Bioteknologi A

Studentereksamen

Gammel ordning

Af opgaverne 1 og 2 skal begge opgaver besvares.

Af opgaverne 3 og 4 skal en og kun en af opgaverne besvares.

Torsdag den 24. maj 2018kl. 9.00 - 14.00gl-frs181-BTK/A-24052018

171363.indd 1 01/03/2018 13.54

2

Opgave 1 SlangemodgiftDen sorte mamba er en af verdens farligste giftslanger, blandt andet fordi den producerer relativt store mængder gift, og den kan angribe flere gange i træk. Der er mange forskellige toksiner i slangegiften, og det menes, at det er cocktaileffekten af de forskellige toksiner, der samlet set gør giften så effektiv.Et af toksinerne i den sorte mambas gift er proteinet α-dendrotoksin. Proteinets struktur kan ses i figur 1b.

a) b)

Figur 1. a) Den sorte mamba. b) -dendrotoksin fra sort mamba. Toksinets bindingsområde er markeret med rødt.

1. Redegør for de sekundære strukturer af α-dendrotoksin, vist i figur 1b, og markereksempler på disse.

Shutterstock.com

171363.indd 2 01/03/2018 13.54

3

Proteinet α-dendrotoksin påvirker nervesystemet ved at blokere spændingsstyrede kaliumkanaler i neuronernes membran, se figur 2.

Figur 2. a) Den spændingsstyrede kaliumkanal ved normalt aktionspotentiale. b) Den blokerede kaliumkanal.

I toksinets bindingsområde, som er markeret med rødt i figur 1b, er hovedparten af aminosyrerne lysin og arginin, se figur 3a og b.

O–

O

NH3+

NH3+

O–

O

NH3+

NH

NH2+

NH2

a) b)

Figur 3. Struktur af a) lysin og b) arginin ved neutral pH.

2. Angiv, hvordan -dendrotoksin kan bindes til de spændingsstyrede kaliumkanaler.

K+

α-dendrotoxin

K+

-kanal

Yderside

Inderside

K+

a) b)

171363.indd 3 01/03/2018 13.54

4

Blokering af de spændingsstyrede kaliumkanaler bevirker, at depolariseringen af membranen forlænges i forhold til et normalt aktionspotentiale, se figur 4. Det medfører en øget frigivelse af transmitterstoffet acetylcholin i synapsen, hvilket fører til krampe.

Figur 4. Normalt aktionspotentiale i et neuron.

3. Argumenter for, at en blokering af de spændingsstyrede kaliumkanaler kan forlængedepolariseringen af membranen og øge frigivelsen af acetylcholin i synapsen. Inddragfigur 2 og 4.

Modgift mod slangegift produceres i dag ved hjælp af antistoffer fra heste, der er immune over for slangegift. Forskere arbejder på at fremstille modgift mod den sorte mambas gift ud fra humane antistoffer.Til at undersøge hvilke humane antistoffer, der kan bruges som modgift, anvendes genmodificerede bakteriofager. Bakteriofager er virusser, der kan inficere bakterier. For at undersøge virkningen af et antistof indsættes genet for et fragment af antistoffet i en bakteriofag. Bakteriofagen udstiller antistoffragmentet på ydersiden, se figur 5.

Figur 5. Bakteriofag der udstiller antistoffragment på ydersiden.

Membranpotentiale(mV)

Aktionspotentiale

Hvilepotentiale

1 2 3 40

+30

0

-70

Tid (ms)

Udstilletantisto�ragment

Enkeltstrenget DNA, som indeholder gen for et antisto�ragment

171363.indd 4 01/03/2018 13.54

5

Derefter tester man, om de forskellige bakteriofager kan binde til α-dendrotoksin fra den sorte mambas slangegift, se figur 6.

Figur 6. Overblik over metode til udvælgelse af de bakteriofager, der binder bedst til α-dendrotoksin.

4. Forklar, hvordan bakteriofager kan udvælges ved hjælp af metoden, vist i figur 6. Inddragen beskrivelse af punkt 1 – 6 i figuren.

5. Diskuter brugen af modgifte udviklet på baggrund af humane antistoffer, i forhold tilmodgifte udviklet på baggrund af antistoffer fra heste.

α-dendrotoxin

Vask

1 2 3

456

Forskellige bakteriofagerer testet i forskellige brønde.

Forskelligebakteriofager

positiv kontrol

negativkontrol

171363.indd 5 01/03/2018 13.54

6

Opgave 2 Produktion af vanillin

Vanilje er et krydderi, der især anvendes i kager og desserter. Det stammer fra frøene af en orkidé, som har bønnelignende frugter, se figur 1.

Vanillin er det vigtigste aromastof i vanilje. Det kan ekstraheres fra grønne vaniljebønner som vanillin-glycosid, der efterfølgende kan omdannes til vanillin. De kemiske strukturer af vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd) og vanillin-glycosid ses i figur 2.

O

OH

O

OO

OHOH

OH

OHO

O

a) b)

Figur 2. Kemiske strukturer af a) vanillin og b) vanillin-glycosid.

1. Angiv to funktionelle grupper i vanillin, vist i figur 2a.

Figur 1. Vaniljebønner.

Shutterstock.com

171363.indd 6 01/03/2018 13.54

7

Da der ikke kan ekstraheres meget vanillin fra vaniljebønner, er det billigere at fremstille vanillinkemisk. Syntesen af vanillin sker ud fra 2-methoxyphenol, som vist i figur 3.

O

OH

O

OH

OH

O

OH

O

OH

O

O

OH

O

O

OH

2-methoxyphenol

Vanillin

Figur 3. Kemisk syntese af vanillin ud fra 2-methoxyphenol.

2. Beregn massen af vanillin, der kan fremstilles ud fra 12,0 g 2-methoxyphenol.

For at finde en mere effektiv og miljøvenlig måde til fremstilling af vanillin har forskere arbejdet på at genmodificere gærceller, så de kan producere vanillin. Det har vist sig nødvendigt at indsætte flere forskellige gener i gærcellerne, for at de kan producere vanillin.

3. Giv forslag til, hvorfor der skal indsættes flere forskellige gener for at få gærcellerne til at producere vanillin.

171363.indd 7 01/03/2018 13.54

8

I et forsøg har man gensplejset tre forskellige gærstammer for at undersøge hvilken af stammerne, der er mest effektiv til at producere vanillin. Man har dyrket gæren i 48 timer og derefter målt mængden af de tre kemiske forbindelser vanillin, 3,4-dihydroxyphenylethansyre og4-(hydroxymethyl)-2-methoxyphenol, se figur 4.

O

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH O

a) b) c)

Figur 4. Kemiske strukturer af a) vanillin, b) 3,4-dihydroxyphenylethansyre og c) 4-(hydroxymethyl)-2-methoxyphenol.

I gærcellerne er 3,4-dihydroxyphenylethansyre et mellemprodukt i syntesen af vanillin. Ved nedbrydning af vanillin dannes 4-(hydroxymethyl)-2-methoxyphenol.

Resultatet af forsøget er vist i figur 5.

Figur 5. Dannelse af vanillin, 3,4-dihydroxyphenylethansyre og 4-(hydroxymethyl)-2-methoxyphenol i tre gærstammer.

4. Analysér figur 5, og vurdér anvendeligheden af stammerne til produktion af vanillin.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Stamme 1 Stamme 2 Stamme 3

Konc

entr

atio

n (m

M) Vanillin

3,4-dihydroxyphenylethansyre

4-(hydroxymethyl)-2-methoxyphenol

171363.indd 8 01/03/2018 13.54

9

For at kunne producere store mængder vanillin undersøgte forskerne, om høje koncentrationer af vanillin og vanillin-glucosid er giftige for gærcellerne. Til en opløsning af gærceller blev der tilsat varierende koncentrationer af vanillin eller vanillin-glucosid, og antallet af gærceller blev målt over et døgn. Resultatet af forsøget er vist i figur 6.

Figur 6. Vækst af gærceller dyrket med varierende koncentrationer af vanillin og vanillin-glucosid.

5. Diskutér hvordan resultaterne, vist i figur 6, kan bruges til at effektivisere produktionen af vanillin i genmodificerede gærstammer.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25

Anta

l gæ

rcel

ler

106

Tid (timer)

0 g/L vanillin

0,5 g/L vanillin

1,0 g/L vanillin

5,0 g/L vanillin

25 g/L vanillin-glucosid

171363.indd 9 01/03/2018 13.54

10

Opgave 3 Fjernelse af nitrogen fra spildevand

En række forskellige mikroorganismer er involveret i fjernelse af nitrogen fra spildevand. Ved den biologiske rensning nedbrydes nitrogenholdigt organisk stof til ammonium, som derefter omdannes videre. Blandt andet sker processerne nitrifikation, denitrifikation og anammox, se figur 1a:

Figur 1. a) Nitrogens kredsløb i et renseanlæg. b) Spildevand i et renseanlæg.

1) Redegør for nitrogens oxidationstal i forbindelse med omdannelse af ammonium til nitritog nitrat i forbindelse med en nitrifikation.

Koncentrationen af nitrat i spildevandet kan bestemmes ved at lade nitrat fra spildevandsprøven reagere med et stof, så der dannes et rødt produkt. Absorbansen af det røde produkt kan måles ved hjælp af spektrofotometri ved en bølgelængde på 505 nm.En gruppe gymnasieelever lavede en række opløsninger med kendt stofmængdekoncentration af nitrat, som de tilsvarende lod reagere, så der blev dannet det samme røde produkt. De målte derefter absorbansen. Resultaterne er vist i figur 2.

[NO3-] (µM) 0 25 50 75 100

Absorbans 0,002 0,066 0,098 0,161 0,224

Figur 2. Sammenhørende værdier mellem aktuel stofmængdekoncentration af nitrat og absorbans målt ved 505 nm.

Shutterstock.com

NO₂⁻

NO₃⁻

N₂

NH₄⁺

Nitrifika�on

Nitrogenfixering Denitri

fika�

onAnammox

171363.indd 10 01/03/2018 13.54

11

Eleverne bestemte ved samme metode absorbansen i vandprøver taget efter den biologiske rensning fra forskellige renseanlæg, se figur 3.

Renseanlæg A B C D

Absorbans 0,027 0,052 0,121 0,071

Figur 3. Absorbans af prøver fra forskellige renseanlæg efter den biologiske rensning.

2) Vis, at resultaterne i figur 2 følger Lambert-Beers lov, og bestem koncentrationen iprøverne, vist i figur 3.

3) Giv forslag til hvilke biotiske og abiotiske faktorer, der har betydning for, atkoncentrationen af nitrat efter biologisk rensning varierer mellem forskellige renseanlæg.

For at få den mest optimale fjernelse af nitrogen fra spildevandet er man interesseret i at kende sammensætningen af bakterier i renseanlægget, men ofte er bakterierne umulige at isolere og rendyrke. Ved hjælp af nye DNA-sekventeringsteknikker kan man nu få mere viden om hvilke arter, der findes. Hidtil har man ment, at nitrifikation foregår i to trin, der udføres i samspil mellem to højt specialiserede bakteriearter inden for slægterne Nitrosomonas og Nitrospira. Med de nye DNA-teknikker har man opdaget en hidtil ukendt bakterieart fra Nitrospira-slægten, som kan udføre begge deltrin i nitrifikationen, se figur 4a og b.

a) b)

Figur 4. a) Nitrifikation ved hjælp af Nitrosomas og Nitrospira. b) Nitrifikation ved hjælp af nyopdaget Nitrospira-bakterie.

4) Diskutér betydningen af at kunne identificere så mange arter af bakterier som muligt i etrenseanlæg, herunder den nyopdagede Nitrospira-art. Inddrag figur 1, 3 og 4.

Nitrosomonas Nitrospira

NH4+ NO2

- NO3-

NH4+

NO2-

NO3-

Ny Nitrospira-art

171363.indd 11 01/03/2018 13.54

12

I spildevand ligger pH-værdien normalt i intervallet 7-9. Reaktion 1 er en pH-afhængig kemisk proces, der har indflydelse på de øvrige processer i nitrogens kredsløb, vist i figur 1. Processen får derfor betydning for hvor effektivt nitrogen kan fjernes fra spildevandet som dinitrogen.

NH4+ (aq) + HCO3

- (aq) ⇌ NH3 (aq) + H2CO3 (aq) (1)

Bjerrumdiagrammer for ammonium/ammoniak og carbonsyresystemet er vist i figur 5:

a) b)

Figur 5. Bjerrumdiagram for a) ammonium/ammoniak og b) carbonsyresystemet.

5) Angiv, i hvilket pH-interval reaktion 1 foregår; og vurder, hvilken betydning reaktionen har for fjernelse af dinitrogen fra spildevandet. Inddrag figur 5.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 10 12 14

Syre

brøk

pH

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 10 12 14

Syre

brøk

pH

H2CO3 HCO3- CO3

2-NH4+ NH3

171363.indd 12 01/03/2018 13.54

13

Opgave 4 Bestemmelse af AB0-blodtype

De røde blodlegemer har nogle bestemte glycoproteiner på deres overflade, som er med til at afgøre en persons AB0-blodtype. Glycoproteinerne fungerer som antigener. Enzymet glycosyltransferase (GTF) katalyserer overførsel af carbohydrater til disse glycoproteiner. Genet for GTF består af 7 exons og findes i tre allelle former, IA, IB og i.IA og IB er co-dominante og dominerer begge over i. Kombinationen af disse alleler hos en person bestemmer, om man får blodtype A, B, AB eller 0, se figur 1.

Figur 1. Røde blodlegemer fra forskellige AB0-blodtyper.

1. Angiv mulige genotyper for blodtyperne A, B, AB og 0.

Bestemmelse af en persons AB0-blodtype kan ske ved oprensning og sekventering af DNA. Man kan for eksempel anvende DNA fra celler i mundhulen. Cellerne skrabes ud med en vatpind og tilsættes en pufferopløsning, som dels indeholder proteinase K, som er en meget bredspektret protease, og dels indeholder natriumdodecylsulfat, der er et sæbestof, se figur 2.

OS

O-

O O

Na+

Figur 2. Sæbestoffet natriumdocecylsulfat.

2. Forklar, hvad formålet er med at tilsætte proteinase K og natriumdodecylsulfat iforbindelse med oprensning af DNA fra celler.

Blodtype 0 Blodtype A Blodtype B Blodtype AB

Glycoproteiner© MarkR Gra�k

171363.indd 13 01/03/2018 13.54

14

Efter adskillige trin i oprensningen er DNA isoleret fra cellerne. Det opformeres derefter ved hjælp af PCR med primerpar, der er specifikke for exon 6 og 7 i genet for GTF, hvorefter prøverne analyseres ved hjælp af gelelektroforese.

For at kunne bestemme den præcise størrelse af de opformerede DNA-stykker, måles vandringslængden af størrelsesmarkørens DNA-stykker. Resultaterne er vist i figur 3.

Størrelse af DNA (bp) Vandringslængde (mm)

10000 21,3 6000 25,0

3000 31,9

2500 34,4

1500 41,3

1000 46,3

500 55,6

250 62,5

Figur 3. Sammenhørende værdier af størrelse af DNA-stykker angivet som antal basepar (bp) og vandringslængde i mm.

3. Afbild resultaterne vist i figur 3, og argumentér for, at der er en logaritmisk sammenhæng mellem størrelsen af et DNA-stykke og dets vandringslængde. Bestem endvidere størrelsen af PCR-produkterne fra exon 6 og exon 7, der er vandret henholdsvis 55,3 mm og 52,3 mm på gelen.

De udgaver af enzymet GTF, som allellerne IA og IB koder for, varierer med 3-4 aminosyrer i aminosyresekvensen i exon 7. De to enzymvarianter katalyserer derfor overførelsen af to forskellige carbohydrater til glycoproteinerne på de røde blodlegemer, hvorved henholdsvis antigen A og antigen B dannes. Individer med blodtypen 0 producerer hverken antigen A eller B, hvilket skyldes en deletion af basen guanin i position 185 i exon 6 i genet for GTF.

171363.indd 14 01/03/2018 13.54

15

For at kunne bestemme en persons blodtype har man først sekventeret PCR-produkterne fra exon 6 i genet for GTF. Figur 4 viser resultater af sekvensbestemmelse af exon 6 fra to forskellige personer.

Figur 4. Udsnit af kromatogram fra analyse af exon 6 fra person a og person b. Pilene markerer position 185.

4. Analysér resultaterne vist i figur 4, og angiv mulige genotyper for personerne a og b.

Person a og b venter barn med hinanden.

5. Angiv mulige blodtyper for barnet, og bestem sandsynligheden for hver enkelt af disseblodtyper.

180 190 200

180 190 200

a)

b)

GG

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

TT

TT

TT

TT

TT

TT

TT

GG

GG

GG

GG

GG

GG

AA

CC

TT

GG

GA

AC

CT

TG

GC

TC

CC

CC

CC

CC

CC

GG

GG

GG

GG

TT

TT

TT

CT

CT

TG

GC

171363.indd 15 01/03/2018 13.54

16

Figurliste

Opgave 1

Figur1a: Shutterstock.com

Figur 1b: Commons.wikimedia.org/www.rcsb.org

Figur 2a, 2b, 4, 5 og 6: MarkR grafik/Hans Marker

Figur 3a og b: Hanne Wolff

Opgave 2

Figur 1: Shutterstock.com

Figur 2, 3 og 4: Hanne Wolff

Figur 5 og 6: Kristine Rask Raae

Opgave 3

Figur 1a og 5: Dorte Ankerfelt

Figur 1b: Shutterstock.com

Figur 2 og 3: Kristine Rask Raae

Figur 4: MarkR grafik/Hans Marker

Opgave 4

Figur 1 og 4: MarkR grafik/Hans Marker

Figur 2: Hanne Wolff

Figur 3: Kristine Rask Raae

171363.indd 16 01/03/2018 13.54

171363.indd 17 01/03/2018 13.54

171363.indd 18 01/03/2018 13.54

171363.indd 19 01/03/2018 13.54

171363.indd 20 01/03/2018 13.54

AG

YM

181

-05