biotehnoloogiaalase hariduse
TRANSCRIPT
- 1. Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp (EIBE)
taotleb biotehnoloogiaalase hariduse edendamist Euroopa Liidu
liikmesriikide ldhariduskoolides ja kolledites. Sellega
suurendatakse inimeste biotehnoloogiaalaseid oskusi, svendatakse
arusaamist ning juhitakse neid sisulistele mttevahetustele.
EIBE kontaktisikud
AUSTRIA
I Rainhart Berner, Hhere Bundeslehr- und Versuchsanstalt fr Chemische Industrie Wien, Abt. fr Biochemie, Biotechnologie und Gentechnik, Rosensteingasse 79, A-1170 WIEN.
BELGIA
I Vic Damen / Marleen Van Strydonck, R&D Groep VEO, Afdeling Didactiek en Kritiek, Universiteit Antwerpen, Universiteitsplein 1, B-2610 WILRIJK.
g_BULGAARIA
I Raytcho Dimkov, Faculty of Biology, University of Sofia " St. Kliment Ohridski" , Dr. Tzankov blvd. No.8, 1421 SOFIA.
^gTEHHI
I Hana Novkov, Pedagprogram, Faculty of Education UK, Pedagogical Centre, Prague, Konevova 241, CZ-13000 PRAGUE 3.
TAANI
I Dorte Hammelev, Frederiksberg HF kursus, Sonderjyllands alle 2,
DK-2000 FREDERIKSBERG.
I Lisbet Marcussen, Nyborg Gymnasium og HF kursus, Skolebakken
13,DK-5800NYBORG.
II
IIRI
I Catherine Adley / Cecily Leonard, University of Limerick, LIMERICK.
EESTI
I Tago Sarapuu, Science Dldactics Dept., Instltute of Molecular and Cell Biology, University of Tartu, Vanemuise 46,51014 TAJRTU.
II
PRANTSUSMAA
I Gerard Coutouly, LEGTP Jean Rostand, 18 Bouievard de la Victoire, F-67084 STRASBOURG Cedex.
I Laurence Simonneaux / Jean-Baptiste Puel, Ecole Nationale de Formation Agronomique, Toulouse-Auzeville, Boite Postale 87, F-31326 CASTANET TOLOSAN Cedex.
SAKSAMAA
I Horst Bayrhuber / Eckhard R. Lucius / Ute Harms / Angela
KroB, Institut fur die Pdagogik der Naturwissenschaften an der
niversitt Kiel, OlshausensttaBe 62, D-24098 KIEL.
I Michael Schallies, Paedagogische Hochschule Heidleberg, Im
Neuenheimer Feld 561, D-69120 HEIDELBERG.
IOgnian Serafimov, UNESCO-INCS, c/oJrg-Zrn-
Gewerbeschule, Rauensteinstrafie 17, D-88662 BERLINGEN.
I Eberhard Todt, Fachbereich Psychologie, niversitt Giefien, Otto-
Behaghel-StraBe 10, D-35394 GIEGEN.
KREEKA
I Vasilis Koulaidis / Vasiliko Zogza-Dimitriadi, Dept. of Education, Unit of Science, University of Patras, Rion, GR-26500 PATRAS
li
ITAALIA
I Antonio Bargellesi-Severi /Alessandra Corda Mannino/ Stefania Uccelli , Centro di Biotecnologie Avanzate, Largo Rosanna Benzi 10,1-16132 GENOVA.
LUKSEMBURG
I John Watson / Laurent Kieffer, Ecole Europeenne de Luxembourg, Departement de Biologie, 23 Bouievard Konrad Adenauer, L-1115 LUXEMBOURG.
HOLLAND
I David Bennett / Ana-Maria Bravo-Angel, Cambridge Biomedical
Consultants, Schuytstraat 12, NL-2517 XE DEN HAAG.
I Fred Brinkman, Hogeschool Holland, Dept. of International Re-
lanons, PO Box 261, NL-1112 XB DIEMEN.
I Liesbeth van de Grint / Jan Frings, Hogeschool van Utrecht,
Educatie Centrum voor Biotechnologie, FEO, Afdeling Exacte
Vakken, Biologie, Postbus 14007, NL-3508 SB UTRECHT.
POOLA
I Anna Stemicka, Department of Biology, University of Gdansk, Bazynskiego 1, GDANSK.
&
HISPAANIA
I Maria Sez Brezmes / Angela Gmez-Nirio / Rosa M. Villamarin, Facultad de Educacin, Universidad de Valladolid, Geologo Hernandez Pacheco 1, ES-47014 VALLADOLTD.
ROOTSI
I Margareta Johansson, Freningen Gensyn, PO Box 37, S-26881
SVALV
I Elisabeth Strmberg, Ostrabo Gymnasiet, Kaempegatan 36, S-
45117 UDDEVALLA.
VEITS
I Kirsten Schlueter, Instutut fuer Verhaltenswissenschaft, Eidgenoessische Technische Hochschule IfV/ETH, ETH Zentrum TUR, Turnerstr. 1, CH-8092 ZUERICH
[S SUURBRITANNIA li
I Wilbert Garvin / jill Turner, Northern Ireland Centre for School Biosciences, NIESU, School of Education, The Queen's University of Belfast, BELFAST, BT7 1HL.
I John Grainger / John Schollar / Caroline Shearer, National Centre for Biotechnology Education, The University of Reading, PO Box 228, Whiteknights, READING, RG6 6AJ. I Jenny Lewis, Centre for Studies in Science and Mathematics Education, University of Leeds, LEEDS, LS2 9JT Queen's University of Belfast, BELFAST, BT7 1LQ. I Paul Wymer, Society for General Microbiology, Marlborough House, Basingstoke Road, READING, RG7 1EA.
EIBE koordinaator
Horst Bayrhuber, Institut fr die Pdagogik der Naturwissenschaften an der niversitt Kiel, OlshausensttaBe 62, D-24098 KIEL, Germany. Telefon: + 49 431 880 3129/8803151 (EIBE sekretr: Ute Harms). Faks: + 49 431 880 3132.
2 ;1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Mikroorganismid ja molekulid
D Q O
o
1
Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Sisukord
Veebilehekljed
*-*-****--*
I Ohutusnuded, autoriigused, mooduli koostajad ja tnu4
I Kesolevast moodulist
Sissejuhatus5
I Mudelite valmistamine
DNA mudeli valmistamine6
Mikroorganismide mudelid8
I DNA eraldamine
Bakteriaalse DNA eraldamine10
DNA eraldamine sibulast12
I Tootlikud mikroorganismid
Amlaasi tootmine mulla
bakterite poolt14
Tsellulaasi tootmine16
Antibiootikumi tootmine18
I Mikroorganismide elutegevuse jlgimine
Leivataigna valmistamine20
Seotud prmirakud22
Mikrobioloogiline ktteelement 25
I Geenilekanne
Geenilekanne bakterite
konjugatsioonil27
Looduslik geenilekanne
Agrobacterium tumefaciens abil31
I Lisa 1
Mikrobioloogilised
stmed34
I Lisa 2
Mikrobioloogiaalased
tvtted35
I Lisa 3
Loflliseeritud kultuurigaampulli avamine40
Vhesed teadusharud arenevad sama kiiresti, kui biotehnoloogia. Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupi (EIBE) ppematerjale levitatakse elektrooniliselt. See vimaldab neid parandada, kaasajastada ja seejrel minimaalsete kulutustega levitada.
Kesolev ja ka jrgnevad EIBE moodulid on ktte saadavad kogu Euroopas ning mujal maailmas interneti aadressil:
ht tp://www.rdg.ae.uk/EIBE
Kik EIBE moodulid on veebis postskript-failidena (PDF). See tagab illustratsioonide hea kvaliteedi ja hesuguse kujunduse sltumata arvutitbist (Macintosh, kaasaarvatud Power PC, Windows, DOS vi Unix).
PDF failid on viksemad, kui need, milles nad esialgselt koostati - see aga vimaldab neid kiiremini internetist ktte saada. EIBE moodulitega tutvumiseks vajate programmi Adobe Acrobaf Reader, mis on tasuta levitatav mitmetes keeltes (hollandi, inglise, prantsuse, saksa ja itaalia keeles). Programmi saate kas EIBE vi Adobe' kodulehekljelt:
http://www.adobe.com/
Nimetatud tarkvaraga saate EIBE mooduleid nii vaadata kui vlja trkkida. Seejuures on dokumentide otsimine ja nendes orienteerumine suhteliselt lihtne.
Mrkus: Adobe ja Acrobat on firma Adobe Systems Incorporated registreeritud kaubamrgid. Macintosh on firma Apple Computer Incorporated registreeritud kaubamrk.
EIBE Biotehnoloogilase Hariduse Huroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid
A Ohutusnuded
EIBE moodulites on ptud vlja tuua kik teadaolevad ohud ja soovitatud vastavaid ettevaatusabinusid.
Vimaluse korral on praktilistes tdes kasutatud kige tavalisemaid meetodeid, mille puhul kehtivad ldised ohutusnuded. Krgendatud ohtlikkusega katsete puhul on sellele alati thelepanu juhitud. Kesoleva ppematerjali lisas 2 jagatakse ohutusalastid tiendavaid juhiseid.
Vaatamata sellele peavad kasutajad olema valmis selleks, et esitatud ohutusnuetes vivad esineda ksikud eksitused ja puudujgid. Lisaks sellele on ka ohutusnuded erinevates riikides mnevrra erinevad. Seetttu peavad kik praktiliste tde korraldajad alati iseseisvalt hindama riske ja jrgima kohalikke ohutusnudeid ja kehtivaid seadusi, sltumata EIBE materjalides esitatud soovitustest.
Juhul, kui ei ole eraldi mrgitud, eeldatakse, et:
praktilisi tid viiakse lbi vastavalt sisustatud laborites;
tvahendeid kasutatakse vastavalt nende kasutuseeskirjadele;
tavaliste praktiliste tde lbiviimisel, niteks kuumutamisel, jrgitakse ettevaatusabinusid; jrgitakse nudeid kemikaalide ja elusorganismide kasutamisel;
kui on vhegi vajalik, kantakse kaitseprille; pilased on omandanud ldised ohutusnuded, niteks kemikaalide ning mikroorganismidega ttamisel.
Autoriigused
EIBE ppematerjalid on autorikaitse all. Moodulite koostajatele laienevad kik autoriigused (" Designs, Patents and Copyright Act" , UK 1988, lige 77).
ppe-eesmrkidel kasutamine. piotstarbel on lubatud EIBE materjale kasutada ja paljundada kas elektrooniliselt vi trkitud kujul. Seejuures peab materjalide levitamine olema tasuta vi katma ksnes paljunduskulud. Kigil juhtudel tuleb ra
mrkida mooduli koostajad ja tunnistada nende autoriigusi.
Teised kasutusvimalused. Materjale vib levitada isikult isikule mittekommertslikel eesmrkidel. Keelatud on moodulite elektrooniline levitamine listide, huvigruppide, postiaadresside, tellimuste, veebi vi teiste analoogsete masslevivahenditega, mis kahjustavad autorite huve.
Kommertslikel eesmrkidel ilma autorite eelneva nusolekuta on moodulite kasutamine rangelt keelatud. Materjalide osaliseks vi terviklikuks kasutamiseks ja nende mistahes kujul paljundamiseks palume kontakteeruda:
Ute Harms
Institut fr die Pdagogik der
Naturwissenschaften an der Universitt Kiel
Olshausenstr. 62
D-24098 KIEL
Germany
Telefon: + 49 431 880 3151
Faks: + 49 431 880 3132
E-mail: [email protected]
Mooduli koostajad
Catherine Adley
The University of Limerick, Eire.
Jan Frings
Hogeschool van Gelderland, The Netherlands.
Cecily Leonard
The University of Limerick, Eire. 9 Eckhard R. Lucius (koordinaator) IPN an
der Universitt Kiel, Germany. 9 Marleen van Strydonck
The University of Antwerp, Belgium.
Paul E.O. Wymer
The Wellcome Trust for Medical Science London, The United Kingdom.
Kujundus, illustratsioonid, trkikiri, tiendavad
tekstid ja toimetamine: Dean Madden, Caroline
Shearer, NCBE, The University of Reading, The
United Kingdom.
Illustratsioonide ja tpograafia autoriigused
Dean Madden, 1997
Eestikeelne tlge Tago Sarapuu, 1999
Tnu
EIBE on eriti tnulik alljrgnevatele isikutele, kes aitasid kaasa kesolevate materjalide valmimisele. Liesbeth van de Grint (Hogeschool van Utrecht, Holland) ja John Schollar (National Centre for Biotechnology Education, The University of Reading, Suurbritannia) korraldasid rahvusvahelise seminari, kus katsetati selle mooduli materjale. Jrgnevad petajad vtsid seminarist osa ja tegid esialgsesse materjali palju kasulikke mrkusi: E. Vergauts, L. Daniels, L. Neels (Belgia), Dorte Hammelev (Taani), Lucienne Diemer, Gerald Coutouly (Prantsusmaa), Thomas JeB, Dr. U. Schnack, Dr. E. Lipkow (Saksamaa), A. de Graaf, Guus Smid, J. Gradener (Holland), Rebecca Weston, Jane Gent, Derek Mackle, Sarah Whitethread, Maggie Parson (Suurbritannia).
4 ' 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Kesolevast moodulist
Kesolev moodul sisaldab valiku tjuhendeid, mida vib petamisel kasutada kas ksikult vi komplektina. Mitmete Euroopa riikide tegevpetajad ja haridusspetsialistid on andnud oma panuse nende materjalide koostamisse, mis on teoks saanud Euroopa Komisjoni DGXII toetusel EIBE (Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupi) egiidi all.
Kiki tjuhendeid on Euroopa mitmete koolide petajate poolt ulatuslikult katsetatud.
Tjuhendid hlmavad jrgmisi teemasid:
DNA molekuli ja erinevate mikroorganismide lihtsad mudelid. Need nitavad nimetatud biossteemide philisi omadusi ning vimaldavad pilastel tajuda mikroorganismide suurust.
DNA eraldamise lihtsad, ohutud ja odavad meetodid. Sellega omandavad pilased geneetilise materjaliga ttamise phi-vtted.
Autorid on pdnud pakkuda nii lihtsamaid kui keerukamaid lesandeid lootes, et iga bioloogiapetaja leiab nende hulgast just endale sobiva. Kolm lisa sisaldavad philist informatsiooni koolilaborites rakendatavatest mikrobioloogia-alastest tvtetest.
Lhitulevikus on vimalik saada tiendavaid lisamaterjale, mis ksitlevad mooduli seost Euroopa Liidu liikmesriikide erinevate ppekavadega, ohutusnudeid ja tvahendite kttesaadavust.
Kik kommentaarid, mis puudutavad kesolevat moodulit, on vga teretulnud. Eriti oodatakse aga petajate thelepanekuid. Kik mrkused ja ksimused palume saata aadressil:
Dr. Eckhard R. Lucius
Institut fr die Pdagogik der
Naturwissenschaften an der Universitt
Kiel
Olshausenstr. 62
D-24098 KIEL
Germany
Telefon: + 49 431 880 3137
Faks: + 49 431 880 3132
E-mail:[email protected]
3.Rida katseid, mis nitavad:
mikroorganismide olemasolu keskkonnas ja kasulikke tvesid;
mningaid mikrobioloogilisi produkte (ensmid ja antibiootikumid).
Kaks katset on kvalitatiivsed, ks uurib kvantitatiivselt ensmide moodustumist.
Mitmed katsed mikroorganismide elutegevuse tagajrgedest - lihtsast leivataignast ja krimisprotsessi uurimisest kuni prm-seente ainevahetuse aktiivsuse mtmiseni. Kiki katseid on vimalik edasi arendada laiaulatuslikeks uurimistdeks. pilaste motiveerimiseks on suurem rhk asetatud biotehnoloogia rakenduslikule tasandile, mitte ksnes teoreetilisele kljele.
Kaks loodusliku geenilekande esitust, milles tutvustatakse geenitehnoloogia phimtteid.
Et kaks praktilist td sisaldavad antibiootikumide tootmist, toimet ja resistentsuse lekannet, siis on vastavate teemade kohta esitatud ka lisainformatsioon.
EIBE Biotehnoloogiaalasc Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid S
DNA mudeli valmistamine
Eesmrk
Nidata DNA (desoksribonukleiinhappe)ehituse peamisi omadusi.
T planeerimine
Mudeli valmistamiseks kulub umbes 30 minutit. Varuge rohkem aega, kui vljaliked tuleb ka vrvida.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
krid;
tugev paberiliim, kleeplint vi vike klammerdaja {kahepoolne kleeplint on sobiv, kuigi mne aja mdudes vib see lahti tulla);
niit (valmis mudeli lesriputamiseks ja sildi kinnitamiseks).
Mrkus: selleks, et mudel oleks tugevam, vib kahe desoksriboosidest ja fosfaatrhmadest " selgroo "' omavahel kokku .
Tkik
Ligake vlja desoksriboosidest ja fosfaatrhmadest moodustunud " selgrood"A ja B.
Ligake vlja paardunud lmmastikaluste ribad.
Murdke ribad otstest tagasi, nagu nidatud krvaloleval joonisel.
Liimige iga riba ks tagasimurtud ots " selgroo"A nummerdatud kastikesse. Ribade jrjekord ei ole oluline.
Liimige ribade teised otsad " selgroo"B vastavalt nummerdatud kastikestesse.
Kinnitage niidiga valminud DNA biheelik-si klge silt. Soovi korral vib mudelile kinnitada ka joonisel toodud sildi.
Tnu
Kesoleva mudeli koostamisel on aluseks vetud mudel, mille tegi Austraalia riikliku uurimisorganisatsiooni CSIRO teadusklubi " Double Helix" . EIBE on tnulik CSIRO-le alguprase idee ja loa eest nende mudelit kasutada.
Esimene positsioon
Teine positsioon
Kolmas positsioon
PHE SERTYRCYS
PHE SERTYRCYSLEU SER
LEU SERTRP
LEU PROHISARG
LEU PROHISARG
LEU PROGLNARG
LEU PROGLNARG
ILETHRASNSER
ILETHRASNSER
ILETHRLYSARG
MET THRLYSARG
VAL ALAASPGLY
VAL ALAASPGLY
VAL ALAGLUGLY
VAL ALAGLUGLY
Geneetiline kood
DNA molekuli kolm jrjestikust nukleotiidi mravad ra he kahekmnest aminohappest, mis on esitatud tabeli keskosas kolmetheliste lhenditena.
DNA struktuur
Desoksribooside ja fosfaatrhmade omavahelisel hinemisel on moodustunud DNA molekuli kaks " selgroogu" . Nende vahel on neli erinevat lmmastikalust: tmiin (T); tsutosiin (C); adeniin (A) ja guaniin (G), mis on omavahel paarikaupa hendatud vesiniksidemetega.
61. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotelmoloogiaatese Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
CD
Faardunud lmmastikaluste ribad
41846503267710IPS
pV
tps
Biotehnoloogiaalase
Hariduse
Euroopa Initsiatiivgrupp
DNA MUDEL |
(F) Fosfaatrhm (S) Desoksriboos
Adeniin
2505710186055ps
ps
Tstosiin
Guaniin
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid * 7
Mikroorganismide mudelid
jr jr
kieit-kiririeiriririr
Mikroorganismide mtmete hindamisel esineb pilastel tihti raskusi. Ka on mikroskoobi kahemtmelise vaate alusel keeruline mista nende organismide ruumilist ehitust.
Mudelite tegemine annab ettekujutuse nii mikroorganismide ehitusest kui suurusest.
Tulemused on paremad, kui pilased peavad tegema oma mudelid, mitte jrgima detailset valmistamise juhendit. Seetttu on see lesanne sobilik kodutks (rohkem aega ja materjale).
Mrkus: Neile, kes arvavad, et mudelite valmistamine on liiga lihtne tegevus, viks elda, et molekulaarbioloogias on mudelitel pikk ja vljapaistev ajalugu - kuigi tnapeval tehakse neid peamiselt arvutitega.
Eesmrgid
Nidata lambdafaagi ehituse olulisi jooni ja bakterite mitmekesisust.
Aidata pilastel mista viiruste ja bakterite suhtelist suurust.
T planeerimine
Bakteriofaagi mudeli tegemiseks kulub aega umbes 30 minutit, kuid kui tuleb ka vrvida, vtab t rohkem aega. Sltuvalt tegijast kulub aega kas tund vi pisut rohkem. Mrkus: See t sobib hsti kodutks.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
pikud, milles on kirjeldatud viiruste ja bakterite ehitust;
materjalid mudeli valmistamiseks, nt. lmikukile, paksem paber, pakkematerjalide jgid, lauatennise pallid, helmed jne;
krid;
liim, kleeplint vi vike klammerdaja;
vrvid.
Tkik
Viirused
Kasutage lambdafaagi mudeli tegemiseks nidist. Kopeerige pise kontuurid lmikukile-le ja ligake see vlja. Voltige pise mudel kokku ja kleepige kiiresti kuivava liimiga. DNA biheeliksi kujutamiseks kasutage paksu niiti vi traati. Sabandi tegemiseks kasutage joogikrt (realistlikuma mudeli saamiseks kasutage painduvat soonilist krt, mida saab pikemaks venitada).
Bakterid
Bakterite (kepikeste ja kokkide) mudelite
tegemiseks kasutage olemasolevaid materjale.
Iga mudeli juures:
mratlege philised struktuurid, mis on eksponeeritud, nt. rakumembraan, geneetiline materjal;
mrake organismi suurus, mida mudel kujutab;
melge, kuidas teistele lihtsalt seletada suhtelisi suurusi, niteks: kui bakterid oleksid selle mudeli suurused, siis vrreldes nendega peaksime meie olema majasuurused.
Tiendavalt
pilastel vib lasta teha ka taime- vi looma-raku mudeleid, mida saaks kasutada prokaroo-tide ja eukarootide vaheliste erinevuste ja endosmbioosi (eukarootide arvatava evolutsioonilise prinemise) teooria selgitamisel.
Lisakirjandus
Mudelite valmistamist ksitletakse ka jrgmises ajakirjas:
Nicholl, L. and Nicholl, D. (1987) Modelling the eukaryotic chromosome: a stepped ap-proach. Journal of BiologicalEducation 21 (2) 99 -104.
81. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
-3075305109855Nidis lambdafaagi mudeli valmistamiseks
Kopeerige lambdafaagi pise kontuurid lmikukilele.
Ligake see piirjooni mda vlja, voltige kokku ja liimige servadest kiiresti kuivava liimiga.
Rakumembraan
Bakteriaalse DNA eraldamine
:ft * * jf'
k **** ~k ~k
Kesolevas ts kasutatakse bakterite rakukestade lhkumiseks lsosmi (ensmi) ja rakumembraanide purustamiseks ning nukleiinhapete (DNA ja RNA) vabastamiseks kodus tarvitatavat pesuvahendit.
Eesmrk
Eraldada Escherichia coli bakteri tvest K-12nukleiinhapped.
Ettevalmistused
Vhemalt 4 peva varem tuleb bakterikultuurid stmele kasvama panna (vaid kllaldaselt kasvanud kultuurid annavad piisava koguse nukleiinhapet).
T planeerimine
Kogu katse jaoks tuleb arvestada umbes 50 minutit. See sisaldab ka 30 minutit ooteaega, mille jooksul baktereid tdeldakse ensmiga.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
Escherichia coli K-12 tiskasvanud kultuur;
lsosmi pulber - vajatakse vikseimat kogust, mida on vimalik spaatli otsaga vtta;
6 ml klma etanooli (tstuslik metlalkohol on ka sobiv);
0,5 ml kodus kasutatavat vedelat pesuvahendit, nt. PrzV (Henkel), Woolite (Reckitt & Colman);
klviaas;
3 ml destilleeritud vett;
2 katseklaasi;
pipett vi 1 ml plastmassist sstal lsosmi lahuse lisamiseks;
veevann 60 C;
termostaat vi veenu 37 C veega.
Tkik
Vhemalt neli peva varem pange Escbe-richia coli K-12 bakterikultuur kasvama.
Lisage 5 ml bakterisegule vike kogus lsosmi ja segage hsti.
Hoidke segu 30 min. temperatuuril 37 C.
Lisage bakterisegule 0,5 ml kodus kasutatavat pesuvahendit.
Hoidke segu 2 min. veevannis temperatuuril 60 C.
Jahutage segu mne minuti jooksul klmas vees.
Valage klm etanool vga aeglaselt ja ettevaatlikult segu pinnale.
Nukleiinhapped (DNA ja RNA) sadestuvad lemisse (etanooli) kihti.
Tiendavalt
DNA-d vib vrvida, nt. metleensinise vi atsetoortseni lahusega.
Ohutusnuded
Bakterikultuuridega ttamisel tuleb jrgida ohutusnudeid. Kuuma vee kasutamisel (punkt 5) tuleb olla ettevaatlik.
Tnu
Kesolev t phineb katsel, mis viidi lbi Hertel et ai. ja Sbmuth et ai. (1987) poolt, kes eraldasid DNA Bacillus subtiilsest. Tname prof. Joseph Lengelerit (Osnabrckist), kes soovitas selles katses kasutada pesuvahendit.
Joonisel on kujutatud bakterirakk, DNA ja rakustruktuurid (rakukest ja rakumemb-raan), millesse toimivad lsosm ja pesuvahend.
Kromoeoom
Ribosoomid -^ valgusnteesi toimumise kobad
Rakukest
0,5 (im
511810198120Plasmiidid -vikesed DNA rngad
10 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotchnoloogiaalasc Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
5 ml bakter segu
Klm vesi
Klm etanool
Pesuvahend
Loksutage katseklaasi, nii et sisu seguneb
DNA
ja RNA
Vhemalt neli peva varem pange stmesse kasvama Escherichia coli K-12 kultuur.
Lisage 5 ml bakterisegule vike kogus lsosmi ja segage hsti.
Hoidke segu
30 min. temperatuuril 37C.
Lisage bakterisegule 0,5 ml kodus kasutatavat vedelat pesuvahendit.
Hoidke segu 2 min. 60 C veevannis.
Jahutage segu mni minut klmas vees.
Valage klm etanool vga aeglaselt ja ettevaatlikult segu pinnale.
Nukleiinhapped (valged niidikesed) sadestuvad lemisse (etanooli) kihti.
EIBE Biotehnoloogiaalasc Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 11
DNA eraldamine sibulast
k-kit-kit-kjrifirir-k-kirir-k
Selles katses eraldatakse DNA ja RNA taimerakkudest. Kigepealt purustatakse kude mehhaaniliselt. Koduses majapidamises kasutatava nudepesuvahendiga lhutakse nii rakumembraan kui ka tuuma-membraanid. Raku jnused eraldatakse filtreerimisega. Lahusesse jvad nukleiin-happed ja lahustunud valgud. Valkude lagundamiseks kasutatakse ensmi, seejrel sadestatakse nukleiinhapped jklma etanooliga.
Eesmrk
Eraldada nukleiinhapped sibula kudedest. Mrkus: Katses esitatud meetodil eraldatud nukleiinhape ei ole vga puhas. T peamiseks eesmrgiks on kudedest DNA eraldamise ivtete tutvustamine.
Ettevalmistused
Etanool peab olema jklm. Selleks asetage etanool plastmassist pudeliga klmkappi vhemalt 24 tundi enne katset.
T planeerimine
Katse kestab umbes 35 minutit, sealhulgas veevannis hoidmine 15 minutit.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
kgikombain vi mikser;
terav juurviljanuga ja likelaud;
suur plastmassist lehter;
veevann 60 C;
kann jga;
kaks 250 ml nud;
kohvifilter (mitte kasutada laboratoorset
filterpaberit);
keskmise suurusega sibul;
10 ml nudepesuvahendit (mitte kasutada
kontsentreeritud vahendit);
3 g keedusoola;
100 ml destilleeritud vett;
lOml plastpipett vedelike mtmiseks;
katseklaas;
klaasist segamispulk;
2-3 tilka proteaasi, nt. Neutrase (Novo
Nordisk);
umbes 6 ml jklma etanooli (tstuslik
metlalkohol on ka sobiv).
Tkik
Lisage keedusool nudepesuvahendile. Kallake juurde niipalju destilleeritud vett, et kokku oleks lahust 100 ml.
Peenestage sibul, kuid mitte viksemateks kui 10 X 10 mm tkkideks.
Valage peenestatud sibula tkkidele soola ja pesuvahendi segu.
Asetage nu 60 C veevanni tpselt 15 minutiks.
Jahutage segu 5 minutit jveevannis, segage pidevalt.
Kallake segu mikserisse ja kivitage see mitte kauemaks kui 5 sekundiks.
Filtreerige segu teise nusse. Jlgige, et vaht ei ummistaks filtrit.
Lisage 2-3 tilka proteaasi katseklaasi, milles on umbes 6 ml saadud segu. Loksutage seda veidi aega.
Valage jklm etanool ettevaatlikult mda katseklaasi seina nii, et see moodustaks pealmise kihi sibula ekstrakti peal. Jtke katseklaas mneks ajaks seisma.
Nukleiinhapped sadestuvad lemisse (etanooli) kihti.
Tiendavalt
DNA-d vib vrvida, nt. metleensinise vi atsetoortseiini lahusega.
DNA-d saab eraldada ka mnest loomsest koest (nt. tursamarjast, maksast, vasika harknrmest). Mikseri asemel lhutakse kude uhmris uhmrinuiaga (koos kvarts-liivaga). Nii jvad DNA ahelad terveks.
Ohutusnuded
Erilisi ohtusid selle katsega ei kaasne, kuid sibula peenestamisel ja mikseri kasutamisel tuleb olla ettevaatlik.
Tnu
See meetod on adapteeritud Alison Rasmusseni ja Robert Mathesoni raamatust " A Source-book of Biotechnology Activities"(1990), National Association of Biology Teachers / North Carolina Biotechnology Center. ISBN: 0941212092.
Raamatu saate tellida aadressil: NABT, 11250 Roger Bacon Drive #19, Reston, Virginia 22090, USA.
12 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloq%iaaIase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
.;
10 ml noudepesuvahendit
3 g keedusoola
100 ml vett
1 keskmise suurusega sibul
Lisage sool pesuvahendile ning seejrel lisage niipalju vett, et segu ruumala oleks 100 ml. Segage hoolikalt, et sool lahustuks.
Lisage peenestatud sibul soola ja pesuvahendi segule.
Nudepesuvahend lhub rakumembraani ja tuumamembraanid vabastades DNA.
Kuumutage segu 60 C veevannis 15 minutit.
Krge temperatuur kiirendab protsessi ...
... ja denatureerib DNaasid, mis lhustavad DNA-d.
Jahutage segu jnus mne minuti jooksul.
... aga selle toimel vib laguneda ka DNA ahel ..
seega on jahutamine jvannis vajalik.
kohvifilter
jklm etanool
proteaas
i j
hoolikalt segada
Kivitage mikser mitte kauemaks kui 5 sek.
Mikser aitab lhkuda sibula rakud, kuid liiga tugev segamine tkeldab ka DNA.
Filtreerige segu.
Filtreerimisega saame DNA ja valkude lahuse.
Lisage 2-3 tilka prote-aasi umbes 10 ml sibula ekstraktile ja segage hoolikalt.
Proteaas lagundab lahuses olevad valgud.
Lisage seguga vrdne kogus jklma etanooli, valades see ettevaatlikult sibula ekstrakti pinnale.
Etanool peab olema JKLM - hoitud eelnevalt 24 tundi klmkapis.
DNA
eraldamine sibulast
DNA sadestub lemisse (etanooli) kihti.
DNA ei lahustu etanoolis, seetttu muutub selle sade lemises kihis nhtavaks.
DNA RNA
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 13
Amlaasi tootmine mulla bakterite poolt
-tt iiA * ** '* * * *Jr~k it
Trkliseahel koosneb glkoosijkidest, mis on hendatud nii, et moodustub kas lineaarne (amloos) vi hargnenud polmeer (amlopektiin). Neid polmeere lagundavad ensmid amlaasid, mida toodavad mitmed organismid, kaasaarvatud bakterid ja seened. On avastatud, et paljud mikroorganismid on sobilikud nende ensmide tootmiseks. Kesolevas katses vaadeldakse amlaaside saamist mulla bakterite abil.
Eesmrk
Jlgida looduslikke mulla baktereid, kestoodavad amlaasi.
Vajalikud eelteadmised
pilased peavad valdama mikrobioloogiaalaseid ldisi tvtteid, kaasaarvatud neid, mis tagavad steriilsuse. Kasuks tulevad ka teadmised trklise ja joodi reaktsioonist.
Ettevalmistused
Joodilahus peab olema valmistatud vhemalt pev varem, sest joodikristallide tielik lahustumine vtab aega.
Trkliseagar ja steriilse veega pudelid peavad olema valmis vahetult enne katse algust. Mullaproovid tuleks enne kasutamist hu kes kuivatada.
Steriilsed vatitampoonid. Poest ostetud vatitampoonide plastmassist vars ei kannata autoklaavimist ja mnda tpi vatitupse vib olla antiseptiliselt tdeldud. Seetttu tehke ise vatitampoonid ja autoklaavige need kas McCartney pudelis vi alumiiniumfooliumis 15 minutit temperatuuril 121 C.
T planeerimine
Petri tasside ettevalmistamine: 45 min. Tulemuste vaatlemine 2-3 peva hiljem: 15 min.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
steriilne Petri tass 15-20 ml steriilse agar-stmega; valmistatud tstuslikust stmeagarist 0,2% lahustuva trklise lisamisel;
lg kuiva mulda, mis on vetud 10 cm sgavuselt;
joodilahus, mis on saadud lg joodikristallide ja 2 g kaaliumjodiidi lahustamisel 300 ml destilleeritud vees;
15 ml steriilset destilleeritud vett McCartney pudelis;
steriilsed omatehtud vatitampoonid;
viltpliiats Petri tasside mrgistamiseks.
14 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotchnoloqj>iaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Tkik
1. Pange 1 g kuiva mulda 15 ml destilleeritud vette ja segage hoolikalt mulla peenestamiseks.
2.
3.
Kasutades steriilset vatitampooni katke trldiseagari pind mulla seguga. Kirjutage Petri tassile oma initsiaalid, kuupev ja klvatud materjali pritolu. Hoidke klvatud tassi mberpratuna 2-3 peva 30 C juures. Kallake joodilahust ettevaatlikult inkubeeri-tud tassile kattes selle umbes 1 mm kihiga. Kohad, kus on ikka veel trklist, vrvuvad sinkjas-mustaks (joodi molekulid sisenevad glkoosijkidest koosneva trklise helikaal-se ahela keskossa). Helepruunid alad (joodilahuse vrv) mrgivad koloonia ri,
juhul kui mikroorganismid on lagundanud trklise.
Ohutusnuded
NB! Mnes riigis on keelatud avada tasse, milles on kasvatatud tundmatuid mikroorganisme. Vajadusel vib kasutada mulla asemel Bacillus subtiiis'e kultuuri. Katset lbi viies ja kultuuride hvitamisel tuleb jrgida mikrobio-loogiaalaseid ldisi ohutusreegleid. Klvatud tassidelt ei soovitata tundmatuid mikroorganisme edasi klvata. Jood on toksiline ja seetttu tuleb olla ettevaatlik.
(D
Valmistage ette Petri tass trkliseagariga.
Amulaasi tootmine mulla mikroorganismide poolt
1402080533400Kuiv muld
Destilleeritud vesi
Segage 1 g mulda 15 ml destilleeritud vees.
853440283210Klvake steriilse vatitampooniga mulla segu stmele.
Hoidke tassi 2-3 peva 30 C juures.
Hoidke tassi mberpratuna
Hele ala mrgib trklise puudumist
Kasutage joodilahust, et nha, kus on trklis lagunenud.
Tsellulaasi tootmine
it *k **k k k- k kr k- ~k -kk
Tselluloosirikaste jtmete kasutamisel fermentatsiooni protsessi lhteainena on suur thtsus. Sellega muudetakse kasutud lhteained mitmeteks vrtuslikeks produktideks. Enamik tsellulaasi-dest (ensmid) saadakse tstuslikult seene Trichoderma reesei fermentat-sioonil. Kesolevas ts kasutatakse bakterit Cellulomonas. See kasvab Petri tassil kiiremini ja moodustuvat tsellulaasi on kergem mta.
Eesmrk
Korraldada katse bakteri Cellulomona/etsellulaasi koguse hindamiseks.
Ettevalmistused
Ette valmistada Cellulomonas'e kultuurid toite -lahuses (nt. McCartney pudelis) klassis kasutamiseks. Seda tuleks teha 2-3 peva enne planeeritud katset. Kultuure peaks hoidma 25-30 C juures.
Karboksmetltselluloosi sde koosneb 0,5 g karboksmetltselluloosist (tselluloosi lahustuv vorm); 0,1 g NaNO,; 0,1 g K2HP04; 0,1 g KC1; 0,05 g MgS04; 0,05 g prmi ekstraktist ja 0,1 g glkoosist 100 ml vees. Sde muudetakse tahkeks agari lisamisega 1,7%-ni.
T planeerimine
Petri tasside ettevalmistamine ja bakterikultuuri
klvamine 45 min.
Tulemuste vaademine 2-3 peva hiljem 15 min.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
Cellulomonas sp. kaldkultuur;
steriilne Petri tass, mis sisaldab 15 ml karboksmetltselluloosi (vt. " Ettevalmistused" );
steriilne vesi (McCartney pudelis);
2 steriilset 1 ml pipetti vi filtriga pipett ja 2 steriilset otsikut;
jtmenu, mis sisaldab 5% Chlorate I lahust, nt. Domestos (Lever);
Kongo punase vesilahus (1 mg/ml);
IM naatriumkloriidi lahus;
etanool (korgipuud steriliseerimiseks);
5 mm lbimduga korgipuur;
termostaat 25-30 C;
viltpliiats Petri tasside mrgistamiseks.
Tkik
Kastke 5 mm lbimduga korgipuur korraks alkoholi ja viige seejrel mneks sekundiks leegi kohale. NB! Hoidke korgi-puuri horisontaalselt, et leegid ei leviks mda vart lespoole ega pletaks ktt.
Kergitage tassi kaant hest servast pisut ja ligake agarist auk vlja.
Kahe augu saamiseks korrake 1. ja 2.' punktis esitatut.
Mrgistage mlemad augud, nt. thtedega C [Cellulomonas) ja V (steriilne vesi, kont-rollauk).
Viige hte auku bakterikul tuuri ja teise steriilset vett, kasutades mlemal juhul steriilset pipetti. Kasutatud pipetid pange desinfitseerivasse lahusesse.
Hoidke tasse kuni ndal aega temperatuuril 25-30 C. Kui tasse on 30 C juures hoitud 48 tundi tekivad bakteri Cellulomonas'e elutegevuse tagajrjel kuni 16 mm lbimduga vrvusetud alad.
Prast inkubeerimist ...
7.Vrvige stme pind tassis Kongo punaselahusega 15 min., seejrel vrvitustage seesoolalahusega 10-15 min. Vrvusetapiirkondades on karboksmetltsellulooslagundatud (3-1,4-glkaanideks. Viimasekoostises on kuni seitse glkoosijki.Vrvuseta alade diameetrite mtmisegasaab vrrelda tselluloosi lagundamiseaktiivssi.
Tiendavalt
2.
3.
1. Tassil olevatesse aukudesse vib pipeteeri-da mulla segu, et jlgida tsellulaasi moodustamist mulla bakterite poolt. Sama vtet vib katsetada tstuskku tsellulaasi valmistamiseks. Tselluloosi lagundamist vib jlgida mitmel peval kasutades selleks rohkem tasse.
16 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1.
Steriliseerige
korgipuur
kuumutades
seda koos
etanooliga
tuleleegis.
NB! Etanool on kergestisttiv!
Vatitups
Klvake hte auku Cellulomonas e kultuuri ja teise steriilset vett.
Hoidke tasse 48 tundi temperatuuril 30 C.
Kinnitage tassi kaas kleeplindiga
5. Vrvige tass.
Mtke selle ala diameeter, kus tselluloos on lagunenud.
4.
Ligake agarist vlja ja eemaldage kaks ringi moodustades sellega stmesse kaks auku.
Ohutusnuded
Katse tegemisel tuleb jrgida mikrobioloogia-alaseid ldisi ohutusreegleid ja steriilsuse nudeid.
NB! Kui kasutatakse mullaproove (vt. " Tiendavalt" , 1.), vivad kohalikud seadused keelata klvatud tasside hilisema avamise.
EM3E Biotehnoioogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 17
Antibiootikumi tootmine
Paljud mikroorganismid toodavad antibiootikume - aineid, mis prsivad bakterite kasvu. Alates penitsilliini avastamisest 1940-ndatel aastatel (seenest Penicillium) on need ained vga efektiivselt aidanud videlda haiguste vastu. Tnapeval toodetakse kige thtsamad antibiootikumid bakterist Streptomyces.
Eesmrk
Vaadelda antibiootikumi streptomtsiini tekkimist Streptomycesgriseufest ja selle mju mitmetele mikroorganismidele.
Vajalikud eelteadmised
Antibiootikumide pritolu ja mju; resistentsuse tekkimine ja levik (vt. jrgnevaid mrkusi).
Ettevalmistused
Vajatakse aktiivseid Streptomyces griseu/c kultuure. Neid tuleb 2-3 peva kasvatada 15-20 ml agarstmega tassil. Eelnevalt peab olema ette valmistatud kultuur, mis neile tassidele klvatakse. Selleks viige kaldkultuurilt klviaasatis Streptomyces^ 1 ml steriilsesse stmesse.
Pildil: kolmepevane Streptomyces griseuse kultuur (vasakul). Kontrollorganismid on (levalt): Candida utilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, BaciHus mycoides ja Escherichia coli.
Seejrel pipeteerige see katseklaasi, milles on 5 ml steriilset sdet. Hoidke klvi 24 tundi temperatuuril 30 C.
Klvake Petri tassidele peva seisnud Streptomyces griseuse kultuur tmmates heainsa vertikaalse joone vasakule servale, nii et parem pool jb steriilseks.
Hoidke tasse 3-4 peva temperatuuril 30 C.
Lisaks sellele valmistage ette kontrollorganismi-de klvid (nt. BaciHus mycoides, Candida utilis, Escherichia coli K-12, Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens).
T planeerimine
Petri tasside ja kuivatava materjali ettevalmistamine: 60 min. +
esialgse Streptomyces'e kultuuri kasvatamine: 24 tundi ning seejrel veel 72-96 tundi. Tassidele klvamine: 20 min. Kasvatamine: 24-72 tundi.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu).
termostaat 30 C;
klviaas;
steriilne Petri tass, millel on 15-20 ml agarsdet. Sellele on tmmatud triip bakteriga Streptomyces griseus ning lastud kasvada 48-72 tundi (vt. " Ettevalmistused" );
kontrollorganismidena valik jrgmistest bakteritest kaldkultuuridena:
Candida utilis (prm), DSM 02361
Micrococcus luteus (bakter), DSM 20030
Pseudomonas fluorescens (bakter),
DSM 50090
Ballus mycoides (bakter), DSM 2048
Eschenclxa eolt K-12 (bakter), DSM 498.
NB! Jrgige kohalikke seadusi mikroorganismide kasutamise kohta koolis. Sellele vib olla mnes riigis piiranguid.
18 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaaiase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Tkik
1.Igale ettevalmistatud tassile Streptomyces'tkultuuriga klvake kontrollorganismidjrgnevalt:
Steriliseerige klviaas tmmates seda lbi Bunseni pleti leegi ja laske aasal pisut jahtuda.
Kastke aas kontrollorganismi kultuuri ning tmmake sellega ks horisontaalne triip tassi paremale poolele Streptomyces z vertikaalse joone krvale. Jlgige, et vrreldes Streptomyces1 & klviga oleksid jooned tmmatud tisnurga all ning algaksid selle lhedalt.
NB! Klviaas ei tohi Streptomyces'e kultuuri puudutada!
c)Steriliseerige klviaas tuleleegis ja korrakepunkte a-c kigi kontrollorganismidega.
Hoidke tasse 2 peva temperatuuril 30 C.
Vaadelge tasse.
Ohutusnuded
Katse tuleb lbi viia laboris jrgides mikrobio-loogiaalaseid ldisi ohutusreegleid. Katse kigus saadud antibiootikumi kogus ei ole ohtlik.
Mrkus
Streptomyces griseus toodab antibiootikumi streptomtsiini, mis difundeerub mbritsevasse stmesse. Streptomtsiin ja teised sama rea antibiootikumid prsivad valgusnteesi, inakti-veerides bakteri ribosoomide viksema (30S) alamksuse. Mned organismid on sellele antibiootikumile tundlikud (Bacillus mycoides, Escherichia coli, Micrococcus luteus), teised mitte {Pseudomonas fluorescens). Streptomtsiin ei mjuta prmseeni (Candida utilis), kuna nad on eukaroodid, kelle ribosoomid on teistsugused.
5447030118745
2953385643255
ks tmm vasakule
Valmistage ette Petri tass Streptomyces griseus'e klviga 3-4 peva enne katse tegemist.
Kontroll-kultuurid
Steriliseerige traadist klviaas
rge puudutage Streptomyces'^
Tmmake kontroll-orgnismiga joon kuni Streptomyces'e jooneni
Kirjutage tassi phjale
161290252730Kinnitage tassi kaas kleeplindi ga
Korrake seda teiste kontrollorganismidega ja rge unustage iga kord klviaasa steriliseerimast.
Hoidke tassi mberpratuna 2-3 peva temperatuuril 30 C.
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 19
iir*+ *
Leivataigna valmistamine
* ,Ki:- i i- >-
Biotehnoloogia rakendamise heks vanimaks niteks on leivategemine, mida tendavad leiud Vana-Egiptusest (4000 eKr). Suurbritannias tehakse leiba traditsiooniliselt nisujahust, veest ja soolast, vahel lisatakse ka rasvainet. Taigna massisse " ptakse lksu"prmseened. Amlaasid hakkavad niisutatud jahus muutma trklist glkoosiks, millest toituvad seotud prmi-rakud.
Lisaks vajab prm lmmastikuallikat. Jahu valgu (gluteeni) osalisel hdrol-sil tekivad peptiidid ja aminohapped. Prmi elutegevuse tulemusena anaeroobses keskkonnas tekivad ssinikdi-oksd ja alkohol.
Tnu gluteenile on taigen elastne ning ssinikdioksiid ei pse vlja, vaid suurendab humulle taignas, mistttu see kerkib.
Eesmrk
Katsete abil uuritakse retsepti erinevate komponentide mju jahu valkudele ja ensmidele.
T planeerimine
Sltuvalt tingimustest (temperatuurist jm.) kulub aega umbes 50 minutit.
Tvahendid ja materjalid
1 leiva kohta
1 g kuivatatud prmi; 75 g krgema sordi jahu; 50 ml vett;
lisaained vastavalt soovile, nt. askorbiinhape, OC-amlaas, kaaliumbromaat (vt " Tiendavalt" );
nu taigna segamiseks; jmedad klaaspulgad segamiseks; kaks 100 ml mtsilindrit; kell.
Tkik
Lahustage kuivatatud prm vees. Lisage jahu ja segage hsti.
Veeretage taignast vorstikujuline rull ja asetage see hte mtsilindrisse.
Mrkige les taigna krgus silindris iga kmne minuti jrel. Tehke vaadusi tunni aja jooksul.
Tiendavalt
Kuidas mjutavad taigna kerkimist erinevad prmseened (nt. tavaline kuivatatud prm vrreldes vrske prmiga)?
Kuidas mjutavad taigna kerkimist erinevad jahusordid (nt. krgema sordi jahu, milles on vrreldes esimese ja teise sordi jahuga palju gluteeni, kuid vga vhe a-amlaasi)?
Missugune on taignaparandaja askorbiinhappe (vitamiin C) mju taigna kerkimisele? Askorbiinhape reageerib ensmidega taignas piirates S-S-sidemete moodustumist gluteeni aminohappejkide vahel. (Lisage retseptile 1 g askorbiinhapet.)
Kuidas mjutab taigna kerkimist a-amlaasi lisamine? Kuidas neid erinevusi seletada?
Taignaparandaja kaaliumbromaat soodustab S-S-sidemete tekkimist gluteenis krvuti olevate aminohappejkide vahel, mille tulemusel saadakse elastsem ning paremini kerkinud taigen. Muidugi nrgendab liigne paisumine taignat. Vrrelge taignaid, mis on valmistatud selle lisandiga ja ilma.
Sool pidurdab proteaaside tegevust ja ei lase gluteenil muutuda kleepuvaks massiks, mis ei suuda siduda ssinikdioksiidi. Liigne sool moodustab tugevaid ioonilisi sidemeid valgumolekulide krvalahelatega, vhendades nende elastsust. Tulemusena saame kva leiva. lemrane sool takistab ka prmseente kasvu. Proovige leida taigna optimaalne soolasisaldus.
20 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Lisakirjandus
Onfood and cooking. The science and lore of the kitchen by Harold McGee (1991) Harper Colns Publishers. ISBN: 0 00412657 2.
Pritchard, P.E. (1992) Studies on the bread-improving mechanism of fungal alpha-amylase Journal of Biological Education 26, (1) 12-18
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp19991. moodul: Mikroobid ja molekulid 21
Seotud parmirakud
r jr *k *# it j?
Harilik nn. pagariprmi Saccharomyces cerevisiae ei ole vimeline kasutama laktoosi. Ensm |3-galaktosidaas lagundab laktoosi glkoosiks ja galaktoosiks. Kui prmseened on seotud koos selle ensmiga, siis on nad vimelised kasvama laktoosi sisaldavas keskkonnas. Prmseened kasutavad moodustunud kahest suhkrust (glkoosist ja galaktoosist) esmalt glkoosi. Kui glkoosivarud on ammendatud, kohandub prmi ainevahetus laktoosi teise lagunemisprodukti -galaktoosi - kasutamiseks. Prmi elutegevus on kergesti jlgitav. Selleks mdetakse eralduva gaasi (ssinikdioksiidi) mahtu, mis tekib krimisprotsessis.
Eesmrk
Uurida kvantitatiivselt krimisprotsessi.
Ettevalmistused
Naatriumalginaat on vees vhelahustuv. Seda tuleb lahustada segades kuumas vees. Seetttu tuleb naatriumalginaadi lahus eelnevalt valmistada. Kui on vaja naatriumalginaadi lahust silitada, siis on soovitatav see kigepealt autoklaavid. NB! Kigi lahuste tegemiseks kasutada destilleeritud vi deioniseeritud vett, sest kraanivees olevad kaltsiumioonid phjustavad alginaadi sadestu-mist.
T planeerimine
Seotud prmirakkude valmistamiseks kulub 10-15 minutit ja krimisprotsessiks kuni ndal.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
10-15 ml 4% naatriumalginaadi lahust;
100 ml 1,5% kaltsiumkloriidi lahust;
10 ml pipett;
teesel;
kaks 200 ml nud;
kaks 250 ml koonilist kolbi;
kaks vljalaskeavaga korki;
kaks suurt (nt. 500 ml) nud;
100 ml mtsilinder;
steriliseerimislahus, nt. naatriummetabisul-
fiidi lahus vi valmistoode, nt. Milton
(naatriumhpokloriidi lahus, Procter &
Gamble);
Kaltsiumalginaadis seotud parmirakud.
ca 1 liiter 13% naatriumkloriidi lahust
(sobib tavaline keedusool);
100 ml sdet, mis sisaldab 2 g glkoosi,
1 g prmi ekstrakti ja lg peptooni;
100 ml sdet, mis sisaldab 2 g laktoosi,
g prmiekstrakti jalg peptooni;
ml (3-galaktosidaasi, nt. YMcto^ym (Novo Nordisk); vrske vi kuivatatud pagariprm.
Tkik
Valmistage seotud ensmi ja prmi graanulid jrgnevalt:
Segage vikeses nus kuivatatud prm 25 ml destilleeritud veega. Katke nu ja jtke 10 minutiks toatemperatuuril seisma.
Teises vikeses nus segage naatriumalginaadi lahus ja [3-galaktosidaas. Lisage sellele 10 ml prmisegu.
Vtke natuke prmi, ensmi ja alginaadi segu pipetti ja lisage seda tilkhaaval teises suures nus olevale kaltsiumkloriidi lahusesse.
Laske kaltsiumkloriidi lahusel, millesse on seotud ensm koos prmirakkudega,
10 minuti jooksul kvastuda.
22 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
5. Eraldage teeselaga graanulid lahusest ja loputage neid kraanivee all.
Klmkapis vib graanuleid silitada steriilses vees kuni kolm peva.
Krimisprotsessi lbiviimine:
Steriseerige kolvid metabisulfaadi lahusega vi mne teise sarnase kemikaaliga. Prast steriliseerimist loputage kolbe veega.
Valage kolbidesse steriilset sdet: hte kolbi glkoosi sisaldavat sdet (kontroll-kolb) ja teise laktoosi sisaldavat sdet.
Pange vrdne kogus seotud prmi graanu-leid mlemasse kolbi.
Asetage kolbidele korgid.
Hoidke kolbe temperatuuril 21-25 C. Juhtige tekkiv gaas lbi 13% naatriumklorii-
di lahuse (ssinikdioksiid ei lahustu selles lahuses). Kogunenud gaasi maht registreerige sobiva ajavahemiku jrel. 6.Tehke graafik, mille ks telg thistab eraldunud gaasi hulka ja teine aega.
Tiendavalt
Vib kasutada erineva pritoluga prmi, nt. veiniprmi vi pagariprmi.
Muutke (3-galaktosidaasi kontsentratsiooni, temperatuuri ja teisi muutujaid.
Ohutusnuded
Gaas vib klaasnudes olla ohtlik. Kontrollige, et krimisproduktil (CO ) oleks piisavalt vaba vljaps. Keemilisel steriliseerimisel tuleb olla hoolikas ja jrgida kemikaalide kasutusjuhised.
Rakkude sidumiseks kasutatakse kige laialdasemalt kaltsiumalginaati. Meetod sobib ka elavate rakkude puhul, kuna see toimub " pehmetes"tingimustes. Meetodi kasutusalad hlmavad elusate vi surnud rakkude sidumist bioreaktorites ning taime protoplastide ja taimeloodete sidumist koekultuuris paljundamiseks (ehk mikropaljundamiseks). Samuti kasutatakse seda hbridoomi rakkude sidumiseks monokloonsete antikehade tootmisel ja ensmide vi ravimite kohale- kinnitamiseks (vt. tabel jrgmisel lehel).
Seotavad rakud vi ensmid segatakse kigepealt naatriumalginaadi lahusega. Moodustunud segu tilgutatakse lahusesse, mis sisaldab mitme-valentseid katioone (tavaliselt Ca2+). Niipea, kui tilgad langevad lahusesse, moodustavad nad koheselt ruumilise struktuuri, mis seob rakud alginaadi kolmemtmelisse vresse.
Lisakirjandus: Smidsrod, O. & Skjk-Brask, G. (1990) " Alginate as an Immobilization Matrix for Cells."Trends in Biotechnology 8 (3) 71-78.
EIBE Biotehnoloogiaahise Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 23
Joonistage graafik, mille ks telg thistab eraldunud gaasi hulka ja teine aega.*
Ssinikdioksiid
13%
naatriumkloriidi lahus
Laktoosi lahus, millele on lisatud peptoon ja prmiekstrakt
Prmirakud kasutavad ensmi poolt tekitatud suhkruid moodustades ssinikdioksiidi ja etanooli.
PARM
Ensm lagundab laktoosi glkoosiks ja galaktoosiks
Prm, laktaas ja naatriumalginaadi lahus.
Nited alginaadiga seotud rakkude kasutusaladest (Smidsrod & Skjak-Brsek, 1990)
RakudToode/eesmrkRakudToode/eesmrk
Bakterid
Erwinia rhapontici Pseudomonas denitrificans Zymomonas mobilis
Tsanobakterid Anabena sp.
Seened Kluyveromyces bulgaricus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces bajanus
Vetikad
Botryococcus braunii
Isomaltuloos Joogivee puhastamine Etanool
Ammoniaak
Laktoosi hdrols Etanool Sampanja tootmine
Ssivesinikud
Taimerakud
Chatharanthus roseus
Mitmed taimed Taime protoplastid
Imetajate rakud
Hbridoomid Langerhansi saarekesed Fibrobkstid vi lmfoomirakud
Alkaloidid vhktve raviks Kunstseemned Rakutehnoloogia, mikroskoopia
Monokloonsed antikehad Insuln/implantatsioon Interferoonid (CX vi (3)
24 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Mikrobioloogiline ktteelement
k-k-kit-kir-k-k-kirlr ir -k -k ie
Aastakmneid peeti elektrit tootvaid mikroorganisme bioloogilisteks kurioosu-mideks. Tnapeval ennustavad teadlased nende organismide kasutuselevttu kellades ja kaamerates, Kolmanda Maailma energiaallikates ja tstusjtmeid elektriks muutvates bioreaktorites. Kesolevas ts kirjeldatud ktteelement annab nrka elektrivoolu. Vool tekib prmseente rakkude hingamisprotsessi elektrontransportahe-las olevate elektronide energia arvelt. Ktteelementi saab kasutada hingamis-reaktsioonide uurimiseks uudsel viisil. Lisainformatsiooni leiate ajakirjast: " BIO/ technology Education" , kide 1, number 4, lk. 163-168.
Eesmrgid
Tutvustada hingamisreaktsioonide uurimis-vimalusi.
Uurida mikroorganismide hingamist mjutavaid faktoreid.
Nidata, kuidas orgaanilisi jkaineid saab kasutada elektri tootmiseks.
Ettevalmistused
Lahused tuleb eelnevalt valmistada. Leotage katioonvahetusmembraani enne kasutamist destilleeritud vees 24 tundi. Kuivatatud prm-seeni vib taaselustada siis, kui ktteelement on juba kokku pandud.
T planeerimine
Ktteelemendi kokkupanemiseks kulub umbes 30 minutit.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
Perspex (ICI) ktteelement, ligatud 4 mm paksusest lehest;
kaks neopreenist tihendit;
sobiva suurusega katioonvahetusmemb-raan (membraani vib korduvalt kasutada, kuid see sulab autoklaavimisel);
kaks sobiva suurusega ssinikfiibrist elektroodi;
kaks sobiva suurusega hukese klaasriide tkki;
kaks 10 ml plastmassist pipetti;
kamber ja tagasein liimitakse omavahel kokku akvaariumikiti (silikooni) abil
-201295121920klaasriie isoleerib elektroodi membraanist
Mikrobioloogilise ktteelemendi kokkupanek (tpsed mtmed ei oma thtsust - joonisel oleva ktteelemendi suurus on ca 55 X 55 mm)
Kttelemendi saate osta:
NCBE
The University of
Reading
POBox 228
Reading RG6 6AJ, UK
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 25
anood
katood
4:
O elektroni this
4
metleensinine (redutseeritud)
Ktteelemendi tphimte
glkoos
ssinikdioksiid
kaaliumheksa-tsanoferraat
Fe(CNV|-
r
Fe(CN)^
^'metleensinine (oksdeeritud) 4 H+
^
katioonvahetusmembraan
Kokkupandud ktteelement
Petri tassi kaas, millele asetada ktteelement;
kaks elektrijuhet koos kinnitusklambritega;
0-5 V voltmeeter vi multimeeter ja/vi madalpingemootor;
krid;
Kigi alljrgnevate lahuste valmistamisel tuleb vee asemel kasutada 0,1 M fosfaatpuhvri lahust pH 7,0.
kuivatatud prm, millele on lisatud 0,1 M fosfaatpuhvri lahust. Tulemusena saadakse pudrutaoline mass (mitte lisada glkoosi-lahust enne, kui prm on puhverlahuses elustatud);
5 ml 10 mM metleensinise lahust;
5 ml 1 M glkoosilahust;
10 ml 0,02 M kaaliumheksatsanoferraadi (III) lahus (nimetatakse ka punaseks veresoolaks).
0,1 M fosfaatpuhvri lahuse (pH 7,0)
3,29
tegemiseks lahustage 4,08 g Na9HP04 j NaH2P04 500 ml destilleeritud vees.
Tkik
Ligake ssinikfiibrist kaks elektroodi.
Ligake klaasriidest kaks tkki nii, et need sobiksid ktteelemendi sisse.
Pange ktteelement kokku, nagu on nidatud joonisel.
Asetage kokkupandud ktteelement Petri tassi kaanele, et lekkida viv vedelik maha ei lheks.
Segage kokku " prmipuder" , glkoosilahus ja metleensinise lahus. Kandke segu pipetiga ktteelemendi hte kambrisse.
Teisele poole pipeteerige kaaliumheksatsanoferraadi (III) lahust.
7.
hendage voltmeeter vi multimeeter klambritega elektroodide klge. Sellist tpi ktteelemendid annavad 0,4-0,6 V pinge. Mrkus: Vool peaks tekkima kohe. Kui nit on 0, kontrollige hendusi ja seda, et ssinikfiibrist elektroodid ei puutuks kokku katioonvahetus-
Tiendavalt
1.Suurema pinge saamiseks vib hendadakokku mitu ktteelementi. Ktteelemendisuuruse (vi elektroodide pindala) suurendamine annab tugevama voolu, pinge eimuutu.
Vib kasutada erinevaid stmeid ja/vi prmisorte, nt. veiniprmi vi pagariprmi. Mrkus: Turvalisuse mttes ei soovitata selles ktteelemendis kasutada teisi mikroorganisme.
Uurida vib ka temperatuuri mju ktteele-mendile. (rge unustage kontrollkatseid, mis on vajalikud sellist laadi vrdluste tegemiseks).
Ohutusnuded
Kaaliumheksatsanoferraat (III) on mrgine ja selle kasutamisel on kaitseprillide kandmine kohustuslik. Lahuse silma sattumisel loputage neid rohke veega ja prduge arsti poole. Lahuse allaneelamise korral anda kannatanule palju juua ja viia arsti juurde. Kasutatud lahuste hvitamisel jrgida kohalikke seadusi.
Tnu
Mikrobioloogilise ktteelemendi loojaks on Dr. Peter Bennetto Londoni King's Kolledist.
26 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Geenilekanne
bakterite
*
konjugatsioonil
kA
* # * -
Looduses kanduvad geenid bakterite vahel le mitmel viisil. Ilmselt on need mehhanismid tekkinud kiiresti muutuvate keskkonnatingimuste tttu. Reeglina asuvad kige liikuvamad geenid plasmiidides. Plasmiidid on vikesed ringikujulised DNA molekulid, mis replitseeruvad iseseisvalt. Nad sisaldavad vikest arvu geene, mis vimaldavad bakteril lagundada ohtlikke aineid keskkonnast, nt. raskmetalhhendeid ja antibiootikume.
Looduses esineb kolm tpi geenilekan-net:
Trasformatsioon - vaba DNA levtmine rakku mbritsevast keskkonnast;
Transduktsioon - DNA lkumine hest rakust teise bakteriofaagi abil;
Konjugatsioon - spetsiaalsete F-plasmiidi-de lekanne lbi kitsa kanalikese (sugufib-rilli), mis hendab kahte bakterirakku (joonis 1).
Geenitehnoloogid kasutavad kiki neid meetodeid (eriti transformatsiooni) selleks, et sisestada bakteritesse teatud geene.
Jrgnevas katses uuritakse konjugatsiooni kahe bakteritve vahel.
NB! Kesolevas ts jlgitakse looduslikult toimuvaid protsesse, baktereid ja plasmiide. Seetttu ei ole siinkohal tegu geenitehnoloogia ega insenergeneetikaga.
Joonis 1: Konjugatsioon ja F-plasmiidide lekanne bakterirakkude vahel.
1. Lahtikeerdumata ja
replitseerunud F-plasmiid
Plasmiid sisaldab sugufibrilli moodustavate valkude geene
F-plasmiid
sugu-fibrill
Doonor
bakteri-kromosoom
2. Uheahelaline DNA liigub lbi sugufibrilli retsipiendi rakku
i
3. Komplementaarne DNA on snteesitud ja on moodustunud uus F-plasmiid
Retsipient
EIBE Biotchnoloogiaalasc Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 27
Doonor 'Escherichia coli
Lae* tviLac> 9een
plasmiidis
F-plasmiidid
Niinimetatud F-plasmiidid (F thendab fertiilsust, viljakust) sisaldavad geene, mis vimaldavad plasmiidide lekannet doo-norrakust retsipientrakku (bakterite konju-gatsioonil).
F-plasmiidid vivad kanda ka teisi geene. Niteks kesolevas uurimuses sisaldavad doonorrakud plasmiidi, mida nimetatakse F Lae. See geen vimaldab lagundada laktoosi (bakterit nimetatakse seetttu Lac+ tveks). Retsipient, millel see plas-miid puudub, ei suuda laktoosi lagundada (nimetatakse Lae tveks).
MacConkey agariga tassidel saab neid kahte tve eristada vrvuse jrgi: doonor moodustab punase koloonia, retsipient aga valge (joonis 2).
Doonori ja retsipiendi rakkude kokkusegamisel kanduvad F Lae plasmiidid le donoorilt retsipiendile. Sellisel viisil omandab retsipient vime laktoosi lagundada ning teda nimetatakse transkonjugandiks.
Geneetiline " trikk"vimaldab eristada doonorit, retsipienti ja transkonjuganti.
Joonis 2:
Retsipient
Escherichia coli
Lae tvi
Doonor ja retsipient MacConkey agaril
Retsipiend on kromosomaalne geen, mille tttu antibiootikum streptomtsiin talle ei mju. Doonortvel sellist geeni ei ole ja streptomtsiin peatab ta kasvu. Retsipiendi ja transkonjugandi mramiseks kasutatakse nende vimet kasvada streptomtsiini sisaldavas keskonnas (joonis 3).
Retsipient " " " " " "Escherichia coli K-12CSH36'~~~ DoonorEscherichia eol K-12L17f*>v~AILae* geen plasmiidisStreptomtsiini resi geen kromosotentsuse smis/rPr, Vikesed valged i kolooniad/ " 'T ( J v" '' Kolooniad puuduvadJoonis 3: Doonori,Punasedkolooniad^/retsipiendi jatranskonjugandieristamine(lx.Lae geen /____^^^--"plasmiidis/MacConkey agaril, mis sisaldab streptomtsiini~3TStreptomtsiini resistentsuse geen kromosoomis0 Transkonjugant
28 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalse Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Eesmrgid
Tutvuda bakterigeneetikaga.
Vimaldada pilastel arutleda geenitrans-formatsiooni teemadel, nt. resistentsuse levik antibiootikumide suhtes ja riski anals geenitehnoloogias.
Ettevalmistused
Valmistada ja steriliseerida jrgmised vahendid:
3 vikest koonilist kolbi (100 ml) 10 ml toitelahusega;
steriilne MacConkey agar, millele on lisatud streptomtsiinsulfaati (200 mg/ml). 50 C jahutatud agar valatakse Petri tassidele (igale tassile 15-20 ml).
Kasutatakse jrgnevaid kultuure: doonortvi: Escherichia coli K-12 CSH36 (DSM number 6253) retsipienttvi: Escherichia coli K-12 LI 7 (DSM number 6254)
Neid looduses esinevaid tvesid saab niteks Saksamaa rakukultuuride ja mikroorganismide kogust (DSM). Mlemat kultuuri vljastatakse klmutatult-kuivatatult dofiliseeritult) klaas-ampullides. Ampulle peab avama igesti, et nende sisu ei saastuks ega ohustaks avajat (Lisa 3). Doonorkultuuri on raske kaldagaril silitada, seega on vaja vrskelt elustatud kultuuri.
Valmistage ette doonorkultuur ja retsipientkultuur:
Klvake hte kolbi doonortve (kleepige kolvile silt " Doonor" ) ja teise retsipient-tve (sildiga " Retsipient" ).
Hoidke mlemat kolbi pev temperatuuril 37 C. Kui vimalik, kasutage loksu-tiga veevanni.
Nende kahe kultuuri " paaritamine"toimub jrgnevalt:
Lisage steriilse pipetiga 0,8 ml doonorkultuuri kolmandasse kolbi, mis sisaldab 10 ml steriilset toitelahust.
Samasse kolbi lisage teise steriilse pipetiga 0,2 ml retsipientkultuuri.
3.Kleepige kolbidele sildid ja hoidke kolbe16-24 tundi temperatuuril 30 C.
NB! Kolbe vib loksutada vaid VAGA. AEGLASELT, sest sugufibrillid vivad geda loksutamise ajal katkeda.
Steriilsed vatikorgid valmistatakse vatitki mhkimisel mber puutiku. Autoklaavige korke kas McCartney pudelis vi alumiiniumfooliumis 15 minutit temperatuuril 121 C.
T planeerimine
Stmete valmistamine:60 minutit
Eelnev inkubeerimine:48tundi
Klvamine:15 minutit
Kasvatamine:24tundi
Tulemuste registreerimine:20 minutit
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
termostaat 30 C;
steriilne Petri tass, millel on 15-20 ml streptomtsniga MacConkey agarit;
jrgnevad eelkasvatatud kultuurid:
doonorkultuur
retsipientkultuur
doonori ja retsipiendi kultuuride
segu;
3 steriilset omatehtud vatitampooni;
vike nu desinfitseeriva vahendiga, nt. 3% Domestoie. (Lever) lahusega, kuhu visata kasutatud vatitampoonid;
viltpliiats klaasnude thistamiseks.
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 29
Tkik
Vtke ks tass, milles on streptomtsniga MacConkey agar. Tmmake viltpliiatsiga tassi alakljele kolm joont, nii et moodustuks kolm vrdset sektorit.
Iga sektori keskele joonistage umbes
10 mm lbimduga ring. Mrgistage ks neist thega " D"(doonorkultuur), teine thega " R"(retsipient) ja kolmas thega " S"(eelneva kahe segu - transkonjugantide moodustumiseks).
Klvake vastavaid kultuure steriilsete vatitampoonidega mrgitud sektoritesse. Vtke iga kord uus vatitampoon, kasutatud vatitampoon visake desinfitseerivasse lahusesse.
Laske vedelikul mne minuti jooksul agarisse imbuda. Katke tassid ja hoidke neid mberpratuna temperatuuril 30 C ks kuni kaks peva.
Tiendavalt
Lhtudes sellest tst on vimalik teha mitmeid kvantitatiivseid lisakatseid:
Mrata doonorkultuuri ja retsipientkultuu-ri optimaalne suhe lahjendades doonorkul-tuuri ja retsipientkultuuri steriilses Ringeri lahuses vi 10" 3 M MgSO lahuses.
Mrata optimaalne konjugatsiooni aeg.
Ohutusnuded
Katse tuleb lbi viia laboris jrgides mikrobio-loogiaalaseid ldisi ohutusreegleid ja steriilsuse nudeid.
Tnu
See katse on lihtsustatud variant prof. Patricia Neversi poolt korraldatust (Hamburgi likool), mis omakorda phines E. Hrle ja R. Haus-manni tl (Freiburgi likool).
30 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Looduslik geenilekanne Agrobacterium tumefaciensi abil
^iff m - 'M -kk k -M ik #f * * *
Taimede kasvajad phjustavad palju probleeme pllumajanduses, iluaianduses ja viinamarjakasvatuses. Tihti tekivad kasvajad pisitillukeste vigastuste tagajrjel, mis vivad tuleneda klmakahjustustest, mullaharimisest vi pookimisest.
Sajandivahetusel mrgati, et teatud kasvajate teke on seotud bakteriaalse nakkusega. Baktereid hakati nimetama Agrobacterium tumefaciens (ladina keeles: agar = maa; tumor = paisuma; facere = tegema). Alles 1970-ndatel aastatel avastati keerukad suhted taimede ja Agrobacterium tumefaciens'! vahel.
Kasvajaid tekitavad bakterid sisestavad vikese osa oma geneetilisest infost (he plasmiidi) taimerakku, kus see llitub peremeesraku kromosoomistikku. Tulemusena hakkavad nakatunud rakud jrgima bakterite poolt pealesunnitud programmi. Taimerakud jagunevad ja neist areneb kasvaja, millest saab bakterite elukoht. Kasvajarakud toodavad bakterite elutegevuseks vajalikke hendeid.
Taimearetajad kasutavad Agrobacterium'i osavtul toimuvat geenitransformatsiooni soovitavate geenide lekandmiseks taimedele aeganudvaid ristamiskatseid teostamata. Selle tulemusel on Agrobacterium'i modifitseeritud vormidest saanud oluline geenitehnoloogia vahend.
Agrobacterium on pulgakujuline ja sama pikk kui E.'coli (umbes 1-3 " jn). Agrobacterium tumefaciens silitab patogeensu-se elades mulla lemises hukllases kihis. Agrobacterium rndab ainult kaheidulehelisi. Ta suudab rakku siseneda ja seda nakatada vaid vigastuste kaudu, sest bakterid ei suuda tungida lbi taimeraku kesta. Kahjustunud rakkude mahl " meelitab ligi"bakterid ja aktiveerib geenitransformatsiooni. Bakterid paljunevad haavapiirkonnas ja tungivad rakuvaheruumi, kus nad kinnituvad rakukestadele. Agrobacterium tumefaciens''! plasmiid kandub le ja selle DNA luhtub taime kromosoomi. Bakteri geenilt toodab taim opeiine (nt. guanido-amiinhapet), mida Agrobacterium kasutab ssiniku- ja lmmastikuallikana.
Eesmrk
Kesolevas katses nakatatakse kalanhoe vi Bryophyllurtfi taimi (mlemaid on kerge kasvatada ja paljundada) looduslikult esineva Agrobacterium^igz erinevates tingimustes ning nelja ndala jooksul jlgitakse kasvaja arengut. Katsetada vib jrgmisi variante:
A.Nakatamise viis:
tehke taime vastavasse piirkonda haav ja nakatage seda kohe Agrobacteriunflgz; tehke haav, kuid. kandke Agrobacterium peale jrgmisel peval;
tehke haav ja nakatage kohe Agrobacte-rium'iga. ning katke see niiske pabersalvrti-
ga;
tehke haav, kuid rge nakatage seda bakteritega;
kandke Agrobacterium tervete taimede samasse piirkonda.
B.Nakatamise koht:
vars, lehe pind,
vrse tipp.
Ettevalmistused
1.Peremeestaimede paljundamine (pilasedsaavad seda iseseisvalt teha, vimalusekorral isegi kodus);
2.Kasvukeskkonna ja Agrobacterium tume-facieni kultuuride ettevalmistamine. Vrsked kultuurid tuleb vhemalt 2 ndalat ennekasutamist ette valmistada.
T planeerimine
Taimede kasvatamine (vajadusel): 4 kuud Agrobacterium kultuuri ettevalmistamine: 2 ndalat
Taimede nakatamine Agrobacteriumg2c. 20 min. Kasvaja jlgimine: 3-4 ndalat
EIBE Biotehnoloqgiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 31
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
destilleeritud vesi (McCartney pudelis);
klvinel;
klvi aas;
binokulaarne mikroskoop;
krid;
klgeseotavad sildid ja viltpliiats;
paberktertid;
kleeplint;
etanool instrumentide steriliseerimiseks
leegis;
bakteri Agrobacterium tumefaciens kultuur
(agaril);
3-4 kuu vanused kalanhoe vi Bryophyllum,
taimed.
Steriliseerige nelapea.
NB! Etanool on kergesti-sttiv!
0
Kandke bakterid
kriimustatud
piirkonnale.
15119351469390Kriimustage taime pinda nelaga.
Vtke baktereid Agrobacterium tumefaciens.
Kuumutage klviaasa leegis enne ja prast kasutamist.
Tkik
Selles katses nakatatakse taimi mitmel viisil (vt. sissejuhatavad ligud ja instruktsioonid).
Mrgistage iga taim sildiga, millel on kuupev ja informatsioon, mida taimega on tehtud. Kui vaja, eristage taime nakatatud osad klgeriputatavate siltidega.
Asetage taimed hsti valgustatud kohta ja hoidke neid niiskena (mitte le kasta).
Jlgige ja registreerige kasvajate arengut jrgmise 4-6 ndala jooksul. Uurige kasvaja-koe tkikest binokulaarse mikroskoobi all ja vrrelge seda kahjustamata lehe koega.
Taimede nakatamine Agrobacterium'iga.
Meetod 1 (vigastatud taimepind nakatatakse kohe)
Kastke klvinel alkoholi ja steriliseerige see leegis. Kriimustage taime pinda kas ks vi mitu korda.
Nakatage vigastatud pind Agrobacteriun/ig^.. Selleks kuumutage klviaasa ja laske sellel natuke aega jahtuda. Vtke aasaga veidi valget bakterikultuuri ja mrige vigastatud aladele. Kuumutage uuesti klviaasa.
Meetod 2 (taimed nakatatakse 24 tundi prast kriimustuste tegemist)
Vigastage taimi (vt. meetod 1).
Katke haavad Agrobacteriun/igz. jrgmisel peval.
Meetod 3 (prast nakatamist kaetakse vigastatud ala niiske pabersalvrtikuga)
Tehke kriimustused ja nakatage taime nagu lalpool kirjeldatud (meetod 1).
Ligake paberktertist paberitkid ja niisutage neid steriilse veega. Asetage paber vigastatud alale ning kinnitage kleeplindiga. Hoidke paberkate niiskena 2 peva jooksul.
Meetod 4 (vigastatud ala ei nakatata)
1.Tehke taimele kriimustused samasse kohta, kuhu esimese meetodi korral. Seejrel tehke kriimustused teise kohta ja katke need niiske paberiga. rge kandke vigastatud alale Agrobacteriunfyt.
Meetod 5 (nakatamine ilma vigastamata)
rge kriimustage taimi.
Kasutage klviaasa, et kanda AgrobacteriunTxt taime hte vi mitmesse piirkonda.
32 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotetmoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Ohutusnuded
Seda katset peab lbi viima laboris jrgides bakterikultuuridega ttamise ldisi ohutusnudeid.
Tnu
Katse ttas vlja Uta Nellen Koolibioloogia ja Keskkonnahariduse Keskusest (Hamburg). EIBE tnab teda loa eest seda katset kasutada.
NB! Agrobacterium tumefaens on ohtlik taime-patogeen ning sellega ttamiseks on mnedes riikides kehtestatud ranged nuded. Enne Agrobacterium tumefaciens'! kasutamist veenduge, et see on koosklas kohalike seadustega.
Restriktaas
DNA ligaas (ensm) hendab DNA osad
Restriktaas (ensm likab DNA katki kindlatest kohtadest
Soovitud geen eraldatakse doonori organismist
-1286510609600Mittevajalikud geenid eemaldatakse plasmiidist
Bakteri kromosoom
-374015069850Uus plasmiid viiakse bakterisse Agrobacterium tumefaciens
Lehe tkke hoitakseLehe tkke kasvatatakseRakkudest kasvatatakse
Agrobacterium' rakkeselektiivsel stmel, kus arenevad uusi geene sisaldavad
sisaldavas stmesainult transformeerunud rakudtaimed
Agrobacterium tumefaciens'/' modifitseeritud vormide kasutamine geenitehnoloogias
EIBE Biotehnoioogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 33
1
Z) Q O
o
Lisa 1
Mikrobioloogilisel! stmed
Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Agar- ja vedelstmed valmistatakse tstuslikult toodetavatest ainetest tootja instr-uktsioonide jrgi. Enne kasutamist tuleb stmeid autoklaavida 15 minutit temperatuuril 121 C. Valmis stmeid vib silitada kasutusklblikena temperatuuril ~4 C mitu kuud.
Trkliseagar
Agar Lahustuv trklis
20,7 g 2,0 g
Lisage niipalju destilleeritud vett, et segu ruumala oleks 1 1 ja autoklaavige 15 minutit temperatuuril 121 C.
MacConkey agar streptomtsiiniga
MacConkey agar50,0 g
Destilleeritud vesi990 ml
Prast 15-minutilist autoklaavimist temperatuuril 121 C laske agaril jahtuda 50 C-ni ja seejrel lisage
streptomtsiinsulfaadi lahus200 mg/10 ml
Selle stmega tasse vib silitada vaid mne peva klmkapis temperatuuril ~4 C.
34'-. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1
3 D O O
Lisa 2
Mikrobioloogiaalased tvtted
Biotehnoloogilase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Aerosoolid
Aerosoolid on mikroorganisme sisaldavad vikesed piisakesed, mis on juhuslikult hku sattunud. Need vivad seal psida pool tundi vi kauemgi ning on potentsiaalsed saasteallikad. Aerosool, mis prineb mahapillatud kultuuridelt, vib phjustada naha vi silmade nakkust. Kui kultuure pipeteeritakse suuga, siis vib mikroorganisme ka kogemata alla neelata.
Laboratoorsed td
Laboratoorsete tde lbiviimisel tuleb silmas pidada alljrgnevaid ohutusnudeid.
Tuleb olla ettevaatlik, et midagi ei satuks ktelt suhu (nt. pliiatsi nrimisel, siltide keelega letmbamisel vi suuga pipeteerimisel). Laboris on keelatud sa, juua ja suitsetada.
pilased peavad laboris kandma kitieid. Enne praktiliste tde algust tuleb ktel olevad nahavigastused katta veekindla plaastriga.
Enne ja prast iga praktikumi tuleb labori lauad le pesta desinfitseeriva lahusega. Neid saate koolilaborite varustajatelt.
petajad, laborandid ja pilased peavad prast praktikumi alati ksi pesema.
Mahapillatud ja purunenud vahendid
Mikrobioloogiliste kultuuridega juhtunud nnetuste puhul tuleb toimida jrgnevalt:
Soovitav on kanda hekordselt kasutatavaid kindaid. Mikroorganisme sisaldav purunenud nu vi mahapillatud kultuur tuleb katta riidega, mida on eelnevalt leotatud desinfitseerivas vahendis. 10 minuti prast tuleb jgid paber-kterttide ja prgikhvliga ra koristada. Saastunud materjal visatakse spetsiaalsesse prgikonteinerisse vi prgikotid, mida enne raviskamist autoklaavitakse. Ka prgikhvel tuleb autoklaavida vi asetada 24 tunniks desinfitseerivasse vahendisse.
Riiete vi naha saastumine
Saastunud nahapiirkonda tuleb koheselt pesta. Tugevasti saastunud riided pannakse enne pesemist desinfitseerivasse lahusesse.
Saastunud puhastuslapid tuleb autoklaavida vi panna desinfitseerivasse lahusesse.
Mikroorganismide allikad
Kiki mikroorganisme tuleb ksitleda kui potentsiaalselt ohtlikke. Kesolevas moodulis kasutatavad organismid on igete tvtete korral vheohtlikud. Tellige neid ainult kindlatest allikatest.
tagavad tvtted
Steriilsust tagavate tvtete eesmrgiks on:
saada ja silitada puhtad kultuurid;
tagada ohutus mikroorganismidega ttamisel.
Puhas kultuur sisaldab ainult hte liiki, segatud kultuur aga kahte vi enamat liiki mikroorganisme.
Alati esineb saastumise oht, sest mikroorganisme on kikjal: nahal, hus ja esemetel. Selleks, et tagada kultuuride puhtus, on vaja kasutada steriliseeritud tvahendeid ja stmeid ning vlistada saastumine. Need on steriilsuse silitamise peamised phimtted.
et vikese srme ja peopesa vahel hoitakse veel korki vi kaant. (Sellisel hoidmisel on oluline, et klviaasa lesvtmisel ldvenda-takse pisut korgi hoidmise haaret.) Vajadusel vivad kaks pilast sooritada vastavat katset koos.
t
Korki hoitakse
srme ja peopesa
vahel
On alusetu loota, et nooremad pilased valdaksid steriilsust tagavaid tvtteid tiuslikult. Kesoleva mooduli mned katsed eeldavad siiski tieliku steriilsuse tagamist. Nendel juhtudel kasutage jrgmisi protseduure:
Steriliseerige stmed enne kasutamist autoklaavimisega. Kasutage steriilseid nusid (kolbe, Petri tasse jne.) ja hoidke saastumise vltimiseks neil kaaned peal.
Ttada tuleb Bunseni pleti krval, siis kannab leegi kohal esinev tusev huvool stmeid ja puhtaid kultuure saastavad mikroorganismid eemale.
rge eemaldage korke ja kaasi nudelt kauemaks kui vaja. Avades mikrobioloogilist kultuuri sisaldava pudeli, rge korki kuhugi asetage, vaid hoidke seda seni kes, kuni saate selle peale tagasi panna. Sellega hoiate ra laua ja kultuuri saastumise. Pudeli avamisel tuleb selle suuet kuumutada 1 -2 sekundit, sest nii hvitatakse seal olevad mikroorganismid ja tekitatakse soe huvool, mis aitab ra hoida kultuuri juhuslikku saastumist.
Klviaasa tuleb kuumutada, kuni kogu leegis olev osa hakkab hguma. Seda tuleb teha nii enne kui prast kultuuride ksitsemist. Klviaasa tuleb lhendada Bunseni pleti leegile aeglaselt, et vhendada srise-mist ja aerosoolide teket.
Sel ajal kui pletit ei kasutata, on soovitav reguleerida leek kollaseks, sest see on hsti mrgatav. Klviaasade, traatide ja pudelikaelade steriliseerimiseks tuleks kasutada umbes 5 cm krgust sinist leeki.
Vltige tlaua saastumist. Steriliseerige instrumendid kohe prast kasutamist, pipetid asetage kohe vrske desinfitseeriva lahusega nusse.
Harjutamise tulemusena on vimalik hoida pudelit hes kes ja klviaasa teises kes nii,
36-1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotchnolooxiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Kultuuride kasvatamine
457201539240Kirjutage Petri tasside alumistele klgedele enne klvamist nimi, kuupev ja kasutatud organismi nimi vi allikas. Vajadusel kleepige Petri tassi alus ja kaas kleeplindiga kinni, nagu on nidatud joonisel.
Kirjutage
tassi
phjale
Kinnitage tassi kaas kleeplindiga
Kinnikleepimine hoiab ra tassi juhusliku avanemise ja saastumise. NB! rge tmmake kleeplinti horisontaalselt mber rte, sest selline kinnitus vib luua tassi sees anaeroobsed tingimused.
Bakterid
Bakterikultuuri kasvatamisel Petri tassil pratakse see mber. Nii langeb kondenseerunud vesi kaanele ega satu kolooniatele. (Kui steriilsel Petri tassil on palju kondenseerunud vett, tuleb tass enne kasutamist kuivatada.)
Bakterikolooniad ilmuvad nhtavale peale 2-3-pevast kasvatamist temperatuuril 25-30 C.
Seened
Seeni sisaldavaid Petri tasse ei ole vaja tagurpidi keerata. Seenekultuure kasvatatakse umbes 7 peva. Kuigi toatemperatuur (21 C) on kllaldane, vimaldab termostaat protsessi paremini kontrollida.
Jtmete likvideerimine ja steriliseerimine
Kik praktikumis kasutatud materjalid tuleb likvideerida igel viisil, et vltida labori ja inimeste saastumist. Nud, mida kasutati kultuuride kasvatamiseks ja silitamiseks, tuleb enne jrgmist kasutamist autoklaavida, pesta desinfitseeriva vahendiga ja loputada.
Laborisse on vaja kahte autoklaavimiskotti: ks taaskasutatavate klaasnude jaoks ja teine ravisatava materjali jaoks. Igas tkohas peaks olema ks suur nu pipettide ja teine vike -mikroskoobi'alusklaaside jaoks. Purunenud klaas visatakse metallmbrisse.
se. Seejrel vib neid uuesti kasutada. Klaasist pipetid tuleks asetada suuremasse nusse. rge vtke pumpa pipeti kljest ra enne, kui pipeti ots on viidud desinfitseerivasse vedelikku, sest muidu vivad tekkida aerosoolid. Pipetid tuleb enne uut kasutamist autoklaavida, pesta ja loputada.
Saastunud paberrtid, lapid ja plastmassist Petri tassid tuleb panna ravisatavate asjade autoklaavimiskotti. Saastunud klaasnud, kaasaarvatud klaasist Petri tassid, asetatakse klaasist asjade autoklaavimiskotti.
ravisatavad plastmassist pipetid, mikroskoobi alus- ja katteklaasid ning kultuuridest vljaimbu-nud vedelik tuleb panna vikesesse desinfitseeriva vedelikuga nusse. Plastmassist pipetid autoklaavitakse ja visatakse seejrel ra. Mikroskoobi alus- ja katteklaase leotatakse 24 tundi desinfitseerivas vedelikus, pestakse ja loputatak-
Klaasnud, mis ei ole saastunud, pestakse tavaliselt. Purunenud klaas visatakse spetsiaalselt selle jaoks meldud prgikasti. Kui saastunud klaasnu puruneb, tuleb see enne raviska-mist autoklaavida. Purunenud klaasi, mis pole mikroorganismidega kokkupuutes olnud, vib kohe ra visata.
EIBE Biotehnoloqgiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 37
Autoklaavimine
Steriliseerimine on kigi mikroorganismide ja nende spooride tielik hvitamine. Kogu varustus tuleb enne praktikumi steriliseerida. Kultuurid ja saastunud materjal steriliseeritakse ka prast kasutamist, et need seejrel ohutult likvideerida. Stmete, vesilahuste ja kultuuride steriliseerimiseks sobib kige paremini autoklaavimine. Selleks kasutatakse krgsurvel olevat auru, tavaliselt temperatuuril 121 C. Niiske kuumus tapab mikroorganisme paremini kui kuiv, sest aur denatureerib nende valke. Autoklaavida saab ka koduse krkeetjaga, kuid kuna selle maht on vike, siis vib tekkida raskusi kogu klassi jaoks materjali steriliseerimi-
Autoklaavimise phimtted
Alljrgnevalt on esitatud korrektse autoklaavi-mise kaks olulisemat nuet:
Autoklaavist tuleb hk tielikult eemaldada. See garanteerib krgel temperatuuril oleva auru kokkupuute steriliseeritavate pindadega. hu juuresolekul on samal rhul oleva auru temperatuur madalam. Steriliseerita-vad materjalid ei tohi olla tihedalt pakitud. hk peab saama nende vahelt vljuda. Kinnikeeratavate kaantega pudelid ja purgid ei tohi olla suletud, sest rhk vib nende sees ohtlikult krgele tusta.
Autoklaavimine peab kestma piisavalt pikka aega, et kuumus saaks tungida Petri tassis vi teistes nudes oleva stmeni. Jrgnev tabel nitab, kui kaua tuleb mingil temperatuuril stmeid vi tvahendeid autoklaavida.
Vike erinevus temperatuuris phjustab suuri erinevusi autoklaavimise ajas. Temperatuur
Steriliseerimisaeg
Temperatuur (-C)
Steriliseerimisaeg (minutites)
peab mratud aja jooksul mjuma kigile steriliseeritavatele materjalidele, nt. stmele fermenteri sisemuses.
Autoklaavimise koguaeg koosneb kolmest osast:
temperatuuri htlustumise aeg - aeg, mis kulub autoklaavi keskel paiknevatel materjalidel nutud temperatuuri saavutamiseks;
hoidmise aeg - minimaalne aeg, mille kestel etteantud temperatuuril kik elusorganismid surevad;
ohutuse tagamise aeg - tavaliselt moodustab see poole hoidmise ajast.
Kodused kiirkeetjad ttavad temperatuuril 121 C. Seega steriliseerimise aeg moodustub umbes 5-minutilisest hdustumise ajast, 15-minutilisest hoidmise ajast ja umbes 5-minutilisest ohutuse tagamise ajast, mis annab kokku 25 minutit.
NuMahtSteriliseerimisaegKatseklaas20 ml12-14 min.Kolb50 ml12-14 min.Kolb200 ml12-15 min.Fermenter1 120-25 min.
Karamellistumine
Spetsiaalsed autoklaavid ttavad ka krgemal temperatuuril kui 121 C. Kuigi aja kokkuhoid vib nida kasulik, tuleb meeles pidada, et krgem temperatuur mjub teatud stmetele lagundavalt. Niteks glkoosilahus karamellistub krgel temperatuuril moodustades hendeid, mis vivad olla mikroorganismidele mrgised. Seda reaktsiooni saab glkoosi puhul vltida keskkonna reaktsiooni viimisega pH 4-ni. Vajadusel saab prast steriliseerimist pH-d jlle muuta.
MaillarcTi reaktsioon
Stmete lmmastikhendid ja ssivesikud tekitavad krgel temperatuuril pruunistumise reaktsiooni (Maillard'i reaktsiooni). Moodustuvad hendid on mnedele mikroorganismidele mrgised. Teatud juhtudel vib osutuda vajalikuks autoklaavida ssivesikud ja lejnud osa stmest eraldi, nt. piimaagari ettevalmistamisel.
38 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnolooxiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
Autoklaavi kasutamine ja hooldamine
Kiirkeetja vi autoklaavi kasutamisel tuleb alati jrgida tootjapoolseid instruktsioone. Eriti hoolikalt peab jlgima, et autoklaavis oleks piisavalt vett. Koduses majapidamises kasutatavatesse kiirkeetjatesse tuleb panna vhemalt 250 ml vett, kuid suuremates autoklaavides kulub seda tunduvalt rohkem. Destilleeritud vi deioniseeritud vee kasutamine hoiab ra kada-kivi moodustumise. Prast kasutamist kuivata-takse autoklaav hoolikalt. Kui seda ei tehta, siis vib autoklaavi phi kahjustuda, mille tagajrjel see rhu all vljapoole kummub.
Prast autoklaavi kasutamist laske veeaurul ja hul umbes he minuti jooksul vljuda, enne kui sulete vljalaskekraani. Kui autoklaavi tskkel on lppenud, tuleb lasta selle sisul jahtuda ning siserhul mbritseva atmosfri-rhuni langeda. Autoklaavi ega selle klappe ei tohi avada, kui need on rhu all, sest see vib phjustada pletusi. Kaane enneaegne allalaskmine ja seejrel rhu vhendamine vib ajada
vedeliku autoklaavis keema. Agar vi toitelahus vivad keeda le nude rte.
Keemiline steriliseerimine
Steriliseerida vib erinevate kemikaalidega. Laborikatsetes kasutatakse kige sagedamini fenoolseid hendeid ja hpokloriteid. Fenoolsed hendid on efektiivsed bakterite ja seente vastu, kuid ei hvita eoseid ja kiki viirusi. Kokkupuude kummi, puu ja plastikuga inakti-veerib neid hendeid teatud mral. Laborites kasutatakse fenoolseid hendeid pindade desinfitseerimiseks ja ravisatava materjali hoidmise nudes.
Hpokloritid (nt. valgendajad) ei ole kige sobivamad Petri tasside steriliseerimiseks, sest valgud ja plastmassist materjalid vivad neid inaktiveerida. 5% Domestos'e (Lever) vi Chlorate I lahust vib kasutada ravisatava materjali nudes.
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 39
1
z>
Q
o o
Lisa 3
Luofiliseeritud kultuuriga ampulli avamine
Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Ampulli avamine
NB! Kaitseprillide kandmine on kohustuslik, sest ampulli avamisel vib lennata klaasikilde.
Kuumutage veidi ampulli teravat otsa igast kljest Bunseni pleti leegis (vt. joonist). Tilgutage pipetiga ks tilk klma vett ampulli kuumutatud otsale, oaasile peaks tekkima mra.
3.
Murdke pintsettidega ampulli ots ra, nii et klaasikillud kukuksid Petri tassile. Klaasikillud visake selleks ettenhtud nusse. Eemaldage pintsettidega vatikork, mis hoiab sisemist katseklaasi ampullis paigal. Kallake sisemine katseklaas ettevaadikult Petri tassile. Katke tass kaanega.
Luofiliseeritud kultuuri elustamine
Eemaldage pintsettidega vatikork ja kuumutage sisemise katseklaasi suuet.
Lisage sisemisse katseklaasi umbes 1 ml steriilset toitelahust.
Kuumutage uuesti katseklaasi suuet ja asetage vatikork tagasi. Kultuur elustub ligikaudu 20 minuti jooksul.
Segage steriilse klviaasaga katseklaasi sisu hsti lbi ja valage sisu steriilsesse katseklaasi, mis sisaldab umbes 5 ml toitelahust.
Hoidke kultuuri peva jooksul temperatuuril 30 C.
Jrgmisel peval ...
6.Viige steriilse klviaasaga tilk mikroorganismide segu agariga tassile. Sellega kontrollime, kas kultuur pole saastunud: tassil peaksidkasvama hakkama ainult hte tpi kolooniad.
Mi
0
Ampulli avamine
Jr
40 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp 1999