las

mutaciones, que son,: que las mutaciones pueden surgir por mala replicación de DNA, es

decir, por errores en la replicación del DNA, o bien, por una mala reparación, es decir, por

errores durante la reparación del DNA dañado.

Parece ser que la replicación del DNA es mas discriminatoria en los eucariontes, como

también la reparación del daño del DNA inducido por agentes mutagénicos. Por lo tanto

existe una tendencia de fagos a procariotas y a eucariotas inferiores hacia la presencia de

reparación errónea como fuente de mutación.

4.5.1 Mutaciones cromosómicas

Las mutaciones se pueden clasificar como mutaciones puntuales o mutaciones

cromosómicas. Las mutaciones cromosómicas son cambios bruscos ya sea en el

numero o estructura de los cromosomas, en tanto que las mutaciones puntuales son

cambios pequeños a través de los nucleótidos. El daño al DNA causado por agentes

mutagénicos puede ocasionar errores en la transmisión hereditaria de cromosomas

completos y, por lo tanto, puede causar la pérdida o ganancia de estos. También

puede suceder que los cromosomas se rompan, y estos tengan afinidad por otros

cromosomas rotos dando lugar a liberaciones cromosómicas. Estas pueden

ocasionar la transferencia de un cromosoma a otro (translocación); la perdida de

material genético (delección); o bien, la inversión de una porción del cromosoma si

ocurren dos rupturas en el mismo cromosoma.

4.5.2 Mutación por sustitución de bases

Los cambios en la secuencia de nucleótidos pueden alterar el sentido del código

genético dando como resultado un aminoácido diferente en un polipéptido o un

polipéptido truncado si el cambio es de un codón con sentido a uno sin sentido.Los

efectos de tal mutación, es decir, el fenotipo, dependen del lugar de la mutación. Es

evidente que una mutación sin sentido que produce una proteína truncada, causará

la ausencia de la actividad proteínica particular, amenos que la mutación tenga lugar

cerca del extremo normal del polipéptido. Las mutaciones sin sentido que producen

un cambio en un aminoácido de un polipéptido tendrán un efecto que depende de

la posición del aminoácido en la proteína. Es claro que los cambios en el lugar

activo o en una posición que afecta la estructura dela proteína tendrán mayor efecto.

Algunos cambios causaran unja disminución en la actividad de la proteína dando

como resultado una mutación rezumante. Sin embargo, algunas mutaciones por

substitución de bases no producen un cambio en el sentido debido a los codones

múltiples de algunos aminoácidos. Es obvio que estas no tienen efecto sobre el

producto proteínico.

4.5.3 Mutación por cambio en el marco de lectura

Estas mutaciones son el resultado de inserciones o delecciones de bases, estas

alteran el marco de lectura del DNA y alteran la secuencia de codones posterior. El

efecto de la mutación por cambio en el marco de lectura es dar una proteína no

funcional, por ejemplo (figura 4.6);

ABC ABC ABC ABC ABC Wild-tipo de

secuencia

ABC AAB CAB CAB CAB Inserción

ABC BCA BCA BCA BCA Eliminación

Figura 4.6

Estas mutaciones pueden ocurrir, por supuesto, con múltiplos de una base. Los

múltiplos de tres bases deben ser añadidos o eliminados, así el marco de lectura no

se altera, pero los aminoácidos se añaden o eliminan en el polipéptido final.

4.5.4 Mutación espontánea e inducida

Las mutación puede surgir ya sea espontáneamente o debido a la inducción con un

agente mutagénico. La mutación espontanea puede ocurrir debido ala radiación de

fondo, errores en la replicación de DNA o inclusive por modificaciones

tautoméricas de

entonces para precipitar mRNA para la proteina de interes mientras se produce en el

ribosoma. Así, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describió y se obtiene una

copia de cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen

secuencias interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la producción de cDNA es

crítica en la representación de secuencias codificadoras cuando es necasaria la expresion en

los organismos inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento

y proceso de secuencias no codificadoras.

4.6.4. Mapeo con la nucleasa S1:

El análisis de la enzima de restricción permite indicar la posición de los genes al cortarlos,

o bien, sus secuencias laterales efectuarán su expresión cuando se analice la formación de

producto génico en los fragmentos. Las secuencias laterales intervienen en funciones tales

como la regulación, la unión de la RNA polimerasa y la unión ribosómica.

La nucleasa S1 digiere únicamente DNA o RNA de una sola hebra. El mapeo con la

mucleasa S1 es una herramienta muy útil para ubicar el sito de transcripción en el DNA.

Mediante la hibridación de una RNA transcriptasa a DNA de una sola hebra, se produce un

hibrido resistente a la digestión por la nucleasa S1. Así, es posible desnaturalizar el híbrido

DNA-RNA y analizar y separar el DNA.

4.6.5 Electroforesis en gel:

En forma rutinaria, las moléculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel. El gel

es una red compleja de moléculas poliméricas y distancia que el DNA migra a

Biología molecular

cada 256 pares de bases. Por lo tanto, es probable ya que un gen típico de procariotas tiene

de 1 a 2 pares de kilobases (1000 bases), que por lo menos algunas endonucleasas de

restricción que reconocen 6 pares de bases, no corten tal secuencia. En los eucariotas los

genes pueden ser más grandes y contener secuencias interpuestas llamadas intrones, que

pueden causar complicaciones.

4.6.3 Aislamiento de cDNA

Se puede obtener genes determinados mediante la elaboración de DNA complementario a

un RNA mensajero (mRNA) particular. Este enfoque se utiliza ampliamente en estudios

con plantas y mamíferos. El mRNA se puede aislar fácilmente debido a su extremo

poliadenilado de hasta 200 nucleótidos de longitud.

Ingeniería genética

El RNA crudo se pasa a través de una columna que contiene secuencias de poli U o poli T

unidas a un soporte sólido, que une a las secuencias de polo A del mRNA. Así, la

transcriptasa reversa puede usarse para sintetizar una molécula de DNA de una sola hebra

la cual se puede convertir posteriormente a una hebra doble mediante una DNA polimerasa

(figura 4.9). El cDNA se puede incorporar en vectores para su amplificación y análisis.

En ciertos casos los anticuerpos monoclonales se pueden usar para aislar un mRNA solo a

partir de los componentes celulares. Los anticuerpos monoclonales se obtienen, se inyectan

a un ratón o a un conejo con la proteína para la que se requiere el cDNA. El animal se

sacrifica posteriormente para obtener las células del bazo, las cuales se fusionan con células

de mieloma. Las células denominadas hibridomas producen un anticuerpo muy específico

para la proteína blanco (figura 4.10). El anticuerpo se utiliza entonces para precipitar

mRNA para la proteína de interés mientras se produce en el ribosoma.

Biología molecular

Así, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describió y se obtiene una copia de

cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen secuencias

interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la producción de cDNA es crítica en la

representación de secuencias codificadoras cuando es necesaria la expresión en los

organismos inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento y

proceso de secuencias no codificadoras.

4.6.4 Mapeo con la nucleasa S1

El análisis de la enzima de restricción permite indicar la posición de los genes al cortarlos,

o bien, a sus secuencias laterales efectuaran su expresión cuando se analice la formación de

producto génico en los fragmentos. Las secuencias laterales intervienen en funciones tales

como la regulación, la unión de la RNA polimerasa y la unión ribosómica.

La nucleasa S1 dirige únicamente DNA O RNA de una sola hebra.El mapeo con la

nucleasa S1 es una herramienta muy útil para ubicar el sitio de transcripción en el DNA.

Mediante la hibridación de una RNA transcripatasa a DNA de una sola hebra, se produce

un hibrido resistente a la digestión por la nucleasa S1. Así, es posible desnaturalizar el

hibrido DNA-RNA y analizar y separar el DNA.

4.6.5 Electroforesis en gel

En forma rutinaria, las moléculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel.El gel

es una red compleja de moléculas poliméricas y la distancia que le DNA migran a

través del gel refleja su tamaño, el cual se puede estimar usando fragmento de DNA

marcador como referencia. La agarosa se usa en le análisis de moléculas de varios cientos

hasta 20 000 pares de bases, en tanto que la poliacrilamida se usa para fragmentos de DNA

mas pequeños. El DNA se observa usando luz UV después de teñirlo con bromuro de etidio

(figura 4.11).

4.6.6 Hibridación de ácidos nucleicos

La homología entre moléculas de ácidos nucleicos se puede determinar mediante la unión

irreversible del DNA o del RNA a un material que generalmente consiste en filtros de

nitrocelulosa, seguida por la hibridación usando sondas de DNA o RNA marcadas

radiactivamente. L a transferencia southern describe el proceso de hibridación de una sonda

de DNA de cadena sencilla con DNA, en tanto que la transferencia northern hibrida al

DNA de una sola hebra.Por otra parte, la técnica complementaria con el RNA que han sido

transferidos al papel de nitrocelulosa o a otras membranas ( figura 4.12).

4.6.7 Determinación de secuencias de bases

La secuencia de bases del DNA se puede determinar usando uno de dos métodos. En uno

de ellos, creado por Maxam y Gilbert, se necesita el rompimiento de la hebra en bases

específicas, como lo que seobtienemoléculas de tamaño característico. El segundo método,

mas requiere la síntesis de DNA en presencia de los nucleótidos, pero con la adición de un

nucleótido análogo que irrumpe la síntesis (un trifosfato de disoxinucleósido). Ambos

métodos utilizan una cantidad limitante de DNA o reactivo de terminación, por lo que la

frecuencia d estos eventos es aleatoria y ocurre ne cada sitio disponible en el DNA. Las

moléculas de tamaño diferente son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida y

se observan mediante auto radiografía del DNA marcado radiactivamente.

4.6.8 vectores para la transferencia de DNA clonado

Los fragmentos de DNA de interés se manipulan en pequeñas moléculas circulares de DNA

llamado plásmidos o en virus. La mayor parte de las manipulaciones del DNA requieren la

bacteria E. coli, para la transferencia hacia otros organismos huésped después de la

amplificación y el análisis.

Los plásmidos de las moléculas de DNA de doble hebra que contienen la información de

origen de una replicación y varias proteínas, en las bacterias estas proteínas a menudo están

asociados a la resistencia, por ejemplo a los antibióticos. En este caso, los plásmidos llevan

la información de proteínas que rompen el antibiótico. Los plásmidos se aíslan y modifican

para su uso en la experimentación con DNA. Un ejemplo de un plásmido de uso común es

el pBR322 (figura.4.13).

El plásmido consta de 4362 pares de bases y lleva genes resistentes a la ampicilina y la

tetraciclina. Su mapa de restricción está perfectamente caracterizado con un sitio para la

enzima Bam HI en el gen resistente a la tetraciclina y un sitio Pst I en el gen existente a la

ampicilina. El DNA recombinante se puede preparar mediante la ruptura de uno de estos

sitios de restricción. Lo anterior produce extremos cohesivos y se puede asociar, mediante

puentes de hidrógeno, un fragmento de DNA de otra fuente obtenido con la misma enzima.

Por último, el DNA es unido covalentemente por medio de la enzima DNA ligasa.

Si el DNA del plásmido (pBR322) y el de la fuente se cortan con Bam HI y se ligan

entonces esto se inactiva al gen de resistencia de la tetraciclina y la introducción del

plásmido recombinante en E. coli da lugar a que la bacteria sea sensible a la tetraciclina y

resistente a la ampicilina. las bacterias que no hayan incorporado el plásmido se eliminan

exponiéndolas a ampicilina; entre las colonias resistentes a estos antibióticos, aquellas que

son resistentes a la tetraciclina contienen insertos de DNA.

los plásmidos que contienen genes de interés tendrían que ser aislados de insertos obtenidos

del DNA celular total o de cDNA obtenido a partir de mRNA, Éstos pueden determinarse

si se dispone de una sonda para el gen de interés al realizar la hibridación de la colonia. El

DNA de colonias individuales se hibrida en filtros de nitrocelulosa. O también, es posible

seleccionar un plásmido si se puede detectar su proteína característica, por ejemplo, al

rescatar una bacteria mutante por medio del DNA extraño que sustituye a una enzima. Este

tipo de elección depende de la expresión de los genes en el huésped extraño, la cual no

siempre se efectúa, especialmente cuando se trata de genes eucarióticos incorporados a

bacterias. Esto se debe a que los mecanismos de expresión difieren, y también a que los

genes eucarióticos pueden contener secuencias interpuestas denominadas "intrones".

4.6.9 Bacteriófagos

Los bacteriófagos (fagos) son virus bacterianos que se usan como vectores. Ellos infectan

ciertas capas de bacterias y presentan algunas ventajas sobre los plásmidos. La

característica principal es que pueden contener fragmentos de DNA recombinante, lo cual

reduce el número de aislados necesarios para representar a los genes de los eucariotas

superiores.

El fago lambda, como sus derivados, se usa mucho, y hasta un tercio de su DNA se puede

reemplazar con DNA extraño. El DNA circular de una sola hebra, el cual se puede obtener

del fago M13, y sus derivados, también se usan frecuentemente en el método didesoxi

(Sanger) para e análisis de a secuencia de DNA.

En el fago lambda hay secuencias específicas de DNA denominadas sitios cos que permiten

el empaquetamiento del DNA. Dichos sitios se han clonado en plásmidos para producir

cósmidos. Estos vectores contienen diferentes sitios de restricción y marcadores de

resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden llevar fragmentos de DNA grandes de 30 a

45 kilobases cuando el DNA está empaquetado en forma similar al DNA del fago lambda.

Los cósmidos tiene el potencial para llevar moléculas de DNA grandes.

4.6.10 virus

Los virus eucarióticos se usan como vectores de clonación, este es el caso del virus SV40

usado con algunas células de mamíferos.

4.6.11 Sistemas huésped para DNA recombinante

Las manipulaciones de DNA recombinante se efectúan en bacterias (E. coli), pero en

ocasiones los genes pueden ser transferidos de nuevo a otros huéspedes. En algunos casos,

se han creado vectores de vía colateral que pueden funcionar en dos tipos de huésped. Un

ejemplo se encuentra en la levadura Saccharomyces cerevisiae, en la cual una parte del

plásmido pBR322 y otra parte del plásmido denominado 2 um (de la levadura), se

entrelazan con un gen de levaduras. Esto puede funcionar en E. coli con la selección de

bacterias que llevan plásmidos en base a la resistencia de los antibióticos y en la levaduras

por la presencia de genes para los cuales la célula de levadura huésped es defectuosa. Esto

permite que las células de la levadura que llevan el plásmido sean seleccionadas, ya que

éste deja que ellas crezcan.

Existen plásmidos vectores para otras bacterias y levaduras, así como para algas, plantas y

células de mamífero. Estos vectores son de importancia práctica, ya que muchos

organismos proporcionan características novedosas que se optimizan mejor in situ, en vez

de tratar de llevarlas a un sistema extraño (heterólogo). Otra característica de E. coli, es que

no se utiliza en ninguna fermentación industrial tradicional. Las bacterias que se

acostumbran utilizar son: Bacillus sp. Para la producción de enzimas, actinomicetos para la

producción de antibióticos o corineformes para la obtención de aminoácidos.

Existen sistemas de vectores para Bacillus subtilis, que incluyen vectores de vía colateral E.

coli-B. sublitis y otros semejantes para Stretomyces. El interés en las últimas especies se

debe a que con ellas se produce la mayor variedad de antibióticos. Se espera mejorar los

rendimientos de estos antibióticos y modificarlos. Las especies de Pseudomonas también

son recomendables como huéspedes para los plásmidos recombinantes. Estos organismos

son de interés debido a su capacidad para degradar muchos contaminantes de la atmósfera.

4.6.12 Huéspedes eucarióticos

Ha surgido interés en cuanto a los sistemas de gran clonación de levaduras tanto para la

producción de compuestos de importancia comercial como para el mejoramiento de la

utilización de sustratos. Las técnicas también han demostrado ser muy valiosas en el uso de

levadura como un sistema modelo para el análisis de de células eucarióticas. En cuanto a la

aplicación práctica, se ha puesto mucho interés en el uso de la levadura como huésped en la

producción de compuestos valiosos por medio de la ingeniería genética, debido a la

experiencia acumulada por la fermentación de levaduras.

Se han obtenido varios tipos de vectores para levaduras, los cuales también se replican en

E. coli (figura 4.14). Las manipulaciones del DNA se hacen en E. coli, donde la selección

se basa en la resistencia de antibióticos. Los plásmidos tienen sitios diana únicos para

varias enzimas de restricción, así como marcadores elegibles para las levaduras, los cuales

pueden rescatar por complementación células huéspedes mutantes.

Los plásmidos episomales de levaduras (YEp), contienen una parte del plásmido 2um de la

levadura unida aun plásmido bacteriano y al marcador elegible para la levadura (figura

4.13). En una célula haya aproximadamente 50 a 100 copias del plásmido 2um; los vectores

híbridos también están presentes como plásmidos en copias múltiples que son mantenidos

bajo selección. Los vectores de este tipo tienen una alta eficiencia de transformación.

Figura 4.14 Cuatro plásmidos de levaduras. Un plásmido integrante contiene un marcador

que las levaduras eligen peo ningún origen de la replicación para ellas. Estos plásmidos

serán estables solamente si se integran en los cromosomas de las levaduras. Un plásmido

episomal contiene un marcador elegible para las levaduras y un segmento de DNA del

círculo 2u. El DNA de este círculo contiene el origen de replicación y también los genes

"rep", los cuales mantienen estable al plásmido extra cromosómico a un número de copias

relativamente bajo. Un plásmido replicante contiene un segmento de DNA (la secuencia

ARS) que le permite replicarse de manera autónoma en células de levaduras; sin embargo,

la secuencia ARS que contienen plásmidos no son estables ya que no existe un mecanismo

para mantener tales plásmidos extracromosómicos a alto número de copias durante la

mitosis. Su estabilidad se logra al añadir una secuencia CEN, un segmento de DNA de uno

de los centrómeros de levadura que se unen al huso durante la mitosis. La secuencia CEN

asegura la segregación estable del plásmido extracromosómico durante la mitosis. (Tomado

de Watson, J. D. Tooze, J. y Kurtz, D. T. (1983) Recombinante DNA: A short course.

Scientific American Books.)

También se han obtenido los plásmidos constitutivos de las levaduras (YIp), los cuales

también carecen de secuencias del plásmido 2um pero contienen secuencias para el rescate

de mutantes en las levaduras mutantes, así como para la selección y replicación 4en E. coli.

Debido a que no tienen un origen de replicación transforman las células de las levaduras

mediante integración en el DNA cromosomal, y realizan la transformación a una rapidez

que es varias órdenes de magnitud menor que la de los plásmidos YEp.

En contraste, la transformación mediante vectores YIp es estable, y por lo general, el

número de vectores en las células transformadas es 1.

Se han obtenido plásmidos replicantes de levaduras (YRp), que contienen secuencias de

estas, lo cual les confiere la capacidad de replicarse de manera autónoma. En otros

aspectos, estos vectores son semejantes a los vectores YIp. el número de copias de los

vectores YRp en células transformadoras es bajo (aproximadamente 10) y son inestables.

Los cromosomas contienen una región denominada centrómero, la cual es importante en la

distribución efectiva de los cromosomas con las células hijas en la división celular. Los

plásmidos centroméricos de las levaduras. vCp contienen centrómeros, así como

secuencias, que permiten la replicación en las levaduras y en E. coli. El número de copias

de estos plásmidos circulares es bajo y son estables aunque no tanto como los cromosomas

lineales naturales.

4.6.13 Vectores de expresión

Las secuencias de nucleótidos ubicadas a cada lado de las secuencias codificantes de los

genes, contienen estructuras importantes para la expresión y regulación de éste. en la región

5' de las células eucarióticas y procarióticas están las secuencias de DNA que enlazan las

proteínas. Estas incluyen a la secuencia de Pribnow, o bien, TATAAT de los procariotas,

donde empieza la transcripción, la cual va precedida por la secuencia TTGACA, que es el

sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa. Las regiones 5' se conocen como

promotores y la posición de estos elementos es crucial para la expresión del gen. En los

eucariotas opera un sistema similar que consiste en una secuencia TATAAA de Golberg-

Hogness a unos 25 pb hacia arriba del sitio de iniciación, con un segundo elemento CAAT

ubicado a unos 80 pb hacia arriba que también puede ser importante. En los procariotas, la

secuencia AGAGGU, conocida como secuencias de Shine-Delgarno, es importante en la

colocación correcta del mRNA en los ribosomas.

Las secuencias hacia abajo del gen también son importantes para la expresión. en los

procariotas, la terminación de la transcripción ocurre en secuencias específicas que pueden

formar una estructura secundaria rizada. En los eucariotas es importante una secuencia

AAUAA, ya que se añade un extremo poli-A de aproximadamente 100 a 200 residuos, sin

embargo, se tiene que saber más acerca de las señales de terminación.

La importancia de las regiones 3' (hacia abajo) y en particular, la regiones 5' (hacia arriba)

de los genes, ha dado como resultado la incorporación de taleselementos en los

denominados vectores de expresión. La región 5' hacia arriba contiene elementos que dan

por resultado la expresión característica de los genes. Estas regiones han sido tomadas de

genes altamente expresados y se han usado para expresar otras proteínas incluyendo

proteínas de importancia comercial.

En las levaduras, éstas han sido usadas, por ejemplo, con el promotor de la 3-fosfo-

glicerato cinasa para expresar el interferon alfa del hombre (figura 4.14). Las

concentraciones de las proteínas no son tan altas como lo serían si estuviese presente en el

vector el gen PGR de las levaduras, debido a que la carga de la célula de producir grandes

cantidades tales de proteínas que, entre otras cosas, pueden efectuar la viabilidad.

Idealmente. La secuencia promotora usada debe ser controlable de modo que la síntesis de

proteína en concentración alta se accione en el momento adecuado. Este tipo de regulación

se puede obtener usando, por ejemplo, promotores de proteínas de choque térmico, o bien,

como se ha logrado en las levaduras, un promotor de fosfatasa ácida, el cual funciona a 28

ºC pero no a 35ºC. Esto permite obtener suficiente biomasa antes de pasar a la síntesis del

producto

4.6.14 Vectores de secreción

Otra característica de aplicación potencial es el uso de vectores de secreción que permiten

exportar el producto y su recolección a partir de caldo de fermentación más que de la masa

celular. Esto tiene aplicación posible en sistemas celulares inmovilizados. Estos vectores de

secreción se pueden desarrollar en muchos sistemas. En las levaduras, se basan en todas la

proteínas secretadas conocidas e incorporan la terminal amino principal de tales proteínas

que se requiere para el proceso previo a la secreción. La hormona sexual de levaduras,

denominada factor alfa, se ha utilizado para lograr la secreción, pero para ser que las

levaduras también pueden reconocer y procesar señales de secreción colocadas en genes de

interferon de eucariotas superiores.

La levadura que más se usa y estudia aquí es la Saccharomyces cerevisiae, sin embargo,

recientemente se han creado sistemas de transformación para otras levaduras como

Schizosaccharomyces pombe, Klyveromyces lactis,

Klyveromyces fragalis, Hansenula polymorpha. Algunas de estas especies pueden ser más

adecuadas en la expresión de ciertos genes o bien, pueden serlo usando substratos más

baratos. Por ejemplo Hansenula polymorpha puede crecer en metanol y Klyveromyces con

lactosa (suero) como fuentes de carbono.

En comparación con las levaduras, hubo un menor avance de los sistemas de clonación

génicos en hongos filamentosos.

La transformación se ha logrado con varios hongos filamentosos y es de interés en cuanto a

la secreción de producto en alta concentración.

En las plantas, también se han obtenido sistemas de clonación de genes. Se han construido

plásmidos que se replican autónomamente para la alga verde unicelular Chlamydomonas

reinhardii. Este sistema promete la producción por medio de un crecimiento fotosintético.

En estos últimos dos años hubo un avance rápido en los sistemas de clonación en las

plantas superiores. Este problema se solucionó al investigar vectores posibles basados en

virus y plásmidos vegetales. La solución que se basa en los plásmidos Ti de la bacteria

Agrobacterium tumefaciens, inductora de tumores vegetales parte de este plásmido y se

incorpora en el DNA vegetal; el DNA extraño incorporado en esta parte de este plásmido

usando enzimas de restricción y la DNA ligasa se incorporan junto con el DNA Ti. Esto ha

abierto amplias posibilidades para el mejoramiento de los vegetales, no obstante, el

plásmido Ti solo se puede insertar de manera natural en un número limitado de especies

vegetales, las cuales no incluyen algunos de los cultivos más importantes. Los sistemas de

vectores para estas especies aún se encuentran en investigación y entre sus posibles

aplicaciones se encuentran la manipulación de vías biosintéticas, la incorporación de

resistencia a herbicidas y el mejoramiento del valor nutricional de las cosechas.

Se puede introducir DNa extraño en el DNA de las células de mamífero mediante la

microinyección directa en el embrión. La obtención de sistemas de clonación de genes en

cultivos de células de mamífero es de la mayor importancia ya que pueden ser la base de

procesos de fermentación comerciales.

Las células transformantes pueden ser detectadas con facilidad luego de la incubación con

DNA total si existe una forma de seleccionarlas. La detección de transformantes se basó

inicialmente en la complementación de células deficientes en una función determinada, con

el gen activo correspondiente. La contrasformación de un gen deseable unido a un

marcador seleccionable, por ejemplo, de resistencia a antibióticos, puede superar este

problema y permitir la integración en los cromosomas.

En la actualidad se cuenta con vectores virales para células de mamífero, la mayoría se basa

en el virus circular SV40. Se han obtenido derivados que contienen un replicón de E. coli

unido al suyo que contiene la expresión en el cual se pueden insertar y expresar los genes

extraños. Estos vectores de vía colateral pueden usar de nuevo E coli para manipulaciones

de DNA con transferencia de líneas de células mono, en las cuales se efectúa el análisis de

su expresión o efecto. La función episomal de este y otros vectores virales limita el número

de huéspedes, pero se puede usar para la integración cromosómica de las células.

RESUMEN

1). La tecnología de la ingeniería genética depende de la fragmentación del DNA mediante

las enzimas de restricción y de su unión en combinaciones distintas como los vectores.

2). Los genes se clonan mediante el aislamiento de vectores que llevan genes normales,

capaces de rescatar o "complementar" células defectuosas. En forma alternativa, es posible

aislar el mRNA y producir una copia de DNA usando transcriptasa inversa.

3). El análisis de DNA se puede realizar mediante el examen del mapa de los sitios de la

enzima de restricción usando electroforesis en gel para separa fragmentos de DNA de

diferente tamaño, examinando la homología entre secuencias de nucleótidos mediante la

hibridación de una sonda de DNA, marcada radiactivamente con DNA unido a filtros;

analizando la secuencia con base en la interrupción de las hebras de DNA en posición de

bases conocidas y determinándolas por diferencias de tamaño en geles de poliacrilamida.

4). Los vectores se usan para mover en DNA de una célula a otra por el proceso se

transformación.

5). La selección de transformantes puede efectuarse por la recuperación del plásmido o por

resistencia a una toxina celular.

6). Existen sistemas de clonación para bacterias, levaduras, hongos filamentosos, algas,

plantas superiores y células de mamíferos. Para la explotación biotecnológica de la

ingeniería genética es importante el refinamiento de la técnica para ampliar la variedad de

huéspedes, el control de la expresión de genes y el número y la estabilidad de los

plásmidos.

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biotecnologia

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