bruna de melo aquino envolvimento dos receptores...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS APLICADAS
BRUNA DE MELO AQUINO
ENVOLVIMENTO DOS RECEPTORES P2X3 NA HIPERALGESIA MUSCULAR
INVOLVEMENT OF P2X3 RECEPTORS IN MUSCLE HYPERALGESIA
LIMEIRA
2018
BRUNA DE MELO AQUINO
ENVOLVIMENTO DOS RECEPTORES P2X3 NA HIPERALGESIA MUSCULAR
INVOLVEMENT OF P2X3 RECEPTORS IN MUSCLE HYPERALGESIA
Orientadora: Profa. Dra. Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira Fusaro
LIMEIRA
2018
Tese apresentada a Faculdade de
Ciências Aplicadas/ Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para obtenção do
Título de Doutora em Ciências da
Nutrição e do Esporte e Metabolismo,
área de Biodinâmica do Movimento
Humano e Esporte.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE
À VERSÃO FINAL DA TESE
DEFENDIDA PELA ALUNA
BRUNA DE MELO AQUINO E
ORIENTADA PELA PROFA. DRA.
MARIA CLÁUDIA GONÇALVES
DE OLIVEIRA FUSARO
Ata da Defesa
Autora: Bruna de Melo Aquino
Título: Envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia muscular
Natureza: Doutorado
Instituição: Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual de Campinas
(FCA/UNICAMP)
Data da Defesa: Limeira, 28 de fevereiro de 2018.
BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira Fusaro __________________________
(Orientadora) (assinatura)
Prof. Dr. Wladimir Rafael Beck __________________________
(assinatura)
Prof. Dra. Cristina Gomes de Macedo Maganin _________________________
(assinatura)
Prof. Dra. Adriane Elisabete Antunes de Moraes ________________________
(assinatura)
Prof. Dr. Dennys Esper Correa Cintra _______________________
(assinatura)
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida
acadêmica da aluna.
DEDICATÓRIA
A Deus por guiar meus passos e permitir a realização desse sonho. E por colocar as pessoas
certas, nos momentos certos em minha jornada.
Meu amado esposo Braico por se mudar para Limeira e me apoiar na realização do meu
doutorado. Por me incentivar a ir atrás do meu doutorado sanduíche mesmo significando 6
meses separados, e por estar presente todos os dias nesses 6 meses.
Aos meus pais Rita e José por acreditarem em mim e me incentivarem cada dia a ser melhor e
a minha irmã Emília por seu apoio, amor e entusiasmo.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do Prof.
Dr. Àlvaro de Oliveira D’Antona (diretor).
Ao programa de pós-graduação em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo pela
oportunidade e dedicação com que vocês cuidam de seus alunos, meu muito obrigada.
A minha orientadora professora Dra. Maria Cláudia Oliveira Fusaro pela oportunidade,
apoio, incentivo, confiança e pelas suas valiosas orientações. Pessoalmente, agradeço pelo
carinho e por me fazer querer ser melhor a cada dia. Você terá sempre um lugar especial no
meu coração e da minha família. Serei sempre grata por tudo.
Ao professor Ms. Cláudio Fusaro, por ter mudado minha história num convite na sala de café
da clínica de fisioterapia da USF, para conhecer a profa. Maria Cláudia. Agradeço por ver em
mim um potencial que eu sequer sabia que tinha, e por me ajudar a trilhar esse caminho.
Minha mais sincera gratidão.
A todos os professores do programa CNEM, meu muito obrigado. Agradeço também a profa.
Dra. Juliana Maia e ao prof. Dr. Augusto Ducatti, pelas muitas conversas e ensinamentos
sobre as técnicas de ELISA e MPO. E ao prof. Dr. Igor Luchinni pelo ano de aprendizagem
como PED na disciplina de Anatomia e Histologia aplicadas ao Esporte.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de
estudo para desenvolvimento do meu estudo no Brasil e no exterior através do programa
PDSE CAPES.
Aos professores Alan R. Light e Markus Aman por me abrirem as portas de seus laboratórios
de pesquisa e pelo seus ensinamentos e entusiasmo durante meu período de Doutorado
Sanduíche na Universidade de Utah.
Aos membros da banca examinadora do Exame de Qualificação Profa. Dra. Elayne Dias e
Dr. Igor Luchinni e Dr. Augusto Ducatti, por aceitarem avaliar nosso trabalho e por suas
contribuições.
Aos membros da banca examinadora do Exame de Defesa Profa. Dra. Cristina Macedo, Dr.
Wladimir Beck, Dra. Adriane Antunes e Dr. Dennys Cintra pelo aceite e colaborações como
componentes da banca de defesa dessa tese.
Aos companheiros e amigos do Laboratório de Estudos da Dor e inflamação: Diogo, Carol, e
Graciana, Natália e Beatriz muito obrigada pelo carinho e pelo apoio nesses anos. A média
de anos é de aproximadamente 6 anos juntos, então agradeço por todo aprendizado pessoal e
profissional que me proporcionaram. Agradeço também pelo auxílio nos experimentos,
palavras de incentivo e pelos momentos de muitas risadas.
Aos colegas Lizete Perez, Ron Hughen, Jie Zhang, Jennifer Lu, Will Tang, Soheil, Mandy,
Taylor La Salle e Oh Sung por me receberem tão bem em Salt Lake City e pelos muitos bons
ensinamentos e experiências.
Aos amigos Ivani, Cláudia, Maria Clara e Esli, por se tornarem uma família e fonte de apoio
e carinho ao longo desses anos; A minha amiga Laís Raé por me incentivar a lutar pelos meus
sonhos.
A minha avó Conceição pelo seu carinho e pelo seu apoio nos meus primeiros anos de estudo,
sem seu essencial apoio essa jornada teria sido interrompida ainda no ensino médio, por falta
de condições financeiras, deixo a você meu profundo agradecimento e amor.
A todos os funcionários da Faculdade de Ciências Aplicadas, que direta ou indiretamente
colaboraram para meu aprendizado.
E a todos que porventura não citei nominalmente aqui e que colaboraram na execução desta
tese, expresso meu profundo agradecimento.
EPÍGRAFE
“Seja forte e corajoso, não se apavore, nem desanime, por que Eu o Senhor teu Deus estarei
com você em qualquer lugar para onde você for”.
(Josué 1:9)
RESUMO
A contração muscular estática é o padrão de contração muscular mais associado às atividades
de vida diária e laborais. A sustentação postural por longos períodos de tempo é capaz de
induzir dor e inflamação local. Dados obtidos recentemente por nosso grupo de pesquisa
demonstraram que a contração estática em ratos é capaz de induzir hiperalgesia muscular
mecânica, modulada por diferentes mediadores inflamatórios, como bradicinina, aminas
simpatomiméticas, prostaglandinas e neutrófilos. Demonstramos também que a ativação dos
receptores P2X3 pelo ATP endógeno é essencial para o desenvolvimento da hiperalgesia
muscular induzida pela contração estática, entretanto, os mecanismos envolvidos nesse
processo ainda são desconhecidos. Assim sendo, o objetivo geral do presente estudo foi
avaliar o envolvimento dos receptores P2X3, periféricos e do corno da raiz dorsal da medula
espinhal, no desenvolvimento da hiperalgesia muscular de origem inflamatória induzida pela
carragenina ou pela contração muscular estática via farmacologia comportamental utilizando-
se o teste de Randall Selitto. Ainda, se o envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia
muscular é modulado pela migração de neutrófilos, via quantificação da enzima
mieloperoxidase (MPO). Os resultados demonstraram que o pré-tratamento com o antagonista
seletivo de receptores P2X3, A-317491, via intramuscular ou intratecal, preveniu o
desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida pela contração estática e pela carragenina
(p<0.0001; ANOVA One way, Teste de Tukey) e a migração de neutrófilos no tecido
muscular em ambos os modelos (p<0.05; Teste de Tukey). Esses resultados demonstram que
a hiperalgesia muscular induzida pela contração estática e carragenina é modulada pelos
receptores P2X3 periféricos e centrais e que esse processo é modulado, pelo menos em parte,
pela migração de neutrófilos. Esses dados sugerem, portanto, que os receptores P2X3 são
importantes alvos farmacológicos no controle das dores musculares de origem inflamatória.
Por fim, paralelamente ao estudo principal demonstramos que a contração estática não induz
aumento das citocinas inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 nas primeiras 24 horas após a
contração, via ensaio imunoenzimático (ELISA) (p>0.05; Teste de Tukey). Além disso,
apresentamos informações sobre o projeto “Desenvolvimento de Camundongos GCaMP6
para estudo dos mecanismos de dor e fadiga muscular” relativo ao período de doutorado
sanduiche realizado na universidade de Utah, EUA, no qual demonstramos o processo de
desenvolvimento de camundongos TRPV1-cre/GCaMP6+, capazes de expressar a proteína
fluorescente GFP apenas nas fibras TRPV1+. Além disso, demonstramos os resultados da
análise via calcium imaging das células do gânglio da raiz dorsal desses animais quanto à
caracterização e a sua resposta a diferentes doses de metabólitos. Verificamos que 57,64% das
células de cultura do GRD são de origem muscular e que destas 78% apresentam GFP, sendo
que 1/3 delas não respondem a capsaicina. Demonstramos por fim, que 85,6% e 100% das
células de origem muscular que respondem, respectivamente, ao pH 7.0 e 6.6, são TRPV1+,
sugerindo, portanto, que os receptores neurônios TRPV1+ possuem um importante papel
como mediador da resposta evocada por metabólitos na fadiga e na dor muscular.
Palavras-chaves: Receptores purinérgicos P2X3, hiperalgesia muscular, inflamação,
migração de neutrófilos.
ABSTRACT
Static contraction is the pattern of muscle contraction most associated with activities of daily
living and work. Postural support for long periods of time is able to induce pain and local
inflammation. Data obtained recently by our research group have demonstrated that static
contraction in rats is capable to induce mechanical muscle hyperalgesia, modulated by
different inflammatory mediators such as bradykinin, sympathetic amines, prostaglandins and
neutrophils. We also demonstrated that the activation of P2X3 receptors by endogenous ATP
is essential for the development of muscle hyperalgesia induced by static contraction,
however, the mechanisms underlying are still unknown. Therefore, the general aim of the
present study was to evaluate the mechanism by which activation of peripheral P2X3
receptors and those expressed in the dorsal horn of the spinal cord contributes to the
development of inflammatory muscle hyperalgesia-induced by carrageenan or static
contraction by behavioural pharmacology Randall Selitto test was used. Furthermore, if the
involvement of P2X3 receptors in muscle hyperalgesia is modulated by neutrophil migration,
by measurement of myeloperoxidase (MPO). The results demonstrated that intramuscular or
intrathecal pretreatment with the selective antagonist of P2X3 receptors, A-317491, prevented
the development of muscle hyperalgesia induced by static contraction and carrageenan
(p<0,0001; ANOVA One way, Teste de Tukey) and prevented increase in neutrophil
migration in muscle tissue in both models (p<0,05; Teste de Tukey). These results
demonstrate that muscle hyperalgesia induced by static contraction and carrageenan are
mediated by peripheral and central P2X3 receptors and that this process is modulated, at least
in part, by neutrophil migration. Therefore, these data suggest that P2X3 receptors are
important pharmacological targets to control inflammatory muscle pain. Finally, in parallel
with the main study, we demonstrated that static contraction did not induce an increase in the
inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 in the first 24 hours after contraction, by
immunoenzymatic test. In addition, we present information about the project "Development
of GCaMP6 mice for the study of mechanisms of pain and muscular fatigue", related to the
period of phD sandwich at the University of Utah, USA. We demonstrated the process of
development of TRPV1-cre / GCaMP6+ mice, able of expressing a GFP fluorescent protein
only in the TRPV1+ fibers. In addition, we demonstrated the results of calcium imaging
analysis of dorsal root ganglion cells, such as the ability to express and respond to different
doses of metabolites. We found that 57.64% of the GRD culture cells are DiI+ and that 78% of
them have GFP, and that 1/3 of them were irresponsive to capsaicin. Finally, we showed that
85.6% and 100% of the cells of muscular origin, respectively, pH 7.0 and 6.6, are TRPV1 +,
suggesting that TRPV1+ neurons play an important role in mediating metabolite evoked
muscle fatigue or pain.
Keywords: P2X3 receptors, muscle hyperalgesia, inflammation, neutrophil migration.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aδ – Fibras A delta
A-317491 – Antagonista seletivo dos receptores P2X3
Αβ-meATP – Alfa beta-metileno ATP – agonista putinérgico P2X
AINEs – Anti-inflamatórios não esteroidais
AMPc – Monofosfato cíclico de adenosina
ANOVA – Análise de variância
ASIC3 – Canais iônicos sensíveis a ácido do tipo 3
ATP – Adenosina trifosfato
B1 – Receptor de bradicinina 1
B2 – Receptor de bradicinina 2
BSA – Albumina Bovina Sérica
C – Celsius
Ca2+
- íons cálcio
CEMIB – Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica
CEUA – Comissão de Ética em pesquisa Animal
CFA – Adjuvante Completo de Freud
Cg – Carragenina
CGRP – Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
CINC-1 – Quimioatraente-1 de Neutrófilos Indutor de Citocinas (Cytokine-Induced
Neutrophil Chemoattractant-1)
COX-2 – Ciclo-oxigenase 2 (Cyclooxigenase 2)
ct – Contralateral
DOMS – Dor muscular tardia (delayed-onset muscle soreness)
ELISA – Ensaio imuno enzimático (Enzyme-linked immunosorbent assay)
EPM – Erro padrão da média
FBS – Soro Fetal Bovino (Fetal Sovine Serum)
Fibras Aβ – Fibras A Beta
Fibras Aδ – Fibras A delta
g - Gramas
G - Gauge
GCaMP6 – camundongos GCaMP6
GDNF – Fator neurotrópico derivado de linhagem de células gliais
GFP – proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein)
GRD – Gânglio da raiz dorsal
h – Hora
HBSS – Solução Balanceada de Hank´s (Hank´s Balanced Salt Solution)
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
H2SO4 – Ácido sulfúrico
H-TAB – Brometo de hexadeciltrimetilamônio
Hz - Hertz
III/IV – fibras III e fibras IV
IASP – Associação Internacional para Estudo da Dor (International Association for Study of
Pain)
IL-1β – Interleucina 1β
IL-6 – Interleucina 6
i.m. – Intramuscular
i.t. – Intratecal
KCl – cloreto de potássio
l - Litro
L4 – Vértebra lombar 4
L5 – Vértebra lombar 5
LPS – Lipopolissacarídeo de Escherichia Coli
M - Molar
min – Minuto
m/s – Metros por segundo
MEM – solução mínima essencial de Eagk
MPO – Enzima mieloperoxidase
MyD88 – Molécula adaptadora de diferenciação mielóide 88
NaCl – Cloreto de Sódio
NaEDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético dissódico
NaOH – Hidróxido de sódio
NaPO4 – Fosfato de sódio
NGF – Fator de crescimento neuronal
NIH – Instituto nacional de saúde (National Institute of Health)
nm - Namômetro
NO2 – Dióxido de nitrogênio
O2 – Oxigênio
P2X – Receptor purinérgico P2X
P2X3 – Receptor P2X3
P2X2/3 – Receptor P2X2/3
P2Y – Receptor purinérgico P2Y
PBS – Tampão fosfato salina (Phosphate Buffer Saline)
pH – Potencial hidrogeniônico
PKA – Proteína quinase A
PKC – Proteína quinase C
RNA – Ácido desoxirribonucleico
RNAm – RNA mensageiro
RPM – Rotações por minuto
s – Segundos
SI – Área somatosensorial primária
SII – Área somatosensorial secundária
sal - Salina
SNC – Sistema Nervoso Central
SNP – Sistema Nervoso Periférico
SP – Substância P
TLR – receptores do tipo Toll
TMB - Tetrametilbenzidina
TNF-α – Fator de necrose tumoral α (Tumor Necrosis Factor alpha)
TRP – receptor de potencial transitório
TRPV1 – receptor de potencial transitório tipo 1
TRPV1+ - fibras/ neurônios TRPV1 positivas
TRPV1-Cre/GCaMP6+ - animais TRPV1-cre e GCaMP6
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
V – volt
λ-carragenina – Carragenina lambda
LISTA DE SÍMBOLOS
% porcentagem – por cento
δ Delta
µ Micro
β Beta
α Alfa
λ Lambda
º Graus
< menor
> maior
* asterisco
± mais ou menos
= igual
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ultraestrutura das terminações nervosas livres no tecido muscular
Figura 2. Papel dos receptores P2X3 periféricos na hiperalgesia muscular induzida por
contração estática
Figura 3. Desenho experimental do modelo de contração estática.
Figura 4. Desenho experimental do modelo da carragenina
Figura 5. Papel dos receptores P2X3 do corno da raiz dorsal da medula espinhal na
hiperalgesia muscular induzida por contração estática
Figura 6. Hiperalgesia muscular mecânica induzida pela carragenina
Figura 7. Papel dos receptores P2X3 periféricos na hiperalgesia muscular induzida pela
carragenina
Figura 8. Papel dos receptores P2X3 expressos no corno da raiz dorsal na hiperalgesia
muscular induzida pela carragenina
Figura 9. Receptores P2X3 modulam a migração de neutrófilos induzida pela contração
estática
Figura 10. Receptores P2X3 modulam a migração de neutrófilos induzida pela carragenina
Figura 11. Contração estática não induz aumento nos níveis de citocinas pró-inflamatórias no
tecido muscular
Figura 12. Resultado da genotipagem de uma linhagem de animais derivados do cruzamento
de animais Cre-TRPV1 e GCaMP6.
Figura 13. Células do gânglio da raiz dorsal de camundongos TRPV1-Cre/GCaMP6+ são
capazes de emitir fluorescência detectável pela técnica de cálcio imaging.
Figura 14. Células do gânglio da raiz dorsal de camundongos TRPV1-Cre/GCaMP6+
emitindo fluorescência em resposta a capsaicina (aumento de 10X) neurônios e dendritos e
coloração dessas áreas.
Figura 15. Análise de células do gânglio da raiz dorsal de animais TRPV1-Cre/GCaMP6+.
Figura 16. Quantificação das células do gânglio da raiz dorsal apresentando marcador DiI
indicativas de neurônios de origem muscular.
Figura 17. Quantificação do padrão de resposta dos neurônios de origem muscular a
diferentes concentrações de metabólitos e quanto a expressão de receptores TRPV1.
Figura 18. Traçado representativo das respostas de Ca+2 em neurônios individuais e células
não neuronais em respostas aos diferentes tratamentos.
17
SUMÁRIO
Carta de esclarecimento.........................................................................................................20
CAPÍTULO 1. Envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia muscular........................23
1. Introdução....................................................................................................................23
1.1.A importância clínica e econômica da dor muscular.............................................23
2. Conceitos e definições em dor......................................................................................23
1.2.1. Dor e Nocicepção..............................................................................................23
1.2.2. Hiperalgesia......................................................................................................25
3. Fisiologia da dor...........................................................................................................25
1.3.1. A detecção do estímulo doloroso......................................................................25
1.3.2. As vias de condução da dor..............................................................................26
1.3.3. Processo inflamatório e dor..............................................................................26
4. Dor muscular................................................................................................................28
1.4.1. Particularidades da dor muscular....................................................................28
1.4.2. Modelos de estudo da dor muscular.................................................................30
1.4.2.1.Modelo de dor muscular induzida pela contração estática
.....................................................................................................................31
5. Papel do ATP e seus receptores na dor........................................................................33
2. Objetivos............................................................................................................................38
2.1.Objetivo Geral.........................................................................................................38
2.2.Objetivos Específicos..............................................................................................38
3. Materiais e métodos..........................................................................................................40
3.1. Animais...................................................................................................................40
3.2. Procedimentos Gerais............................................................................................40
3.3.Delineamento experimental....................................................................................41
3.4.Modelo de hiperalgesia muscular induzida pela contração estática.....................42
3.5.Modelo de hiperalgesia muscular induzida pela carragenina...............................42
3.6. Administração intramuscular de drogas................................................................43
3.7. Administração intratecal de drogas......................................................................43
18
3.8. Drogas utilizadas...................................................................................................43
3.9. Quantificação da hiperalgesia muscular mecânica..............................................43
3.10. Quantificação da atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO)....................44
3.11. Quantificação de citocinas pelo teste de ELISA...............................................45
3.12. Análises Estatísticas..........................................................................................45
4. Resultados..........................................................................................................................48
4.1. Envolvimento dos receptores P2X3 expressos no corno da raiz dorsal no
desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida pela contração
estática....................................................................................................................48
4.2. Carragenina induz hiperalgesia muscular mecânica............................................49
4.3. Envolvimento dos receptores P2X3 periféricos na hiperalgesia muscular induzida
pela carragenina.....................................................................................................50
4.4. Envolvimento dos receptores P2X3 do corno da raiz dorsal no desenvolvimento
da hiperalgesia muscular induzida pela carragenina............................................51
4.5. Envolvimento dos receptores P2X3 na migração de neutrófilos induzida pela
contração estática...................................................................................................52
4.6. Envolvimento dos receptores P2X3 na migração de neutrófilos induzida pela
carragenina.............................................................................................................53
4.7.Envolvimento de citocinas pró-inflamatórias no modelo de hiperalgesia muscular
induzida pela contração estática...........................................................................54
5. Discussão.........................................................................................................................57
6. Conclusões.......................................................................................................................60
7. Referências bibliográficas.............................................................................................62
CAPÍTULO 2. Desenvolvimento de Camundongos GCaMP6 para o estudo dos mecanismos
de dor muscular e fadiga...........................................................................................................94
8. Introdução..........................................................................................................................97
9. Objetivos..........................................................................................................................101
19
10. Materiais e Métodos........................................................................................................103
10.1. Questões éticas...............................................................................................................103
10.2.Primeira Etapa - Desenvolvimento dos animais TRPV1-Cre/GCaMP6+.....................103
10.2.1. Cruzamentos para obtenção dos animais...................................................................103
10.2.2. Genotipagem...............................................................................................................103
10.3. Segunda Etapa - Experimentos in vitro ......................................................................104
10.3.1. Administração de DiI..................................................................................................104
10.3.2. Cultura de gânglios da raiz dorsal............................................................................105
10.3.3. Calcium Imaging........................................................................................................105
10.3.4. Análise do padrão de resposta a metabólitos............................................................106
10.4. Análise estatística..........................................................................................................106
11. Resultados...................................................................................................................109
11.1. Desenvolvimento de camundongos TRPV1-cre/GCaMP6+...........................................109
11.2. Caracterização anatômica da cultura de células do gânglio da raiz dorsal de animais
TRPV1-cre/GCaMP6+............................................................................................................109
11.3. Padrão de respostas das células do gânglio da raiz dorsal a diferentes doses de
metabólitos..............................................................................................................................112
12. Discussão....................................................................................................................116
13. Conclusão...................................................................................................................119
14. Referências bibliográficas.........................................................................................121
ANEXOS................................................................................................................................132
Anexo 1 – Autorização do comitê de ética da UNICAMP......................................................132
Anexo 2 - Carta de submissão à revista “Neuropharmacology”...........................................133
Anexo 3 – Analgesímetro e posicionamento dos animais para análise das respostas
comportamentais ....................................................................................................................135
20
CARTA DE ESCLARECIMENTO
A presente tese é dividida em duas partes levando em consideração o local de
realização dos experimentos. A primeira parte, descrita no capítulo 1 corresponde ao estudo
realizado no Laboratório de Estudos da Dor e Inflamação (LABEDI) na Faculdade de
Ciências Aplicadas da UNICAMP, sob orientação da Profa. Dra. Maria Claudia G de Oliveira
Fusaro. Nesse trabalho foi estudado o mecanismo pelo qual a ativação dos receptores P2X3
contribui para o desenvolvimento da hiperalgesia muscular de origem inflamatória. Já na
segunda parte, referente ao capítulo 2, apresento os resultados obtidos durante o doutorado
sanduíche, que foram realizados no Departamento de Anestesiologia da Universidade de Utah
nos Estados Unidos, sob orientação do Prof. Dr. Alan R. Light e Markus Amann. O estudo
baseou-se no desenvolvimento de uma nova linhagem de camundongos capazes de expressar
fluorescência apenas nas fibras aferentes TRPV1 positivas. Demonstramos os resultados
obtidos desde o desenvolvimento dessas linhagens, as análises in vitro, a caracterização
estrutural da cultura de gânglios da raiz dorsal desses animais e o padrão de resposta desses
neurônios à diferentes concentrações de metabólitos, mimetizando situações de dor e fadiga
muscular.
21
Capítulo 1
Envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia muscular
22
Introdução
23
CAPÍTULO 1 – Envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia muscular
1. INTRODUÇÃO
1.1. Importância clínica e econômica da dor muscular
A dor é uma das principais causas de atendimentos médicos no mundo (SALAFFI
et al., 2005). Estima-se que cerca de 600 bilhões de dólares sejam gastos todos os anos apenas
nos Estados Unidos com tratamentos para dor e afastamentos médicos dela decorrentes
(INSTITUTE OF MEDICINE, 2011), com perda de produtividade em torno de 300 bilhões de
dólares ao ano (GASKIN; RICHARD, 2012). Além disso, apenas na população americana,
cerca de 100 bilhões de dólares são gastos todos os anos com terapias alternativas e
complementares para o tratamento da dor, uma vez que os tratamentos atuais surtem pouco ou
nenhum efeito curativo (DUBOIS; FOLLETT, 2014).
Dentre os principais tipos de condições dolorosas a dor muscular tem sido
apontada como um dos problemas clínicos mais importantes da sociedade moderna (MENSE
et al., 2008; MURRAY et al., 2010). Estima-se que mais de 45% da população mundial
apresente dor muscular e sua prevalência gira em torno de 24% (CIMMINO et al., 2011),
gerando prejuízos socioeconômicos (REID et al., 2011). No Brasil, as dores de origem
musculoesquelética, especialmente as dores na região da coluna lombar, estão entre as
principais queixas relatadas ao longo da vida sendo que mais de 80% da população relatam as
dores de origem musculoesquelética como o tipo de dor mais frequente nos últimos três meses
(IBOPE, 2013) sendo responsável por 29% das faltas no ambiente de trabalho (MINSON,
2009).
1.2.Conceitos e Definições em dor
1.2.1. Dor e nocicepção
A dor foi definida pela Associação internacional para Estudo da Dor (IASP, 1976)
como sendo “uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a um dano
tecidual real ou potencial ou descrita nos termos de tal dano”. Recentemente, foi proposta
uma revisão dessa definição, sendo sugerido que a dor seria “uma experiência angustiante
associada a um dano tecidual atual ou potencial com componentes sensoriais, emocionais,
24
cognitivos e sociais” (WILLIAMS; CRAIG, 2016). Essa definição vem sendo discutida por
diferentes autores, cujo questionamento baseia-se no fato de que adicionar esses termos à
definição original realmente facilitaria a compreensão desse conceito (TESARZ; EICH, 2017;
WRIGHT; AYDEDE, 2017) dentro da questão histórica e social da dor (ALCOCK, 2017;
WHITBURN et al., 2017).
Toda essa discussão acerca do conceito de dor reafirma a questão da subjetividade
e da ampla gama de fatores que podem mediar e modular o processo doloroso, uma vez que já
foram descritos que fatores culturais (HOLT; WATERFIELD, 2018; ROBERTSON et al.,
2017), ambientais (TOPALOGLU et al., 2013), de gênero (FISCHER et al., 2008; FÁVARO-
MOREIRA et al., 2009), idade (FERREIRA; DE LUCA, 2017; KROON VAN DIEST et al.,
2017), experiências prévias ao processo doloroso e estado emocional (NAUSHAD et al.,
2018), qualidade dos serviços de atendimento (CLARKE et al., 2014) e a própria integridade
das vias de condução de dor (ROCZNIAK et al., 2016; ZENGIN-TOKTAS et al., 2013)
podem influenciar no processamento da informação dolorosa modulando, portanto, a sua
percepção. Assim sendo, afirma-se que a dor é uma experiência de natureza multidimensional
com componentes sensório-discriminativos (relacionados à qualidade, localização e duração
da dor), motivacional-afetiva, (relacionados ao desconforto e a busca por proteção), e
cognitivo-avaliativo (envolvido com o processamento final da informação) (MELZACK;
CASEY, 1968; MERSKY, 1986).
De uma maneira mais simples, a dor pode ser considerada como um alerta
fisiológico, agindo como um mecanismo de proteção do indivíduo à presença de um estímulo
nocivo e potencialmente destrutivo ao organismo (MENESCAL-DE-OLIVEIRA; DA
SILVA, 2009). Podemos definir a dor também como sendo a percepção de uma sensação
nociceptiva. Nesse contexto, podemos discutir dois conceitos, um de nocicepção, de
dimensão sensório-discriminativa (MELZAC; CASEY, 1968) relacionada à ativação de uma
população de neurônios específica, responsivos a estímulos de natureza destrutiva, e que
conduzirão as informações da periferia para as áreas centrais onde serão interpretadas
(MILLAM, 1999; JULIUS; BAUSBAM, 2001) e o conceito de percepção, resultado da
integração da informação nos centros superiores e que envolve fatores cognitivo-emocionais
(MERSKY, 1986). Os mecanismos envolvidos desde a detecção do estímulo nervoso até sua
interpretação serão discutidos nos próximos capítulos, abordados numa perspectiva geral do
processo de detecção, transmissão e interpretação do estímulo lesivo.
25
1.2.2. Hiperalgesia
Enquanto a IASP define nocicepção como sendo o processo de detecção e
transmissão do impulso doloroso até as áreas de processamento centrais e que se dá de forma
fisiológica e natural em resposta a estes tipos de estímulo (DUBIN; PATAPOUTIAN, 2010),
outra condição chamada de hiperalgesia é descrita como um “aumento na sensibilidade
dolorosa”, gerada pela ação de mediadores inflamatórios locais liberados pelos tecidos em
resposta à lesão inicial (VERRI et al., 2006; CUNHA et al., 2005; CUNHA et al., 2008a).
Esses mediadores, ao se ligarem aos seus receptores específicos na membrana neuronal,
ativam mecanismos moleculares que facilitam o disparo neuronal (OZAKTAY et al., 2006)
pela redução do limiar e maior magnitude de resposta ao estímulo (COOPER et al., 1991).
Portanto, aumenta a condução do processo doloroso (CUNHA et al., 2007; TREEDE et al.,
1992), vinculando, de forma geral, o processo inflamatório ao desenvolvimento da
hiperalgesia.
1.3.Fisiologia da dor
1.3.1. A detecção do estímulo doloroso
Os estímulos ambientais internos e externos são detectados por receptores
sensoriais, estruturas localizadas em nosso corpo e que são capazes de detectar e traduzir
estímulos de diferentes naturezas (química, mecânica ou térmica) (ROSENOW et al., 2003) e
transmiti-los por meio de vias de condução específicas em direção às áreas de processamento
dessas informações no sistema nervoso central (SNC) (GUYTON; HALL, 2006) por meio de
uma cadeia de neurônios que incluem os neurônios de primeira e segunda ordem em direção
aos centros superiores de processamento da informação (BONICA, 1980).
Quando um estímulo, seja ele de natureza mecânica, térmica ou química, torna-se
demasiadamente intenso a ponto de provocar a lesão dos tecidos, um tipo específico de
receptor, os chamados nociceptores, ou receptores de dor, são ativados (STEEDS, 2009). Os
nociceptores são fibras aferentes de pequeno diâmetro, caracterizadas por serem terminações
nervosas livres, de alto limiar de ativação (GUYTON; HALL, 2006), amplamente distribuídos
na pele, havendo discussões sobre seu posicionamento e densidades em áreas como músculo,
articulações e tecido visceral (WILLIS et al., 2004; ROBINSON et al., 2008; RAJA et al.,
1988). Os nociceptores podem ser ativados, por uma (unimodal) ou mais modalidades de
26
estímulo (polimodais), sendo capazes de gerar sinais elétricos (potenciais de ação) na
membrana dos neurônios aferentes primários onde estão localizados (STEEDS, 2009).
1.3.2. As vias de condução da dor
A informação dolorosa é conduzida através de uma cadeia de neurônios chamada
de vias aferentes, ou vias de condução da dor. Como descrito anteriormente, a ativação do
neurônio aferente primário inicia o processo de transmissão do impulso doloroso. O neurônio
aferente primário é classificado como um neurônio pseudounipolar, com o corpo celular
presente no gânglio da raiz dorsal (ou nos gânglios trigeminais para informações vindas das
áreas de face e cabeça), com prolongamentos fazendo sinapse no corno da raiz dorsal da
medula espinhal (ou tronco encefálico para os nervos cranianos), onde estão os neurônios de
segunda ordem. A ativação dos neurônios aferentes primários leva a liberação de
neurotransmissores no terminal pré-sináptico, como glutamato, substância P e CGRP
(MILLAN, 1999), que estimulam os neurônios de segunda ordem e permitem a condução da
informação às áreas encefálicas onde serão processadas.
Foi descrito que os receptores de dor encontram-se dispostos no terminal
neuronal de fibras aferentes do tipo A-delta (Aδ) e C. As fibras Aδ são fibras pouco
mielinizadas, de médio diâmetro (2-6μm) e que apresentam velocidade de condução média
entre 12 a 30 m/s. São responsáveis pela condução da dor aguda, rápida e bem localizada. Já
as fibras do tipo C são de pequeno calibre (0,2-1,2μm), virtualmente amielínicas, com
velocidade de condução em torno de 0,5 a 2,0 m/s e estão envolvidas com a condução da dor
lenta, crônica e difusa (WOOLF; MA, 2007; GYTON; HALL, 2011). As fibras Aδ fazem
sinapse na lâmina I e V do corno da raiz dorsal da medula espinhal enquanto que as fibras C
fazem sinapse na lâmina I e II (MENESCAL-DE-OLIVEIRA; DA SILVA, 2009).
Essas fibras dolorosas estão relacionadas a duas vias de condução: a via
Paleoespinotalâmica, envolvida com a condução da dor crônica e a via Neoespinotalâmica
envolvida com a condução da dor aguda. O trato neoespinotalâmico possui número reduzido
de sinapses e o processamento da dor é mais preciso, enquanto que a via paleoespinotalâmica
envolve um maior número de sinapses e as informações são menos precisas (MACHADO,
2006).
1.3.3. Processo inflamatório e dor
A dor é um dos cinco sinais cardinais do processo inflamatório. A inflamação
pode ser definida como uma resposta corporal resultante de um dano tecidual. Trata-se de um
27
mecanismo de defesa que protege os indivíduos de lesão, processos infecciosos, estresse
tecidual ou mau funcionamento (MAJNO; JORIS; 2004; KUMAR et al., 2003;
MEDZHITOV, 2008).
A lesão tecidual induz a liberação de uma série de mediadores inflamatórios,
como bradicinina (CHOI; HWANG, 2018; BELLUCCI et al., 2013), aminas
simpatomiméticas (LI et al., 2013), prostaglandinas (SINGH et al., 2017), substância P
(LISOWSKA et al., 2015), endotelinas (ZARPELON et al., 2013), fator de crescimento
neural (PRATO et al., 2017) e ATP (JUNG et al., 2014) que ativam ou sensibilizam o
neurônio aferente primário, aumentando a descarga de potenciais de ação vindos da região
lesada e facilitando o reconhecimento da área lesionada e sua proteção.
Conforme descrito previamente, a sensibilização neuronal e o aumento do número
de disparos elétricos vindo da área lesionada estão envolvidos com o desenvolvimento da
hiperalgesia uma vez que a lesão inicial induz a liberação de uma série de mediadores
inflamatórios e que podem se ligar a receptores específicos promovendo a abertura de canais
iônicos ou a ativação de receptores acoplados a proteína G. Ambos, em última instância,
promovem uma redução do potencial de membrana das células neuronais, com consequente
redução do limiar de resposta (MENSE, 2009).
Inicialmente, a ativação de canais iônicos induz a um influxo de íons como, por
exemplo, os íons sódio pela membrana neuronal, que reduzem o limiar de despolarização do
neurônio aferente primário, facilitando assim seu disparo (BERNE; LEVY, 2009). Já os
receptores acoplados a proteína G estão relacionados à ativação de cascatas de sinalização por
meio de segundos mensageiros, incluindo proteína quinase A e C (PKA e PKC), a enzima
adenilato-ciclase e o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) (BERNE; LEVY, 2009;
KACZEWSKI et al., 2010), que desencadeiam respostas capazes de promover o influxo de
cátions para o interior da membrana, facilitando, como descrito anteriormente, a
despolarização (MENSE, 2009; SACHS et al., 2009). Esse processo de redução do limiar de
despolarização é o princípio do conceito de sensibilização neuronal e da hiperalgesia primária
(SANDKUHLER, 2009).
Outro mecanismo envolvido é a ativação de células de defesa residentes, como
macrófagos que estimulam a migração de neutrófilos ao tecido e potencializam a resposta
inflamatória. Além disso, essas células de defesa atuam liberando citocinas pró-inflamatórias
capazes de estimular a síntese de prostaglandinas e aminas simpatomiméticas que em via final
ativam mecanismos moleculares capazes de sensibilizar o neurônio aferente primário
(CUNHA et al.,2007).
28
1.4. A dor muscular
Conforme descrito previamente, a dor muscular possui elevada incidência e
importante impacto socioeconômico. O tecido muscular possui características únicas, fazendo
com que a dor muscular apresente particularidades que precisam ser compreendidas e melhor
estudadas.
1.4.1. Particularidades da dor muscular
A dor muscular possui particularidades interessantes em relação a dor cutânea,
articular e de origem neuropática. Sabe-se que muito do conhecimento científico sobre os
mecanismos de desenvolvimento da dor muscular são baseados em estudos realizados no
tecido cutâneo (KEHL; FAIRBANKS, 2003), entretanto, tem sido descritas diferenças
importantes entre a dor muscular e a dor cutânea (MENSE, 1993). Morfologicamente já foi
descrito que os nociceptores no tecido muscular apresentam diferenças no formato e
localização em relação a outros tecidos. Enquanto que os nociceptores foram descritos como
terminações nervosas livres presentes em áreas da derme e regiões como ligamentos e cápsula
articular, no tecido muscular, ainda não se sabe ao certo sua real localização. O primeiro
estudo na área, realizado por Stacey (1969), demonstrou que os nociceptores musculares
seriam ligados a fibras aferentes de pequeno diâmetro, responsáveis pela inervação de tecidos
profundos, conhecidas por fibras III e IV. As fibras III são semelhantes às fibras Aδ, enquanto
que as fibras IV são correspondentes às fibras C (GRAVEN-NIELSEN; MENSE, 2001).
Quanto à velocidade de condução das fibras III, esta é em torno de 2,5 a 35m/s, e das fibras
IV em torno de 2,5m/s (GRAVEN-NIELSEN; MENSE, 2001; DJOUHRI; LAWSON, 2004).
Ambas projetam-se para as lâminas I e IV/V da medula espinhal (HOHEISEL et al., 1989;
PANNETON et al., 2005), característica que pode explicar a dificuldade de localizar com
precisão as informações dolorosas de origem muscular.
Ensaios imunohistoquímicos demonstraram que as terminações nervosas no tecido
muscular apresentam formato semelhante a um “colar de contas”, chamados de varicosidades,
que variam entre 0,5 e 1μm (STACEY, 1969). Outros estudos posteriores demonstraram que
o terminal nociceptivo não estaria localizado nas fibras musculares (REINERT et al., 1998),
mas sim ao redor do perimísio e na adventícia de arteríolas, vênulas e tecidos linfáticos
(DURING; ANDRES, 1990). Além disso, os terminais de fibras III são geralmente maiores
dos que os de fibras IV e possuem maior número de mitocôndrias e vesículas (ANDRES et
29
al., 1985). Uma representação da estrutura atualmente aceita para as terminações nervosas
livres no tecido muscular podem ser visualizadas na figura 1.
Figura 1
Figura 1. Ultraestrutura das terminações nervosas livres no tecido muscular. A)
Representação de uma terminação nervosa livre por microscopia eletrônica. Os terminais
apresentam diversos ramos e exibem várias varicosidades. As células de Schwann envolvem a
maior parte desses axônios, deixando expostos apenas pequenas áreas. As áreas expostas são
sítios onde os agentes químicos agem. B) Secção transversal de uma varicosidade. As
varicosidades apresentam o axônio não completamente envolto pelas células de Schawn,
formando as áreas de axônio exposto. Podemos verificar também a presença de diversas
mitocôndrias na região do axoplasma neuronal e de vesículas contendo neuropetídeos (Fonte:
MENSE; GERWIN, 2009).
30
Outra característica ainda relacionada às fibras sensoriais aferentes primárias tipo
C do tecido muscular é que elas possuem maior quantidade de CGRP (peptídeo relacionado
ao gene da calcitonina) (O'BRIEN et al., 1989) e sua estimulação induz efeitos mais
prolongados (WALL; WOOLF, 1984) do que no tecido cutâneo. Funcionalmente a dor
muscular induz um aumento significativamente maior de campos receptivos (HOHEISEL et
al., 1993, MENSE, 1993, YU et al., 1993) e ativa diferentes núcleos de controle da dor no
Sistema Nervoso Central (MAIXNER et al., 1995)
Por fim, foi descrito que a administração intramuscular do agente pró-inflamatório
carragenina no ventre do músculo gastrocnêmio induz a um aumento mais lento das citocinas
IL-1β e IL-6 do que no tecido cutâneo e, diferente do tecido cutâneo, não induz aumento da
concentração de TNF-α no tecido muscular (LORAM et al., 2007), indicando uma diferença
também quanto ao processo inflamatório local em resposta a estímulos de natureza
inflamatória. Além disso, existem evidências de que a liberação de citocinas inflamatórias
depende do mecanismo de indução do processo doloroso, uma vez que já foi descrito que a
liberação de citocinas pode ou não ser fundamental para o desenvolvimento de diversos tipos
de condição dolorosa de origem muscular, uma vez que já foi descrito que a hiperalgesia
induzida pelo exercício excêntrico induz a liberação de citocinas pró-inflamatórias (KANDA
et al., 2013), enquanto que condições crônicas como fibromialgia parece não ser mediada pela
liberação de citocinas inflamatórias (ÜÇEYLER et al., 2011), sendo portanto, estímulo
dependente.
1.4.2. Modelos de estudo de dor muscular
Dentre os principais modelos experimentais empregados no estudo da dor
muscular em animais, os mais comuns são caracterizados pela dor muscular induzida por
administração local de agentes químicos e a induzida por contração muscular através de
exercícios físicos ou estimulação elétrica do ventre muscular (Gregory et al., 2013).
Nos modelos experimentais de dor muscular induzida por agentes químicos
irritantes há o uso do óleo de mostarda (HAN et al., 2008), carragenina (LORAM et al.,
2007), Adjuvante Completo de Freund (CFA), salina ácida (SLUKA et al., 2001, FREY LAW
et al., 2008; NIELSEN et al., 2004) ou hipertônica (KNARDAHL, 2002), serotonina
(BABENKO et al., 1999), fator de crescimento neuronal (NGF) (SVENSSON et al., 2003) e
ATP (MORK et al., 2003). Esses agentes podem ou não induzir um processo inflamatório,
entretanto, de maneira geral, mimetizam a dor muscular em humanos. Especificamente, a
31
carragenina é um modelo experimental muito utilizado e bem estabelecido em alguns tecidos
(CUNHA et al., 1995; CHOPADE et al., 2014). Ela mimetiza a resposta dolorosa em seres
humanos (WINTER et al., 1962; WINTER et al., 1968; MIRSHAFIEY et al., 2005), sendo
frequentemente empregada para induzir dor inflamatória (FEHENBACHER et al., 2012;
TEIXEIRA et al., 2010; TEIXEIRA et al., 2016; TEIXEIRA et al., 2017; CHOPADE et al.,
2014; LORAM et al., 2007). Sabe-se que a hiperalgesia induzida pela carragenina no tecido
subcutâneo é modulada por bradicinina, ATP, via receptores P2X3 e P2X7, citocinas pró-
inflamatórias, prostaglandinas e aminas simpatomiméticas (CUNHA et al., 1992;
BERNHEIM et al., 1980; ZUCALI et al., 1986; CUNHA et al., 1992; POOLE et al., 1995;
CUNHA et al., 2005; HANDWERKER, 1976; FERREIRA; NAKAMURA, 1976;
OLIVEIRA et al., 2009; TEIXEIRA et al., 2014; de OLIVEIRA FUSARO et al., 2010).
Quanto aos modelos de dor muscular induzida por contração muscular,
comumente são usados modelos de exercícios físicos ou estimulação elétrica simulando as
contrações que resultam em dor muscular tardia (DOMS – delayed-onset muscle soreness)
(KEHL 1996; SLUKA; RASMUSSEN 2010; YOKOYAMA et al., 2007) (BORGHI et
al.,2014a; BORGHI et al.,2014b; BORGHI et al.,2015). (TAGUCHI et al., 2005, TAGUCHI
et al., 2007, MURASE et al., 2010). Esses modelos experimentais de dor tardia são muito
relevantes, entretanto, esse tipo de dor muscular não está associado às atividades funcionais
diárias dos indivíduos e, por essa razão, não apresentam importante impacto socioeconômico.
1.4.2.1. Modelo de hiperalgesia muscular induzida por contração estática
A contração estática, também conhecida como contração isométrica sustentada,
caracteriza-se por ser um tipo de contração na qual existe a geração de tensão sem, contudo,
existir movimento da articulação (HILL, 1925). A contração estática é o padrão de contração
mais associado às dores referidas durante e após as atividades de vida diária (KNARDAHL,
2002, BOIX et al., 2005; NOSAKA et al., 2011). Sabe-se que as atividades funcionais,
realizadas por longos períodos de tempo e potencialmente dolorosas, como a sustentação do
peso corporal na postura em pé e permanecer sentado em atividade de digitação, são mantidas
principalmente por contração estática (ROY et al., 1989). Além disso, foi sugerido que a dor
nas costas referida após os períodos de sono na posição deitada é causada por contração
estática dos músculos lombares (BAUM; ESSFELD, 1999).
Finalmente, diferentes modelos experimentais realizados em humanos confirmam
que a contração estática induz dor (NOSAKA et al., 2011; VECCHIET et al., 1983). Há
relatos de dores musculares após contrações estáticas do músculo masseter ou trapézio,
32
realizadas repetidamente por um determinado período de tempo (HEDENBERG-
MAGNUSSON et al., 2006); do músculo quadríceps, na posição de flexão de joelho a 90°,
realizada uma única vez até a exaustão, tanto em mulheres saudáveis como nas portadoras de
fibromialgia (KOSEK et al., 1996). Entretanto, apesar da sua relevância clínica, os
mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da dor muscular induzida pela
contração estática são pouco conhecidos.
Recentemente nosso grupo de pesquisa desenvolveu um modelo experimental de
dor muscular induzida pela contração estática (SANTOS et al., 2017). Esse modelo baseia-se
na indução de uma contração estática no músculo gastrocnêmio de ratos através da
eletroestimulação do mesmo, pelo período de 1 hora. Demonstramos que a contração estática
induz hiperalgesia muscular mecânica após ½ hora do término da contração, com pico em 1
hora e resolução após 2 horas (SANTOS et al., 2017). Demonstramos também que essa
resposta hiperalgésica é modulada por bradicinina, via receptores B1 e B2, aminas
simpatomiméticas, via receptores β1 e β2, prostaglandinas e neutrófilos (SANTOS et al.,
2017).
Dados ainda não publicados do nosso grupo também demonstraram o
envolvimento do ATP endógeno, via ativação de receptores P2X3 na hiperalgesia muscular
induzida pela contração estática. Isso porque o pré-tratamento intramuscular com o
antagonista seletivo dos receptores P2X3, A-317491, reduziu a hiperalgesia muscular (Figura
2).
Figura 2
33
0
10
20
30
40
50
*
*
A-317491
60g 0.6g 6.0g 60g 60g (ct)
Contração estática (n=5)
(Sham)
#
Hip
era
lgesia
Muscula
r (
g)
Figura 2. Papel dos receptores P2X3 periféricos na hiperalgesia muscular induzida por
contração estática. A contração estática induziu hiperalgesia muscular quando comparada ao
grupo sham, como indicado pelo símbolo “#”. A administração do A-317491 (6 e
60µg/músculo) reduziu a hiperalgesia muscular induzida pela contração estática, como
indicado pelo símbolo “*” (p < 0.0001, F= 11.00, teste de Tukey). Na pata contralateral (ct),
A317491 não reverteu a hiperalgesia muscular e quando administrado no grupo Sham, não
houve alteração do limiar nociceptivo basal (n=5; p>0.05, ANOVA).
1.5. O papel do ATP e seus receptores na dor
A primeira menção histórica da molécula de ATP foi feita em 1929, quando Karl
Lohamann e o então prêmio Nobel de medicina Laureate Otto Meyerhof demonstraram que
uma molécula formada por purinas estava presente em extratos de tecido muscular. Apenas
por volta de 1950, Pamela Holton, pesquisadora do departamento de fisiologia da
Universidade de Cambridge sugeriu que o ATP seria liberado de nervos sensoriais e poderiam
estar envolvidos com a sinalização celular (HOLTON; HOLTON, 1953; HOLTON;
HOLTON, 1954; HOLTON, 1959). Posteriormente G. Burnstock demonstrou que o ATP
estava envolvido com a sinalização entre neurônios motores e tecido muscular liso
(BURNSTOCK et al., 1964; BURNSTOCK et al., 1970; SATCHELL; BURNSTOCK, 1971;
34
SU et al., 1971). Quase dez anos depois Burnstock sugeria a existência de nervos
purinérgicos, capazes de liberar ATP como neurotransmissor (SATCHELL et al., 1972;
BURNSTOCK, 1972).
“Mas se há um neurotransmissor devem haver receptores capazes de serem
ativados por eles”, provavelmente com esse pensamento Burnstock propunha o conceito de
receptores purinérgicos, que em 1978 foram divididos em duas famílias, os P1, que são
receptores ativados pela adenosina, e os receptores P2, ativados pela molécula de ATP
(BURNSTOCK, 1978). Os receptores P2 são ainda divididos em duas classes funcionais, os
receptores da família P2Y, que são receptores metabotrópicos, acoplados a proteína G, e os
receptores da família P2X que são ionotrópicos (BURNSTOCK; KENNEDY, 1985) e
permeáveis a íons Na+, K
+ e Ca
2+ (NORTH, 2002).
Quantos aos subtipos de receptores P2X, foram identificados sete receptores
funcionais dentro dessa classe (P2X1-7) (COLLO et al., 1996; COLLO et al., 1997;
NÖRENBERG; ILLES, 2000; VULCHANOVA et al., 1997), expressos no sistema nervoso
de mamíferos (ABBRACCHIO et al., 2009), incluindo neurônios e células gliais (FRANKE
et al., 2001; MEOMARTINI et al., 2003; XIANG et al., 2005), células do sangue (WANG et
al., 2005; SLUYTER et al., 2007; SKALS et al., 2009), músculo liso (MURTHY;
MAKHLOUF, 1998; VIAL; EVANS, 2000) e em neurônios sensoriais (BURNSTOCK,
2000). Os receptores P2X já foram descritos como envolvidos com diversas funções
fisiológicas e patológicas, incluindo sua ação como modulação da neurotransmissão
(ERNEST et al., 2006; SMITH et al., 2001), sinalização de sensações somestésicas como o
gustação (FINGER et al., 2005), olfato e visão (LOHR et al., 2014), estando envolvida
também no desenvolvimento da inflamação (DI VIRGILIO, 2015; BURNSTOCK), uma vez
que a ativação de receptores P2X expressos em células imunes como macrófagos, monócitos
(IDZKO et al., 2014), por exemplo, estimulam a inflamação (VITIELLO et al., 2012). Por
fim, outra condição em que os receptores P2X vêm sendo descritos de forma importante é a
transmissão de informações nociceptivas (CHIZH, ILLES, 2001; KUAN; SHYU, 2016).
Os primeiros estudos relacionando o ATP e a dor demonstraram que a
administração local de ATP promovia respostas vasculares na pele e dor persistente
(BLEEHEN, KEELE, 1977; COUTTS et al., 1981; HAMILTON et al., 1999). Sobre o papel
do ATP na dor, sabe-se que a molécula de ATP está presente em todas as células do
organismo (McCleyskey; Gold, 1999) e existem diversas circunstâncias nas quais o ATP pode
35
ser liberado e atuar como um mediador inflamatório do tecido periférico (HAMILTON,
2002). Os dois processos básicos envolvidos com a liberação do ATP são: de forma passiva,
resultado da lise celular causada por trauma direto (BLEEHEN; KEELE, 1977; MAEHARA
et al., 1987; RYAN et al., 1991) e da forma ativa, no qual o ATP é liberado por vesículas
(BURNSTOCK, 1995). Estudos in vitro e in vivo tem demonstrado que a administração de
ATP pode aumentar o padrão de descarga das fibras C (HILLIGES et al., 2002).
Durante a inflamação, o ATP liberado no meio extracelular contribui com o
desenvolvimento da dor inflamatória via ativação dos receptores purinérgicos P2X, incluindo
o subtipo P2X3 (COCKAYNE et al., 2000, SOUSLOVA et al., 2000, JARVIS et al., 2002,
MCGARAUGHTY et al., 2003, WU et al., 2004, OLIVEIRA et al., 2005, OLIVEIRA et al.,
2009). Os receptores P2X3 são predominantemente expressos nos nociceptores aferentes
primários (CHEN et al., 1995, LEWIS et al., 1995, COLLO et al., 1996), e são importantes
moduladores de diversos tipos de condições dolorosas. Já foi demonstrado seu papel em
modelos de estudo como a dor neuropática induzida pela ligação parcial do nervo ciático
(JARVIS et al., 2002; BARCLAY et al., 2002), dor oncológica em modelo de câncer ósseo
(KAAN et al., 2010; WU et al., 2012), hiperalgesia articular induzida pela administração de
carragenina (TEIXEIRA et al., 2017), visceral em um modelo de colite (DEITEREN et al.,
2015) e inflamatória no tecido subcutâneo por administração de agentes inflamatórios como a
carragenina (DE OLIVEIRA FUSARO et al., 2010).
Recentemente, demonstramos que a ativação dos receptores P2X3 pelo ATP
endógeno é essencial para o desenvolvimento da dor inflamatória induzida pela carragenina
no tecido subcutâneo da pata de ratos, uma vez que o antagonista seletivo de receptores P2X3,
A-317491, bloqueou a hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina (OLIVEIRA et al.,
2009). Neste estudo, demonstramos que a participação dos receptores P2X3 na hiperalgesia
mecânica induzida pela carragenina é mediada pela sensibilização direta e indireta dos
nociceptores aferentes primários. A sensibilização direta envolve a ativação dos receptores
P2X3 expressos nas fibras aferentes primárias, enquanto que a sensibilização indireta envolve
a liberação prévia da citocina pró-inflamatória TNF-α (OLIVEIRA et al., 2009). Em outro
estudo também realizado por nosso grupo de pesquisa demonstramos que o agonista não
seletivo de receptores P2X3, α,β-meATP, induz hiperalgesia mecânica no tecido subcutâneo
da pata de ratos através da sensibilização indireta dos nociceptores aferentes primários (dados
não publicados).
36
No tecido muscular, a molécula de ATP está particularmente presente em altas
concentrações e, por essa razão, tanto em traumas musculares quanto em eventos patológicos
da musculatura, o ATP pode contribuir para o desenvolvimento da dor muscular
(MCCLESKEY; GOLD, 1999, BURNSTOCK, 2007). Estudos que sustentam essa hipótese
demonstram que a contração muscular excêntrica aumenta a expressão do RNAm de
receptores P2X3 no músculo masseter de ratos (DESSEM et al., 2010), os nociceptores
aferentes primários do músculo gastrocnêmio de ratos (REINOHL et al., 2003) ou do músculo
tríceps femural de gatos (HANNA; KAUFMAN, 2004) são ativados pela administração do
agonista não seletivo de receptor P2X3 α,β-meATP ou de ATP em concentrações
equivalentes às encontradas nas células musculares. Além disso, a administração de ATP ou
α,β-meATP no músculo esquelético de humanos (MORK et al., 2003) ou camundongos
(MAKOWSKA et al., 2006, REITZ et al., 2009) induz dor muscular intensa. Recentemente
demonstramos que a administração de α,β-meATP também induz hiperalgesia muscular em
ratos, e que este efeito é mediado por bradicinina via receptores B1, prostaglandinas, aminas
simpatomiméticas via receptores β1 e β2, migração de neutrófilos e aumento das citocinas
pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β (SCHIAVUZZO et al., 2015).
Conforme descrito previamente, os receptores P2X3 periféricos estão envolvidos
com o desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida por contração estática no tecido
muscular. Entretanto, não se conhece até então, o envolvimento dos receptores P2X3 centrais
e seu papel sobre a migração de neutrófilos para o tecido muscular. Considerando que o
modelo de contração estática é um modelo relativamente novo e ainda em estudo, analisamos
o envolvimento desses receptores no modelo inflamatório da carragenina. Para isso, testamos
a hipótese de que o antagonista seletivo dos receptores P2X3, o A-317491 pode reduzir a
hiperalgesia muscular e a migração de neutrófilos em ambos os modelos. Além disso,
considerando-se a importância das citocinas pró-inflamatórias no desenvolvimento da
hiperalgesia muscular, avaliamos o padrão de liberação de citocinas pró-inflamatórias em
resposta a contração estática.
37
Objetivos
38
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo geral do presente estudo foi avaliar o envolvimento dos receptores
P2X3 no desenvolvimento da hiperalgesia muscular de origem inflamatória.
2.2. Objetivos Específicos
1) Avaliar o envolvimento dos receptores P2X3 do corno da raiz dorsal, na
hiperalgesia muscular induzida por contração estática. Para isso, foi administrado por via
intratecal o antagonista dos receptores P2X3, o A-317491, e analisado o comportamento
hiperalgésico via Randall Selitto;
2) Avaliar se a administração de Carragenina (100 µg) no ventre do músculo
gastrocnêmio é capaz de induzir hiperalgesia muscular. Para isso, foi realizada administração
de carragenina no ventre do músculo gastrocnêmio dos animais e analisado o comportamento
hiperalgésico via Randall Selitto;
3) Avaliar o envolvimento dos receptores P2X3 periféricos e do corno da raiz dorsal,
na hiperalgesia muscular induzida pela carragenina. Para isso, o A-317491, foi administrado
por via intramuscular ou intratecal o A-317491, e analisado o comportamento doloroso via
Randall Selitto;
4) Avaliar o envolvimento dos receptores P2X3 na migração de neutrófilos induzida
pela contração estática e pela carragenina. Para isso, foi administrado 5 minutos antes da
indução de contração estática ou da administração de carragenina no ventre do músculo
gastrocnêmio, o A-317491 e quantificada a migração de neutrófilos pelo teste de MPO.
5) Avaliar se a contração estática induz aumento dos níveis de citocinas pró-
inflamatórias pelo teste de ELISA.
39
Materiais e Métodos
40
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados ratos machos Wistar pesando entre 200 a 250 g, provenientes do
CEMIB-UNICAMP. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas (cinco por gaiola)
contendo maravalha, em ambiente com controle de luminosidade (ciclos claro/escuro de 12
horas) alimentação e água, ad libitum.
Todos os procedimentos experimentais foram previamente aprovados pelo comitê
de ética em pesquisa animal da Universidade Estadual de Campinas (2770-1, Anexo 1) e
seguiram as diretrizes propostas pelo comitê para pesquisa e ética da Associação Internacional
para Estudo da Dor (IASP) em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983). Em particular,
a duração dos experimentos e o número de animais utilizados foi o menor possível
(aproximadamente cinco ratos por grupo) considerando-se o cálculo amostral na Equação 1.
𝒏 = 𝟏 + [𝟐𝑪 ∗ (𝒔/𝒅)𝟐]; 𝑜𝑛𝑑𝑒 𝑪 = (𝒛𝜶 + 𝒛𝜷).
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑖𝑑𝑒𝑟𝑎𝑛𝑑𝑜 − 𝑠𝑒: 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑣𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑓𝑖𝑎𝑛ç𝑎(𝐼𝐶) = 95%, 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑝 < 0,05, 𝑠
= 0,2 (20%)𝑒 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛ç𝑎 = 0,5 (50%)
𝐶 = (1,96 + 1,282)2 = 10,51 𝑒 𝑛 = 1 + [2 ∗ 10,5 ∗ (0,2
0,5)
2
]=
4,36 animais = aproximadamente 5 animais
Equação 1: Cálculo amostral considerando-se os valores de Intervalo de confiança = 95%,
valor de p < 0.05, valor de desvio padrão aceitável = 20% e diferença estatística = 50%.
3.2. Procedimentos Gerais
As sessões de teste foram realizadas durante a fase clara (entre as 9 às 17 h) em
sala silenciosa, com temperatura ambiente mantida a 25 °C (ROSLAND, 1991). Os animais
41
foram habituados por 1 hora na sala antes do início dos experimentos e não tiveram acesso à
água ou a comida durante o teste.
3.3. Delineamento experimental
As análises do comportamento doloroso foram realizadas utilizando-se 5 animais
por grupo, considerando-se o cálculo amostral na Equação 1. Para as análises do
envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia muscular induzida por contração estática
os animais foram brevemente anestesiados e receberam a injeção do antagonista dos
receptores P2X3, o A-317491, 5 minutos antes da contração estática, conforme demonstrado
na figura 3.
Figura 3. Desenho experimental das análises comportamentais no modelo da contração
estática.
Para as análises do envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia muscular
induzida pela carragenina os animais foram brevemente anestesiados e receberam a injeção do
A-317491, 5 minutos antes da administração de carragenina (100μg). Estes animais foram
avaliados previamente a administração inicial e após ½, 1, 3, 6, 24, 48 e 72 horas da
administração de carragenina, conforme demonstrado na Figura 4.
42
Figura 4. Desenho experimental das análises comportamentais no modelo da carragenina. A
sigla RS indica o momento de avaliação via Randall Selitto. A sigla Cg indica carragenina.
3.4. Modelo de hiperalgesia muscular induzida por contração estática
Previamente à indução de contração estática, os animais foram anestesiados por
inalação isoforine (LE BARS et al., 1979) e colocados em posição de decúbito ventral. A
região glútea e posterior da pata direita foram tricotomizadas e os eletrodos (em número de 2;
do tipo agulha – agulha gengival longa 27 gauge (G)) foram inseridos obliquamente no
ventre do músculo gastrocnêmio dos ratos, sendo separados por uma distância de 10 mm.
Esses eletrodos foram acoplados a um equipamento da marca Grass Instruments, modelo
S88X Stimulator (West Warnick, Estados Unidos) com os seguintes parâmetros de
estimulação: pulso repetido, corrente monofásica, frequência= 50 Hz, duração de pulso= 19
ms, intensidade da corrente 1,6 V, tempo 1 hora, conforme previamente padronizado
(SANTOS et al., 2017). Como controle foi utilizado o grupo sham. Este grupo recebeu apenas
os eletrodos no ventre do tecido muscular sem a passagem de corrente elétrica.
3.5. Modelo de hiperalgesia muscular induzida pela carragenina
Para indução de hiperalgesia muscular induzida pela administração de
carragenina, os animais foram brevemente anestesiados com isoforine e uma solução de λ-
carragenina diluída em salina (100 µg/músculo; OLIVEIRA et al., 2009) foi injetada no
ventre do músculo gastrocnêmio conforme descrito item 4.5.
3.6. Administração intramuscular de drogas
43
As drogas ou seus veículos foram administrados no ventre do músculo
gastrocnêmio através de uma agulha 30 G acoplada a uma cânula de polietileno e também a
uma seringa Hamilton de 50 µL (GAUTAM; BENSON, 2013; SCHIAVUZZO et al., 2015).
O volume final das administrações foi de 50 µL.
3.7. Administração intratecal de drogas
O antagonista dos receptores P2X3 e seu veículo (salina) foram administrados por
via intratecal segundo a técnica descrita por Papir-Kricheli (1987), porém com algumas
modificações conforme descrição abaixo. Previamente os animais foram anestesiados por
inalação de isoforine (LE BARS et al., 1979) e submetidos a tricotomia da região lombar. A
seguir, foram posicionados de maneira que a coluna vertebral fique arqueada, então uma
agulha hipodérmica de 26G foi inserida no espaço subaracnóide da medula entre as regiões
sacral e cauda eqüina, perfurando a região medial entre L4 e L5 num ângulo de
aproximadamente 45º. O volume de cada injeção foi de 10 L (OLIVEIRA et al., 2009). A
velocidade de administração foi de aproximadamente 1L/s.
3.8. Drogas utilizadas
A-317491 (o antagonista seletivo de receptor P2X3,2/3 – (5-([(3-Phenoxybenzyl)
[(1S)-1,2,3,4-tetrahydro-1naphthalenyl] [amino]carbonyl)-1,2,4-benzene- tricarboxylic acid:
60g, OLIVEIRA et al., 2009) e λ-carragenina (100 µg; OLIVEIRA et al., 2009). Todas as
drogas foram diluídas em salina e obtidas da Sigma-Aldrich (Brasil).
3.9. Quantificação da hiperalgesia muscular mecânica
A metodologia empregada para a quantificação da hiperalgesia mecânica foi
proposta por Randall & Selitto (1957). Para o teste utilizamos um analgesímetro digital
(Insight, Ribeirão Preto, anexo 3), que aplica uma força mecânica linear com aumento gradual
no ventre do músculo gastrocnêmio da pata traseira de ratos (SCHIAVUZZO et al., 2015;
SANTOS et al., 2017). O registro do limiar de retirada da pata foi quantificado pela média de
três medidas realizadas em intervalos de 5 minutos. Os animais foram habituados na sala de
experimentação pelo período de 1 hora antes do teste. As avaliações do comportamento
doloroso basal foram realizadas imediatamente antes da indução de contração estática ou
administração de drogas/veículo; 1 hora após o término da contração estática (conforme
44
padronizado previamente por Santos et al., 2017) e ½, 1, 3, 6, 24 e 48 horas após a
administração de carragenina. A hiperalgesia muscular mecânica foi quantificada pela
variação no limiar nociceptivo mecânico calculado pela subtração da média do limiar
nociceptivo mecânico registrado antes da contração estática/carragenina menos a média das
respostas comportamentais pós-tratamento. Assim sendo, os aumentos dos valores do eixo Y
dos gráficos representam maior comportamento hiperalgésico.
3.10. Quantificação da atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO)
A migração de neutrófilos para o tecido muscular foi determinada pela avaliação
colorimétrica da enzima mieloperoxidase (BRADLEY et al., 1982). Os animais foram
eutanasiados utilizando anestesia inalatória (isoforine) e posterior deslocamento cervical. O
tecido muscular foi coletado (peso médio entre 0,1 a 0,4 g), do músculo gastrocnêmio, após
uma hora da indução de contração estática e três horas após a administração de carragenina.
Foram coletados 3 grupos por modelo. Para o modelo de contração estática foram coletados
os grupos: sham, contração estática e A-317491 administrado 5 minutos antes da contração
estática. E para o modelo de carragenina foram coletados: veículo (salina), carragenina
(100μg) e A-317491, administrado 5 minutos antes da carragenina. Esses tecidos foram
homogeneizados em tampão (0,5 mL: 0.1 M NaCl, 0.02 M NaPO4, 1.015 M NaEDTA, pH
4,7) utilizando-se o equipamento Marconi, modelo MA 102/MINI (Piracicaba) e foram
posteriormente centrifugados a 4 º C, 3000 RPM por 15 min. Os pellets foram inseridos em
novamente em solução (0,5 mL: 0.1 M NaCl, 0.02 M NaPO4, 1.015 M NaEDTA, pH 4,7),
sendo posteriormente adicionada solução hipotônica para lise celular (0,5 mL de NaCl 0,2% )
por 30 s, seguidos por adição em igual volume de solução de NaCl 1,6% e glicose 5%. Após
centrifugação (4 º C, 3000 RPM por 15 min), os pellets foram ressuspendidos em tampão
0,05M NaPO4 (pH 5,4) contendo H-TAB, e foram então congelados (nitrogênio líquido) e
descongelados (água corrente) por 3 vezes, sendo então centrifugados a 4 º C, 12000 RPM,
por 15 min. Em seguida, os sobrenadantes foram congelados em nitrogênio líquido e
posteriormente usados no ensaio. As amostras foram analisadas utilizando uma placa de 96
poços com volume total de 50 μL/poço, pela combinação de amostra e 0,08 M de NaPO4 na
proporção de 25:25, 20:30, 10:40, 1:49 e 0,5:49,5. Foram adicionados 25 μL de TMB 1,6
mM/ poço. Cinco minutos depois, foram adicionados 100 μL de H2O2 0,5mM/poço e
finalmente a reação foi interrompida adicionando-se 50 μL de H2SO4 4M/poço. A densidade
óptica empregada nas leituras foi de 450 nm usando o espectrofotômetro Epoch, da Biotek, e
45
o programa Gen 5. Os resultados foram calculados pela comparação da densidade óptica do
sobrenadante do tecido muscular com a curva padrão de neutrófilos (> 95% de pureza) e
foram expressos como número de neutrófilos x 108/mg de tecido.
3.11. Quantificação de citocinas pelo teste de ELISA
A metodologia para a dosagem de citocinas no músculo gastrocnêmio de ratos foi
baseada na descrição de Safieh-Garabedian et al., (1995). Resumidamente, amostras de tecido
muscular foram obtidas 1/2, 1, 2, 3, 6, 24 horas após a contração muscular ou grupo sham e 1,
3, 6 e 24 horas após a administração de carragenina ou seu veículo, salina, e homogeneizadas
em solução Tampão Fosfato Salina (PBS) contendo Tampão Roche (Complete Inhibitor
Roche; na concentração de 1:50, num volume total de 750µL) no equipamento Omni Bead
ruptor 12 (USA, utilizando-se 7 beads de metal em eppendorfes de tampa de rosca, com
velocidade de homogeneização máxima em até 6 tentativas de 20 segundos. Após a
homogeneização, as amostras foram centrifugadas (4 º C, 10000 RPM, 5 min) e o
sobrenadante foi utilizado para avaliar a concentração das seguintes citocinas pró-
inflamatórias: TNF-, IL-1, IL-6 e CINC-1 por ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assay). As quantificações foram realizadas através dos seguintes kits Quantikine R&D
Systems: TNF-α: Rat TNF-α DuoSet ELISA Kit (Catálogo número: DY 510), IL-1β: Rat IL-
1β/IL-1F2 DuoSet ELISA Kit (Catálogo número: DY 501) e IL-6: Rat IL-6 DuoSet ELISA
Kit (Catálogo número: DY 506). Todos os procedimentos seguiram as instruções do
fabricante e as análises foram realizadas empregando-se o espectrofotômetro Epoch, da
Biotek, e o programa Gen 5. Os resultados foram calculados pela comparação da densidade
óptica do sobrenadante do tecido muscular com a curva padrão de citocinas e foram expressos
em pg de citocina/mg de proteína ou mg/tecido. Todos os procedimentos foram repetidos ao
menos três vezes para garantir a reprodutibilidade dos resultados.
3.12. Análises Estatísticas
Para realização dos cálculos estatísticos foi utilizado o programa Prisma 5,0 e os
dados com homogeneidade de variância foram analisados através da aplicação do teste
estatístico One-Way análise de variância (ANOVA) e comparações múltiplas foram
realizadas aplicando-se o teste de Tukey. Para análise temporal do limiar de retirada da pata
em resposta a carragenina foi utilizado o teste de ANOVA two-way, com pós-teste de
Bonferroni. Quando apropriado o teste t foi aplicado. Para todos os testes o nível de
46
significância foi estabelecido em p < 0.05 e os dados foram apresentados pela média ± o Erro
Padrão da Média.
47
Resultados
48
4. RESULTADOS
4.1. Envolvimento dos receptores P2X3 expressos no corno da raiz dorsal no
desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida pela contração estática.
Conforme demonstrado previamente por nosso grupo de pesquisa (Figura 2), o
pré-tratamento intramuscular com A-317491 diminui a hiperalgesia muscular induzida pela
contração estática, indicando que os receptores P2X3 periféricos estão envolvidos no
desenvolvimento da hiperalgesia muscular induzida pela contração estática (MELO, 2014).
Assim sendo, iniciamos o presente estudo avaliando se os receptores P2X3 expressos no
corno da raiz dorsal da medula espinhal também participam desse processo. Os resultados
demonstraram que o pré-tratamento intratecal com A-317491 (60 e 180 µg) reduziu a
hiperalgesia muscular induzida pela contração estática (Fig. 5). O pré-tratamento intratecal
com o veículo, salina, NaCl 0,9 %, não alterou a hiperalgesia induzida pela contração estática
(Fig. 5).
Figura 5
0
10
20
30
40
50
Contração estática (n=5)
A-317491
Sham sal i.t. 20 g 60 g 180 g
**
#
Hip
era
lgesia
Muscula
r (
g)
Figura 5. Papel dos receptores P2X3 do corno da raiz dorsal da medula espinhal na
hiperalgesia muscular induzida por contração estática. A administração intratecal do A-
49
317491 (60 e 120 µg) reduziu a hiperalgesia muscular induzida pela contração estática, como
indicado pelo símbolo “*” (p < 0,0001, F=21,78, teste de Tukey). A administração de salina
intratecal não influenciou a hiperalgesia induzida pela contração estática (n=5, p > 0,05, teste
de Tukey). O símbolo “#” indica resposta significativamente maior quando comparado ao
grupo sham.
4.2. Carragenina induz hiperalgesia muscular mecânica.
Inicialmente, avaliamos o perfil temporal da hiperalgesia muscular mecânica
induzida pela carragenina (100 µg) no ventre do músculo gastrocnêmio. Verificamos que a
administração intramuscular de carragenina induziu hiperalgesia muscular mecânica entre ½
hora e 96 horas após sua administração, com pico em 3 horas quando comparado ao grupo
controle (salina NaCl 0,9%; Fig. 6). A resolução da hiperalgesia aconteceu apenas após 120
horas da administração da carragenina (Fig. 6).
Figura 6
1/2 1 3 6 24 48 72 96 120
-10
0
10
20
30
40
50
NaCl 0.9% (50 L/músculo) (n=5)
Carragenina (100 g/músculo) (n=5)
**
** * *
*
*
Tempo após a injeção (horas)
Hip
era
lgesia
Muscula
r (
g)
Figura 6. Hiperalgesia muscular mecânica induzida pela carragenina. A administração de
carragenina intramuscular (100 µg/50 µL) induziu respostas comportamentais hiperalgésicas
significativamente maiores do que as induzidas pela administração da salina (NaCl 0,9%)
logo após ½ hora, com pico em 3 horas e manutenção até 96 horas, como indicado pelo
símbolo “*” (n=5, p < 0,0001, F= 40,20; ANOVA Two-way, teste de Bonferroni).
50
4.3. Envolvimento dos receptores P2X3 periféricos na hiperalgesia muscular induzida
pela carragenina.
Considerando o perfil temporal hiperalgésico induzido pela carragenina, a análise
do envolvimento dos receptores P2X3 na hiperalgesia muscular induzida pela carragenina foi
feita sempre no pico da resposta hiperalgésica, ou seja, três horas após a administração de
carragenina. Para isso, administramos o antagonista seletivo dos receptores P2X3, A-317491,
por via intramuscular, 5 minutos antes da administração de carragenina (100 µg). O pré-
tratamento com A-317491 (60 e 180 µg/músculo) foi capaz de reduzir a hiperalgesia muscular
induzida pela carragenina (Fig. 7). A administração de A-317491 (60 μg) na pata contralateral
não reduziu a hiperalgesia muscular, confirmando o envolvimento de receptores P2X3
periféricos nesse processo (Fig 7). Ainda, a administração de A-317491 (60 µg/músculo)
previamente à administração de NaCl 0,9% não influenciou no limiar de retirada da pata (Fig.
7).
Figura 7
0
10
20
30
40
50
*
*
__________________________________
A-317491
20 g 60 g 180 g
_________________________________
Carragenina (100 g)
___________
Salina
ct
Hip
era
lgesia
Muscula
r (
g)
Figura 7. Papel dos receptores P2X3 periféricos na hiperalgesia muscular induzida pela
carragenina. A administração intramuscular do antagonista seletivo dos receptores P2X3, A-
317491 (60 e 180 µg/músculo) reduziu significativamente a hiperalgesia muscular induzida
51
pela carragenina, como indicado pelo símbolo “*” (n=5, p < 0,0001, F= 88,75, teste de
Tukey). A administração do A-317491 na pata contralateral (ct) não afetou a hiperalgesia
induzida pela carragenina (p > 0,05, teste de Tukey). A administração do A-317491 sozinho
não afetou o limiar basal (n=5, p > 0,05, teste de Tukey)
4.4. Envolvimento dos receptores P2X3 do corno da raiz dorsal no desenvolvimento da
hiperalgesia muscular induzida pela carragenina.
Para analisarmos o envolvimento dos receptores P2X3 expressos no corno da raiz
dorsal na hiperalgesia muscular induzida pela carragenina, foi realizado pré-tratamento com
A-317491 por via intratecal. A dose escolhida foi determinada pela curva dose resposta
realizada no modelo de contração estática, sendo utilizada a menor dose capaz de reduzir a
hiperalgesia muscular (60 μg; Fig. 5). O pré-tratamento intratecal com A-317491, 60 µg,
reduziu a hiperalgesia muscular induzida pela carragenina (Fig. 8). O pré-tratamento intratecal
com NaCl 0,9% não alterou a hiperalgesia induzida pela carragenina (Fig. 8).
Figura 8
0
10
20
30
40
50
______________________________________________
Carragenina (100 g)
Sal i.t. ___________
A-317491
60 g
*
Hip
era
lgesia
Muscula
r (
g)
Figura 8. Papel dos receptores P2X3 expressos no corno da raiz dorsal na hiperalgesia
muscular induzida pela carragenina. A administração intratecal do A-317491 (60 µg)
reduziu a hiperalgesia muscular induzida pela carragenina, como indicado pelo símbolo “*”
52
(n=5, p = 0,0172, F = 6600; teste de Tukey). A administração de salina intratecal não
influenciou a hiperalgesia induzida pela carragenina (n=5, p > 0,05, teste de Tukey).
4.5. Envolvimento dos receptores P2X3 na migração de neutrófilos induzida pela
contração estática.
Para analisarmos o envolvimento dos receptores P2X3 na migração de neutrófilos
induzida pela contração estática, os animais foram pré-tratados com A-317491, via
intramuscular, e a atividade da enzima mieloperoxidase, que indica a migração de neutrófilos,
no músculo gastrocnêmio foi avaliada. Os resultados demonstraram que o pré-tratamento com
A-317491 (60 μg) preveniu o aumento da migração de neutrófilos induzida pela contração
estática (Figura 9).
Figura 9
0.0
5.0×1009
1.0×1010
1.5×1010
2.0×1010
2.5×1010
Sham (1h)
Contração estática (1h)
A317491 / Contração estática (1h)
#
*
Neutr
ófil
os m
g/tecid
o
Figura 9. Receptores P2X3 modulam a migração de neutrófilos induzida pela contração
estática. Pré-tratamento com A-317491 (intramuscular) preveniu o aumento na migração de
neutrófilos induzida pela contração estática no tecido muscular, como indicado pelo símbolo
”*” (n=5, p < 0,05; ANOVA One-way; teste de Tukey). O símbolo “#” indica resposta
significativamente maior do que a induzida pelo grupo sham (n=5, p < 0,05; F=2159;
ANOVA One-way; teste de Tukey).
53
4.6. Envolvimento dos receptores P2X3 na migração de neutrófilos induzida pela
carragenina.
Inicialmente analisamos se a administração de carragenina induziria migração de
neutrófilos no tecido muscular no mesmo período do pico da resposta hiperalgésica, ou seja,
três horas após a administração de carragenina. Os resultados demonstraram que a
administração de carragenina intramuscular induziu aumento significativo na migração de
neutrófilos para o tecido muscular três horas após sua administração quando comparado ao
grupo salina.
Semelhante aos dados na contração estática, o pré-tratamento com A-317491 (60
μg), intramuscular, preveniu o aumento da migração de neutrófilos induzido pela carragenina
(Figura 10 ).
Figura 10
0.0
5.0×1007
1.0×1008
1.5×1008
*
#
Salina (3h)
Carragenina (100 g) (3h)
A-317491 /Carragenina (100 g)
Neutr
ófil
os m
g/tecid
o
Figura 10. Receptores P2X3 modulam a migração de neutrófilos induzida pela
carragenina. Carragenina induziu aumento na migração de neutrófilos quando comparado ao
grupo salina, conforme indicado pelo símbolo “#” (n=5; p<0.0001, F= 14190; ANOVA One-
way, teste de Tukey). Pré-tratamento intramuscular com A-317491 (60 μg) preveniu o
aumento dessa migração, como indicado pelo símbolo “*” (n=5; p < 0,0001, F=14190;
ANOVA One-Way).
54
4.7. Envolvimento de citocinas pró-inflamatórias no modelo de hiperalgesia muscular
induzida pela contração estática
Como os resultados do nosso estudo anterior demonstraram que a contração
estática do músculo gastrocnêmio de ratos induz hiperalgesia muscular através de
mecanismos inflamatórios (SANTOS, et al., 2017), avaliamos, por 24 horas, se a contração
estática induz liberação das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 no tecido
muscular. Os resultados demonstraram que a contração estática não induziu aumento dos
níveis de TNF-α (A), IL-1β (B) e IL-6 (C) nos períodos avaliados, quando comparado ao
grupo sham (Figura 9).
Figura 9
A
0
5000
10000
15000
20000
25000
Sham
Contração estática
________ ________ ________ ________ ________
1/2 h 1 h 3 h 6 h 24 h
TN
F-
(pg/m
g tecid
o)
B
55
0
5000
10000
15000
Sham
Contração estática
1/2 h 1 h 3 h 6 h 24 h
________ ________ ________ ________ ________
IL-1
(pg/m
g tecid
o)
C
0
5000
10000
15000
20000
Sham
Contração estática
1/2 h 1 h 3 h 6 h 24 h
________ ________ ________ ________________
IL-6
(pg/m
g tecid
o)
Figura 9. Contração estática não induz aumento nos níveis de citocinas pró-
inflamatórias no tecido muscular. A contração estática não induziu aumento na
concentração tecidual de TNF-α, IL-1β e IL-6 (C) nos períodos avaliados, quando comparado
ao grupo sham (n=5, p > 0,05, teste de Tukey, n=10).
56
Discussão
57
5. DISCUSSÃO
O presente estudo confirma o envolvimento dos receptores P2X3 periféricos e
centrais na hiperalgesia muscular mecânica induzida pela contração estática e demonstra pela
primeira vez seu papel na hiperalgesia induzida pela carragenina. Demonstramos também que
os receptores P2X3 estão envolvidos com a migração de neutrófilos induzida nesses dois
modelos. Por fim e paralelamente, verificamos que a contração estática não induz, pelo menos
até 24 horas, liberação de citocinas pró-inflamatórias.
Os dados do presente estudo demonstraram que os receptores P2X3, expressos
tanto no músculo gastrocnêmio quanto no corno da raiz dorsal da medula espinhal, são
essenciais para o desenvolvimento da hiperalgesia muscular mecânica induzida pela contração
estática e pela carragenina. Esses dados são suportados por estudos que relacionaram os
receptores P2X3 ao desenvolvimento de diferentes modelos de dor muscular, incluindo
Adjuvante Completo de Freud (CFA) (KNEŽEVIĆ et al., 2016), contração excêntrica
(SHINODA et al., 2008; DESSEN et al., 2010; NOMA et al., 2013) e interferência oclusal
(SUN et al., 2016; QI et al., 2016). Os receptores P2X3 também estão envolvidos no
desenvolvimento de condições dolorosas em outros tecidos, incluindo hiperalgesia mecânica
induzida pela ligação parcial do nervo ciático (BARCLAY et al., 2002), hiperalgesia térmica
induzida pelo CFA intraplantar e hiperalgesia térmica e alodinia tátil induzida por constrição
crônica do nervo ciático (NOVAKOVIK et al., 1999) ou ligação dos nervos L5/ L6 (JARVIS
et al., 2002), dor induzida pelo câncer (HANSEN et al., 2012), dor da endometriose (YUAN
et al.,2017), dor articular (TEIXEIRA et al., 2010; TEIXEIRA et al., 2017) e dor visceral
(DEITEREN et al., 2015). Sabe-se que a ativação dos receptores P2X3 aumenta a
susceptibilidade dos nociceptores aos mediadores inflamatórios finais como as
prostaglandinas e aminas simpatomiméticas (PRADO et al., 2013). Considerando-se que a
hiperalgesia induzida pela contração estática e pela carragenina é mediada por prostaglandinas
e/ou aminas simpatomiméticas (SANTOS et al., 2017; CUNHA et al., 1991; CHOPADE et
al., 2014), sugerimos que a contração estática assim como a carragenina induziram liberação
de ATP, que via ativação de receptores P2X3, aumentou a susceptibilidade dos nociceptores
musculares aos mediadores inflamatórios finais.
Nosso grupo também demonstrou que a hiperalgesia muscular induzida pelo
agonista não seletivo de receptores P2X3, αβ-meATP, é modulada pela migração de
neutrófilos (SCHIAVUZZO et al., 2015). Agora, no presente estudo demonstramos, pela
58
primeira vez, que os receptores P2X3 modulam a hiperalgesia muscular induzida pela
contração estática e também pela carragenina. É importante destacar que o envolvimento da
migração de neutrófilos na hiperalgesia induzida pela carragenina só havia sido descrita no
tecido subcutâneo (OLIVEIRA et al., 2009). É amplamente conhecido que a migração de
neutrófilos participa de diferentes condições dolorosas (GIORGI et al., 1998; CARREIRA et
al., 2013; SUO et al., 2014; SCHIAVUZZO et al., 2015; MULLEY et al., 2016), incluindo a
dor muscular (TOUMI et al., 2006; KANDA et al., 2010; BORGHI et al., 2014;
MANJAVICH et al., 2014). Entretanto, o papel dos receptores P2X3 na migração de
neutrófilos associada à hiperalgesia inflamatória parece ser dependente do tecido, uma vez
que os receptores P2X3 estão envolvidos na migração de neutrófilos induzida pela
carragenina na articulação do joelho de ratos (TEIXEIRA et al., 2017) mas não no tecido
subcutâneo de ratos (OLIVEIRA et al., 2009). O mecanismo pelo qual os receptores P2X3
modulam a migração de neutrófilos na hiperalgesia muscular induzida pela contração estática
e carragenina ainda é desconhecido. Entretanto, considerando-se que os neutrófilos modulam
a dor inflamatória através da prostaglandina E2 (CUNHA et al., 2008) e que tanto a
hiperalgesia induzida pela contração estática (SANTOS et al., 2017) quanto pela carragenina
(CHOPADE et al., 2014) são moduladas por prostaglandinas, sugerimos que a contração
estática e a carragenina tenham induzido liberação de ATP endógeno, que via ativação de
receptores P2X3, contribuiu para a migração de neutrófilos e liberação de prostaglandinas E2
no tecido muscular.
Por fim, demonstramos que não há aumento dos níveis teciduais de TNF-α, IL-1β e
IL-6 e no período de 24 horas após o fim da contração estática. Esses dados são suportados
pela demonstração de que a carragenina não induz aumento dos níveis de TNF-α após a
administração intramuscular de carragenina, e o aumento na concentração de IL-1β só ocorre
após 24 horas (LORAM et al., 2013). É importante salientar que não podemos excluir a
possibilidade de terem ocorrido aumentos nos níveis dessas citocinas em períodos além de 24
horas. Além disso, a contração estática é o tipo de contração mais relacionada à fadiga em
humanos (BABAULT et al., 2006). Portanto, é possível que a contração tenha aumentado o
fluxo sanguíneo local por mecanismos envolvidos com a fadiga (AMANN et al., 2010;
AMANN et al., 2011a; AMANN et al., 2011b) e promovido a remoção das citocinas na área
(AMANN et al., 2006), entretanto, novos estudos são necessários para confirmar essa
hipótese.
59
Conclusões
60
6. CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo demonstraram que os receptores P2X3 expressos
no tecido muscular e no corno da raiz dorsal da medula espinhal são importantes moduladores
da hiperalgesia muscular mecânica induzida pela contração estática e pela carragenina, ambos
modelos de dor muscular de origem inflamatória. Além disso, demonstramos que os
receptores P2X3 modulam a migração de neutrófilos induzida nos dois modelos de dor
muscular. Esses resultados sugerem que os estímulos inflamatórios no tecido muscular
induzem liberação endógena de ATP, o qual via ativação de receptores P2X3, contribui para o
desenvolvimento da dor muscular através da modulação da migração de neutrófilos. Assim
sendo, os receptores P2X3 parecem ser importantes alvos farmacológicos no controle da dor
muscular de origem inflamatória.
61
Referências Bibliográficas
62
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBRACCHIO, M.P.; BURNSTOCK, G.; VERKHRATSKY, A.; ZIMMERMANN, H.
Purinergic signaling in the nervous system: an overview. Trends Neurosci, v. 32, p. 19-29,
2009.
ALCOCK, M.M. Defining pain: past, present, and future. Pain, v. 158, n. 4, p.761-762, 2017.
AMANN, M.; ELDRIDGE, M.W.; LOVERING, A.T.; STICKLAND, M.K.; PEGELOW,
D.F.; DEMPSEY, J.A. Arterial oxygenation influences central motor output and exercise
performance via effects on peripheral locomotor muscle fatigue in humans. J Physiol, v. 15,
n. 575, p. 937-52, 2006.
AMANN, M.; BLAIN, G.M.; PROCTOR, L.T.; SEBRANEK, J.J.; PEGELOW, D.F.;
DEMPSEY, J.A. Group III and IV muscle afferents contribute to ventilatory and
cardiovascular response to rhythmic exercise in humans. J Appl Physiol, v. 109, n. 4, p. 966-
76, 2010.
AMANN, M.; BLAIN, G.M.; PROCTOR, L.T.; SEBRANEK, J.J.; PEGELOW, D.F.;
DEMPSEY, J.A. Implications of group III and IV muscle afferents for high-intensity
endurance exercise performance in humans. J Physiol, v. 1; n. 589, p. 5299-309, 2011a.
AMANN, M., RUNNELS, S., MORGAN, D.E., TRINITY, J.D., FJELDSTAD, A.S.,
WRAY, D.W., REESE, V.R., RICHARDSON, R.S. On the contribution of group III and IV
muscle afferents to the circulatory response to rhythmic exercise in humans. J Physiol, v. 1,
n. 589, p. 3855-66, 2011b.
AMBALAVANAR, R.; YALLAMPALLI, C.; YALLAMPALLI, U.; DESSEM D. Injection
of adjuvante but not acidic saline into craniofacial muscle evokes nociceptive behaviors and
neuropeptide expression. N.S., v.149, p. 650-659, 2007.
ANDRES, K.H.; DÜRING, M.V. Morphology of cutaneous receptors. In: IGGO A, editor.
Handbook of sensory physiology, vol. II, somatosensory system. Berlim: Springer, p 3-28,
1973.
63
ANDRES, K.H.; DÜRING, M.V.; SCHMIDT, R.F. Sensory innervation of the Achilles
tendon by group III and IV afferent fibers. Anat Embryol, 172:145-156, 1985.
BABAULT, N.; DESBROSSES, K.; FABRE, M.S.; MICHAUT, A.; POUSSON, M.
Neuromuscular fatigue development during maximal concentric and isometric knee
extensions. J Appl Physiol, v. 100, p.780 –785, 2006.
BABENKO, V.V.; GRAVEN-NIELSEN, T.; SVENSSON, P.; DREWS, A.M.; JENSEN,
T.S.; ARENT-NIELSEN, L. Experimental human muscle pain induced by intramuscular
injections of bradykinin, serotonin, and substance P. Eur J Pain, v. 3, p. 93-102, 1999.
BARCLAY, J.; PATEL, S.; DORN, G.; WOTHERSPOON, G.; MOFFATT, S.; EUNSON,
L.; ABDEL'AL, S.; NATT, F.; HALL, J.; WINTER, J.; BEVAN, S.; WISHART, W.; FOX,
A.; GANJU, P. Functional downregulation of P2X3 receptor subunit in rat sensory neurons
reveals a significant role in chronic neuropathic and inflammatory pain. J Neurosci, v. 22,
p. 8139–8147, 2002.
BAUM, K.; ESSFELD, D. Origin of back pain during bedrest: A new hypothesis. Eur J Med
Res, v. 4, p.389-393, 1999.
BELLUCCI, F.; MEINI, S.; CUCCHI, P.; CATALANI, C.; NIZZARDO, A.; RIVA, A.;
GUIDELLI, G.M.; FERRATA, P.; FIORAVANTI, A.; MAGGI, C.A. Synovial fluid levels
of bradykinin correlate with biochemical markers for cartilage degradation
and inflammation in knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage, v. 21, n. 11, p. 1774-80,
2013.
BERNE E LEVY: Fisiologia. Elsevier, Rio de Janeiro, 2009.
BLEEHEN, T.; KEELE, C.A. Observations on the algogenic actions of adenosine compunds
on the human blister base preparation. Pain, v. 3, n. 4, p. 367-77, 1977.
64
BERNHEIM, H.A.; GILBERT, T.M.; STITT, J.T. Prostaglandin E levels in the third
ventricular cerebrospinal fluid of rabbits during fever and changes in body temperature. J
Physiol, v. 301, p. 68-78, 1980.
BOIX, F.; ROE, C.; ROSENBORG, L.; KNARDAHL, S. Kinin peptides in human trapezius
muscle during sustained isometric contraction and their relation to pain. J Appl Physiol, v.
98, p. 534-540, 2005.
BORGHI, S.M.; ZARPELON, A.C.; PINHO-RIBEIRO, F.A.; CARDOSO, R.D.; MARTINS-
PINGE, M.C.; TATAKIHARA, R.I.; CUNHA, T.M.; FERREIRA, S.H.; CUNHA,
F.Q.; CASAGRANDE, R.; VERRI, W.A. JR. Role of TNF-α/TNFR1 in intense acute
swimming-induced delayed onset muscle soreness in mice. Physiol Behav, v. 10, n. 128, p.
277-87, 2014a.
BORGHI, S.M.; ZARPELON, A.C.; PINHO-RIBEIRO, F.A.; CARDOSO, R.D.; CUNHA,
T.M.; ALVES-FILHO, J.C.; FERREIRA, S.H.; CUNHA, F.Q.; CASAGRANDE,
R.; VERRI, W.A. JR. Targeting interleukin-1β reduces intense acute swimming-induced
muscle mechanical hyperalgesia in mice. J Pharm Pharmacol, v. 66, n. 7, p. 1009-20,
2014b.
BORGHI, S.M.; PINHO-RIBEIRO, F.A.; ZARPELON, A.C.; CUNHA, T.M.; ALVES-
FILHO, J.C.; FERREIRA, S.H.; CUNHA, F.Q.; CASAGRANDE, R.; VERRI, W.A.JR.
Interleukin-10 limits intense acute swimming-induced muscle mechanical hyperalgesia in
mice. Exp Physiol, v. 100, n. 5, p. 531-44, 2015.
BONICA, JJ. The management of pain. 2 ed. Philadelphia. 1990.
BURNSTOCK, G. A basis for distinguishing two types of purinergic receptor, in Cell
Membrane Receptors for Drugs and Hormones: A Multidisciplinary Approach, eds
STRAUB, R.W.; BOLIS, L., editors. (New York, NY: Raven Press) 107–118, 1978.
BURNSTOCK, G. Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission. Physiol
Rev, v. 87, p. 659-797, 2007.
65
BURNSTOCK, G. Purinergic nerves. Pharmacol Rev, v. 24, n. 3, p. 509-81, 1972.
BURNSTOCK, G. P2X ion channel receptors and inflammation. Purinergic Signal, v. 12, n.
1, p. 59-67, 2016.
BURNSTOCK, G. P2X receptors in sensory neurones. Br J Anaesth, v. 84, n. 4, p. 476-88,
2000.
BURNSTOCK, G. Noradrenaline and ATP: cotransmitters and neuromodulators. J Physiol,
v. 46, n. 4, p. 365-84, 1995.
BURNSTOCK G, CAMPBELL G, BENNETT M, HOLMAN ME. Innervation of the guinea-
pig taenia coli: are there intrinsic inhibitory nerves which are distinct from sympathetic
nerves? Int J Neuropharmacol. V. 3, P. 163-6, 1964.
BURNSTOCK, G.; CAMPBELL, G.; SATCHELL, D.; SMYTHE, A. Evidence that
adenosine triphosphate or a related nucleotide is the transmitter substance released by non-
adrenergic inhibitory nerves in the gut. Br J Pharmacol, v. 40, n. 4, p. 668-88, 1970.
BURNSTOCK, G.; KENNEDY, C. Is there a basis for distinguishing two types of P2-
purinoceptor. Gen Pharmacol, v. 16, p. 433–440, 1985.
BRADLEY, P.P; PRIEBAT, D.A.; CHRISTENSEN, R.D., ROTHSTEIN, G. Measurement of
cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker. J Invest
Dermatol, v. 78, p. 206-209, 1982.
CARREIRA, E.U.; CARREGARO, V.; TEIXEIRA, M.M.; MORICONI, A.; ARAMINI, A.;
VERRI, W.A. JR.; FERREIRA, S.H.; CUNHA, F.Q.; CUNHA, T.M. Neutrophils recruited
by CXCR1/2 signalling mediate post-incisional pain. Eur J Pain, V. 17, n. 5, p. 654-63,
2013.
CHACUR, M.; LAMBERTZ, D.; HOHEISEL, U.; MENSE, S. Role of spinal migroglia in
myositis-induced central sensitization: an immunohistochemical and behavioural study in
rats. Eur J Pain, v. 13, p. 915-923, 2009.
66
CHEN, C.C.; AKOPIAN, A.N.; SIVILOTTI, L.; COLQUHOUN, D.; BURNSTOCK, G.;
WOOD, J.N. A P2X purinoceptor expressed by a subset of sensory neurons. Nature, v. 377,
p. 428-431, 1995.
HWANG, S.W. Depolarizing Effectors of Bradykinin Signaling in Nociceptor Excitation in
Pain Perception. Biomol Ther (Seoul), 2018. IN PRESS.
CHIZH, B.A.; ILLES, P. P2X receptors and nociception. Pharmacol Rev, v. 53, n. 4, p. 553-
68, 2001.
CHRISTIDIS, N.; GHAFOURI, B.; LARSSON, A.; PALSTAM, A.; MANNERKORPI, K.;
BILEVICIUTE-LJUNGAR, I.; LOFGREN, M.; BJERSING, J.; KOSEK, E.; GERDLE, B.;
ERNBERG, M. Comparison of the levels of Pro-inflammatory cytokines released in the
vastus lateralis muscle of patients with fibromyalgia and healthy controls during
contractions of the quadriceps muscle--a microdialysis study. PLoS One, 10(12):e0143856;
2015.
CHOPADE, A.R.; SAYYAD, F.J.; NAIKWADE, N.S. Pharmacological characterization of
carrageenan induced heat muscle hyperalgesia in rats using non-selective, preferential and
selective COX-2 inhibitors. Pharm reports. v. 66, n. 3, p. 353-64, 2014.
CIMMINO, M.A.; FERRONE, C.; CUTOLO, M. Epidemiology of chronic musculoskeletal
pain. Best Pract Res Clin Rheumatol. v. 25, n. 2, p. 173-183, 2011.
CLARKE, S.P.; MORETON, B.J.; DAS NAIR, R.; WALSH, D.A.; LINCOLN, N.B.
Personal experience of osteoarthritis and pain questionnaires: mapping items to themes.
Disabil Rehabil. v. 36, n. 2, p.163-9, 2014.
CLARKSON, P.M.; BYRNES, W.C.; MCCORMICK, K.M.; TURCOTTE, L.P.; WHITE,
J.S. Muscle soreness and serum creatine kinase activity following isometric, eccentric, and
concentric exercise. Int J Sports Med, v. 7, p. 152-155, 1986.
67
COCKAYNE, D.A.; HAMILTON, S.G.; ZHU, Q.M.; DUNN, P.M.; ZHONG, Y.;
NOVAKOVIC, S.; MALMBERG, A.B.; CAIN, G.; BERSON, A.; KASSOTAKIS, L.;
HEDLEY, L.; LACHNIT, W.G.; BURNSTOCK, G.; MCMAHON, S.B.; FORD, A.P.
Urinary bladder hyporeflexia and reduced pain-related behaviour in P2X3-deficient mice.
Nature, v. 407, p.1011-1015, 2000.
COLLO, G.; NEIDHART, S.; KAWASHIMA, E.; KOSCO-VILLBOIS, M.; NORTH, R.A.;
BUELL, G. Tissue distribution of the P2X7 receptor. Neuropharmacol, v. 36, p. 1277-
1284, 1997.
COLLO, G.; NORTH, R.A.; KAWASHIMA, E.; MERLO-PICH, E.; NEIDHART, S.;
SURPRENANT, A.; BUELL, G. Cloning of P2X5 and P2X6 receptors and the distribution
and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. J Neurosci, v. 16, p. 2495-
2507, 1996.
COOPER, B.; AHLQUIST, M.; FRIEDMAN, R.M.; LABANC, J. Properties of high-
threshould mechanoreceptors in goat oral muscosa. II. Dynamic and static reactivity in
carrageenan-inflamed mucosa. J Neuphysiol, 1991; 66(4): 1280-90.
COUTTS, A.A.; JORIZZO, J.L.; EADY, R.A.; GREAVES, M.W.; BURNSTOCK, G.
Adenosine triphosphate-evoked vascular changes in human skin: mechanism of action. Eur
J Pharmacol, v. 76, n. 4, p. 391-401, 1981.
CUNHA, F.Q.; LORENZETTI, B.B.; POOLE, S.; FERREIRA, S.H. Interleukin-8 as a
mediator of sympathetic pain. Br J Pharmacol, v. 104, p. 765-767, 1991.
CUNHA, F.Q.; POOLE, S.; LORENZETTI, B.B.; FERREIRA, S.H. The pivotal role of
tumour necrosis fator alpha in the development of inflammatory hyperalgesia. Br J
Pharmacol, v.107, p. 660-664, 1992.
CUNHA, T.M.; VERRI, J.R.W.A., POOLE, S., PARADA, C.A., CUNHA, F.Q., FERREIRA,
S.H. Pain facilitation by proinflammatory cytokine actions at peripheral nerve terminals. In.
68
Immune and glial regulation of pain. DELEO, J.A.; SORKIN, L.S.; WATKINS, L.R.
IASP Press, Seattle, 2007.
CUNHA, T.M.; VERRI, W.A. JR.; SILVA, J.S.; POOLE, S.; CUNHA, F.Q.; FERREIRA,
S.H. A cascade of cytokines mediates mechanical inflammatory hypernociception in mice.
Proc Natl Acad Sci USA, v. 1, n. 102(5), p. 1755-60, 2005.
CUNHA, T.M.; VERRI, W.A.JR.; VALÉRIO, D.A.; GUERRERO, A.T.; NOGUEIRA,
L.G.; VIEIRA, S.M.; SOUZA, D.G.; TEIXEIRA, M.M.; POOLE, S.; FERREIRA,
S.H.; CUNHA, F.Q. Role of cytokines in mediating mechanical hypernociception in a model
of delayed-type hypersensitivity in mice. Eur J Pain, v. 12, n. 8, p. 1059-68, 2008.
CUNHA, T.M.; VERRI JR, W.A.; SCHIVO, I.R.; NAPIMOGA, M.H.; PARADA, C.A.;
POOLE, S.; TEIXEIRA, M.M.; FERREIRA, S.H.; CUNHA, F.Q. Crucial role of
neutrophils in the development of mechanical inflammatory hypernociception. J Leukoc.
Biol, 83:824-832, 2008.
DEITEREN, A.; VAN DER LINDEN, L.; DE WIT, A.; CEULEERS, H.; BUCKINX,
R.; TIMMERMANS, J.P.; MOREELS, T.G.; PELCKMANS, P.A.; DE MAN, J.G.; DE
WINTER, B.Y. P2X3 receptors mediate visceral hypersensitivity during acute chemically-
induced colitis and in the post-inflammatory phase via different mechanisms of
sensitization. PLoS One, v. 17, n. 10(4), 2015.
DESSEM, D.; AMBALAVANAR, R.; EVANCHO, M.; MOUTANNI, A., YALLAMPALLI,
C., BAI, G. Eccentric muscle contraction and stretching evoke mechanical hyperalgesia and
modulate CGRP and P2X(3) expression in a functionally relevant manner. Pain, v. 149, p.
284-295, 2010.
DE OLIVEIRA-FUSARO, M.C.G.; PELEGRINE-DA-SILVA, A.; TAMBELI, C.H.;
PARADA, C. Peripheral mechanisms underlying the essential role of P2X3,2/3 receptors in
the development of inflammatory hyperalgesia. Pain (Amstersdam), v. 141, p. 127-134,
2009.
69
DEVOR, S.T.; FAULKNER, J.A. Regeneration of new fibers in muscles of old rats reduces
contraction-induced injury. J Appl Physiol, v. 87, p. 750-756, 1999.
DIEHL, B.; HOHEISEL, U.; MENSE, S. Histological and neurophysiological changes
induced by carrageenan in skeletal muscle of cat and rat. Agents Actions, v. 25, p. 210-213,
1988.
DINA, O.A.; GREEN, P.G.; LEVINE, J.D. Role of IL-6 in chronic muscle hyperalgesia
priming. Neuroscience. v. 18, n. 152(2), p. 521-525, 2008.
DINA, O.A.; LEVINE, J.D.; GREEN, P.G. Muscle inflammation induces a protein kinase C
ε–dependent chronic-latent muscle pain. J Pain. v. 9, n. 5, p. 457–462, 2008.
DI VIRGILIO, F. P2X receptors and inflammation. Curr Med Chem, v. 22, n. 7, p. 866-77,
2015.
DJOUHRI, L.; LAWSON, S.N. Aβ-fiber nociceptive primary afferent neurons: a review of
incidence and properties in relation to other afferent A-fiber neurons in mammals. Brain
Res Rev, v. 46, p.131-145, 2004.
DUBIN, A.E.; PATAPOUTIAN, A. Nociceptors: the sensors of the pain pathway. J Clin
Invest, v. 1, n. 120(11), p. 3760-3772, 2010.
DUBNER, R. Basic mechanisms of pain associated with deep tissues. Can J Physiol
Pharmacol, v. 69, p. 607-609, 1991.
DUBOIS, M.Y.; FOLLETT, K.A. Pain medicine: The case for an independent medical
specialty and training programs. Acad Med, v. 89, n. 6, p. 863-8, 2014.
DÜRING, M.V.; ANDRES, K.H. Topography and ultrastructure of group III and IV nerve
terminals of cat’s gastrocnemius muscle. In: Zenker W, Neuhuber WL, editors. The
primary afferent neuron. New York: Plenum press. p. 35-41, 1990.
70
ERNEST, J.A.; MACDONALD, C.J.; SESSLE, B.J. ATP potentiates neurotransmission in
the rat trigeminal subnucleus caudalis. NeuroReport, v. 17, n. 14, p. 1507-1510, 2006.
FÁVARO-MOREIRA, N.C.; TORRES-CHÁVEZ, K.E.; FISCHER, L.; TAMBELI, C.H.
Peripheral estradiol induces temporomandibular joint antinociception in rats by activating
the nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate signaling pathway. Neuroscience, v. 1, n.
164(2), p. 724-32, 2009.
FEHRENBACHER, J.C.; VASKO, M.R.; DUARTE, D.B. Models of inflammation:
carrageenan- or complete freund’s adjuvant-induced edema and hypersensitivity in the rat.
Curr Protoc Pharmacol, v. 56, 2012.
FERREIRA, S.H.; MONCADA, S.; PARSONS, M.; VANE, J.R. Proceedings: the
concomitant release of bradykinin and prostaglandin in the inflammatory response to
carrageenin. Br J Pharmacol, v. 52, p. 108-109, 1974.
FERREIRA, S.H.; LORENZETTI, B.B.; BRISTOW, A.F.; POOLE, S. Interleukin-1 beta as a
potent hyperalgesic agent antagonized by a tripeptide analogue. Nature, v. 25, n. 334(6184),
p. 698–700, 1988.
FERREIRA, S.H.; NAKAMURA, M. Prostaglandin hyperalgesia, a cAMP/Ca2+
dependente
process. Prostaglandins, v. 18, p. 179-190, 1970.
FERREIRA, M.L.; DE LUCA, K. Spinal pain and its impact on older people. Best Pract Res
Clin Rheumatol, v. 31, n. 2, p.192-202, 2017.
FINGER, T.E.; DANILOVA, V.; BARROWS, J.; BARTEL, D.L.; VIGERS, A.J.; STONE,
L.; HELLEKANT, G.; KINNAMON, S.C. ATP signaling is crucial for communication from
taste buds to gustatory nerves. Science, v. 310, n. 5753, p. 1495-9, 2005.
FISCHER, L.; TORRES-CHÁVEZ, K.E.; CLEMENTE-NAPIMOGA, J.T.; JORGE,
D., ARSATI, F.; DE ARRUDA VEIGA, M.C.; TAMBELI, C.H. The influence of sex and
ovarian hormones on temporomandibular joint nociception in rats. J Pain, v. 9, n. 7, p. 630-
8, 2008.
71
FONOFF, E.T. Mecanismo encefálico da dor. In. Dor: princípios e prática. NETO, O.A.;
COSTA, C.M.C.; SIQUEIRA, J.T. Artmed. Porto Alegre. 2009.
FRANKE, H.; GROSCHE, J.; SHANDLICH, H.; KRUGEL, U.; ALGAIER, C.; ILLES, P.
P2X receptor expression on astrocytes in the nucleous accumbens of rats. Neurosc, v. 108,
n. 3, p. 421-9, 2001.
FREY LAW, L.A.; SLUKA, K.A.; MCMULLEN, T.; LEE, J.; ARENT-NIELSEN, L.;
GRAVEN-NIELSEN, T. Acidic buffer induced muscle pain evokes referred pain and
mechanical hyperalgesia in humans. Pain, v. 140, p. 254-264, 2008.
FUJII, Y.; OZAKI, N.; TAGUCHI, T.; MIZUMURA, K.; FURUKAWA, K.; SUGIURA, Y.
TRP channels and ASICs mediate mechanical hyperalgesia in models of inflammatory
muscle pain and delayed onset muscle soreness. Pain, v.140, p. 292-304, 2008.
GABRIEL, A.F.; MARCUS, M.A.; HONIG, W.M.; WALENKAMP, G.H.; JOOSTEN, E.A.
The CatWalk method: a detailed analysis of behavioral changes after acute inflammatory
pain in the rat. J Neurosci Methods, v. 163, p. 9-16, 2007.
GASKIN, D.J.; RICHARD, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain, v. 13,
n. 8, p. 715-24, 2012.
GAUTAM, M.; BENSON, C.J. Acid-sensig ion channels (ASICs) in mouse skeletal muscle
afferent are heteromers composed of ASIC1a, ASIC2, and ASIC3 subunits. Faseb J, v. 27,
p. 793-802, 2013.
GIORGI, R.; PAGANO, R.L.; DIAS, M.A.; AGUIAR-PASSETI, T.; SORG, C.; MARIANO,
M. Antinociceptive effect of the calcium-binding protein MRP-14 and the role played by
neutrophils on the control of inflammatory pain. J. Leukoc. Biol, v. 64, n. 2, p. 214-20,
1998.
GRAVEN-NIELSEN, T.; MENSE, S. The peripheral apparatus of muscle pain: evidence
from animal and human studies. Clin J Pain, v.17, p. 2-10, 2001.
72
GREGORY, N.; HARRIS, A.L.; ROBINSON, C.R.;DOUGHERTY, P.M.; FUCHS, P.M.;
SLUKA, K.A. An overview of animal models of pain: disease models and outcome
measures. J Pain, v. 14, n. 11, 10.1016, 2013.
GUYTON, A.C.; HALL, J.E. Tratado de Fisiologia médica. 12 ed. São Paulo, Elsevier;
2011.
HAMILTON, S.G. ATP and pain. Pain Pract, v. 2, p. 289-294, 2002.
HAMILTON, S.G.; MCMAHON, S.B.; LEWIN, G.R. Selective activation of nociceptors by
P2X receptor agonists in normal and inflamed rat skin. J Physiol, v. 15, n. 534 (Pt. 2), p.
437-45, 2001.
HAMILTON, S.G.; WADE, A.; MCMAHON, S.B. The effects of inflammation and
inflammatory mediators on nociceptive behaviour induced by ATP analogues in the rat. Br
J Pharmacol, v. 126, p. 326-332, 1999.
HAN, S.R.; LEE, M.K.; LIM, K.H.; YANG, G.Y.; JEON, H.J.; JU, J.S.; YOON, Y.M.; KIM,
S.K.; AHN, D.K. Intramuscular administration of morphine reduces mustard-oil-induced
craniofacial-muscle pain behavior in lightly anesthetized rats. Eur J Pain, v. 12, p. 361-370,
2008.
HANDWERKER, H.O. Influences of algogenic substances and prostaglandins on the
discharges of unmyelinated cutaneous nerve fibers identified as nociceptors. In: BONICA,
J.J.; ALBE-FESSEL, D.(Eds). Proceedings of the first world congress on Pain, advances
in pain research and therapy, v. 1, New York, Raven Press, p. 41-45, 1976.
HANNA, R.L.; KAUFMAN, M.P. Activation of thin-fiber muscle afferents by a P2X agonist
in cats. J Appl Physiol, v. 96, p. 1166-1169, 2004.
HANSEN, R.R.; NASSER, A.; FALK, S.; BALDVINSSON, S.B.; OHLSSON, P.H.; BAHL,
J.M.; JARVIS, M.F.; DING, M.; HEEGAARD, A.M. Chronic administration of the
selective P2X3, P2X2/3 receptor antagonist, A-317491, transiently attenuates cancer-
induced bone pain in mice. Eur J Pharmacol, 688:27–34, 2012.
73
HEDENBERG-MAGNUSSON, B.; BRODDA JANSEN, G.; ERNBERG, M.; KOPP, S.
Effects of isometric contraction on intramuscular level of neuropeptide Y and local pain
perception. Acta Odontol Scand, v. 64, p. 360-367, 2006.
HILL, A.V. Length of muscle, and the heat and tension developed in an isometric contraction.
J Physiol, v. 60, n. 4, p. 237-263, 1925.
HILLIGES, M.; WEIDNER, C.; SCHMELZ, M.; SCHMIDT, R.; ØRSTAVIK, K.;
TOREBJÖRK, E.; HANDWERKER, H. ATP responses in human C nociceptors. Pain,
v.98, n. 1-2, p. 59-68, 2002.
HOHEISEL, U.; MENSE, S.; SIMONS, D.G.; YU, X.M. Appearance of new receptive fields
in rat dorsal horn neurons following noxious stimulation of skeletal muscle: a model for
referral of muscle pain?. Neurosci Lett, v. 153, p. 9-12, 1993.
HOLT, S.; WATERFIELD, J. Cultural aspects of pain: A study of Indian Asian women in the
UK. Musculoskeletal Care, 2018. In press.
HOLTON, P. The liberation of adenosine triphosphate on antidromic stimulation of sensory
nerves. J Physiol, v. 145, p. 494-504, 1959.
HOLTON, F.A.; HOLTON, P. The capillary dilator substances in dry powders of spinal roots;
a possible role of adenosine triphosphate in chemical transmission from nerve endings. J
Physiol, v. 126, n. 1, p. 124–140, 1954.
HOLTON, F. A. & HOLTON, P. The possibility that ATP is a transmitter at sensory nerve
endings. J Physiol, v. 19, p. 50-51, 1953.
HUXLEY, A. F. Discoveries on muscle: observation, theory, and experiment. Br Med J (Clin
Res Ed), v. 12, n. 293, p. 115–117, 1986.
IDZKO, M.; FERRARI, D.; ELTZSCHIG, H.K. Nucleotide signaling during inflammation.
Nature, v. 509, p. 310-317, 2014.
74
IBOPE. Dor no Brasil. 2013
INSTITUTE OF MEDICINE. Relieving pain in America: a blueprint for transforming
prevention, care, education, and research. Washington D.C: National Academies of
Science. 2011.
JARVIS, M.F.; BURGARD, E.C.; MCGARAUGHTY, S.; HONORE, P.; LYNCH, K.;
BRENNAN, T.J.; SUBIETA, A.; VAN BIESEN, T.; CARTMELL, J.; BIANCHI, B.;
NIFORATOS, W.; KAGE, K.; YU, H.; MIKUSA, J., WISMER, C.T.; ZHU, C.Z.; CHU, K.;
LEE, C.H.; STEWART, A.O.; POLAKOWSKI, J.; COX, B.F.; KOWALUK, E.;
WILLIAMS, M.; SULLIVAN, J.; FALTYNEK, C. A-317491, a novel potent and selective
non-nucleotide antagonist of P2X3 and P2X2/3 receptors, reduces chronic inflammatory and
neuropathic pain in the rat. Proc Natl Acad Sci USA, v. 99, n. 17179-17184, 2002.
JOUNGER, S.L.; CHRISTIDIS, N.; SVENSSON, P.; LIST, T., ERNBERG, M. Increased
levels of intramuscular cytokines in patients with jaw muscle pain. J Headache Pain, 2017;
v. 18: 30, 2017.
JULIUS, D.; BASBAUM, A.I. Molecular mechanisms of nociception. Nature, v. 13, n.
413(6852), p. 203-10, 2001.
JUNG, J.; JO, H.W.; KWON, H.; JEONG, N.Y.ATP release through lysosomal exocytosis
from peripheral nerves: the effect of lysosomal exocytosis on peripheral nerve degeneration
and regeneration after nerve injury. Biomed Res Int, v. 2014;2014:936891.
KAAN, T.K.; YIP, P.K.; PATEL,S.; DAVIES, M.; MARCHAND, F.; COCKAYNE, D.A.;
NUNN, P.A.; DICKENSON, A.H.; FORD, A.P.; ZHONG, Y.; MALCANGIO, M.;
MCMAHON, S.B. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer
pain behavior in rats. Brain, v. 133, n. 9, p. 2549-64, 2010.
KANDA, K.; SUGAMA, K.; HAYASHIDA, H.; SAKUMA, J.; KAWAKAMI, Y.; MIURA,
S.; YOSHIOKA, H.; MORI, Y.; SUZUKI, K. Eccentric exercise-induced delayed-onset
muscle soreness and changes in markers of muscle damage and inflammation. Exerc.
Immunol. Rev, v. 19, p.72-85, 2013.
75
KARCZEWSKI, J.; SPENCER, R.H.; GARSKY, V.M.; LIANG, A.; LEITL, M.D.; CATO,
M.J.; COOK, S.P.; KANE, S.; URBAN, M.O. Reversal of acid-induced and inflammatory
pain by the selective ASIC3 inhibitor, APETx2. Br J Pharmacology, v.161, p.950-60,
2010.
KHAKH, B.S.; BURNSTOCK, G. The double life of ATP. Sci Am, v. 301, n. 6, p. 84–92,
2009.
KEHL, L.J.; FAIRBANKS, C.A. (2003) Experimental animal models of muscle pain and
analgesia. Exerc Sport Sci Rev, v. 31, p. 188-194, 2003.
KEHL, L.J.; TREMPE, T.M.; HARGREAVES, K.M. Eccentric exercise induces muscle
hyperalgesia in rats. Am. Pain Soc. Abstract, v. 641, p. A-51,1996.
KNARDAHL, S. Psychophysiological mechanisms of pain in computer work: the blood
vessel-nociceptor interaction hypothesis. Work & Stress, v. 16, p. 179-189, 2002.
KNEŽEVIĆ, P.T.; VUKMAN,R.; ANTONIĆ, R.; KOVAČ, Z.; UHAČ, I.; SIMONIĆ-
KOCIJAN, S. The role of P2X3 receptors in bilateral masseter muscle allodynia in rats.
Croat Med J, v. 57, n. 6, p. 530–539, 2016.
KROON VAN DIEST, A.M., ERNST, M.M., SLATER, S., POWERS, S.W. Similarities
and Differences Between Migraine in Children and Adults: Presentation, Disability, and
Response to Treatment. Curr Pain Headache Rep, v. 25, n. 21-48.2017.
KOSEK, E.; EKHOLM, J.; HANSSON, P. Modulation of pressure pain thresholds during and
following isometric contraction in patients with fibromyalgia and in healthy controls. Pain,
v. 64, p. 415-423, 1996.
KUAN, Y.H.; SHYU, B.C. Nociceptive transmission and modulation via P2X receptors in
central pain syndrome. Mol Brain, v. 9, n. 58, 2016.
76
KUPERS, R.C.; SVENSSON, P.; JENSEN, T.S. Central representation of muscle pain and
mechanical hyperesthesia in the orofacial region: a positron emission tomography study.
Pain, v. 108, p. 284-293, 2004.
LABUDA, C.J.; FUCHS P.N. A comparison of chronic aspartame exposure to aspirin on
inflammation, hyperalgesia and open field activity following carrageenan-induced
monoarthritis. Life Sci, v. 69, p. 443-454, 2001.
LANG, C.W.; HOPE, P.J.; GRUBB, B.D.; DUGGAN, A.W. Lack of effect of microinjection
of noradrenaline or medetomidine on stimulus evoked release of substance P in the spinal
cord of the cat: a study with antibody microprobes. Br J Pharmacol, v. 112, p. 951–957,
1994.
LANGEN, P. HUCHO, F. Karl Lohmann and the Discovery of ATP. Angewandte Chemie
International Edition, v. 47, n. 10, p. 1824-1827, 2008.
LE BARS, D.; DICKENSON, A.H.; BESSON, J.M. Diffuse noxious inhibitory controls
(DNIC). I. Effects on dorsal horn convergent neurones in the rat. Pain, v. 6, p. 283-304,
1979.
LENZ, F.A.; WEISS, N.; OHARA, S. et al., The role of the thalamus in pain. Suppl clin
neurophysiol, v. 57, p. 50-61, 2004.
LEVER, I.J.; BRADBURY, E.J.; CUNNINGHAM, J.R.; ADELSON, D.W.; JONES, M.G.;
MCMAHON, S.B.; MARVIZO,´N.J.C.; MALCANGIO, M. Brain-derived neurotrophic
factor is released in the dorsal horn by distinctive patterns of afferent fiber stimulation. J
Neurosci, v. 21, p. 4469–4477, 2001.
LEWIS, C.; NEIDHART, S.; HOLY, C.; NORTH, R.A.; BUELL, G., SURPRENANT, A.
Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in
sensory neurons. Nature, v. 377, p. 432-435, 1995.
LI, W.; SHI, X.; WANG, L.; GUO, T.; WEI, T.; CHENG, K.; RICE, K.C.; KINGERY, W.S.;
CLARK, J.D. Epidermal adrenergic signaling contributes
77
to inflammation and pain sensitization in a rat model of complex regional pain syndrome.
Pain, v. 154, n. 8, p. 1224-36, 2013.
LISOWSKA, B.; LISOWSKI, A.; SIEWRUK, K. Substance P and Chronic Pain in Patients
with Chronic Inflammation of Connective Tissue. PLoS One, v. 10, n. 10, e0139206, 2015.
LORAM, L.C.; FULLER, A.; FICK, L.G.; CARTMELL, T.; POOLE, S.; MITCHELL, D.
Cytokine profiles during carrageenan-induced inflammatory hyperalgesia in rat muscle and
hind paw. J Pain, v. 8, p. 127-136, 2007.
MACHADO, A. Neuroanatomia functional. 2ed. Ed Atheneu. São Paulo, 2006.
MAEHARA, Y.; KUSUMOTO, H.; ANAI, H; KUSUMOTO, T.; SUGIMACJI, K. Human
tumor tissues have higher ATP contents that normal tissue. Clin Chim Acta, v. 169, p. 341-
44, 1987.
MAIXNER, W.; FILLINGIM, R.; BOOKER, D.; SIGURDSSON, A. Sensitivity of patients
with painful temporomandibular disorders to experimentally evoked pain. Pain, v. 63, p.
341-351, 1995.
MCCLESKEY, E.W.; GOLD, M.S. (1999) Ion channels of nociception. Annu Rev Physiol,
v. 61, p. 835-856, 1999.
MCGARAUGHTY, S.; WISMER, C.T.; ZHU, C.Z.; MIKUSA, J.; HONORE, P.; CHU, K.L.;
LEE, C.H.; FALTYNEK, C.R.; JARVIS, M.F. Effects of A-317491, a novel and selective
P2X3/P2X2/3 receptor antagonist, on neuropathic, inflammatory and chemogenic
nociception following intrathecal and intraplantar administration. Br J Pharmacol, v. 140,
p. 1381-1388, 2003.
MAKOWSKA, A.; PANFIL, C.; ELLRICH, J. ATP induces sustained facilitation of
craniofacial nociception through P2X receptors on neck muscle nociceptors in mice.
Cephalalgia, v. 26, p. 697-706, 2006.
78
MALM, C.; NYBERG, P.; ENGSTROM, M.; SJODIN, B.; LENKEI, R.; EKBLOM, B.;
LUNDBERG, I. Immunological changes in human skeletal muscle and blood after eccentric
exercise and multiple biopsies. J Physiol, v. 529, n. 1, p. 243-262, 2000.
MANJAVACHI, M.N.; MOTTA, E.M.; MAROTTA, D.M.; LEITE, D.F.; CALIXTO, J.B.
Mechanisms involved in IL-6-induced muscular mechanical hyperalgesia in mice. Pain, v.
151, p. 345–355, 2010.
MEDZHITOV, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature, v. 454, p. 428–
435, 2008.
MELO, B. Envolvimento de mediadores inflamatórios na hiperalgesia muscular induzida por
contração isométrica sustentada em ratos. Dissertação (Mestrado em ciências da nutrição e
do esporte e metabolismo) – Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual de
Campinas. Limeira, p.54, 2014.
MELZACK, R., CASEY, K.L. Sensory, motivational, and central control determinants of
pain: a new conceptual model. In KENSHALO D, ed. The skin senses. Springfield, IL:
Charles C. Thomas; p. 423-443, 1968.
MENESCAL-DE-OLIVEIRA, L., DA SILVA, L.F.S. Mecanismos neurais e modulação da
dor. In: Neto OA, Costa CMC, Siqueira JTS, Teixeira MJ e colaboradores. Dor: princípios
e prática. Artmed. Porto Alegre. 1 ed. 235-246, 2009.
MENSE, S. Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain. Pain, v. 54,
p. 241-289, 1993.
MENSE, S. Muscle pain: mechanisms and clinical significance. Dt sch Arztebl, v. 105, n. 12,
p. 214-9, 2008.
MENSE, S. Algesic agents exciting muscle nociceptors. Exp Brain Res, v. 196, p.89-100,
2009.
79
MENSE, S.; GERWIN, R.D. Muscle pain: understanding the mechanisms. Springer,
Berlin, 2010.
MEOMARTINI, M.E.; AMADIO, S.; VISENTIN, S.; FRANCHINI, L.; ALOISI, F.;
VOLONTA, C.; VISENTIN, S. Expression and functional analysis of P2 receptors in
oligodendrocytes. Glia, v. 43(suppl 2), n. 59, 2003.
MERSKY, Y.H. Classification of chronic pain. Descriptions of chronic pain syndromes and
definitions of pain terms. Prepared by International association for the study of pain,
subcommittee on Taxonomy. Pain, v. 3: S1-S226, 1986.
MILLAN, M.J. The induction of pain: na integrative review. Prog Neurobiol, v. 57, n. 1, p.1-
164, 1999.
MILNE, R.J.; Foreman, R.D.; Giesler G.J.Jr.; Willis, W.D. Convergence of cutaneous and
pelvic visceral nociceptive inputs onto primate spinothalamic neurons. Pain, v. 11, n.2, p.
163-83. 1981.
MINSON, F.P. Ano internacional de combate as dores musculoesqueléticas. Jornal dor –
SBED. v. 34, n. 4, 2009.
MIRSHAFIEY, A.; CUZZOCREA, S.; REHM, B.; MAZZON, E.; SAADAT, F.; SOTOUDE,
M. Treatment of experimental arthritis with M2000, a novel designed non-steroidal anti-
inflammatory drug. Scand J Immunol, v. 61, p. 435-41, 2005.
MONCADA, S.; FERREIRA, S.H.; VANE, J.R. Prostaglandins, aspirin-like drugs and the
oedema of inflammation. Nature, v. 246, p. 217-219, 1973.
MORK, H.; ASHINA, M.; BENDTSEN, L.; OLESEN, J.; JENSEN, R. Experimental muscle
pain and tenderness following infusion of endogenous substances in humans. Eur J Pain, v.
7, p. 145-153, 2003.
80
MULEY, M.M.; REID, A.R.; BOTZ, B.; BÖLCSKEI, K.; HELYES, Z.; MCDOUGALL, J.J.
Neutrophil elastase induces inflammation and pain in mouse knee joints via activation of
proteinase-activated receptor-2. Br J Pharmacol, v. 173, n. 4, p. 766-77, 2016.
MURASE, S.; TERAZAWA, E.; QUEME, F.; OTA, H.; MATSUDA, T.; HIRATE, K.;
KOZAKI, Y.; KATANOSAKA, K.; TAGUCHI, T.; URAI, H.; MIZUMURA, K.
Bradykinin and nerve growth factor play pivotal roles in muscular mechanical hyperalgesia
after exercise (delayed-onset muscle soreness). J Neurosci, v. 30, p. 3752-3761, 2010.
MURRAY, C.J.; VOS, T.; LOZANO, R. et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291
diseases and injuries in 21 regions, 1990- 2010: a systematic analysis for the Global Burden
of Disease Study 2010. Lancet, v. 380, n. 9859, p. 2197-2223, 2012.
MURTHY, K.S.; MAKHLOUF, G.M. Coexpression of ligand-gated P2X and G protein-
coupled P2Y receptors in smooth muscle. The J Biol Chemistry, v. 273, p. 4695-4704,
1998.
NAUSHAD, N.; DUNN, L.B.; MUÑOZ, R.F.; LEYKIN, Y. Depression increases subjective
stigma of chronic pain. J Affect Disord, v. 3, n. 229, p. 456-462, 2018.
NEWHAM, D.J.; JONES, D.A.; EDWARDS, R.H. Plasma creatine kinase changes after
eccentric and concentric contractions. Muscle Nerve, v. 9. p. 59-63, 1986.
NEWHAM, D.J.; MCPHAIL, G.; MILLS, K.R.; EDWARDS, R.H. Ultrastructural changes
after concentric and eccentric contractions of human muscle. J Neurol Sci, v. 61, p. 109-
122, 1983a.
NEWHAM, D.J.; MILLS, K.R.; QUIGLEY, B.M.; EDWARDS, R.H. Pain and fatigue after
concentric and eccentric muscle contractions. Clin Sci (Lond), v. 64, p. 55-62, 1983b.
NIELSEN, A.N.; MATHIESEN, C.; BLACKBURN-MUNRO, G. Pharmacological
characterization of acid-induced muscle allodynia in rats. Eur J Pharm, v. 487, p. 93-103,
2004.
81
NIEMAN, D.C.; DUMKE, C.L.; HENSON, D.A.; MCANULTY, S.R.; GROSS, S.J.; LIND,
R.H. Muscle damage is linked to cytokine changes following a 160-km race. Brain Behav
Immun, v. 19, n. 5, p. 398-403, 2005.
NOBACK, C.R.; STROMINGER, N.; DAMAREST, R.J. The human nervous system:
structure and function. In: Pain and temperature, 5ª ed. New York, Williams & Wilkins,
cap 9: 123-137, 1996.
NOMA, N.; SHINODA, M.; HONDA, K.; KIYOMOTO, M.; DEZAWA, K.; NAKAYA, Y.;
KOMIYAMA, O.; IMAMURA, Y.; IWATA, K. Interaction of IL-1β and P2X(3) receptor in
pathologic masseter muscle pain. J. Dent. Res, v. 92, n. 5, p. 456-60, 2013.
NÖRENBERG, W.; ILLES, P. Neuronal P2X receptors: localization and functional
properties. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, v. 362, p. 324- 339, 2000.
NORTH, R.A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev, v. 82, p. 1013-1067,
2002.
NOSAKA, K.; ALDAYEL, A.; JUBEAU, M.; CHEN, T.C. Muscle damage induced by
electrical stimulation. Eur J Appl Physiol, v. 111, n. 10, p. 2427-37, 2011.
NOVAKOVIC, S.D.; KASSOTAKIS, L.C.; OGLESBY, I.B.; SMITH, J.A.; EGLEN,
R.M.; FORD, A.P.; HUNTER, J.C. Immunocytochemical localization
of P2X3 purinoceptors in sensory neurons in naive rats and following neuropathic injury.
Pain, 80(1-2):273-82, 1999.
O'BRIEN, C.; WOOLF, C.J.; FITZGERALD, M.; LINDSAY, R.M.; MOLANDER, C.
Differences in the chemical expression of rat primary afferent neurons which innervate skin,
muscle or joint. Neuroscience, v. 32, p. 493-502, 1989.
OLIVEIRA, M.C.; PARADA, C.A.; VEIGA, M.C.; RODRIGUES, L.R.; BARROS, S.P.;
TAMBELI, C.H. Evidence for the involvement of endogenous ATP and P2X receptors in
TMJ pain. Eur J Pain, v. 9, p.87-93, 2005.
82
OLIVEIRA, M.C.; PELEGRINI-DA-SILVA, A.; TAMBELI, C.H.; PARADA, C.A.
Peripheral mechanisms underlying the essential role of P2X3,2/3 receptors in the
development of inflammatory hyperalgesia. Pain, v. 141, p. 127-134, 2009.
OZAKTAY, A.C.; KALLAKURI, S.; TAKEBAYASHI, T.; CAVANAUGH, J.M.; ASIK,
I.; DELEO, J.A.; WEINSTEIN, J.N. Effects of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor
necrosis factor on sensitivity of dorsal root ganglion and peripheral receptive fields in rats.
Eur Spine J, v. 15, n. 10, p.1529-37, 2006.
PALECKOVA, V.; PALECEK, J.; MCADOO, D.J.; WILLIS, W.D. The non-NMDA
antagonist CNQX prevents release of amino acids into the rat spinal cord dorsal horn evoked
by sciatic nerve stimulation. Neurosci Lett, v. 148, p. 19–22, 1992.
PANNETON, W.M.; GAN, Q.; JURIC, R. The central termination of sensory fibers from
nerves to the gastrocnemius muscle of the rat. Neuroscience, v. 134, p. 175-87, 2005.
PAPIR-KRICHELI, D.; FREY, J.; LAUFER, R.; GILON, C.; CHOREV, M.; SELINGER, Z.;
DEVOR, M. Behavioural effects of receptor-specific substance P agonists. Pain, v. 31, n. 2,
p. 263-76, 1987.
POOLE, S.; CUNHA, F.Q.; SELKIRK, S.; LORENZETTI, B.B.; FERREIRA, S.H.
Cytokine-mediated inflammatory hyperalgesia limited by interleukin-10. Br J Pharmacol,
v. 115, p. 684-688, 1995.
PRADO, F.C.; ARALDI, D.; VIEIRA, A.S.; OLIVEIRA-FUSARO, M.C.G.; TAMBELI,
C.H.; PARADA, C.A. Neuronal P2X3 receptor activation is essential to hyperalgesia
induced by prostaglandins and sympathomimetic amines release during inflammation.
Neuropharm, v. 67, p. 252-258, 2013.
PRATO, V.; TABERNER, F.J.; HOCKLEY, J.R.F.; CALLEJO, G.; ARCOURT, A.; TAZIR,
B.; HAMMER, L.; SCHAD, P.; HEPPENSTALL, P.A.; SMITH, E.S.; LECHNER, S.G.
Functional and Molecular Characterization of Mechanoinsensitive "Silent" Nociceptors.
Cell Rep, v. 21, n. 11, p. 3102-3115 , 2017.
83
QI, D.; YANG, Y.; JI, P.; KONG, J.; WU, Q.; SI, H. Upregulation of the Purinergic Receptor
Subtype P2X3 in the Trigeminal Ganglion Is Involved in Orofacial Pain Induced by
Occlusal Interference in Rats. J Oral Facial Pain Headache, v. 30, n. 1, p. 51-60, 2016.
RADHAKRISHNAN, R.; BEMENT, M.K.; SKYBA, D.; SLUKA, K.A.; KEHL, L.J. Models
of muscle pain: carrageenan model and acidic saline model. Curr Protoc
Pharmacol, Chapter 5: Unit 5.35, 2004.
RAJA, S.N.; MEYER, R.A.; CAMPBELL, J.N. Peripheral mechanisms of somatic pain.
Anesthesiology, v. 68, n. 4, p. 571–590, 1988.
RANDALL, L.O.; SELITTO, J.J. A method for measurement of analgesic activity on
inflammaed tissue. Arch Int Pharmacodyn Ther, v. 111, p. 409-419, 1957.
REID, K.J.; HARKER, J.; BALA, M.M.; Truyers, C.; Kellen, E.; Bekkering, G.E; Kleijnen, J.
Epidemiology of chronic noncancer pain in Europe: narrative review of prevalence, pain
treatments and pain impact. Curr Med Res Opin, v. 27, n. 2, p. 449-462, 2011.
REINERT, A.; KASKE, A.; MENSE, S. Inflammation-induced increase in density of
neuropeptide-immunoreactive nerve endings in rat skeletal muscle. Exp Brain Res, v. 121,
p. 171-180, 1998.
REINOHL, J.; HOHEISEL, U.; UNGER, T.; MENSE, S. (2003) Adenosine triphosphate as a
stimulant for nociceptive and non-nociceptive muscle group IV receptors in the rat.
Neurosci Lett, v. 338, p. 25-28, 2003.
REITZ, M.; MAKOWSKA, A.; ELLRICH, J. Excitatory and inhibitory purinergic control of
neck muscle nociception in anaesthetized mice. Cephalalgia, v. 29, p. 58-67, 2009.
ROBERTSON, O.; ROBINSON, S.J.; STEPHENS, R. Swearing as a response to pain: A
cross-cultural comparison of British and Japanese participants. Scand J Pain, v. 17, p. 267-
272, 2017.
84
ROBINSON, D.R.; GEBHART, G.F. Inside Information: The Unique Features of Visceral
Sensation. Mol Interv, v. 8, n. 5. p. 242–253, 2008.
ROCZNIAK, W.; OSWIECIMSKA, J.M.; BRODZIAK-DOPIERALA, B.; CIPORA,
E.; NOWAK, P.G.; BABUSKA-ROCZNIAK, M. Evaluation of the analgesic effect of
morphine on models of acute nociceptive pain in rats with a central noradrenergic system
lesion. Neuro Endocrinol Lett, v. 37, n. 3, p. 239-244, 2016.
ROSENOW, J.M.; HENDERSON, J.M. Anatomy and physiology of chronic pain.
Neurosurg Clin N Am, v. 14, n. 3. p. 445-62, 2003.
ROSLAND, J.H. The formalin test in mice: the influence of ambient temperature. Pain, v. 45,
p. 211-216, 1991.
ROY, S.H.; DE LUCA, C.J.; CASAVANT, D.A. Lumbar muscle fatigue and chronic lower
back pain. Spine (Phila Pa), v. 14, p. 992-1001, 1989.
RYAN, L.M.; RACHOW, J.W.; MCCARTY, D.J. Synovial fluid ATP: a potential substrate
for the production of inorganic pyrophosphate. J Rheumatol, v. 18, p. 716-20, 1991.
SACHS, D.; VILLAREAL, C.F.; CUNHA, F.Q.; PARADA, C.A.; FERREIRA, S.H. The role
of PKA and PKCe pathways in prostaglandina E2-mediated hypernociception. British
Journal of Pharmacology, v. 156, p. 826-834, 2009.
SAFIEH-GARABEDIAN, B.; POOLE, S.; ALLCHORNE, A.; WINTER, J.; WOOLF, C.J.
Contribution of interleukin-1 beta to the inflammation-induced increase in nerve growth
factor levels and inflammatory hyperalgesia. Br J Pharmacol, v. 115, p. 1265-1275, 1995.
SALAFFI, F.; DE ANGELIS, R.; STANCATI, A.; GRASSI, W. Health-related quality of life
in multiple musculoskeletal conditions: a cross-sectional population based epidemiological
study. II. The mapping study. Clin Exp Rheumatol, v. 23, p. 829–839, 2005.
85
SANCHEZ, E.M.; BAGUES, A.; MARTIN, M.I. Contributions of peripheral and central
opioid receptors to antinociception in rat muscle pain models. Pharmacol Biochem Behav,
v. 96, p. 488-495, 2010.
SANDKÜHLER, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev, v.
89, n.2, p. 707-58, 2009.
SANTOS, D.F.D.S.D.; MELO AQUINO, B.; JORGE, C.O.; AZAMBUJA,
G.; SCHIAVUZZO, J.G.; KRIMON, S.; NEVES, J.D.S.; PARADA, C.A.; OLIVEIRA-
FUSARO, M.C.G. Muscle pain induced by static contraction in rats is modulated by
peripheral inflammatory mechanisms. Neuroscience, v. 1, n. 358, p. 58-69, 2017.
SATCHELL, D.G.; BURNSTOCK, G. Quantitative studies of the release of purine
compounds following stimulation of non-adrenergic inhibitory nerves in the stomach.
Biochem Pharmacol. v. 20, n. 7, p. 1694-7, 1971.
SATCHELL, D.G.; LYNCH, A.; BOURKE, P.M.; BURNSTOCK, G. Potentiation of the
effects of exogenously applied ATP and purinergic nerve stimulation on the guinea-pig
taenia coli by dipyridamole and hexobendine. Eur J Pharmacol, v. 19, n. 3, p. 343-50,
1972.
SCHIAVUZZO, J,G.; TEIXEIRA, J.M.; MELO, B.; SILVA DOS SANTOS, D.F.; JORGE,
C.O.; OLIVEIRA-FUSARO, M.C.G.; PARADA, C.A. Muscle hyperalgesia induced by
peripheral P2X3 receptors is modulated by inflammatory mediators. Neuroscience, v. 29, n.
285, p. 24-33, 2015.
SINGH, A.K.; ZAJDEL, J.; MIRRASEKHIAN, E.; ALMOOSAWI, N.; FRISCH, I.;
KLAWONN, A.M.; JAAROLA, M.; FRITZ, M.; ENGBLOM, D. Prostaglandin-mediated
inhibition of serotonin signaling controls the affective component of inflammatory pain. J
Clin Invest, v. 127, n. 4, p.1370-1374, 2017.
SHINODA, M.; OZAKI, N.; ASAI, H.; NAGAMINE, K; SUGIURA, Y. Changes in P2X3
receptor expression in the trigeminal ganglion following monoarthritis of the
temporomandibular joint in rats. Pain, v. 116, (1-2), p. 42-51, 2005.
86
SHINODA, M.; OZAKI, N.; SUGIURA, Y. Involvement of ATP and its receptors on
nociception in rat model of masseter muscle pain. Pain, v. 134(1-2), p. 148-57, 2008.
SKALS, M.; JORGENSEN, N.R.; LEIPZIGER, J.; PRAETORIUS, H.A. α-Hemolysin from
Escherichia Coli uses endogenous amplification though P2X receptors activation to induce
hemolysis. PNAS, v. 106, p. 4030-35, 2009.
SLADE, G.D.; CONRAD, M.S.; DIATCHENKO, L.; RASHID, N.U.; ZHONG, S.; SMITH,
S.; RHODES, J.; MEDVEDEV, A.; MAKAROV, S.; MAIXNER, W.; NACKLEY, A.G.
Cytokine biomarkers and chronic pain: association of genes, transcription, and circulating
proteins with temporomandibular disorders and widespread palpation tenderness. Pain, v.
152, n. 12, 2802-12, 2011.
SLUYTER, R.; SHEMON, A.N.; HUGHES, W.E.; STEVENSON, R.O.; GEORGIOU, J.G.;
ESLICK, G.D. Canine erytocites express the P2X7 receptor: greatly increased function
compared with human erythrocytes. Am J Physiol, v. 293, p. 2090-2098, 2007.
SMITH, B.A.; HANSEN, M.A.; LIU, D.M.; ADAMS, D.J. Pre- and postsynaptic actions of
ATP on neurotransmission in rat submandibular ganglia. Neurosc, v. 107, n. 2, p. 283- 291,
2001.
SLUKA, K.A.; KALRA, A.; MOORE, S.A. Unilateral intramuscular injections of acidic
saline produce a bilateral, long-lasting hyperalgesia. Muscle Nerve, v. 24, p. 37-46, 2001.
SLUKA, K.A.; RASMUSSEN, L.A. Fatiguing exercise enhances hyperalgesia to muscle
inflammation. Pain, v. 148, n. 2, p. 188-97, 2010.
SOUSLOVA, V.; CESARE, P.; DING, Y.; AKOPIAN, A.N.; STANFA, L.; SUZUKI, R.;
CARPENTER, K.; DICKENSON, A.; BOYCE, S.; HILL, R.; NEBENUIS-OOSTHUIZEN,
D.; SMITH, A.J.; KIDD, E.J.; WOOD, J.N. Warm-coding deficits and aberrant
inflammatory pain in mice lacking P2X3 receptors. Nature, v. 407, p. 1015-1017, 2000.
87
STACEY, M.J. Free nerve endings in skeletal muscle of the cat. J Anat, v. 105, p. 231–254,
1969.
STTEDS, C.E. The anatomy and physiology of pain. Surgery, v. 27, n. 12, 2009.
SU, C.; BEVAN, J.A.; BURNSTOCK, G. [3H]adenosine triphosphate: release during
stimulation of enteric nerves. Science, v. 23, n. 173, p. 336-8, 1971.
SUN, S.; QI, D.; YANG, Y.; JI, P.; KONG, J.; WU, Q. Association of occlusal interference-
induced masseter muscle hyperalgesia and P2X3 receptors in the trigeminal subnucleus
caudalis and midbrain periaquedutal gray. Neuroreport, v.27, n. 4, p. 277-83, 2016.
SUO, J.; LINKE, B.; MEYER, DOS SANTOS S.; PIERRE, S.; STEGNER, D.; ZHANG,
D.D.; DENIS, C.V.; GEISSLINGER, G.; NIESWANDT, B.; SCHOLICH, K. Neutrophils
mediate edema formation but not mechanical allodynia during zymosan-induced
inflammation. J Leukoc Biol, v. 96, n.1, p. 133-42. 2014.
SVENSSON, P.; ARENDT-NIELSEN, L.; NIELSEN, H.; LARSEN, J.K. Effect of chronic
and experimental jaw muscle pain on pain-pressure threshoulds and stimulus-response
curves. J Orofac Pain, v. 9, p. 347-356, 1995.
SVENSSON, P.; CAIRNS, B.E.; WANG, K.; ARENDT-NIELSEN, L. Injection of nerve
growth factor into human masseter muscle evokes long-lasting mechanical allodynia and
hyperalgesia. Pain, v. 104, p. 241-247, 2003.
SVENSSON, P.; CAIRNS, B.E.; WANG, K.; HU, J.W.; GRAVEN-NIELSEN, T.;
ARENDT-NIELSEN, L.; SESSLE, B.J. Glutamate-evoked pain and mechanical allodynia in
human masseter muscle. Pain, v. 101, p. 221-227, 2003.
TAGUCHI, T.; MATSUDA, T.; MIZUMURA, K. Change with age in muscular mechanical
hyperalgesia after lengthening contraction in rats. Neurosci Res, v. 57, p. 331-338, 2007.
88
TAGUCHI, T.; MATSUDA, T.; TAMURA, R.; SATO, J.; MIZUMURA, K. Muscular
mechanical hyperalgesia revealed by behavioural pain test and c-Fos expression in the spinal
dorsal horn after eccentric contraction in rats. J Physiol, v. 564, p. 259-268, 2005.
TEIXEIRA, J.M.; OLIVEIRA, M.C.; NOCITI, F.H. JR.; CLEMENTE-NAPIMOGA, J.T.;
PELEGRINI-DA-SILVA, A.; PARADA, C.A.; TAMBELI, C.H. Involvement of
temporomandibular joint P2X3 and P2X2/3 receptors in carrageenan-induced inflammatory
hyperalgesia in rats. Eur J Pharmacol, v. 25, n. 645(1-3), p. 79-85, 2010.
TEIXEIRA, J.M.; DIAS, E.V.; PARADA, C.A.; TAMBELI, C.H. 2017. Intra-Articular
Blockade of P2X7 Receptor Reduces the Articular Hyperalgesia and Inflammation in the
Knee Joint Synovitis Especially in Female Rats. J. Pain, v. 18, n. 2, p. 132-143, 2017.
TEIXEIRA, J.M.; BOBINSKI, F.; PARADA, C.A.; SLUKA, K.A.; TAMBELI, C.H.
P2X3 and P2X2/3 Receptors Play a Crucial Role in Articular Hyperalgesia Development
Through Inflammatory Mechanisms in the Knee Joint Experimental Synovitis. Mol.
Neurobiol, v. 54, n. 8, p. 6174-6186, 2017.
TESARZ, J.; EICH, W. A conceptual framework for “updating the definition of pan”. Pain,
v. 158, n. 6, p. 1177-1178, 2017.
TREEDE, R.D.; MEYER, R.A.; RAJA, S.N.; CAMPBELL, J.N. Peripheral and central
mechanisms of cutaneous hyperalgesia. Prog Neurobiol, v. 38, n. 4, p. 397-421, 1992.
TSUJI, R.F.; HOSHINO, K.; NORO, Y.; TSUJI, N.M.; KUROKAWA, T.; MASUDA, T.;
AKIRA, S.; NOWAK, B. Suppression of allergic reaction by lambda-carrageenan: toll-like
receptor 4/MyD88-dependent and -independent modulation of immunity. Clin Exp Allergy,
v. 33, p. 249-258, 2003.
TOPALOĞLU, N.; TEKIN, M.; YILDIRIM, S.; KÜÇÜK, A; GÖNÜLLÜ, B.; HANC, V.
Passive smoking increases pain perception in children undergoing venous catheterization.
Acta Paediatr, v. 102, n. 11; p.493-6, 2013.
89
TOUMI,H.; F'GUYER,S.; BEST,T.M.The role of neutrophils in injury and repair following m
uscle stretch. J Anat, v. 208, n. 4, p. 459-70, 2006.
ÜÇEYLER, N.; HÄUSER, W.; SOMMER, C. Systematic review with meta-analysis:
cytokines in fibromyalgia syndrome. B.M.C. Musculoskeletal Disorders, v. 12, n. 245,
2011.
VARANI, K.; DE MATTEI, M; VINCENZI, F.; TOSI, A.; GESSI, S.; MERIGHI, S.;
PELLATI, A.; MASIERI, F.; ONGARO, A.; BOREA, P.A. Pharmacological
characterization of P2X1 and P2X3 purinergic receptors in bovine chondrocytes.
Osteoarthitis Cartilage, v. 16, n. 11, p. 1421-9, 2008.
VECCHIET, L.; MARINI, I.; FEROLDI, P. Muscular pain caused by isometric contraction:
evaluation of pain through visual analog scale. Clin Ther, v. 5, n. 5, p. 504-8, 1983.
VERRI, W.A.JR.; CUNHA, T.M.; PARADA, C.A.; POOLE, S.; CUNHA, F.Q.; FERREIRA,
S.H. Hypernociceptive role of cytokines and chemokines: targets for analgesic drug
development? Pharmacol Ther, v. 112, n. 1, p.116-38, 2006.
VIAL, C.; EVANS, R.J. P2X receptor expression in mouse urinary bladder and the
requirement of P2X(1) receptors for functional P2X receptor responses in the mouse urinary
bladder smoth muscle. Br J Pharmacol, v. 131, n. 7, 1489-95, 2000.
VITIELLO, L.; GORINI, S.; ROSANO, G.; LA SALA A. Immunoregulation through
extracelular nucleotides. Blood, v. 120, p. 511-518, 2012.
VULCHANOVA, L.; RIEDL, M.S.; SHUSTER, S.J.; BUELL, G.; SUPRENANT, A.;
NORTH, R.A.; ELDE, R.P. Immunohistochemical study of the P2X2 and P2X3 receptors
subunits in monkey and rat sensory neurons and their central terminals. Neuropharmacol,
v. 36, p. 1229-1242, 1997.
XIANG, Z.; BURNSTOCK, G. Expression of P2X receptors on rat microglial cells during
early development. Glia, v. 52, n. 2, p. 119-26, 2005.
90
ZARPELON, A.C.; CUNHA, T.M.; ALVES-FILHO, J.C.; PINTO, L.G.; FERREIRA, S.H.;
MCINNES, I.B.; XU, D.; LIEW, F.Y.; CUNHA, F.Q.; VERRI, W.A. JR.IL-33/ST2
signalling contributes to carrageenin-induced innate inflammation and inflammatory pain:
role of cytokines, endothelin-1 and prostaglandin E2. Br J Pharmacol, v. 169, n. 1, p. 90-
101, 2013.
ZENGIN-TOKTAS, Y.; FERRIER, J.; DURIF, F. LLORCA, P.M.; AUTHIER, N.
Bilateral lesions of the nigrostriatal pathways are associated with chronic
mechanical pain hypersensitivity in rats. Neurosci Res, v. 76, n. 4, p. 261-4, 2013.
ZIMMERMANN, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious
animals. Pain, v. 16, p. 109-110, 1983.
ZUCALI, J.R.; DINARELLO, C.A.; OBLON, D.J. Interleukin 1 stimulates fibroblasts to
produce granulocyte-macrophage colony-stimulating activity and prostaglandin E2. J Clin
Invest, v. 77, p. 1857-1863, 1986.
WACNIK, P.W.; KEHL, L.J.; TREMPE, T.M.; RAMNARAINE, M.L.; BEITZ, A.J.;
WILCOX, G.L. Tumor implantation in mouse humerus evokes movement-related
hyperalgesia exceeding that evoked by intramuscular carrageenan. Pain, v. 101, p. 175-186,
2003.
WALL, P.D.; WOOLF, C.J. Muscle but not cutaneous C-afferent input produces prolonged
increases in the excitability of the flexion reflex in the rat. J Physiol, v. 356, p. 443-458,
1984.
WANG, L.; OLIVECRONA, G.; GÖTBERG, M.; OLSSON, M.L.; WINZELL, M.S.;
ERLINGE, D. ADP acting on P2Y13 receptor is a negative feedback pathway for ATP
release from human red blood cells. Circ Res, v. 96, p. 189-196, 2005.
WHITBURN, L.Y.; JONES, L.E.; DAVEY, M.A.; SMALL, R. Supporting the updated
definition of pain. But what about labour pain? Pain,v. 158, n. 5, p. 990-991, 2017.
91
WILLIAMS, A.C.; CRAIG, K.D. Updating the definition of pain. Pain, v. 157, n. 11, p.
2420-2423, 2016.
WILLIS, W.D.; COGGESHALL, R.E. Sensory Mechanisms of the Spinal Cord. 3rd ed.
New York, New York, USA: Kluwer Academic/Plenum; 2004.
WINTER, C.A.; RISLEY, E.A.; SILBER, R.H. Antiinflamatory activity of indomethacin and
plasma corticosterone in rats. J Pharmacol Exp Ther, v. 162, p. 196-201, 1968.
WINTER, C.A.; RISLEY, E.A.; NUSS, G.W. Carrageenan-induced edema in hind paw of the
rat as an assay for antiinflammatory drugs. Proc Soc Exp Biol Med, v. 111, p. 544-7, 1962.
WRIGHT, A.; AYDEDE, M. Critical comments on Williams and Craig's recent proposal for
revising the definition of pain. Pain, v. 158, n. 2, p. 362-363, 2017.
WOOLF, C.J.; MA, Q. Nociceptors – noxious stimulus detectors. Neuron, v. 55, n. 3, p. 353-
364, 2007.
WU, J.X.; XU, M.Y.; MIAO, X.R.; LU, Z.J.; YUAN, X.M.; LI, X.Q.; YU, W.F. Functional
up-regulation of P2X3 receptors in dorsal root ganglion in a rat model of bone cancer pain.
Eur J Pain, v. 16, n. 10, p. 1378-1388, 2012.
WU, G.; WHITESIDE, G.T.; LEE, G.; NOLAN, S.; NIOSI, M.; PEARSON, M.S.; ILYIN,
V.I. A-317491, a selective P2X3/P2X2/3 receptor antagonist, reverses inflammatory
mechanical hyperalgesia through action at peripheral receptors in rats. Eur J Pharmacol, v.
504, p. 45-53, 2004.
YOKOYAMA, T.; LISI, T.L.; MOORE, S.A.; SLUKA, K.A. Muscle fatigue increases the
probability of developing hyperalgesia in mice. J Pain, v. 8, n. 9, p. 692-9, 2007.
YU, X.M.; SESSLE, B.J.; HU, J.W. Differential effects of cutaneous and deep application of
inflammatory irritant on mechanoreceptive field properties of trigeminal brain stem
nociceptive neurons. J Neurophysiol, v. 70, p. 1704-1707, 1993.
92
YUAN, M.; DING, S.; MENG, T.; LU, B.; SHAO, S.; ZHANG, X.; YUAN, H.; HU, F.
Effect of A-317491 delivered by glycolipid-like polymer micelles on endometriosis pain.
Int J Nanomedicine, v.9, n. 12, p. 8171-8183, 2017.
93
Capítulo 2
Desenvolvimento de camundongos GCaMP6 para estudo dos
mecanismos de dor e fadiga muscular
94
CAPÍTULO 2 - Desenvolvimento de Camundongos GCaMP6 para estudo dos
mecanismos de dor e fadiga muscular
Informações sobre o projeto:
Orientador no exterior: Prof. Dr. Alan Light, Departamento de Anestesiologia, Faculdade
de Medicina, da Universidade de Utah, Estados Unidos.
Co-orientador no exterior: Prof. Dr. Markus Amann, Laboratório de Pesquisa Vascular,
Hospital de Veteranos, Universidade de Utah, Estados Unidos.
Período do Estágio: maio a outubro de 2017.
Bolsa de estudos: Programa PDSE da CAPES
RESUMO:
Os receptores de potencial transitório vanilóide do tipo 1 (TRPV1) são seletivamente
expressos no conjunto de fibras neuronais que respondem à capsaicina, prótons e ao calor
nocivo (> 44 ° C). Sabe-se que os receptores TRPV1 são importantes no desenvolvimento da
dor (CATHERINA et al 2000) e que a combinação de prótons, lactato e ATP é fundamental
para a estimulação das fibras III/IV em camundongos (LIGHT et al., 2008) e para o
desenvolvimento de dor e fadiga muscular em seres humanos (POLLAK et al., 2014).
Entretanto os mecanismos envolvidos com o funcionamento desses receptores no gânglio da
raiz dorsal ainda não são bem compreendidos. Portanto, o objetivo deste estudo foi,
inicialmente, desenvolver uma linhagem de camundongos que expressasse a proteína
fluorescente GFP (Green Fluorescente Protein) apenas nas fibras TRPV1 positivas (+). Para
isso, obtivemos da empresa Laboratórios Jackson 2 linhagens de animais, fêmeas GCaMP6 e
machos TRPV1. Esses animais foram inicialmente cruzados, e as proles foram avaliadas
quanto a expressão de GCaMP6 e Cre via genotipagem. Verificamos que os cruzamentos
entre esses animais eram capazes de gerar animais TRPV1-Cre/GCaMP6+. A seguir, o
objetivo foi analisar, a partir de cultura de células primárias do gânglio da raiz dorsal (GRD),
se era possível verificar fluorescência via análise usando a técnica de calcium imaging (que
detecta o influxo de Ca2+
no interior das células, representando a ativação das células
neuronais) comparando neurônio de origem muscular aos demais. Para isso, os animais
95
TRPV1-Cre/GCaMP6+ receberam entre 7 e 10 dias de vida a administração do agente
fluorescente DiI diretamente no ventre do tecido muscular. Esses animais tiveram seus
gânglios removidos por volta de 15 a 30 dias pós-administração de DiI e incubadas até 16 e
24 horas. Além disso, analisamos também o padrão de resposta dessas fibras a diferentes
doses de metabólitos e a administração de capsaicina e KCl. Verificamos que os GRD de
animais TRPV1-Cre/GCaMP6+ apresentaram fluorescência suficiente para as análises no
Calcium imaging e que de todas as células presentes na cultura 57,64% apresentavam DiI,
indicando-nas como neurônios do tecido muscular. Destas 78,3% expressavam GFP (sendo
neurônios TRPV1+). Por fim, verificamos que 1/3 dessas células não respondem a capsaicina,
indicando que existem fibras TRPV1 silentes. A seguir, analisamos se estas células eram
capazes de responder a uma dose moderada (pH 7.0) e alta (pH 6.6) de metabólitos.
Verificamos que 20% dos neurônios sensoriais marcados com DiI respondem a administração
dos metabólitos e que 85,6% dos neurônios que respondem ao pH 7.0 e 100% dos que
respondem a pH 6.6 são positivos para TRPV1. Esses dados sugerem, portanto, que os
animais TRPV1-Cre/GCaMP6+ são uma importante ferramenta no estudo da dor muscular e
que os receptores TRPV1 é expresso em mais de 50% dos neurônios sensoriais musculares do
GRD, sendo cerca de 1/3 deles não responsivo a capsaicina. Por fim, concluímos também que
os receptores TRPV1 são fundamentais na resposta a diferentes doses de metabólitos
responsáveis pela indução das sensações de dor e fadiga.
Palavras-chave: GCaMP6, TRPV1, dor muscular, fadiga, gânglio da raiz dorsal.
96
Introdução
97
8. INTRODUÇÃO
Sabe-se que diversas doenças crônicas como fibromialgia (VAILLANT et al.,
2016), disfunção temporomandibular (DAHAN et al., 2016), dor miofascial e enxaqueca
tensional apresentam como sinal clínico clássico não apenas a sensação de dor mas também
sintomas de fadiga crônica (SERTEL et al., 2016).
Caracterizado pela primeira vez por Angelo Mosso em 1904, através da
observação de pássaros que chegavam extremamente exaustos a costa italiana após uma longa
trajetória partindo África, e baseando-se na caracterização do perfil de fibras musculares e do
padrão de resposta muscular a contração estática voluntária ou induzida por estimulação
elétrica (MOSSO, 1904; GIULIO et al., 2006; DI GIULIO, 2011), o conceito de fadiga é
amplo e refere-se a uma variedade de sensações de origem periférica e central, geral ou
mental e que se relacionam a alterações transitórias na capacidade em se desempenhar uma
dada atividade física (ENOKA; DUCHATEAU, 2008; CAUDHURI; BEHAN, 2004;
TANAKA; WATANABE, 2012).
Dentre os sinais gerais envolvidos com a fadiga podemos citar o declínio
progressivo na habilidade de ativar a musculatura voluntária, manutenção de contração
muscular máxima ou habilidade de desenvolver contração muscular estática, perda de força,
de torque (acima de 50%) e de resistência muscular; dentre os sinais mentais temos uma
maior percepção de cansaço após uma dada atividade, e esse sintoma pode se apresentar ao
repouso (FINSTERER; MAHJOUB, 2014). Em relação aos sinais centrais temos a falência na
capacidade do córtex motor em recrutar unidades musculares, redução do feed-back negativo
vindo das fibras aferentes do fuso neuromuscular e perda da atividade de coordenação entre
sistema nervoso central e neurônios motores. Por fim, dentre os sintomas periféricos temos o
declínio da máxima força muscular, senso de exaustão e perda de energia, redução da
produção d e ATP e incapacidade desenvolver ou manter a contração muscular adequada
(FINSTERER AND MAHJOUB, 2014).
A fadiga muscular é muitas vezes relacionada à atividade física voluntária e
esportiva (BURNLEY; JONES, 2018), mas pode ser encontrada muitas vezes em diversos
tipos de condições patológicas (FINSTERER; MAHJOUB, 2014) que incluem desordens
neurológicas e doenças neuromusculares (SCHILLINGS et al., 2007; FÉASSON et al., 2006),
condições infecciosas, inflamatórias (MCCORMACK et al., 2018; ABU-SHAKRA et al.,
2018) e na dor muscular (RUSSELL et al., 2018; BANERJEE et al., 2017).
98
Entretanto, apesar de se conhecer a relação entre fadiga e dor muscular, os
mecanismos pelos quais elas se inter-relacionam ainda são pouco compreendidos (para
revisão, AMANN; LIGHT, 2015).
Já foi demonstrado o envolvimento das fibras III e IV, classicamente envolvidas
na condução do estímulo doloroso vindo dos tecidos viscerais (como o tecido muscular)
também estão envolvidos com a condução da sensação de fadiga, uma vez que o bloqueio
dessas fibras pela administração intratecal de fentanil altera o padrão de fadiga em humanos
(AMANN et al., 2011; AMANN et al., 2014; SIDHU et al., 2014). Além disso, a ativação dos
receptores P2X, TRPV1 e ASIC3, classicamente envolvidos na condução e sinalização da dor
muscular (GREGORY et al., 2015), também participam da sinalização da fadiga crônica
(LIGHT et al., 2008; POLLAK et al., 2014). Entretanto, apesar da sua relevância clínica, os
mecanismos envolvidos com o desenvolvimento de fadiga e dor muscular ainda são pouco
compreendidos.
Os receptores de potencial transiente vanilóide do tipo 1 (TRPV1) são receptores
da família dos receptores de potencial transiente (TRP), ativados por capsaicina (CATERINA
et al., 1997), baixo pH e calor nocivo (acima de 43° C) (CATERINA et al., 1997;
TOMINAGA et al., 1998) e lipídios (JULIUS; BAUSBAM, 2001). Esses receptores já foram
descritos como expressos preferencialmente em fibras C (HU et al., 2008) e já foram descritos
como importantes moduladores de condições como dor (para revisão: NUMAZAKI;
TOMINAGA, 2004; DAI et al., 2016; MARRONE et al., 2017), dor muscular (YUKSEL et
al., 2017; WANG et al., 2017).
Nesse sentido, considerando a importância das fibras TRPV1 positivas para o
processo de transmissão da informação dolorosa, este estudo baseou-se no uso de algumas
técnicas do campo da optogenética para estudo e caracterização da distribuição e função dos
receptores TRPV1 do gânglio da raiz dorsal na dor e fadiga muscular por meio da criação de
animais Cre-TRPV1/GCaMP6+, ou seja, de animais com sensores endógenos de Ca
+2 apenas
nas fibras contendo receptores TRPV1. O presente estudo descreve o processo de criação e
desenvolvimento desses animais, os procedimentos de preparo e coleta do gânglio da raiz
dorsal para estudo de cultura dos neurônios do gânglio e sua avaliação inicialmente da sua
capacidade de emitir fluorescência observável e captável pelo microscópio de imaginologia
do cálcio. Além disso, verificamos a distribuição de células neuronais musculares e não
musculares e o padrão de resposta destas células a diferentes concentrações de metabólitos
mimetizando as concentrações encontradas em condições de dor e fadiga.
99
Objetivos
100
9. OBJETIVOS
Desenvolver animais que expressassem proteína fluorescente GFP apenas nas fibras
aferentes primárias contendo TRPV1.
Analisar a partir de cultura de células primárias do gânglio da raiz dorsal se era
possível verificar fluorescência através da técnica de calcium imaging.
Confirmar se essas respostas são provenientes de células neuronais.
Comparar o padrão de expressão de células GFP positivas em células do GRD
comparando células de origem muscular e não musculares.
Analisar e comparar o padrão de resposta das células neuronais do GRD a diferentes
doses de metabólitos.
101
Materiais e Métodos
102
10. MATERIAIS E MÉTODOS
10.1. Questões Éticas
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as regras do National
Institute of Health (NIH) e o Guia para cuidado e uso de animais de laboratório (NIH nº.
80-23) e foram previamente aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade de Utah. Todos os cruzamentos foram realizados
observando-se a capacidade de manter os animais saudáveis e evitando ao máximo
qualquer tipo de sofrimento.
10.2. Primeira Etapa - Desenvolvimento dos animais TRPV1-Cre/GCaMP6+
10.2.1. Cruzamentos para obtenção dos animais
Para realização deste trabalho, inicialmente 3 camundongos 4 RCL-GCaMP6f e 3
animais TRPV1-Cre (B6.1229-Trpv1 TM1(Cre) Bbm/j mouse) foram obtidos do Laboratório
Jackson (Sacramento, Califórnia). Esses animais foram cruzados com objetivo de criar uma
colônia de animais GCaMP6/Cre-TRPV1, por meio do cruzamento das linhagens iniciais. O
objetivo final disso foi criar uma linhagem de camundongos transgênicos, capazes de
expressar a proteína fluorescente verde (GFP) apenas nas fibras TRPV1 positivas, e emitir
fluorescência observável e mensurável no equipamento de calcium imaging. Posteriormente,
o objetivo foi avaliar se a cultura de gânglios da raiz dorsal (GRD) desses animais poderia ser
avaliada por microscopia de fluorencência, do tipo calcium imaging. Dessa forma,
poderíamos registrar a atividade de todas as terminações aferentes dos grupos III/IV vindas do
músculo esquelético de camundongos a fim de estudar o padrão de resposta destas fibras a
diferentes concentrações de metabólitos, mimetizando condições de dor ou de fadiga
muscular.
10.2.2. Genotipagem
Para confirmar que os animais realmente expressavam essa característica
realizamos genotipagem de todos os animais resultados desses cruzamentos. Para a
genotipagem inicialmente anestesiamos os animais em água gelada entre 2 e 4 minutos e
coletamos uma pequena amostra da orelha dos camundongos, entre 7 e 10 dias de vida. Essas
103
amostras foram tratadas com solução de NaOH a 10M e foram aquecidas no ebulidor por
cerca de 30 minutos, homogeneizadas no vórtex e novamente deixadas no ebulidor por 30
minutos. As amostras foram tratadas com os diferentes primers (para Cre e GCaMP6) e
deixadas no termociclador por 1 hora. A seguir as amostras foram transferidas a um gel de
agarose a 1% e a seguir transferidas por 1 hora usando o eletroporador. As análises foram
realizas no fotodocumentador da Bio Raid e avaliadas quanto a expressão de bandas desses
genes Cre ou GCaMP6 através do programa Quantitation One. Apenas os animais que
apresentassem a expressão de Cre e de GCaMP6 foram empregados nos experimentos
seguintes.
10.3. Segunda Etapa - Experimentos in vitro
Após a obtenção dos animais propostos, passamos a uma segunda etapa desse
projeto, na qual registramos as respostas das fibras TRPV1+ à administração de baixas e altas
doses de metabólitos usando preparações in vitro. Para isso, avaliamos via imaginologia a
expressão de GFP, marcador da presença de receptores TRPV1, e da proteína fluorescente
DiI, indicadora de células neuronais que inervassem o tecido muscular.
10.3.1. Administração de DiI
Os animais TRPV1-Cre/GCaMP6+ receberam entre 7 e 10 dias de vida a
administração do agente fluorescente DiI diretamente no tecido muscular conforme descrito
por Light et al (2008). Para isso os animais foram anestesiados usando água gelada (por até 4
minutos). Após anestesiados os animais eram gentilmente colocados sobre o campo cirúrgico
estéril. Inicialmente os animais tiveram a área do gastrocnêmio limpa com álcool 70% e
utilizando um bisturi foi feita uma pequena incisão na pele da região lateral da coxa expondo
assim o músculo gastrocnêmio. A seguir uma cânula de pequeno diâmetro foi acoplada a uma
seringa Hamilton e foi realizada a administração de 3½ a 4 µL de DiI diretamente no tecido
muscular. Por fim, a ferida cirúrgica foi colada com cola veterinária e os animais mantidos em
uma caixa aquecida com temperatura de 36◦ C até estarem completamente recuperados, secos
e aquecidos. Esses animais retornavam as esta ntes ventiladas e eram usados novamente na
idade de 20 a 30 dias de vida para as análises via calcium imaging. Como controle utilizamos
animais C57Bl/6.
104
10.3.2. Cultura de gânglios da raiz dorsal
Para as análises in vitro analisamos o padrão de respostas das células do gânglio
da raiz dorsal a diferentes concentrações de metabólitos. Para isso, os animais TRPV1-
Cre/GCaMP6+ foram rapidamente anestesiados com isofluorane e eutanasiados com
deslocamento cervical. Os gânglios da raiz dorsal da região lombar direita, lado injetado com
DiI, foram coletados (6 gânglios), com auxílio de um microscópio óptico. Esses gânglios
foram transferidos em solução de HBSS. Essas células foram tratadas com tripsina e
incubadas a 37° C por 15 minutos, posteriormente lavadas (3X) com solução de MEM + 10%
de FBS (3 mL/lavagem/poço) e homogeneizadas. A seguir, essas células foram gentilmente
centrifugadas (1.2 RPM, temperatura ambiente, 5 minutos) e foram gentilmente
ressuspendidas por pipetação. 30µL dessa solução contendo células e MEM + 10% FBS foi
colocada em uma placa de cultura de 48 poços (tratadas previamente com poli-L-lysine e
laminin), em uma área delimitada por anéis de silicone (0.5mm de altura por 4mm de
diâmetro) e mantidas na estufa a 37° C por 1 hora. A seguir, foi administrado 1 mL de GDNF
(10ng/mL) (Glial-derived neurotrophic fator, do inglês, fator de crescimento glial) e as placas
retornavam a estufa podendo ser empregadas nas análises entre 16 e 23 horas. No segundo dia
de análise, as amostras foram lavadas com pH 7.4 oxygenated observation media aquecida a
37° C por 3 vezes e receberam observation media para as análises.
10.3.3. Calcium Imaging
O equipamento empregado para as análises foi o microscópio Olympus
fluorescente, acoplado a um computador com o software Metafluor 5.0 (Universal Imaging) e
Adobe photoshop para a seleção das imagens.
Todas as análises foram realizadas em temperatura ambiente (20-25° C), em sala
escura, e as células posicionadas ao microscópio de forma a se obter o melhor foco e maior
quantidade de células possíveis no campo. A identificação de células neuronais seguiu os
critérios propostos por Light et al., (2008).
Após o posicionamento das células no campo, eram realizadas inicialmente os
registros do baseline, seguidos pela administração de metabólitos, lavagem e ao final de cada
experimento foram aplicados 200nM de capsaicina, seguida por lavagem e então aplicação de
50mM de KCl para assegurar que os registros obtidos eram provenientes de células neuronais.
105
Apenas células que responderam a capsaicina e/ou KCl foram consideradas neurônios e
incluídas nas avaliações finais. A média de células por campo foi de 151 ± 10/ campo. Para
cada célula a taxa de intensidade de fluorescência foi analisada (entre os comprimentos de
onda de 340nm/380nm, normalizada para máximo de 1.0 e mínimo de 0) e registrada em uma
tabela de dados e formação de gráficos.
Os metabólitos e drogas foram administrados usando-se duas pipetas: uma para
remoção das soluções e outra para administração. O momento de administração de soluções
por si só induz a formação de artefatos que são normalizados posteriormente com base em
registros de células naive. A média de imagens baseline é de 30 antes do início da
administração de metabólitos. A resposta das células aos metabólitos é considerada após cerca
de 600 a 1000 imagens fluorescentes (média de 2 segundos pós-administração).
10.3.4. Análise do padrão de resposta a metabólitos
Para análise do padrão de respostas das células a altos e baixos níveis de
metabólitos utilizamos conforme padronizado previamente por Light et al., (2008) as
seguintes concentrações de metabólitos, combinado ATP, lactato e pH (como medida da
concentração de íons H+):
- pH 7.4, ATP 300nM e Lactato 1mM;
- pH 7.0, ATP 500nM e Lactato 10mM;
- pH 6.6, ATP 2µM e Lactato 15mM.
A preparação dos metabólitos foi realizada imediatamente antes do início das
administrações nos poços (volume total de 500 µL/ aplicação) uma vez que a meia vida do
ATP é de até 20 minutos.
10.4. Análise estatística
Os dados de cada análise foram registrados em uma planilha do Excel para
posterior avaliação. Essas análises subtraem o valor da variação do baseline e determinam os
valores de média e desvio padrão e comparam com a média e desvio padrão pós
administração de metabólitos. Foram definidas respostas como taxas de elevação 2 vezes
acima do valor do baseline.
106
Para as análises estatísticas foram usadas como padrão a ANOVA one-way para
analisar a respostas as diferentes doses de metabólitos. Para comparações múltiplas foi
utilizado o teste de Dunnett’s e usado o valor de 0.05 como referencia estatística. Para
comparações entre os grupos foi usado p teste de Tukey-Kramer. As imagens estão descritas
como média e desvio padrão.
107
Resultados
108
11. RESULTADOS
11.1. Desenvolvimento de camundongos TRPV1-Cre/GCaMP6+:
Verificamos inicialmente que cruzamento entre fêmeas GCaMP6 e machos Cre-
TRPV1 foi capaz de criar uma nova linhagem de animais TRPV1-Cre/GCaMP6+, uma vez
que as análises via genotipagem detectaram animais apresentando o gene Cre e GCaMP6 ao
mesmo tempo. É importante deixar claro que nem todos os animais apresentaram essa
característica. Apenas os animais Cre+ e GCaMP6
+ foram usados para as análises seguintes. A
figura 12 representa uma análise realizada no laboratório que demonstrou os animais A,B,C,D
e E como positivos para Cre e A,B,C,D,E e F para GCaMP6. Nesse caso, apenas os animais
A,B,C,D e E foram utilizados nas análises que se seguiram. Outro ponto importante é que o
cruzamento desses animais gerou animais saudáveis e normais. Sem alterações fenotípicas
importantes.
Figura 12. Resultado da genotipagem de uma linhagem de animais derivados do cruzamento
de animais Cre-TRPV1 e GCaMP6. Os animais foram considerados TRPV1-Cre/GCaMP6+
quando demonstravam expressão de ambas as bandas no teste de Northern Blot.
11.2. Caracterização anatômica da cultura de células do gânglio da raiz dorsal de
animais TRPV1-cre/GCaMp6+
Após a confirmação do animais como TRPV1-Cre/GCaMP6+ nós iniciamos a
etapa de análises in vitro. Verificamos inicialmente, que as culturas dos gânglios da raiz
dorsal de animais TRPV1-Cre/GCaMP6+ eram capazes de emitir fluorescência quando
avaliados ao microscópio de calcium imaging, como pode ser verificado na Figura 13.
Podemos verificar conforme demonstrado na Figura 13 que as marcações do GFP podem ser
109
vistas no interior das células sugerindo, portanto, que realmente as marcações do GFP foram
feitas em células neuronais.
Figura 13. Células do gânglio da raiz dorsal de camundongos TRPV1-Cre/GCaMP6+ são
capazes de emitir fluorescência detectável pela técnica de cálcio imaging. A imagem a direita
no topo, da cultura de neurônios do gânglio da raiz dorsal de animais TRPV1-Cre/GCaMP6+,
a luz branca do microscópio (bright field), demonstra a localização das células sem a emissão
de fluorescência (aumento de 2X). A imagem superior, a esquerda demonstra o padrão de
fluorescência para o GFP.
Verificamos também que a administração de capsaicina foi capaz de aumentar a
emissão de fluorescência em células neuronais conforme pode ser verificada na Figura 14.
Confirmando a hipótese de que as fibras são TRPV1+.
110
Figura 14. Células do gânglio da raiz dorsal de camundongos TRPV1-Cre/GCaMP6+
emitindo fluorescência em resposta a capsaicina (aumento de 10X) neurônios e dendritos e
coloração dessas áreas.
A partir desses dados iniciais passamos a avaliação inicialmente anatômica do perfil de
expressão dos GFP e, portanto, dos receptores TRPV1, nas células de cultura. Podemos
verificar, conforme demonstrado na Figura 15 a expressão de GFP e DiI no interior dessas
células. Demonstramos também que essas marcações puderam gerar imagens de colocalização
conforme demonstrado em Merge.
Figura 15. Análise de células do gânglio da raiz dorsal de animais TRPV1-Cre/GCaMP6+.
Imagem no topo a esquerda: cultura de neurônios na imagem de bright field. As mesmas
células foram analisadas no filtro para GFP (topo a direita) e DiI (inferior a esquerda).
Verificamos que há interjunção de expressão de GFP e DiI. Áreas em verde e vermelho
indicam co-marcação tanto de GFP e DiI. Essa imagem demonstra que os neurônios contendo
TRPV1 são fluorescentes ao microscópio e que há expressão de GFP nos tecidos neurais de
neurônios do Gânglio da raiz dorsal de animais TRPV1-Cre/GCaMP6+ sejam eles de origem
muscular ou não.
111
Conforme demonstrado na Figura 16, 57,64% da cultura de células avaliadas
apresentavam DiI sugerindo, portanto, que mais da metade das células do GRD das áreas L1 a
L6 são de origem muscular. Destas 78,3% apresentam GFP, sendo que apenas 1/3 delas não
respondem a capsaicina, agonista dos receptores TRPV1.
Figura 16. Quantificação das células do gânglio da raiz dorsal apresentando marcador DiI
indicativas de neurônios de origem muscular. 57,64% das células do gânglio da raiz dorsal
são DiI positivas, sendo que destas 78,3% apresentam são co-marcadas para GFP, indicativo
da presença dos receptores TRPV1. Destas 27,7% não respondem a capsaicina, indicando
neurônios silentes.
11.3. Padrão de resposta das células do gânglio da raiz dorsal a diferentes doses de
metabólitos
Esses dados sugerem, portanto, que maioria das fibras neuronais dos gânglios
dorsais de L1 a L6 são de origem muscular e que mais de 1/3 delas apresentam receptores
TRPV1, demonstrando a importância destes receptores na condução de informações
sensoriais advindas do tecido muscular. Surpreendentemente, 1/3 das células TRPV1
positivas não respondem a administração de seu agonista, a capsaicina, sugerindo portanto,
que existem receptores e fibras silentes.
Por fim, conforme demonstrado na Figura 17, 20% dos neurônios DiI positivos
respondem a administração de metabólitos. Destes 85,6% dos que respondem ao pH 7.0,
mimético de condições de fadiga muscular, e 100% dos que respondem ao pH 6.6 são
TRPV1+.
112
Figura 17. Quantificação do padrão de resposta dos neurônios de origem muscular a
diferentes concentrações de metabólitos e quanto a expressão de receptores TRPV1. Porcentagem de neurônios que respondem a metabólitos (acima da linha eixo x) e que não
respondem a metabólitos (abaixo do eixo x). Cerca de 20% dos neurônios respondem a
concentrações moderadas (pH 7.0) e altas (pH 6.6) de metabólitos. Nós encontramos que a
vasta maioria dos neurônios (86,5 e 100% das células respondem a moderadas e altas doses de
metabólitos) são TRPV1+. Interessantemente, as células TRPV1 silentes são quase
irresponsivas a metabólitos. Esses resultados sugerem que os receptores TRPV1 são
necessários a responsividade das células a metabólitos.
A Figura 18 demonstra o padrão de resposta das células neuronais e não neuronais
a diferentes concentrações de metabólitos e as administrações de capsaicina e KCl que
confirmam as respostas como sendo neuronais.
113
Figura 18. Traçado representativo das respostas de Ca+2
em neurônios individuais e células
não neuronais em respostas aos diferentes tratamentos. As linhas pontilhadas indicam o
momento em que 3 diferentes concentrações de metabólitos, capsaicina e KCl foram
administradas as células.
Esses resultados podem ter maiores implicações para o entendimento da fadiga muscular e dor
muscular. Acredita-se atualmente que os receptores TRPV1 não possuem papel significativo
no desenvolvimento de dor e fadiga, uma vez que as taxas de pH observadas em resposta ao
exercício não são suficientemente altas para ativar os receptores TRPV1. Acreditamos, no
entanto, eles podem ser ativados por prostaglandinas ou aminas que aumentam com o
exercício induzindo sensibilização.
114
Discussão
115
12. DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo demonstram, pela primeira vez, o processo de
desenvolvimento de uma nova linhagem de camundongos: TRPV1-Cre/GCaMP6+, que
apresentam fluorescência apenas nas fibras sensoriais primárias TRPV1 positivas. Esses
animais foram obtidos como resultado do cruzamento de animais TRPV1-Cre com animais
GCaMP6, com sensores endógenos de cálcio.
Animais transgênicos da linhagem GCaMP6 tem sido empregados para estudo de
diversas condições, sendo um dos indicadores de cálcio mais empregados na imaginologia
neuronal e para as técnicas de quantificação dos níveis de íons cálcio (DING et al., 2014).
Uma vez que esses animais possuem codificados em seu gene o complexo: Miosina 13 (ou
M13), proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein – GFP) e Calmodulina. Esse
complexo age como um indicador do movimento de íons cálcio no interior da célula neuronal.
Isso significa que o aumento dos níveis de cálcio ou sua mobilização gera fluorescência e esta
pode ser mensurada e avaliada por diversas técnicas como calcium imaging e também por
técnicas como o Two-photon imaging (CHEN et al., 2013). Uma das principais
aplicabilidades dessa técnica de optogenética é a criação de animais que podem ser avaliados
em tempo real, in vivo, durante diversos tipos de condições fisiológicas e patológicas
(OUZOUNOV et al., 2017; RENNINGER; ORGER, 2013).
Os camundongos GCaMP6 fazem parte da família de indicadores de cálcio, os
GCaMP, desenvolvidos por Junichi Nakai em 2001 (Nakai et al., 2001). Os primeiros animais
criados dentro dessa variante foram desenvolvidos em 2004 (Ji et al., 2004). Desde então
foram criadas 6 linhagens de camundongos GCaMP, sendo os GCaMP6 a variante com maior
espectro de fluorescência (OHKURA et al., 2012; AKERBOOM et al., 2012). O cruzamento
de animais GCaMP6 com animais contendo o driver Cre, permite o desenvolvimento de
linhagens específicas para estudos, como por exemplo, o dCys-GCaMP para estudo dos
mecanismos envolvidos com os receptores NMDA (CAI et al., 2014).
Em nosso estudo verificamos que o cruzamento de animais GCaMP6 e TRPV1-
Cre. Esse cruzamento foi capaz de gerar animais TRPV1-Cre/GCaMP6+ viáveis e saudáveis.
Verificamos que a cultura de gânglio da raiz dorsal desses animais foi capaz de emitir
fluorescência capaz de ser caracterizada e mensurada via calcium imaging. Esse dado é
interessante, uma vez que demonstram que foi possível desenvolver uma nova ferramenta de
estudo para novos estudos na área de fisiologia, anatomia e histologia.
116
Foi descrito que a combinação dos metabólitos ATP, lactato e prótons é capaz de gerar
dor (GREGORY et al., 2015) e aumento dos níveis de cálcio intracelular de forma mais
efetiva do que a administração desses compostos de forma isolada, e que os receptores
TRPV1 fazem parte dos receptores envolvidos com a detecção de metabólitos no tecido
muscular (LIGHT et al., 2008), em concentrações detectadas em situações de dor
(HOHEISEL et al., 2004; KAUFMAN; RYBICKI,1987; LEFFLER et al., 2006; REINOHL et
al., 2003) e fadiga muscular (POLLACK et al., 2014).
Neste estudo, demonstramos que aproximadamente 60% das células do gânglio da
raiz dorsal de regiões entre S1-L6 eram de origem muscular. Cerca de 1/3 delas apresentam
receptores TRPV1. Indicando a importância desses receptores na condução de informações
sensoriais advindas do tecido muscular. Surpreendentemente, 1/3 das células TRPV1
positivas não respondem a administração de seu agonista, a capsaicina, sugerindo, portanto,
que existem receptores e fibras silentes.
Por fim, demonstramos que 20% dos neurônios DiI positivos respondem a
administração de metabólitos. Dos 85,6% dos que respondem ao pH 7.0, mimético de
condições de fadiga muscular, e 100% dos que respondem ao pH 6.6 são TRPV1+, sugerindo
portanto, que esses receptores são fundamentais para a condução de informações de dor e de
fadiga muscular.
117
Conclusão
118
13. CONCLUSÃO
Esses dados sugerem, portanto, que os animais TRPV1-Cre/GCaMP6+ são uma
importante ferramenta no estudo da dor muscular e que os receptores TRPV1 é expresso em
mais de 50% dos neurônios sensoriais musculares do GRD, sendo cerca de 1/3 deles não
responsivo a capsaicina. Por fim, concluímos também que os receptores TRPV1 são
fundamentais na resposta a diferentes doses de metabólitos responsáveis pela indução das
sensações de dor e fadiga.
119
Referências Bibliográficas
120
14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABU-SHAKRA, M.; ZISMAN, D.; BALBIR-GURMAN, A.; AMITAL, H.; LEVY, Y.;
LANGEVITZ, P.; TISHLER, M.; MOLAD, Y.; AAMAR, S.; ROSER, I.; AVSHOVICH,
N.; PARAN, D.; REITBLAT, T.; MADER, R.; SAVIN, H.; FRIEDMAN, J.;
LIEBERMAN, N.; EHRLICH, S. Effect of Tocilizumab on Fatigue and Bone Mineral
Density in Patients with Rheumatoid Arthritis. Isr Med Assoc J. v. 20, n. 4, p. 239-244,
2018.
AKERBOOM, J.; CHEN, T.W.; WARDILL, T.J.; TIAN, L.; MARVIN, J.S.; MUTLU, S.;
CALDERÓN, N.C.; ESPOSTI, F.; BORGHUIS, B.G.; SUN, X.R.; GORDUS, A.;
ORGER, M.B.; PORTUGUES, R.; ENGERT, F.; MACKLIN, J.J.; FILOSA, A.;
AGGARWAL, A.; KERR, R.A.; TAKAGI, R.; KRACUN, S.; SHIGETOMI, E.;
KHAKH, B.S.; BAIER, H.; LAGNADO, L.; WANG, S.S.; BARGMANN, C.I.;
KIMMEL, B.E.; JAYARAMAN, V.; SVOBODA, K.; KIM, D.S.; SCHREITER, E.R.;
LOOGER, L.L. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.
J Neurosci. v. 32, n. 40, p. 13819-40, 2012.
AMANN, M.; BLAIN, G.M.; PROCTOR, L.T.; SEBRANEK, J.J.; PEGELOW,
D.F.; DEMPSEY, J.A. Implications of group III and IV muscle afferents for high-
intensity endurance exercise performance in humans. J Physiol. v. 1. n. 589 (Pt 21), p;
5299-309, 2011.
AMANN, M.; VENTURELLI, M.; IVES, S.J.; MORGAN, D.E.; GMELCH, B.; WITMAN,
M.A.; JONATHAN GROOT, H.; WRAY, W.D.; STEHLIK, J.; RICHARDSON, R.S.Group
II/IV muscle afferents impair limb blood in patients with chronic heart failure. Int J Cardiol.
V. 174, n. 2, p. 368-75, 2014.
121
AMANN, M.; LIGHT, A.R. From Petri dish to human: new insights into the mechanisms
mediating muscle pain and fatigue, with implications for health and disease. Exp
Physiol. v. 100, n. 9, p. 989-90, 2015.
BANERJEE, A.; HENDRICK, P.; BHATTACHARJEE, P.; BLAKE, H. A
systematic review of outcome measures utilised to assess self-management in clinical
trials in patients with chronic pain. Patient Educ Couns. S. 0738-3991, n. 17, p. 30648-
1, 2017.
122
BOYDEN ES, ZHANG F, BAMBERG E, NAGEL G, DEISSEROTH K. Millisecond-
timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. v. 8, n. 9,
p. 1263-8, 2005.
BURNLEY, M.; JONES, A.M. Power-duration relationship: Physiology, fatigue, and the
limits of human performance. Eur J Sport Sci. v. 18, n. 1, p. 1-12, 2018.
CAI, B.; CHEN, X.; LIU, F.; LI, J.; GU, L.; LIU, J.R.; LIU, J. A cell-based functional assay
using a green fluorescent protein-based calcium indicator dCys-GCaMP. Assay Drug
Dev Technol, v. 12, n. 6, p.342-51, 2014.
CARR, F.B.; ZACHARIOU, V. Nociception and pain: lessons from optogenetics. Front
Behav Neurosci. v. 25, n. 8, p. 69. 2014.
CAUDHURI, A.; BEHAN, P.O. Fatigue in neurological disorders. Lancet. v. 363, n. 9413, p.
978-988, 2004.
CATERINA, M.J.; SCHUMACHER, M.A.; TOMINAGA, M.; ROSEN, T.A.; LEVINE, J.D.;
JULIUS, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.
Nature. v. 389, p. 816–824, 1997.
CATERINA, M.J.; LEFFLER, A.; MALMBERG, A.B.; MARTIN, W.J.; TRAFTON,
J.; PETERSEN-ZEITZ, K.R.; KOLTZENBURG, M.; BASBAUM, A.I.; JULIUS, D.
Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science,
v. 14, n. 288(5464), p. 306-13, 2000.
CHEN, T.W.; WARDILL, T.J.; SUN, Y.; PULVER, S.R.; RENNINGER, S.L.; BAOHAN,
A.; SCHREITER, E.R.; KERR, R.A.; ORGER, M.B.; JAYARAMAN, V.; LOOGER,
L.L.; SVOBODA, K.; KIM, D.S. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal
activity. Nature. v. 499, n. 7458, p. 295-300, 2013.
123
CHENG, L.H.; XIANG, J.Z.; HU, F.F. Vanilloid receptor TRPV1, sensory C-fibers, and
activation of adventitial mast cells: A novel mechanism involved in adventitial
inflammation. Medical Hypotheses. v. 71, n. 1, p. 102-103, 2008.
COHEN, A.E.; VENKATACHALAM, V. Bringing Bioelectricity to Light. Annual Review
of Biophysics. v. 43, p. 211-232, 2014.
DAHAN, H.; SHIR, Y.; NICOLAU, B.; KEITH, D.; ALLISON, P. Self-Reported Migraine
and Chronic Fatigue Syndrome Are More Prevalent in People with Myofascial vs
Nonmyofascial Temporomandibular Disorders. J Oral Facial Pain Headache. v. 30, n.
1, p.7-13, 2016.
DAI, Y. TRPs and pain. Semin Immunopathol. v. 38, n. 3, p. 277-91, 2016.
124
DI GIULIO, C.; DANIELE, F.; TIPTON, C.M. Angelo Mosso and muscular fatigue: 116
years after the first Congress of Physiologists: IUPS commemoration. Adv Physiol
Educ. v. 30, n. 2, p. 51-7, 2006.
DI GIULIO, C. Angelo Mosso: a holistic approach to muscular fatigue. Arch Italiennes de
Biologie. v. 149, p. 69-76, 2011.
DING, J.; LUO, A.F.; HU, L.; WANG, D.; SHAO, F. Structural basis of the ultrasensitive
calcium indicator GCaMP6. Sci China Life Sci, v. 57, n. 3, p. 269-274, 2014.
DUBOIS, M.Y.; FOLLETT, K.A. Pain medicine: The case for an independent medical
specialty and training programs. Acad Med, v. 89, n. 6, p.863-8, 2014.
ENOKA, R.M.; DUCHATEAU, J. Muscle fatigue: what, why and how it influences muscle
function. J Physiol. v. 586, n. 1, p. 11-23, 2008
FÉASSON, L.; CAMDESSANCHÉ, J.P.; EL MANDHI, L.; CALMELS, P.; MILLET, G.Y.
Fatigue and neuromuscular diseases. Ann Readapt Med Phys. v. 49, n. 6, p. 375-84,
2006.
FENNO, L; YIZHAR, O.; DEISSEROTH, K. The Development and Application of
Optogenetics. Ann Rev of Neurosc .v. 34, p. 389-412, 2011.
125
FINSTERER, J.; MAHJOUB, S.Z. Fatigue in Healthy and Diseased Individuals. Am J of
Hospice & Palliative Medicine. v. 31, n. 5, p. 562-575, 2014.
GONG, W.Y.; ABDELHAMID, R.E.; CARVALHO, C.S.; SLUKA, K.A. Resident
Macrophages in Muscle Contribute to Development of Hyperalgesia in a Mouse Model
of Noninflammatory Muscle Pain. J Pain, v. 17, n. 10, p. 1081-94, 2016.
GREGORY, N.S.; WHITLEY, P.E.; SLUKA, K.A. Effect of Intramuscular Protons, Lactate,
and ATP on Muscle Hyperalgesia in Rats. PLoS One, v. 10, n. 9, e0138576, 2015.
GURU, A.; POST, R.J.; HO, Y.; WARDEN, M.R. Making Sense of Optogenetics. Int J
Neuropsychopharmacol. v. 18, n. 11, : pyv079, 2015.
HAN, X.A.C.S. In vivo application of optogenetics for neural circuit analysis. Chem
Neurosci. v. 15, n. 3(8), p. 577-84, 2012.
126
HOHEISEL, U.; REINOHL, J.; UNGER, T.; MENSE, S. Acidic pH and capsaicin activate
mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat. Pain, v. 110, p. 149–157, 2004.
HOHEISEL, U.; REUTER, R.; DE FREITAS, M.F.; TREEDE, R.D.; MENSE, S. Injection of
nerve growth factor into a low back muscle induces long-lasting latent hypersensitivity in
rat dorsal horn neurons. Pain, v. 154, n. 10, p. 1953-60, 2013.
HOHEISEL, U.; TAGUCHI, T.; TREEDE, R.D.; MENSE, S. (2011) Nociceptive input from
the rat thoracolumbar fascia to lumbar dorsal horn neurones. Eur J Pain, v. 15, n. 8, p.
810-5, 2011.
HUANG, F.; TANG, B.; JIANG, H. Optogenetic investigation of neuropsychiatric diseases.
Int J Neurosci. v. 123, n. 1, p. 7-16. 2013.
INSTITUTE OF MEDICINE. Relieving pain in America: a blueprint for transforming
prevention, care, education, and research. Washington D.C: National Academies of
Science, 2011.
JULIUS, D.; BASBAUM, A.I. Molecular mechanisms of nociception. Nature, v. 413, p.
203–210, 2001.
KAUFMAN, M.P.; RYBICKI, K.J. Discharge properties of group III and IV muscle
afferents: their responses to mechanical and metabolic stimuli. Circ Res, v. 61, p. I60 –
I65, 1987.
LEFFLER, A.; MONTER, B.; KOLTZENBURG, M. The role of the capsaicin receptor
TRPV1 and acid-sensing ion channels (ASICs) in proton sensitivity of subpopulations of
primary nociceptive neurons in rats and mice. Neuroscience, v. 139, p. 699–709, 2006.
LIGHT, A.R.; HUGHEN, R.W.; ZHANG, J.; RAINIER, J.; LIU, Z.; LEE, J. Dorsal root
ganglion neurons innervating skeletal muscle respond to physiological combinations of
127
protons, ATP, and lactate mediated by ASIC, P2X, and TRPV1. J Neurophysiol, v. 100,
n. 3, p. 1184-201, 2008.
MARRONE, M.C.; MORABITO, A.; GIUSTIZIERI, M.; CHIURCHIÙ, V.; LEUTI, A.;
MATTIOLI, M.; MARINELLI, S.; RIGANTI, L.; LOMBARDI, M.; MURANA, E.;
TOTARO, A.; PIOMELLI, D.; RAGOZZINO, D.; ODDI, S.; MACCARRONE, M.;
VERDERIO, C.; MARINELLI, S. TRPV1 channels are critical brain inflammation
detectors and neuropathic pain biomarkers in mice. Nat Commun, v. 8, p.15292, 2017.
MCCORMACK, R.C.; O'SHEA, F.; DORAN, M.; CONNOLLY, D. Impact of
a fatigue management in work programme on meeting work demands of individuals with
rheumatic diseases: A pilot study. Musculoskeletal Care. 2018
MENSE, S. Muscle pain: mechanisms and clinical significance. Dt sch Arztebl, v. 105, n. 12,
p. 214-9, 2008.
NAKAI, J.; OHKURA, M.; IMOTO, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a
single green fluorescent protein. Nature Biotechnology, v. 19, n. 2, p. 137–41, 2001.
NUMAZAKI, M.; TOMINAGA, M. Nociception and TRP Channels. Curr Drug Targets
CNS Neurol Disord, v. 3, n. 6, p. 479-85, 2004.
OHKURA, M.; SASAKI, T.; SADAKARI, J.; GENGYO-ANDO, K.; KAGAWA-
NAGAMURA, Y.; KOBAYASHI, C.; IKEGAYA, Y.; NAKAI, J. Genetically encoded
green fluorescent Ca2+ indicators with improved detectability for neuronal Ca2+ signals.
PloS One, v. 7, n. 12, e51286, 2012.
OUZOUNOV, D.G.; WANG, T.; WANG, M.; FENG, D.D.; HORTON, N.G.; CRUZ-
HERNÁNDEZ, J.C.; CHENG, Y.T.; REIMER, J.; TOLIAS, A.S.; NISHIMURA, N.;
XU, C. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in
intact mouse brain. Nat Methods, v. 14, n. 4, p. 388-390, 2017.
128
PARKER, K.L.; KIM, Y.; ALBERICO, S.L.; EMMONS, E.B.; NARAYANAN, N.S.
Optogenetic approaches to evaluate striatal function in animal models of Parkinson
disease.Dialogues Clin Neurosci. v. 18, n. 1, p. 99-107, 2016.
PAWELA, C.; DEYOE, E.; PASHAIE, R. Intracranial Injection of an Optogenetics Viral
Vector Followed by Optical Cannula Implantation for Neural Stimulation in Rat Brain
Cortex. Methods Mol Biol. v. 1408, p. 227-41, 2016.
POLLAK, K.A.; SWENSON, J.D.; VANHAITSMA, T.A.; HUGHEN, R.W.; JO,
D.; WHITE, A.T.; LIGHT, K.C.; SCHWEINHARDT, P.; AMANN, M.; LIGHT, A.R.
Exogenously applied muscle metabolites synergistically evoke sensations of muscle
fatigue and pain in human subjects. Exp Physiol, v. 99, n. 2, p. 368-80, 2014.
RENNINGER, S.L.; ORGER, M.B. Two-photon imaging of neural population activity in
zebrafish. Methods, v. 62, n. 3, p. 255-67, 2013.
REINOHL, J.; HOHEISEL, U.; UNGER, T.; MENSE, S. Adenosine triphosphate as a
stimulant for nociceptive and non-nociceptive muscle group IV receptors in the rat.
Neurosci Lett, v. 338, p. 25–28, 2003.
129
RUSSELL, D.; ÁLVAREZ GALLARDO, I.C.; WILSON, I.; HUGHES, C.M.; DAVISON,
G.W.; SAÑUDO, B.; MCVEIG, J.G. Exercise to me is a scary word': perceptions
of fatigue, sleep dysfunction, and exercise in people with fibromyalgiasyndrome-a focus
group study. Rheumatol Int. v. 38, n. 3, p. 507-515, 2018.
SALAFFI, F.; DE ANGELIS, R.; STANCATI, A.; GRASSI, W. Health-related quality of life
in multiple musculoskeletal conditions: a cross-sectional population based
epidemiological study. II. The MAPPING study. Clin Exp Rheumatol, v. 23, p. 829–
839, 2005.
SCHILLINGS, M.L.; KALKMAN, J.S.; JANSSEN, H.M.; VAN ENGELEN,
B.G.; BLEIJENBERG, G.; ZWARTS, M.J. Experienced and physiological fatigue in
neuromuscular disorders. Clin Neurophysiol. v. 118, n. 2, p. 292-300, 2007.
SERTEL, M.; ŞIMŞEK, T.T.; YÜMIN, E.T. The Effect of Body Awareness Therapy on
Pain, Fatigue and Health-related Quality of Life in Female Patients with Tension Type
Headache and Migraine. West Indian Med J, Feb 19. IN Press, 2016.
SIDHU, S.K.; WEAVIL, J.C.; VENTURELLI, M.; GARTEN, R.S.; ROSSMAN,
M.J.; RICHARDSON, R.S.; GMELCH, B.S.; MORGAN, D.E.; AMANN, M. Spinal μ-
opioid receptor-sensitive lower limb muscle afferents determine corticospinal
responsiveness and promote central fatigue in upper limb muscle. J Physiol. v. 15, n.
592(22), p. 5011-24, 2014.
TANAKA, M.; WATANABE, Y. Supraspinal regulation of physical fatigue. Neurosci
Biobehav Rev. v. 36, n. 1, p. 727-734, 2012.
TIAN L, HIRES SA, MAO T, HUBER D, CHIAPPE ME, CHALASANI SH, PETREANU L,
AKERBOOM J, MCKINNEY SA, SCHREITER ER, BARGMANN CI, JAYARAMAN
V, SVOBODA K, LOOGER LL. Imaging neural activity in worms, flies and mice with
improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods, v. 6, n. 12, p. 875-81, 2009.
130
TING, J.T.; FENG, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of
mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience.
Behav Brain Res. v. 15, n. 255, p. 3-18, 2013.
TOMINAGA, M, CATERINA, M.J.; MALMBERG, A.B.; ROSEN, T.A.; GILBERT, H.;
SKINNER, K.; RAUMANN, B.E.; BASBAUM, A.I.; JULIUS, D. The cloned capsaicin
receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron, v. 21, p. 531–543, 1998.
VAILLANT, J.; REVILLET, P.; SEVENIER, A.M.; JUVIN, R. Impact of fatigue on postural
control in quiet standing in fibromyalgia. Ann Phys Rehabil Med, 59S:e124-e125, 2016.
ZHANG F, GRADINARU V, ADAMANTIDIS AR, DURAND R, AIRAN RD, DE LECEA
L, DEISSEROTH K. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing
mammalian brain structures. Nat Protoc. v. 5, n. 3, p. 439-56, 2010.
ZHAO, M.; ALLEVA, R.; MA, H.; DANIEL, A.G.; SCHWARTZ, T.H. Optogenetic tools for
modulating and probing the epileptic network. Epilepsy Res. v. 116, p. 15-26, 2015.
YÜKSEL, E.; NAZIROĞLU, M.; ŞAHIN, M.; ÇIĞ, B. Involvement of TRPM2 and TRPV1
channels on hyperalgesia, apoptosis and oxidative stress in rat fibromyalgia model:
Protective role of selenium. Sci Rep, 13; v. 7, n. 1, 17543, 2017.
131
Anexos
132
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa da UNICAMP.
133
Anexo 2 – Carta de submissão à revista “Neuropharmacology”.
Elsevier Editorial System(tm) for Neuropharmacology
Manuscript Draft Manuscript
Number: Title: Muscle pain induced by static contraction in rats is modulated by P2X3
receptors
Article Type: Research Paper
Keywords: P2X3 receptors; muscle; hyperalgesia; static contraction; cytokines;
neutrophils.
Corresponding Author: Dr. Maria G. Oliveira-Fusaro, Ph.D Corresponding Author's
Institution: School of Applied Sciences, State University of Campinas
First Author: Bruna M Aquino, PhD
Order of Authors: Bruna M Aquino, PhD; Diogo F Santos, PhD; Carolina O Jorge, PhD;
Aline S Marques, undergraduated; Juliana M Teixeira, PhD; Carlos A Parada, PhD; Maria
G. Oliveira-Fusaro, Ph.D
Abstract: P2X3 receptors are involved with several types of pain conditions. Muscle pain
induced by static contraction has an important socioeconomic impact. Therefore, the
aim of this study was to evaluate the involvement of P2X3 receptors on mechanical
muscle hyperalgesia and neutrophil migration induced by static contraction in rats. In
addition, we evaluated whether static contraction would be able to increase muscle
levels of TNF-α and IL-1β. Intramuscular or intrathecal pretreatment with the selective
P2X3 receptor antagonist A317491 prevented static contraction-induced mechanical
muscle hyperalgesia. In addition, A317491 reduced static contraction-induced
mechanical muscle hyperalgesia when administered 30 and 60 minutes of the beginning
of static contraction, but not after 30 and 60 min of the end of static contraction.
Intramuscular A-317491 also prevented static contraction-induced neutrophil
migration. In a period of 24 hours, static contraction did not increase muscle levels of
TNF-α and IL-1β. Together, these findings suggest that mechanical muscle hyperalgesia
and neutrophil migration induced by static contraction is modulated by peripheral and
134
spinal cord dorsal horn P2X3 receptors. Also, we suggest that P2X3 receptors are
important to the development but not to maintenance of muscle hyperalgesia.
135
Anexo 3 – Analgesímetro e posicionamento dos animais para análise das respostas
comportamentais