biotecnologie farmacologiche lezione 8 biofarmaci e proteine terapeutiche: problematiche legate alla...

BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE

LEZIONE 8

BIOFARMACI E PROTEINE TERAPEUTICHE: PROBLEMATICHE LEGATE ALLA LORO FARMACOCINETICA/DINAMICA

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

Adriana Maggi

PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE

• INSULINA

• FATTORI DI CRESCITA DELL’EMATOPOIESI

• INTERLEUCHINE ED INTERFERONI

• ORMONE DELLA CRESCITA

• ENZIMI

• (ANTICORPI MONOCLONALI)

• (VACCINI)

• FATTORI DELLA COAGULAZIONE

NOMECOMMERCIALE

PROTEINATERAPEUTICA

AZIENDAFARMACEUTICA

PRINCIPALE INDICAZIONE

TERAPEUTICA IN USA

ANNO

HUMULIN INSULINA UMANA ELI LILLY DIABETE 1982

PROTROPIN ORMONE SOMATOTROPO GENENTECH DEFICIENZA GH 1985

INTRON A INTERFERONE ALFA 2b

SHERING-PLOUGH LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE

1986

ROFERON A INTERFERONE ALFA 2a

HOFFMANN-LA ROCHE

LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE

1986

HUMATROPE ORMONE SOMATOTROPO ELI LILLY DEFICIENZA GH 1987

ACTIVASE TPA GENENTECH INFARTO CARDIACO 1987

EPOGEN ERITROPOIETINA AMGEN ANEMIA RENALE 1989

ALFERON N INTERFERONEALFA N3

INTERFERON SCIENCES

PORRIGENITALI

1989

NEUPOGEN G-CSF AMGEN NEUTROPENIA DACHEMIOTERAPIA

1991


NOMECOMMERCIALE

PROTEINATERAPEUTICA

AZIENDAFARMACEUTICA

PRINCIPALE INDICAZIONE

TERAPEUTICA IN USA

ANNO

LEUKINE GM-CSF IMMUNEX TRAPIANTO MIDOLLOAUTOLOGO

1991

PROLEUKIN IL-2 CHIRON CARCINOMARENALE

1992

RECOMBINATE FATTOREANTIEMOFILIA

GENETICINSTITUTE

EMOFILIA A 1992

KOGENATE FATTORE VIII MILES EMOFILIA A 1993

BETASERON INTERFERONEBETA 1-B

CHIRON SCLEROSI MULTIPLA 1993

PULMOZYME DNasi GENENTECH FIBROSI CISTICA 1993

NUTROPIN GH GENENTECH DEFICIENZA CRESCITA DA INSUFFICIENZA

RENALE

1994

CEREZYME GLUCOCEREBROSIDASI GENZYME MALATTIA DI GAUCHER

1994

GONAL-F FSH SERONO INFERTILITA’ 1996


2000EMOFILIA AGENETICSINSTITUTE

FATTORE VIIIREFACTO

1999EMOFILIA A e BNOVONORDISK

FATTORE VIIaNOVOSEVEN

1997EPATITE CAMGENINTERFERONEALFACON-1

INFERGEN

1997EMOFILIA BGENETICSINSTITUTE

FATTORE IXBENEFIX

1996SCLEROSIMULTIPLA

BIOGENINTERFERONEBETA 1a

AVONEX

2000OSTEOPETROSIINTERMUNEINTERFERONEGAMMA 1b

ACTIMMUNE

ANNOPRINCIPALE INDICAZIONE

TERAPEUTICA IN USA

AZIENDAFARMACEUTICA

PROTEINATERAPEUTICA

NOMECOMMERCIALE


Le proteine terapeutiche oggi disponibili sono utilizzabili nella terapia di patologie quali:

Neoplasie (interferoni, anticorpi monoclonaliPatologie cardiovascolari, fibrosi cistica, morbo di Gaucher (Enzimi, fattori ematici) Diabete (Insulina) Anemia (Eritropoietina) Emofilia (fattori ematici di coagulazione)

Le terapie con proteine terapeutiche di maggiore utilizzo nel 2003 sono state: Johnson & Johnson Procrit trattamento per anemieAmgen Epogen trattamento anemia Schering-Plough: Intron A and Peg-Intron per il trattamento dell’epatite

Oggi le classi terapeutiche più utilizzate sono:EritropoietinaAnticorpi monoclonaliInterferoni

FARMACOCINETICA E FARMACODINAMICA

FARMACO LEGATO A PROTEINA

CONCENTRAZIONE PLASMATICA

FARMACO LEGATO A TESSUTO

CONCENTRAZIONE TISSUTALE

DOSEASSORBIMENTO

DISTRIBUZIONE

FARMACO NEL COMPARTIMENTODI EFFETTO

FARMACO LEGATO ARECETTORE/EFFETTORE

EVENTI POST- RECETTORIALI

EFFETTO BIOCHIMICO

RISPOSTA FARMACOLOGICA

METABOLISMO ED ESCREZIONE

ELIMINAZIONE

ASPETTI FARMACOCINETCI E FARMACODINAMICI DI FARMACI PROTEICI O PEPTIDICI

LA FARMACOCINETICA STUDIA LA CINETICA DEI PROCESSI

RESPONSABILI DELLA VARIAZIONE TEMPORALE DEI

LIVELLI DEI COMPOSTI ESOGENI NELL’ORGANISMO

IMPORTANZA DELLA RELAZIONE TRA ASPETTI FARMACOCINETICI

E FARMACODINAMICI NELL’AZIONE DI UN FARMACO

I PROCESSI SONO:

•ASSORBIMENTO

•DISTRIBUZIONE

•METABOLISMO

•ESCREZIONE

1) VIA ORALE

2) VIA PARENTERALE

3) VIE ALTERNATIVE

ENDOVENOSAINTRAMUSCOLARESOTTOCUTANEAINTRAPERITONEALE

TRANSNASALEBUCCALERETTALETRANSDERMICAPOLMONARE

SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE


VIA ORALE controindicata a causa di:

A. ELEVATA DEGRADAZIONE

B. SCARSO ASSORBIMENTO

•Endopeptidasi presenti a livello intestinale (pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi)•Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B)

•Molecole di grande dimensioni•Assenza di meccanismi di trasporto attivo

ECCEZIONE: VACCINI ORALIle cui cellule bersaglio sono linfociti e antigen presenting

cells (APC) presenti nelle PLACCHE DEL PAYER

FOLLICOLO LINFOIDE:gruppo di cellule

contenenti le cellule M disperse in cellule epiteliali

centro germinale(area delle cellule B)

celluleepiteliali

lume intestinale

parete intestinale

cellule M

VIA PARENTERALE via d’elezione:

La scelta della via endovenosa,intramuscolare, sottocutanea e intraperitoneale dipende dall’emivita della proteina stessa e dalla concentrazione ematica necessaria per ottenere l’effetto farmacologico

Es: l’emivita del TPA è di pochi minuti, mentre quella di un

anticorpo monoclonale è di alcuni giorni


si può passare dalla somministrazione per via i.v. a quella i.m.

o s.c. tenendo conto che:

1. La prolungata residenza nel sito d’iniezione aumenta l’esposizione a reazioni di degradazione (es.”insulino-resistenza” di diabetici dovuta ad alte concentrazioni di peptidasi tissutali)

2. Dopo iniezione s.c. il farmaco può entrare nei capillari linfatici e non utilizzare il torrente circolatorio dando una differente biodisponibilità

si possono operare modificazioni nella proteina

(mutagenesi)


PER AUMENTARE L’EMIVITA

VIE ALTERNATIVE: POLMONARE TRANSDERMICA TRANSNASALE

Nel caso di una azione sistemica queste vie hanno limitata rilevanza, mentre possono essere valide qualora sia richiesta una azione locale.

IMPORTANZA VIA NASALEIMPORTANZA VIA NASALE


ASSORBIMENTO DI PROTEINE TERAPEUTICHE

Aumento permeabilità delle barriere d’assorbimento (attraverso iontoforesi, uso liposomi, aggiunta di acidi grassi/fosfolipidi,acidi biliari, enamine derivate dalla fenilglicina, detergenti, derivati salicilici, ciclodestrine)

Diminuzione attività peptidasica nel sito

di assorbimento (attraverso l’uso di inibitori di proteasi)

Aumento della resistenza contro la degradazione (attraverso modificazioni della struttura molecolare)

Aumento tempo d’esposizione (con PEG-polietilenglicol)

APPROCCI PER AUMENTARE

ASSORBIMENTO

Approcci per il controllo della velocità di somministrazione

SISTEMI APERTI:•POMPE MECCANICHE•POMPE OSMOTICHE

SISTEMI CHIUSI:•COMBINAZIONI POMPE BIOSENSORI•SISTEMI AUTOCALIBRANTI•CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE

• SOMMINISTRAZIONE PULSATILE

• INFUSIONE CONTINUA

• TEMPI FLESSIBILI

Problemi:

1. Controllo del flusso (erogazione corrente,flusso nell’ago, perdita liquido dal catetere…)

2. Stabilità del farmaco a lungo termine (il farmaco deve essere stabile a t°ambiente e a 37 C°)

3. Anche con le pompe più sofisticate è necessario raccogliere dati per aggiustare il flusso (questo implica la raccolta invasiva di fluidi corporei)

POMPE MECCANICHE

Problemi:

1. Controllo del flusso (la velocità di rilascio è costante, condizione non sempre desiderabile)

2. Stabilità del farmaco (la dispersione/soluzione di proteina

deve essere stabile alla temperatura corporea)

POMPE OSMOTICHE

MEMBRANA SEMIPERMEABILE(DOVE ENTRA ACQUA)

RESERVOIR

AGENTE OSMOTICO

MEMBRANA IMPERMEABILEDEL RESERVOIR

MODERATORE DEL FLUSSO

CAPPUCCIO RIMUOVIBILE

SOLUZIONE DI FARMACO USCENTE

ESEMPIO DI MINIPOMPA OSMOTICA IMPIANTABILE

SOTTOCUTANEA

REAZIONI ENZIMA SUBSTRATO

Sono basati sul cambiamento di pH quando il glucosio viene convertito in

ac.gluconico. Il pH induce

cambiamenti nei polimeri acido-

sensitivi che iniziano così a rilasciare

insulina.

SISTEMI AUTOCALIBRANTIil rilascio della proteina viene controllato da

uno stimolo corporeo attraverso diverse strategie

concavalinaAconcavalinaA

concavalinaAconcavalinaA

beads di sefarosio beads di sefarosio

COMPETITIVE DESORPTION

GLUCOSIO INSULINA

E’ preferibile l’uso di una membrana che escluda le componenti umorali e cellulari del sistema immunitario per permettere alla cellule di vivere senza l’ausilio di agenti immunosuppressivi

CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE

CELLULE PRODOTTI DI SECREZIONE

NUTRIENTI

PORI DELLA MEMBRANA

SOMMINISTRAZIONE SITO-SPECIFICA

ANTICORPI MONOCLONALI UMANIZZATI

ANTICORPI BISPECIFICI

ANTICORPI CONIUGATI CON COMPOSTI ATTIVI

LIPOSOMI

A differenza dei farmaci sintetici, per i quali lo studio della biodistribuzione è necessario per

evitare l’accumulo di metaboliti tossici in particolari tessuti, la biodistribuzione di proteine terapeutiche indica solo l’avvenuta distribuzione del farmaco in un particolare tessuto, dato che gli

aminoacidi della proteina possono essere riutilizzati

BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI

La misurazione della biodistribuzione viene effettuata con farmaci marcati (presenza di tirosine e lisine)

La difficoltà nell’eseguire studi di biodistribuzione impone di utilizzare l’intensità e la durata dell’effetto farmacologico come prova e misura dei livelli di un farmaco in un particolare tessuto

BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI

SANGUE

DRUG

LINFA

SITO D’INIEZIONE

FA

RM

ACO

A B

ASSO

P.M

.

FARMACO AD ALTO P.M.

La biodistribuzione nei vasi linfatici dopo iniezione s.c. rappresenta l’unico meccanismo di trasporto per macromolecole, che raggiungono il torrente circolatorio indirettamente attraverso il sistema linfatico: composti con P.M. maggiore di 16kD vengono assorbiti dai vasi linfatici, mentre i composti inferiori a 1kD non vi penetrano quasi per nulla

ELIMINAZIONE DI FARMACI PROTEICI

1. PROTEOLISI

2. ESCREZIONE E METABOLISMO RENALE

3. METABOLISMO EPATICO

4. ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA AD OPERA DI ALTRE CELLULE

ELIMINAZIONE RENALE DI PROTEINE

aminoacidi

Tubulo Prossimale

Filtrato Glomerulare LumeAngiotensinaBradichinina

Tubulo Distale

Vaso Peritubulare

IL-2Insulina

CalcitoninaOrmone paratiroideo

vasopressina

Recettore

Lisosomi

Non mediato

ProteineGlomerulo

• Solo per piccole proteine (P.M.<68kD,raggio>20nm)

• La clearance renale è più alta per molecole caricate positivamente rispetto a quelle caricate negativamente

• Dopo la filtrazione glomerulare le proteine possono essere riassorbite dal tubulo prossimale tramite endocitosi e,una volta idrolizzate nelle cellule ad amminoacidi, ritornare nel circolo sistemico.

proteineproteine

METABOLISMO EPATICO

Diffusione passiva (solo per piccole proteine molto idrofobiche quali ciclosporina e peptidi ciclici)

Trasporto energia-dipendente (per peptidi di dimensioni più elevate)

Endocitosi mediata da recettore (per insulina ed EGF)

Recettori che legano gli zuccheri (per glicoproteine)

Proteine correlate al recettore per LDL- LRP (per t-PA, u-PA, trombospondina)

METABOLISMO EPATICO

La velocità di eliminazione intra-epatocita dipende dalla sequenza proteica e dalla presenza di siti di riconoscimento di endopeptidasi

Proteine a vita media elevata sono degradate in lisosomi

Gli oligopeptidi risultanti dall’attacco di endopeptidasi sono ulteriormente degradati da esopeptidasi e poi rientrano nel pool metabolico cellulare

ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA

AD OPERA DI ALTRE CELLULE

M-CFS viene eliminato dai reni quando è presente in elevate quantità: a

concentrazioni minori viene captato dai macrofagi con un

meccanismo recettore mediato saturabile

G-CSFe un suo derivato

(nartograstima) sono captati dal midollo

osseo attraverso un processo saturabile recettore mediato

PROTEINE DI LEGAME PLASMATICHE

Riportate per IGF-I, IGF-II, t-PA, GH, Dnase,NGF…

Il legame di proteine terapeutiche a proteine circolanti nel plasma rende

particolarmente complesse le cinetiche di distribuzione ed

eliminazione

ASPETTI FARMACODINAMICI DI FARMACI PROTEICI

La costruzione di curve DOSE-RISPOSTA è particolarmente utile nella sperimentazione di fase II dato che aiuta a scegliere la dose ottimale per la fase III

Si ritiene che i farmaci biotecnologici manifestino talora una curva dose-risposta a campana

SCALING INTERSPECIE

Le tecniche per la predizione di parametri farmacocinetici in una specie da dati derivanti da una specie diversa usando equazioni allometriche permettono di stimare il range di dosi da studiare, anche se non possono sostituire gli studi stessi.

P= a.Wb

P: parametro farmacocineticoW: peso corporeoa: coefficiente allometricob: esponente allometrico

IMMUNOGENICITA’

LA FORMAZIONE DI ANTICORPI AVVIENE IN GENERE DOPO SOMMINISTRAZIONE CRONICA DI PROTEINE TERAPEUTICHE

Gli anticorpi possono neutralizzarel’attività biologica

della proteina e possono modificarne la farmacocinetica

e farmacodinamica

La risposta immunitaria viene di solito indotta quando la proteina è estranea all’ospite:

inoltre le iniezioni extravascolari stimolano maggiormente

la produzione di anticorpi rispetto alla somministrazione per endovena

FORMULAZIONE DI PROTEINE/PEPTIDI TERAPEUTICI

2.DECONTAMINAZIONE VIRALE: analisi dei m.o. e cellule deputate alla produzione. Rischio nell’utilizzo di eccipienti derivati ematici (albumina)

1.STERILITA’: la produzione deve essere fatta in condizioni di sterilità per l’impossibilità di utilizzare sistemi di sterilizzazione quali radiazioni ionizzanti, gas e calore

fosfato Acido grasso

lipideA core catena antigenicalipopolisaccaride

zucchero

n

STRUTTURA DI UNA ENDOTOSSINA

3. RIMOZIONE PIROGENI: generalmente derivanti da batteri, funghi, virus che contaminano la preparazione (endotossine da Gram negativi quali LPS). In genere sono caratterizzati da carica negativa elevata. Stabili in condizioni standard di sterilizzazione in autoclave, vengono distrutti in presenza di temperature elevate a secco (>250° per 30 min.)

ECCIPIENTI USATI NELLA FORMULAZIONE DI PRODOTTI BIOTECNOLOGICI

1)AGENTI SOLUBILIZZANTI

2)AGENTI ANTIAGGREGANTI

3)AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH

4)CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI

5)AGENTI OSMOTICI

6)TAMPONI

7)CARRIERS

AGENTI ANTIAGGREGANTI

Sono necessari per ridurre l’assorbimento della proteina terapeutica alle superfici della fiala, siringa, ago…. Es.assorbimento insulina su superficie idrofobica

CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI

Per il blocco dell’ossidazione di metionina, cisteina, triptofano, tirosina e istidina in genere l’ossigeno viene sostituito con un gas inerte o tramite l’aggiunta di ascorbato.

Superficie idrofobica

cristallimonomeri

aggregati insolubili

AGENTI OSMOTICI

Si tratta di soluzioni saline e di mono/disaccaridi.Possono influenzare la termostabilità della proteina.

AGENTI SOLUBILIZZANTI

Bloccano l’aggregazione di proteine, soprattutto non glicosilate e ne evitano la precipitazione limitando interazioni idrofobiche e/o elettrostatiche.Il pH ha notevole importanza nel mantenimento del prodotto in soluzione: l’aggiunta di aminoacidi come lisina o arginina o di surfattanti come sodiododecilfosfato possono aumentare la solubilità.

Es.Effetto della concentrazione di argininasulla solubilità del TPA

ARGININA-FOSFATO

SO

LU

BIL

ITA

’

AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH

pH

hG

H m

g/m

l

Es. Solubilità del GH in funzione della variazione di pH

Tamponi usati per la formulazione di prodotti biotecnologici sono di solito fosfato, acetato, citrato

4 5

CONSERVAZIONE DELLE PROTEINE TERAPEUTICHE

SOLUZIONE ACQUOSA

FORME LIOFILIZZATE

TAVOLETTE

BIBLIOGRAFIA

•Wierda et al.”Immunogenicity of biopharmaceuticals in laboratory animals, Toxicology,(158)71-74,2001

•Bickel et al.”Delivery of peptides and proteins through the blood-brain barrier”,Advanced Drug Delivery Reviews,(46)247-79,2001

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•Stayton et al.”Molecular engineering of proteins and polymers for targeting and intracellular delivery of therapeutics”, Journal of Controlled Release,(65)203-220,2000

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