biotransformação de compostos orgânicos
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Apostila de biotransformaçãoTRANSCRIPT
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5/22/2018 Biotransforma o de Compostos Org nicos
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Universidade Federal do ParanDepartamento de Qumica
BIOTRANSFORMAO
DE COMPOSTOS ORGNICOS
Brs H. de Oliveira
2012
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1. Introduo ...................................................................................................................... 11.1. Aspectos gerais ...................................................................................................... 11.2. Exemplos ............................................................................................................... 11.3. Reviso Qumica Orgnica .................................................................................... 3
1.3.1. Nomenclatura................................................................................................. 31.3.2. Estereoqumica .............................................................................................. 31.3.3. Mecanismos de reaes orgnicas ................................................................. 3
1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores .................................................... 31.4.1. Vantagens de uso de enzimas ........................................................................ 31.4.2. Desvantagens do uso de enzimas .................................................................. 4
1.5. Propriedades Enzimticas ...................................................................................... 41.5.1. Aspectos Mecansticos .................................................................................. 51.5.2. Classificao e Nomenclatura ....................................................................... 71.5.3. Coenzimas ..................................................................................................... 71.5.4. Fontes de Enzimas ......................................................................................... 7
2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatlise ............................................................ 82.1. Introduo .............................................................................................................. 82.2. Screening ............................................................................................................... 82.3. Metodologia Analtica ........................................................................................... 92.4. Exemplo ................................................................................................................. 9
3. Aplicaes Biocatalticas ............................................................................................. 113.1. Reaes de Hidrlise ........................................................................................... 11
3.1.1. Hidrlise de Amida ...................................................................................... 113.1.2. Hidrlise de steres ..................................................................................... 123.1.3. Hidrlise de Epxidos ................................................................................. 173.1.4. Hidrlise de Nitrilas .................................................................................... 20
3.2. Reaes de Reduo ............................................................................................ 213.2.1. Reduo de Aldedos e Cetonas (Enzimas Isoladas) ................................... 233.2.2. Reduo de Aldedo e Cetonas com Clulas ............................................... 253.2.3. Reduo de C=C por Clulas ...................................................................... 25
3.3. Reaes de Oxidao ........................................................................................... 263.3.1. Oxidao de lcoois .................................................................................... 263.3.2. Reaes de Oxigenao ............................................................................... 28
3.4. Formao de Ligaes C-C ................................................................................. 353.5. Adio e Eliminao ............................................................................................ 37
3.5.1. Formao de Cianidrina............................................................................... 383.5.2. Adio de gua e Amnia........................................................................... 383.5.3.
Reaes tipo acilona ................................................................................... 39
3.6. Transglicosilao ................................................................................................. 39
3.6.1. Glicosiltransferases ...................................................................................... 403.6.2. Glicosidases ................................................................................................. 40
3.7. Halogenao e Desalogenao ............................................................................ 424. Tcnicas Especiais ....................................................................................................... 45
4.1. Imobilizao ........................................................................................................ 454.2. Enzimas Modificadas e Artificiais ...................................................................... 46
5. Outras Aplicaes ........................................................................................................ 475.1. Modelos microbianos de metabolismo de mamferos ......................................... 475.2. Derivados Ativos de Drogas ................................................................................ 47
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BIOTRANSFORMAO DE COMPOSTOS ORGNICOS
1. Introduo
Este resumo se refere disciplina de Biotransformao de Compostos Orgnicos efoi preparado devido ausncia de textos em Portugus nesse assunto. Seu contedo se
baseia na bibliografia recomendada, mas contm tambm informaes de vrias outras
fontes. Ele pretende apenas ser um guia para o estudante e mais informaes sero
fornecidas nas aulas.
1.1. Aspectos gerais
conceito
importncia: alternativa/auxiliar sntese orgnica; obteno de molculas
quirais;
aplicao industrial: > 200 processos (ca. 2% do total de US$ 25 bilhes)
nmero de processos ao longo do tempo (grfico)
1.2. Exemplos
(Ref. Industrial Biotransformations)
Produto Biocatalisador Desde EmpresaVinagre Bacteria 1823 VariasL-2-metilamino-1-fenilpropan-1-ol
Levedura 1930 Knoll AG, Alemanha
L-sorbose Acetobactersuboxydans
1934 Varias
Prednisolona Arthrobacter simplex 1955 Schering AG,Alemanha
c. L-asprtico Escherichia coli 1958 Tanabe Seiyaku Co.,Japo7-ADCA Bacillus megaterium 1970 Asahi Chemical
Industry, Japoc. L-mlico Brevibacterium
ammoniagenes1974 Tanabe Seiyaku Co.,
JapoD-p-hidroxifenilglicina Pseudomonas striata 1983 Kanegafuchi
Chemical Co, JapoAcrilamida Rhodococcus sp 1985 Nitto Chemical Ltda,
Japoc D-asprtico e L-alanina
Pseudomonasdacunhae
1988 Tanabe Seiyaku Co.,Japo
L-carnitina Agrobacterium sp 1993 Lonza, Rep Checa
c 2-ceto-L-gulonico Acetobacter sp 1999 BASF, Merck,Cerestar, Alemanha
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a) Esterides
b) Aromas (patchouli)
c) Medicamentos (talidomida)
(R:sedativo; S: teratognico)
d) Outros
O
O
O
OH
OH
O
O
O
OHO
progesterona
cortisona
11-hidroxiprogesterona
R. arrhizus
P. rubrum
HO
CH2OH
HO HO
lcool patchouli nor-pathcoulenol
N
O
O
NH
O
O
HO2CC
NH2
C
H
H3C CH3
SH HO2CC
H
C
H2N
H3C
CH3
SH
HO2CC
HH2N
NH2
O
HO2CC
NH2H
NH2
O
R-penicilamina toxico
S-penicilamina antiartrtico
R-asparagina doce
S-asparagina amarga
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1.3. Reviso Qumica Orgnica
1.3.1. Nomenclatura
funes orgnicas
regras de nomenclatura
1.3.2. Estereoqumica
Enantimeros e molculas quirais
Importncia biolgica da quiralidade. Ex.: talidomida
Nomenclatura: sistema R-S
Atividade ptica: e.e.
Drogas quirais
1.3.3. Mecanismos de reaes orgnicas
Repr movimentao de e-
Mecanismos de hidrlise: cat cida e bsica
Mecanismos de substituio: nucleoflica
1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores
1.4.1. Vantagens de uso de enzimas
so catalizadores eficientes
so aceitveis ecolgicamente
atuam em condies brandas so mutualmente compatveis
no esto limitadas ao papel natural
podem catalizar um grande espectro de reaes
seletividade
quimioseletividade,
regioseletividade
enantioseletividade: feitas de L-aa
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1.4.2. Desvantagens do uso de enzimas
ocorrem em apenas uma forma enantiomrica
requerem parmetros restritos (pH, temp.)
mostram maior atividade cataltica em gua
so propensas inibio
podem causar alergias
Enzimas Isoladas X Clulas Inteiras
Biocatalizador Forma Pros ContrasEnzima isolada Qualquer ap. Simples, elab.
Simples, melhorprodutividade
reciclagem de co-fator
dissolvida emgua
alta atividade enzimtica reaes colaterais, subst.lipofil. insolveis, elab.requer extrao
suspensa emsolv. Orgnico
fcil de realizar, elab.fcil, subst. lipoflicossolveis, fcil rec. daenzima
baixa atividade
Imobilizada fcil recuperao da
enzima
perda de atividade durante
a imobilizaoclulas inteiras Qualquer desnecessrio reciclar co-fatores
equip. caro, elaboraotediosa, baixa produt.(menor tolerncia concentrao), baixatolerncia a solv. org.,reaes colaterais
cultura emcrescimento
maiores atividades mais biomassa, mais sub-produtos, processo difcilde controlar
clulas em
repouso
elaborao mais fcil,
menos sub-produtos
menores atividades
clulasimobilizadas
clulas reutilisveis menores atividades
1.5. Propriedades Enzimticas
grupos hidroflicos externos (-COOH, -OH, -NH2, -SH, -CONH2)
grupos lipoflicos internos
pontes disulfeto
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inativao:
rearranjo da cadeia peptdica (comea a 40-50 oC); reversvel
hidrlise; irreversvel
troca de pontes disulfeto
reaes de eliminao e oxidao
enzimas termoestveis (microorganismos termoflicos)
1.5.1. Aspectos Mecansticos
a) Mecanismo Chave e Fechadura (Fisher, 1894)
Problemas: substratos de pequeno volume; substratos no-naturais
b) Mecanismo Encaixe Induzido (Koshland Jr., 1960s)
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c) Teoria Desolvatao e Solvatao-Substituio
Desolvatao (Dewar,1986)
substrato substitui gua no stio ativo
reao tipo fase gasosa
Solvatao-substituio
gua de solvatao do substrato substituida pelo stio ativo
d) Regra de Atracagem de Trs Pontos
e) Razes Cinticas para a Seletividade
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1.5.2. Classificao e Nomenclatura
IUB: 3.000 enzimas (de 25.000)
atividade cataltica: 1 U.I. = 1 mol de substrato transformado/min. enzimas disponveis comercialmente
EC A.B.C.D
A: principal tipo de reao
B: subtipo indicando tipo de substrato
C: natureza do co-substrato
D: nmero da enzima especfica
Ex.: -glucosidase (EC 3.2.1.21) de amndoa; 20-40 unidades/ mg deslido
Classe Nmero Tipo de reao Utilidade*classific. dispon.
1.oxidoredutases
650 90 oxidao-reduo +++25%
2.transferases
720 90 transferncia de grupos +5%
3.hidrolases 636 125 hidrlise/formao devrias funes +++65%4.liases
255 35 adio/eliminao depequenas molculas
++5%
5.isomerases
120 6 isomerizao 5%
6.ligases
80 5 formao/clivagem de C-O, C-S, C-N, C-C
1%
(*) +++: muito til; = pouco uso; %: percentagem de pesquisa no perodo 1987-96
1.5.3. Coenzimas
NAD/NADH; NADP/NADPH; ATP; acetil-CoA
1.5.4. Fontes de Enzimas
indstria de detergentes e alimentos: proteases e lipases
fontes animais: rins, fgado, pncreas fontes microbianas: colees de cultura; natureza
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2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatlise
2.1. Introduo
necessidade de novas enzimas
novas molculas quirais
substituio de processos qumicos
processos ecolgicamente corretos
2.2. Screening
fontes de enzimas
solo: 109clulas/g
gua
vegetais (endofticos): ex. GA3
isolamento no seletivo: solo seco, abs esponja, agar, incubao (temp
variadas). isolamento seletivo: pr-tratamento do solo; ad antibitico; meio seletivo.
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2.3. Metodologia Analtica
Importncia
Mtodos fsico-qumicos: ccd, clae, cg
Bioensaios (clulas animais, microbianas, enzimticos) HTS (high-throuput screening)
2.4. Exemplo
Biotransformao de Esteris. Brs H. de Oliveira e Deise D. Bueno,
Qumica Nova19 (3), 233-6 (1996).
Importncia de substncias esteroidais: hormnios, antiinflamatrios,
anticoncepcionais, etc.
Matrias-primas; intermedirios
O
O
Androstenodiona
HO
-Sitosterol
O
O
HO
Diosgenina
O
O
Progesterona
amostras de solo e de sementes de soja em meio lquido contendo colesterol
como nica fonte de C; 7 dias
alquota para novo frasco contendo o mesmo meio; processo executado por
um total de 15 vezes.
Crescimento microbiano em todos os frascos
Seleo: meio c/ colesterol dosagem
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TABELA 1- Degradao de Colesterol por Microorganismos Provenientes da
Amostragem 1. (S = amostra de semente; So= amostra de solo). Concentrao
inicial de colesterol = 200 mg%
Amostra ColesterolDegradado
(%)10 (S)(*) 53,02
25 (S) 50,928 (So) 48,8214 (S) 47,987 (S) 38,76. .
(*) amostra utilizada nos experimentos de degradao do -sitosterol
Transferncia p/ meio slido
Isolamento: bactria Gram +
Experimento preparativo com sitosterol
Extrao com solvente
Isolamento cromatogrfico de androst-4-eno-3,17-diona
O
O
androst-4-eno-3,17-diona
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3. Aplicaes Biocatalticas
3.1. Reaes de Hidrlise
Hidrlise qumica: mecanismo
2/3 do total da pesquisa
aspectos mecansticos: serina hidrolases
trade cataltica: importncia
C OR2
R1
ON
N
H
His
R2OHOO
-
Asp
OH
Ser
O O H
Asp
N
N
HHis
O
CO
R1
Ser
C OH
R1
O
O H
H
enzima
acilada
3.1.1. Hidrlise de Amida
Ligao amida
Importncia: qumica de aa e peptdeos Mercado de aa: > 0,5 milho toneladas/ano (US$ 2 bilhes)
Adoantes no-calricos: aspartame (Asp, Phe)
Rotas enzimticas p/ aa enantiomricamente puros:
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R CO2R1
NHR2
R CO2H
NH2
R CO2H
O
CO2H
R
hidrolase (res)
liase (ad NH3)
desidrogenase(aminao redut)
Resol por hidrolases: proteases, esterases ou lipases
3.1.2. Hidrlise de steres
Ligao ster: hidrlise
Esterases, proteases e lipases
3.1.2.1. PLE ( Pig Liver Esterase )
verstil, substrato-tolerante, barata
Ex.: prostaglandinas
CO2Me
CO2Me
OHPLE
CO2Me
CO2H
OH
e.e. 98%
O
COOMe
OH
HO
O
COOH
OH
HO
PLE
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3.1.2.2. Esterases microbianas
S
S
CO2
OAc
t-Bu
S
S
CO2
OH
t-Bu
S
S
CO2
OAc
t-Bu
Bacillus sp e.e. 94%
+
CO2MeR
carboxilesteraseNP
Bacillus subtilis
R= Aril-
R= Aril-O-
CO2HAr
CO2HArO
CO2MeAr
CO2MeArO
+
+
e.e. > 95%
e.e.> 87%
Ex.: analgsicos, antiinflamatrios
CO2H CO2H
MeO
Ibuprofeno Naproxeno
Otimizao da seletividade
Modificao do substrato
Variao do sistema de solvente
Variao do pH
OAc
OAc
OH
OAc
PLE
Meio e.e. (%)
H2O 55
H2O/DMSO 6:4 72H2O/DMF 8:2 84
H2O/t-BuOH 9:1 96
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3.1.2.3. Lipases
Hidrlise de triglicerdeos
Importante em: processamento de alimentos e prep de intermedirios quirais
Pode hidrolisar e formar lig ster
Diferena lipase X esterase: interao c/ substrato
Mecanismo: -hlice (tampa) aberta quando em contato c/ bifase leo-
gua
Seletividade
VOLUMOSA pequena
Molcula do Substrato
Lipase de Candida sp
Lipase deAspergillus sp Lipase de Pseudomonas spLipase deMucor sp
Lipase pancretica de porco (PPL)
A mais barata
Preparao bruta (pacreatina, esteapsina)
Outras hidrolases presentes (-quimotripsina, colesterol esterase,
fosfolipases, etc.)
Alta seletividade pode ser devida s impurezas
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cO HO OAc
+hidrolase
rac
Enzima V Reao Seletividade
(razo enantiomrica)
PPL bruta Boa >300
PPL pura No reage -
-quimotripsina No reage -
Colesterol esterase Rpida 17
Hidrolase nova Boa 210
Lpases de Candida sp
C. lipolytica, C. antartica (CAL), C. rugosa(CRL)
C. rugosa:aceita steres volumosos (p.ex. de lcoois sec. cclicos)
OAc
CO2Et
OH
CO2Et
OAcCO2Et
O
CO2Et
O
CO2Et
CRL
principal
e.e.= 77%
e.e. > 99% traos
Lpases de Pseudomonas sp (PSL) P. fluorescens, P. aeruginosa, P. cepaceae , P. glumae
No aceitam steres volumosos
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Ar
SS(CH2)n (CH2)n
CO2MeMeO2C
Ar
SS(CH2)n (CH2)n
CO2HMeO2C
PSL
n e.e. (%)
1 482 >983 79
Lpases de Mucor sp (MSL)
M. miehei, M. javanicus
M. miehei: operador qumico Asp-His-Ser (similar outras lpases)
O
RO
O
RO
O
O
ROH
RO
O
lipase
Lipase R Solvente e.e. (%)
CRL H tampo 12PSL H tampo 81
MSL H tampo >99
MSL Me tampo >99
PPL Me tampo 20
PPL Me tampo/hexano 85
Outras Lipases: microbianas
AcO
OMe
O
Me
OH
OMe
O
Me
AcO
OMe
O
Me
+lipase
Aspergillus sp.
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3.1.3. Hidrlise de Epxidos
Epxidos: estrutura, preparao, importncia (intermedirios p/ sntese de
compostos bioativos)
Sntese assimtrica/resoluo: no disponvel (exceto mtodo Sharpless
lcoois allicos)
Epoxidao microbiolgica: possvel mas tcnicamente difcil (eng. Processo)
Hidrlise qumica: mecanismo cat cida e bsica
Epxido Hidrolases (EH): mais teis que epoxidases; metabolismo de
alquenos e aromticos
O
procariotas
eucariotas
di-oxigenase
mono-oxigenase
dioxetano
epxido
redutase
EH
R
R
O
O
R
OH
OH
R
OH
OH
R
Epxidos como agentes alquilantes: txicos, cancergenos, teratognicos
Epxido Hidrolases Hepticas: CEH (citoslica); MEH (microsomal)
MEH
mais ativa e seletiva com epxidos no-naturais
fgado de porco, coelho, rato, camundongo, etc.
Sobrenadante 9000 g de homogenato de fgado Mecanismo de ao
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O O-
Asp
O
O O-
Asp
OH
HO
N
N
H
His
O O
OH
Asp
H O
H
Tir
OH
N
N
H
HHis
Influncia pH?
Subst Asp por Ser (mutao): que acontece?
resoluo cintica de epxidos assimtricos
OR
OH-
OH-
reteno
inverso
O
R
O
R
EH
HO
HOR
HO
HOR
+
+
substratos para MEH
cadeias lipoflicas prximas ao oxirano maior atividade
grupos polares prximas ao oxirano efeito inibidor
fatores estricos fatores eletrnicos (eletronegatividade)
O
R
O
R1
R2
O
R1
R2
O
R1
R2
R3 O
R1
R2
R3
R4> >
>
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R
MEH
tampo
R
HO
HX
X V reaoO Rpida
NH, N-CH3 LentaS No ocorre
EN O>N>S
Epxido Hidrolases Microbianas: convenincia p/ uso industrial;
escalonamento
Ex.: prep de hormnio juvenil (insetos)
OHO
O
OH
OH
OH
OH
Helmintosporiumsativum +
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Ex.: derracemizao de xido de estireno
O
O
O
O
CH2OH
OH
CH2
OH
OH
CH2OH
OH
B.s
A.n.
A.niger
B.sulfurescens
+
+
(ret.)
(inv.)
A. niger +
B. sulfurescens
98 % e.e. 83 % e.e.
89 % e.e., 92 % rend.
96 % e.e. 51 % e.e.
3.1.4. Hidrlise de Nitrilas
R-CN; H-CN
Nitrilas naturais: reserva de N; defesa
N
N N
NH2 CN
ribose
CN
O
R1
R2 glucoseN
OMe
CN
O
toiocamicina(antibiot.)
glicosdeos cianognicos(mandioca)
ricinina(mamona)
Hidrlise qumica: mecanismo
Caminhos possveis p/ hidrlise enzimtica
R C N R CO
OH+ NH3
R CO
NH2
nitrila hidratase amidase
nitrilase
RCO2H e NH3: alvos para screening
Nitrilase: mecanismo
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R C N R C
NH
S Enz
+ Enz-SH
H2O
R C
NH2
S Enz
O
H
R C
O
S Enz
H2O
R C
O
S Enz
OH
R C
O
OH
NH3
+ Enz-SH
AA contendo SH:
Exemplo:
O
NH2
NN
CN
Rhodococcus rhodochrouso-: picolinamida (977 g/l)m-: nicotinamida (1465 g/l)
p-: isonicotinamida (1099 g/(nitrila hidratase)
Importncia da nicotinamida: NAD, NADP, etc.
3.2. Reaes de Reduo
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conceito
desidrogenases
co-fatores: NAD(H); NADP(H)
reciclagem de co-fatores
enzimas isoladas X clulas inteiras
desidrogenase
cofator-H2 cofator
Substrato Substrato reduzido
sistema dereciclagem
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3.2.1. Reduo de Aldedos e Cetonas (Enzimas Isoladas)
Reduo qumica: NaBH4; LiAlH4; produtos racmicos
desidrogenase lcool de levedura (YADH)
desidrogenase lcool de fgado de cavalo (HLADH) Regra de Prelog
O
PG
OH
PG
[H-]
NAD(P)H NAD(P)
desidrogenase
YADH: muito especfica; aldedos ou metilcetonas; prep lcoois quirais
secundrios
HLADH (fgado de cavalo):
baixa especificidade
estrutura conhecida; R-X; dmero
red. De cetonas cclicas (4-9C)
Ex.:
TBADH (Thermoanaerobium brockii)
Termoestvel ( 85 oC)
Tolera solventes orgnicos Ex.:
1 R2
O
R1 R2
OH
R1 R2
OHTBADH
rec. NADPHou
O
O
H
H
136 O
O
H
H
136 + O
HO
H
H
136HLADH
recicl.NHADH
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HSDH (Hidroxiesteroid)
Substrato natural: esterides
Ex.:
O
R1
R2HO
R1
R2
OOH
O
R1
R2
+
rec. NAD(P)H
R1=R2=H
TBADH ou
HSDH
HSDH
R1,R2=Me, Cl
+
R1 R2 Enzima e.e. lcool(%)
H H HSDH < 10H H TBADH > 95H Cl HSDH > 90Cl Cl HSDH > 95Me Cl HSDH > 98Me Me HSDH > 95
Substratos preferidos pelas desidrogenases:
O
R H
O
R1 R2
R
O
O
YADH HLADH
TBADH HSDH
O
O
O
-
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25
3.2.2. Reduo de Aldedo e Cetonas com Clulas
Vantagens: co-fator
Desvantagens: baixa produtividade (transporte, rec produto, instabilidade
gentica do microorganismo)
Saccharomyces cerevisae
O mais usado; facilidade de manuseio
Primeira reviso: 1949!
Cetonas alifticas e aromticas simples: Prelog
Cadeias longas ou volumosas: no aceita
Comportamento divergente: diferentes DHs com preferncias
estereoqumicas opostas
Ex.:
Outros microorganismos redutores de cetonas
Geotrichum candidum
Sporotrichum exile
Mucor ambiguus
3.2.3. Reduo de C=C por Clulas
Hidrogenao qumica
Enoato redutases:Clostridia, Proteus, S. cerevisae, Beauveria sulfurescens
Adio trans de H
Ativao: facilitar ataque de H-
Ativadores: cidos, steres, lactonas, cetonas, aldedos ,- insaturados
R1 OR2
O O
R1 OR2
OH OS. cerevisae
R1 OR2
OH O
ou
-
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26
Ex.:
RCO2H
Cl
R
Cl
CO2Henoato redutase
S. cerevisae
Cl
CO2H
R
enoato redutase
S. cerevisaeR
CO2H
Cl
R
Cl
O
R
Cl
O
S. cerevisae
rpida
S. cerevisae
lentaR
Cl
OH
R
Cl
OH
+
major. 3.3. Reaes de Oxidao
Importncia
Problemas de mtodos qumicos: metais, inespecificidade (rgio, estreo)
3.3.1. Oxidao de lcoois
Mtodos qumicos: exemplos
Mtodos enzimticos: pouco usados
Termodinmicamente desfavorvel, recicl cofator dificultada
Inibio pelo produto (- polar)
pH timo 8-9: co-fator e produtos instveis
oxid lcool secundrio: destruio de quiralidade Oxidao regiosseletiva de poliis
Carboidratos
-
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27
Ex.:
O O
OHOH
HO
OH
Assimetrizao de diis proquirais ou meso
OH
OHR
R
OHR
RH
O
HLADH
recicl NAD+
O
R
ROH
O
R
RO
HLADH
recicl NAD+
exp.
meso
CH2OH
C
C
C
C
CH2OH
O
HHO
OHH
HHO
Acetobacter
suboxidans
CH2OH
C
C
C
C
CH2OH
OHH
HHO
OHH
OHH
CHO
C
C
C
C
CH2OH
OHH
HHO
OHH
OHH
Sorbitol Sorbose cido L-ascrbicoGlicose
HOO
CO
C
CC
C
CH2OH
HOH
HHO
-
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28
HLADH
recicl NAD+
HLADH
recicl NAD+
exp.
R
OH
OH
R
OH
O
H
OR
OH
OR
O
3.3.2. Reaes de Oxigenao
Oxidao qumica de HC: ativados (ex. oxid allica por SeO2) e no-ativados
(difcil, no-especfica)
Importncia
Oxigenases
Mono-oxigenases
Sub + DoadorH2 + O2 SubO + Doador + H2O
rec. co-fator
Dioxigenases
Sub + O2 SubO2
Oxidases
O2 + 2e- O2
2-H2O2
+ 2H+
2H2O2O22-O2 + 4e
- + 4H+
-
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29
Mono-oxigenases
Maioria ligada a membrana
Ativao do O2: comum a todas
Tipos de substratos/produtos
Sub + O2 + H+ + NAD(P)H SubO + H2O + NAD(P)
+mono-oxigenase
C H C OH
R R
O
Rn-X Rn-X=O X= N, S, Se, P
H OH
R1 R2
O
R1 O
O
R2
Citocromo P-450: grupo + comum de MO; hemeproteina; detoxificao;
mesma seq 26 aa prox heme Ciclo cataltico: ~ oxid qumica com metais
-
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30
Fe3+
S
ON
N
N
N
H H
e-
O2
Fe3+
S
N
N
N
N
OO
Sub
e-
Sub
Fe3+
S
N
N
N
N
OO
H2O 2H
+
Fe4+
S
N
N
N
N
O
Sub
Sub
Fe5+
S
N
N
N
N
O
H2O
SubO
Sub H2O Sub
Fe2+
S
N
N
N
NFe
3+
S
N
N
N
N
Sub
1. Acoplamento do substrato ao stio ativo
2. Red Fe
3+
> Fe
2+
(e
-
de NADP[H] ou outro co-fator (Fe
2+
mais reativo)3. Ligao de O2
4. Recep e-> enfraquecimento de ligao O-O
5. Sada de O na forma de gua: formao de nuclefilo forte
6. Ataque do O ao Sub; subst Sub oxidado pela H2O
MO dependente de flavina:
Co-fator: flavina
Substratos: aldedos, cetonas; produtos: steres
Ciclo cataltico de MO: ~ oxid qumica com perxidos/percidos
H
O OR
R1 OR2
O
R1 R2
OHO O
R
R1 R2
O
Bayer-Williger
-
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31
O2
Sub
N
N NH
N O
O
NADPH NADP+
(Enz-FAD)
N
N NH
N O
O
H
H
(Enz-FADH2-Sub)
N
NNH
N O
OH OHO
(Enz-FAD-4a-OOH-Sub)
N
NNH
N O
OH OH
(Enz-FAD-4a-OH-SubO)
SubO + H2O
N
NNH
N O
OH O
O
O
N
NNH
N O
OH O
O
O
O
O
Hidroxilao de Alcanos
Funcionaliz em pos no-ativadas: poucas alternativas em Q.O.
Reativ relativa: 2o>3o>1o.
Hidroxil esterides
F. verticilloides
CH2OH
Limoneno lcool Perlico
-
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32
Hidroxilao de Comp Aromticos Hidrox regioespecfica difcil por via qumica
Monooxigenases: hidrox em o- e p-; via epxido
Polifenoloxidases (tirosinase): fenol -> catecol -> o-quinona ->
polimerizao
R
OH
R
OH
OH
O2 H2O
polifenoloxidase
O2 H2O
polifenoloxidase
R
O
O
R.arrh izus
CO2H
O
CO2H
O
OH
O
CO 2H
OH
O
CO 2H
OHO
CO 2H
F. verticilloides
+
P. chrysogenum
CO2H
OCH2OH
CO2H
O
-
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33
Mecanismo
Ex.: L-dopa (3,4-diidroxifenilalanina); L-epinefrina (adrenalina)
HO
HO
OH
NHCH3
adrenalina
HO
HO
COOH
NH2H
L-3,4-diidroxifenilalanina(L-DOPA)
Uso de microorganismos; Ex.
N
CO2H
O N
OHCunninghamellaechinulata
Pseudomonas sp
N
CO2H
HO
O N
OH
HO
cido 6-hidroxinicotnico
prenalterol (>85%)
(100 %)
-
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Epoxidao de alquenos
Epxidos quirais: intermedirios sintticos de alto valor
Mtodos qumicos
Epxidos pequenos e no-funcionalizados: obteno difcil por via qumica
Monooxigenases: no usadas em escala preparativa; co-fator; natureza
complexa
Clulas: uso de meio bifsicos; minimizao efeito txico do produto
Ex.:
1 H
R2
R1
R2
Omicroorganismo
O2
Pseudomonas oleovorans
Corynebacterium equiMycobacterium sp
Xanthobacter spNocardia sp
Reaes de Baeyer-Villiger
Mtodo qumico: ster ou lactona
MO dependente de flavina
Uso de clulas
Acinetobacter sp, Pseudomonas sp (algumas patognicas)
Risco de hidrlise do produto: inibidores (p-nitrofenilfosfato de etila =
paraoxon); mutantes no-hidrolticas
Ex.:
O
R
O
RO
O
R
Acinetobacter sp+
Diidroxilao de aromticos
Importncia ecolgica Obteno de glicis quirais
-
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35
Pseudomonas sp
R
O
O
R
di-oxigenase
O2
R
OH
OH
redutase
H2
R
OH
OH
diidrodioldesidrogenase
NAD(P)H NAD(P)+
3.4. Formao de Ligaes C-C
reaes do tipo aldlicas: mecanismo
sntese de imina: mecanismo
R1 R2
NH
R1 R2
O
NH3
C
OH
NH2
R2R1
aldolases
substratos: carboidratos, aa, hidroxicidos
adio 1, 2 ou 3C
2 grupos
Aldolase tipo I
Plantas superiores e animais
Co-fator: no requer
Mecanismo
CH3CHO CH3CHCH2CHO
OHOH-, H2O
5o, 4-5 haldol
-
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36
H2O
-Enz-NH2
H
OR1
R
N
R1
X
OH
Enz
R
O
1
X
OH
RX
N
Enz
H
Enz-B
Enz-NH2
-H2O RX
NEnz
H H
X=H, OH, NH2
RX
O
baseSchiff
enamina
Aldolase tipo II
Bactrias e fungos
Dependente de Zn2+
Mecanismo
Receptor:
Doador: R
O
X
HR1
O
R
O-
X
H R1
O
NN
Enz
H
Zn+2
R1
OH
R
X
O
Obs.: remoo inicial de H+do doador por uma histidina
-
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37
Exemplo: anlogos nitrogenados de acar (anti-HIV)
3.5. Adio e Eliminao
Liases:
adio de H2O ou NH3a alquenos;
adio de HCN a C=O
PO OH
O
+ H
O
N3
OHaldolaseFDP
PO
O
N3
OH
OH
OH
PO
O
N3
OH
OH
OH
+
1) fosfatase2) H
2/Pd
1) fosfatase2) H
2/Pd
NH
OHOH
OH
HO
NH
OH
OH
OH
HO
deoxinojirimicina deoximanojirimicina
-
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38
3.5.1. Formao de Cianidrina
Cianidrinas: estrutura; sntese qumica: aldedo/cetona + HCN
Importantes intermedirios em qumica orgnica
R CN
OHvrios produto
sntese enzimtica: oxinitrilases
Ex.: (prioridade R > R)
R' R"
OR' R"
CNHO
R' R"
OHNC
HCN
R-oxinitrilase
S-oxinitrilase
fontes:
(R)-oxinitrilases: famlia Rosaceae (amndoa, ameixa, pssego) (S)-oxinitrilases: Sorghum bicolor(sorgo), Hevea brasiliensis(seringueira),
Ximenia americana(sndalo), Manihot esculenta(mandioca).
Problemas: uso de HCN transcianao (acetona cianidrina)
3.5.2. Adio de gua e Amnia
Fumarase: ad gua a C=C
C C
X
HOOC
COOH
HC C
X
HOOC
COOH
OH
HH
X= H (ac. fumrico), Cl X= H (ac. mlico)
fumarase
H2O
Influncia da e.n. de X. 3-metilaspartase: ad amnia a C=C
-
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39
C C
X
HOOC
COOH
HC C
X
HOOC
COOH
NH2
HH
X= H, Cl, Me, etc.
NH3
3-metilaspartase
3.5.3. Reaes tipo acilona
Qumica: mecanismo
Biocataltica: sntese da efedrina
Ph H
O
H3C CO2H
O
Ph
OH
O+
S. cerevisae(descarboxilase
de piruvato)
CO2
aciloina
Ph
OH
NH
CH3
(-)-efedrina
MeNH2
H2/Pt
3.6. Transglicosilao
oligossacardeos e polissacardeos: migrao intracelular e excreo de
glicoproteinas; interaes clula-clula; oncognese; interao da superfcie
celular com patgenos
sntese qumica de carboidratos difcil
biocatlise atraente: glicosil transferases; glicosidases
-
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40
3.6.1. Glicosiltransferases
requer acar ativado (UDP-acar)
3.6.2. Glicosidases
independem de co-fatores
endo e exo-glicosidases hidrlise reversa
transglicosilao
usos: celulose > glicose > etanol
-
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Exemplo glicosilao de diis:
Exemplo hidrlise do esteviosdeo:OGG
CO2G
OH
CO2H
esteviosdeo esteviol
pectinase
Exemplo glicosilao do esteviosdeo (veja artigo J.Biotechnology, 2006):
+
esteviosdeo
OGG
CO2G
OGG
CO2G
G
rebaudiosdeo
glicosidases deFusarium sp maior proporo
de rebaudiosdeo
-
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42
Mecanismo lizozima (Nature Structural Biology 8, 737 - 739 (2001)
doi:10.1038/nsb0901-737): NAG= N-acetilglicosamina.
3.7. Halogenao e Desalogenao
Introduo
Cerca de 1000 PN halogenados
Importncia: diazepam, mitotano
CH
CHCl2
Cl
Cl
mitotano
N
NO
CH3
Cl
diazepam
Derivados de Cl (terrestres) e Br (marinhos) mais comuns
Algas marinhas: lib 107ton bromoalcanos
Toxicidade de haloalcanos
Halogenao
Qumica
Haloperoxidases: nico tipo isolado
-
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43
Cloroperoxidase de Caldariomyces fumago; bromoperoxidase de
Pseudomonas aureofaciens; iodoperoxidase de raiz forte (Armoracia
lapathifolia)
Substrato + H2O2+ X
-
+ H
+
Produtos halogenados + 2H2O
1. Halogenao de Alquenos
X+
haloperoxidase
HOX ou X2
OH
X
Y
X
OH-
Y-
O-
O
OO
Xn
I
OH
OH
I
cloroperoxidase
I-, H2O2
+
9 : 1
Halogenao de alquinos
CHCl2
O
Cl
O
Cl+
1 : 2 : 0,3
CH3 C CHcloroperoxidase
Cl-, H2O2
Cl
O
+
Halogenao de Compostos Aromticos
NH2
Cl
NH2
Cl
Brcloroperoxidase
Br-, H2O2
-
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44
Halogenao de Grupos C-H
cloroperoxidase
Cl-
, H2O2
OO OO
Cl
Desalogenao
Importncia ambiental: biodegradao (pesticidas, solventes, etc.)
Mtodo qumico
Halohidrina Epoxidases
Fontes: bactrias (Flavobacteria, Corynebacteria, Pseudomonas),
fungos (Caldariomyces fumago), algas (Laurencia pacifica)
XHO
haloidrina epoxidase
O+ HX
2. Desalogenases: Sn X OH (indep de co-fator); influncia da
natureza de RX (1o., 2o. 3o.)
O O-
Asp
C X
R
H
H
O O-
O O
CH2R
OH
H
N
N
H
His
N
N
H
N
N
H
H
RCH2OH
Asp Asp
3. Ex.: (S)-2-cloropropinico (sntese de anti-inflamatrios e herbicidas)
CO2H
Cl
CO2H
OH
CO2H
Cldesalogenase
(P. putida)+
e.e. > 98%
-
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45
4. Tcnicas Especiais
4.1. Imobilizao
aderncia da enzima a um suporte slido ou confinamento reutilizao da enzima
tcnicas
adsoro (van der Waals, inica, lig. H)
ligao covalente
ligao cruzada
confinamento em gis
confinamento em membranas
-
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46
4.2. Enzimas Modificadas e Art ificiais
enzimas solveis em solventes orgnicos (mod. PEG)
bio-imprinting
enzimas semi-sintticas
anticorpos catalticos
O
O
Ph
OH
R
OH+
-O OPh
R
O
O
R
OP
O OPh
R
+ PhOH
-
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47
5. Outras Aplicaes
5.1. Modelos microbianos de metabolismo de mamferos
Importncia
Exs.:
5.2. Derivados Ativos de Drogas
Importncia
Exs.:
N
NO
CH3
l
diazepam
N
O
O
F
O
S16924 (Servier)Antipsictico
Cunninghamella echinulataMucor plumbeus
Metablitos
O
OO
OCH3
OH
OH21
O
OO
OH
OH21
Galbanoldeo A Galbanoldeo B
Potentes antifngicos (Merck)
Streptomyces halstedii
21-OH
-
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50/50
48
Bibliografia
K. FABER. Biotransformations in Organic Chemistry - A Textbook, 5thed.
Springer, New York, 2004. (Terceira edio disponvel na Biblioteca de
Tecnologia e na de Biolgicas,660.634 B617).
A. L iese, K. Seelbach, C. Wandrey. Industrial Biotransformation, Wiley,
Weihheim, 2000. (660.63 L721i). (Disponvel na Biblioteca de Tecnologia).
A.L. DEMAIN and J.E. DAVIES. Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology, 2ndEdition, American Society for Microbiology,
Washington,1999. (660.62 M294i)
P. PRAVE, U. FAUST, W. SITTING, D.A. SUKATSCH. Fundamentals of
Biotechnology, Editora VCH, Federal Republic of Germany, 1987.
Q. H.G. Davies, R.H. Green, D.R. Kelly, S.M. Roberts. Biotransformations in
Preparative Organic Chemistry, Academic Press, New York, 1989. (547.2
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R. H.-J. Rehm, G. Reed and A. Puhler (Ed.). Biotechnology, 2nded. Weinheim :
VCH, 1993- Biotransformations, Vol 8a, 8b (660.6 B616).