รายงานการวจย

ชอโครงการวจย : การวจยและพฒนาสารตนแบบทางยาตานเชอวณโรคจากสมนไพร Research and development for the lead compounds against

Mycobacterium tuberculosis from medicinal plants

หนวยงานทรบผดชอบงานวจย :

- ศนยเทคโนโลยชวภาพดานการแพทยและสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย - สถาบนวจยสมนไพร กรมวทยาศาสตรการแพทย

คณะผวจย :

ส านกวชาการวทยาศาสตรการแพทย

1) นางเดอนถนอม พรหมขตแกว หวหนาโครงการวจย ศนยเทคโนโลยชวภาพดานการแพทยและสาธารณสข

2) นางสาว ปฐมาพร ปรกษากร ผวจยหลก สถาบนวจยสมนไพร 3) นางสาวประไพ วงศสนคงมน ผรวมวจย 4) นางสาวดวงเพญ ปทมดลก ผรวมวจย 5) นางสาวสมจตร เนยมสกล ผรวมวจย

การวจยและพฒนาสารตนแบบทางยาตานเชอวณโรคจากสมนไพร

ปฐมาพร ปรกษากร* สมจตร เนยมสกล** ประไพ วงศสนคงมน** ดวงเพญ ปทมดลก** และ เดอนถนอม พรหมขตแกว*** * ศนยเทคโนโลยชวภาพดานการแพทยและสาธารณสข ** สถาบนวจยสมนไพร *** ส านกวชาการวทยาศาสตรการแพทย

วณโรคเปนปญหาทางสาธารณสขทส าคญโดยเปนสาเหตการเสยชวตของประชากรโลกราวปละสองลานราย การรกษาวณโรคตองใชยารวมกนสชนดเปนระยะเวลามากกวาหกเดอน ซงการใชยาหลายชนดรวมกนเปนเวลายาวนานท าใหเกดปญหาความไมรวมมอในการใชยาของผปวย สงผลใหเกดการดอยาของเชอวณโรคมากขนและเพมอตราการปวยและเสยชวต ดวยเหตนการพฒนายาใหมและการแพทยทางเลอกเชนการใชยาสมนไพรเพอการรกษายงคงเปนทตองการส าหรบตานวณโรค การวจยนมจดมงหมายเพอคนหาสารตานเชอไมโคแบคทเรยและพฒนาสารตนแบบทางยาตานวณโรค โดยท าการศกษาฤทธของสารสกดสมนไพรมากกวา 100 ชนด จากนนคดเลอกพชทมฤทธดมาท าการศกษาตอเพอแยกสารออกฤทธใหบรสทธ โดยคดเลอกพช 5 ชนดมาแยกบรสทธตามหลกการ bioassay-guided separation ท าใหไดสารบรสทธทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากพชเหลานรวม 7 ชนด คอ Isoeleutherin, 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide, Andrographolide, 1’acetoxy chavicol acetate, Hydroxychavicol, Chavibetol และ Isocentratherin โดยสารเหลานแสดงฤทธตานเชอ Mycobacterium bovis BCG ทระดบความเขมขนต าสดในการยบยงการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรย (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 25 50 25 12.5 25 25 และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ ซงเมอน าสารบรสทธทไดไปศกษาฤทธตานเชอวณโรค (Mycobacterium tuberculosis Rv 37a) พบวาสารบางชนดมคณสมบตนาสนใจเหมาะส าหรบน าไปพฒนาเปนสารตนแบบทางยาตอไป

Research and development for the lead compounds against Mycobacterium tuberculosis from medicinal plants

Patamaporn Pruksakorn*, Somchit Niumsakul**, Prapai Wongsinkongman**, Duangpen Pattamadilok** and Duanthanorm Promkhatkaew*** * Medical Biotechnology Center ** Institute of Medicinal Plants *** Senior Technical Office

Tuberculosis (TB) is a major world health problem killing two million people annually. The treatment of TB infection requires a regimen of four antibiotics taken over a six month period. Long- term multidrug therapy causes non-compliance problem leading an increase in multidrug-resistant TB, which associated with high morbidity and mortality. Therefore new drugs and herbal medicines are still required as alternative medication for treatment of TB infection. This research aimed to search for anti-mycobacterial substances from medicinal plants and development of lead compounds. Over 100 medicinal plant extracts were tested for searching anti-mycobacterial activity. Five plants that showed good activity were further studied by purification of active substances using bioassay guided-separation to obtain 7 of anti-mycobacterium substance i.e. Isoeleutherin, 14-deoxy-11,12-didehydro andrographolide, Andrographolide, 1’acetoxychavicol acetate, Hydroxychavicol, Chavibetol, and Isocentratherin. These compounds showed anti-mycobacterium activity against Mycobacterium bovis BCG with MIC (Minimum Inhibitory Concentration) 25, 50, 25, 12.5, 25, 25, and 25 g/mL, respectively. In order to study anti-TB activity against Mycobacterium tuberculosis Rv 37a found that some substances are promising for development of lead compounds in further study.

i

สารบญ

หนา สารบญตาราง ii สารบญภาพ iii ค ายอ iv

บทน า 1

รายละเอยดเกยวกบการด าเนนการวจย 4

ผลการทดลอง 24

วจารณผลการทดลอง 28

สรปผลการวจย 31

เอกสารอางอง 32

ii

สารบญตาราง

หนา

ตารางท 1 การรกษาวณโรค 11

ตารางท 2 ปรมาณของสารสกดหยาบทได 5-10

ตารางท 3 การวเคราะหคา Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI) 23

ตารางท 4 แสดงชนดของสมนไพรทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยท MIC < 100 µg /mL 24

ตารางท 5 สารบรสทธทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากสารสกดสมนไพร 25

ตารางท 6 ฤทธของสารบรสทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรค (drug combination effects) 27

iii

สารบญภาพ

หนา

ภาพท 1 แผนภาพของ 96-well plate ทใชในการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรย 11

ภาพท 2 ตนวานหอมแดงและหววานหอมแดง 12

ภาพท 3 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากหววานหอมแดง 13

ภาพท 4 ตนขาและเหงาขา 14

ภาพท 5 การแยกสารบรสทธจากเหงาขา 14

ภาพท 6 ตนฟาทะลายโจร 15

ภาพท 7 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากตนฟาทะลายโจร 16

ภาพท 8 ตนพล 17

ภาพท 9 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากใบพล 18-19

ภาพท 10 ตนกระดมไพลน 20

ภาพท 11 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากตนกระดมไพลน 21

ภาพท 12 แผนภาพของ 96-well plate ทใชในการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารบรสทธเมอใช

รวมกบยาตานวณโรค (drug combination effects) 22

ภาพท 13 chavicol analogs 30

iv

List of Abbreviations

CHCl3 Chlorofrom CO2 Carbon dioxide DMSO Dimethyl sulfoxide EMB Ethambutol EtOAc Ethyl acetate FIC Fractional Inhibitory Concentration g. Gram HPLC High-Performance Liquid Chromatography H2O Hydrogen dioxide (water) INH Isoniazid MDR-TB Multidrug-resistant tuberculosis MeOH Methanol mg. Miligram µg. Microgram MIC Minimum Inhibitory Concentration mL Mililitre(s) MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoly)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium

bromide OADC Oleic Acid-Dextrose-Catalase

PZA Pyrazinamice RMP Rifampicin SFE Supercritical fluid extractor SiO2 Silicon dioxide STM Streptomycin TLC Thin Layer Chromatography XTD-TB Extensively drug-resistant tuberculosis 2-D NMR Two-dimensional nuclear magnetic resonance

- 1 -

บทน า (Introduction) วณโรคเปนสาเหตการเสยชวตของผปวยทวโลกราว 1.8 ลานรายในแตละป(1) จากการส ารวจโดยองคการ

อนามยโลกเกยวกบสภาวะการแพรกระจายของวณโรคประจ าป 2553 ระบวาในป 2552 ทวโลกมผปวยวณโรครายใหมอบตขนประมาณ 9.4 ลานคน โดยในประเทศไทยประมาณการวามผปวยวณโรครายใหมอบตขน 93,000 ราย และเสยชวตจากวณโรคสงถง 12,000คน (2) นอกจากนวณโรคเปนหนงในสบอนดบแรกของสาเหตการตายในประชากรไทยอกดวย(3) ปจจบนการรกษาวณโรคท าไดโดยการใชยาฆาเชอ ซงยาหลกทใชในการรกษาคอ streptomycin (STM), isoniazid (INH), rifampicin (RMP), ethambutol (EMB) และ pyrazinamice (PZA) โดยจะใชยาขางตนรวมกนอยางนอย 2 ชนด เปนระยะเวลาตดตอกนไมนอยกวา 6 เดอน(4-5) ซงการใชยาหลายชนดรวมกนเปนระยะเวลายาวนานในการรกษานน เปนสาเหตหนงของความไมรวมมอในการรบประทานยาของผปวย สงผลใหเกดการดอยาของเชอวณโรคทงชนด multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) และ extensively drug-resistant tuberculosis (XTD-TB) ซงน าไปสการเพมขนของอตราการปวยและการเสยชวตของผตดเชอ(6) จากปญหาการเพมขนของเชอดอยาและการแพรกระจายของโรคเอดส ท าใหการควบคมวณโรคเปนไปไดอยางยากล าบากและคงเปนปญหาส าคญของสาธารณสขในปจจบน(7) ดวยเหตนท าใหยาใหมและการแพทยทางเลอกเชนการใชยาสมนไพรยงคงเปนทตองการส าหรบใชรกษาวณโรค

ตารางท 1 การรกษาวณโรค (5)

Treatment of tuberculosis: guidelines–4th edition. Geneva: WHO, 2010

ในประเทศไทยการใชยาสมนไพรเพอบรรเทาและบ าบดโรคนน ถอเปนภมปญญาทองถนทมความส าคญในการสงเสรมสขภาพพนฐานของชาวไทยมาแตโบราณ จากการศกษาวจยในหองปฏบตการและเทคโนโลยสมยใหมทพฒนาขนในปจจบนท าใหการศกษาเกยวกบสมนไพรเปนไปอยางกวางขวาง และมการพสจนยนยนวาสมนไพรหลายชนดทเคยใชกนมาแตโบราณนนมคณสมบตทางยาจรง และบางชนดสามารถน ามาพฒนาเปนยา

WHO Treatment Guidelines for Standard Regimens for New TB Patients

Intensive phase treatment* Continuation phase

2 months of HRZE* (H) Isoniazid (R) Rifampicin (Z) Pyrazinamide (E) Ethambutol

4 months of HR (H) Isoniazid (R) Rifampicin

* WHO no longer recommends omission of ethambutol during the intensive phase of treatment for patients with non-cavitary, smear-negative pulmonary TB or extrapulmonary TB who are known to be HIV-negative. In tuberculous meningitis, ethambutol should be replaced by streptomycin.

- 2 -

แผนปจจบนเพอใชในการรกษาโรคไดส าเรจ อยางไรกตามยงคงมสมนไพรอกจ านวนมากทรอการคนหาค าตอบทางวทยาศาสตรถงคณสมบตทางยา และพชพนบานอกมากมายทรอการศกษาเพอหาฤทธทางเภสชวทยาของพชนน ๆ ในสวนของการน าพชสมนไพรมาใชเพอรกษาวณโรคนน แมจะมขอมลเกยวกบฤทธตานเชอวณโรคของสมนไพรบางชนดในต ารายาแผนโบราณ(8-10) แตขอมลเกยวกบการทดสอบยนยนผลและการศกษาพษเฉยบพลนและพษเรอรงของสมนไพรยงคงมอยจ ากด ท าใหการใชสมนไพรเพอการรกษาวณโรคยงคงมอยในวงแคบ ปจจบนกระทรวงสาธารณสขไดมนโยบายสงเสรมการน ายาสมนไพรมาใชรกษาโรค ควบคกบการใชยาแผนปจจบนภายในโรงพยาบาล เพอเสรมสรางความมนคงทางดานสขภาพอนามยและความปลอดภยของประชากร และเพมโอกาสการพฒนาเพอการสงออกยาและสมนไพรไทยไปจ าหนาย ณ ตางประเทศในอนาคต(11) การศกษานมวตถประสงคเพอวจยและพฒนาสารตนแบบทางยาตานวณโรคจากสมนไพร โดยเบองตนไดคดเลอกพชพนบานและสมนไพรอยางสมจ านวน 100 ชนดมาสกดดวยเอทานอล และศกษาฤทธยบยงการเจรญ (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) ตอเชอไมโคแบคทเรย 2 ชนดคอ Mycobacterium smegmatis (เชอไมโคแบคทเรยมสายพนธทมการเจรญเตบโตรวดเรวและไมกอโรคในมนษย) และ Mycobacterium bovis BCG (เชอไมโคแบคทเรยมสายพนธทมการเจรญเตบโตชาและมพนธกรรมใกลเคยงกบเชอวณโรค) โดยใชเชอดงกลาวเปนตวแทนส าหรบการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารสกดสมนไพรดวยวธ Broth microdilution method เพอใหผลการทดสอบทไดเปนแนวทางในการเลอกชนดสมนไพรส าหรบน าไปศกษาฤทธตานเชอวณโรค และแยกสารออกฤทธใหบรสทธในล าดบตอไป

การศกษานพบวาพชสมนไพร 14 ชนดแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยท MIC ต ากวา 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ประกอบดวย ตนครอบจกรวาล ตนกระดมไพลน เหงาขา ตนฟาทะลายโจร พรก หววานหอมแดง ใบมะพด รากหญางวงชาง ตนกระเพราแดง ใบพล ดอกเลบมอนาง ตนทองพนชง ตนโมกบาน และตนไพลด า โดยไดคดเลอกพชทแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยดทสดในเชอทใชทดสอบทงหมด 5 ชนด คอ หววานหอมแดง ตนฟาทะลายโจร เหงาขา ใบพล และตนกระดมไพลน มาท าการแยกสารออกฤทธใหบรสทธตามหลกการ bioassay guided-separation จากการศกษาสามารถแยกสารบรสทธทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยไดทงหมด 7 ชนด คอ isoelutherin (1) แยกไดจากสารสกดเอทานอลของหววานหอมแดง, 14-deoxy-11,12-didehydro andrographolide (2) และ andrographolide (3) แยกไดจากสารสกดเอทานอลของตนฟาทะลายโจร, 1’ acetoxychavicol acetate (4) แยกไดจากสารสกดเอทานอลของเหงาขา, hydroxychavicol (5) และ chavibetol (6) แยกไดจากสารสกดเอทานอลของใบพล, และ isocentratherin (7) แยกไดจากสารสกดเอทานอลของตนกระดมไพลน โดยสารทงหมดมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยม M. bovis BCG ทระดบ MIC 25, 50, 25, 12.5, 25, 25, และ 25 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ ซงเมอน าสารบรสทธทไดไปศกษาฤทธตานเชอวณโรค (Mycobacterium tuberculosis Rv37a) พบวาสารบางชนดเมอพจาณาโครงสรางและฤทธทางเภสชวทยาแลวมคณสมบตนาสนใจส าหรบน ามาพฒนาเปนสารตนแบบทางยาได นอกจากนพชบางชนดทพบวามฤทธตานเชอ

- 3 -

ไมโคแบคทเรยในการศกษาน มการกลาวอางถงสรรพคณในการรกษาวณโรคดวย เชน ตนครอบจกรวาล ตนทองพนชง และใบสะเดา (12-14) ขอมลผลการทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรทนจงนบเปนการยนยนคณสมบตทางยาของสมนไพรส าหรบรกษาวณโรค และเปนหลกฐานทางวทยาศาสตรทจะสนบสนนการใชสมนไพรดงกลาวในต ารายาแผนโบราณเพอการรกษาวณโรคได

- 4 -

รายละเอยดเกยวกบการด าเนนการวจย (Materials & Method)

เครองมอและอปกรณ

เครองกลนระเหยสารแบบหมน (Rotary evaporator, BÜCHI); ตปลอดเชอชนด Biological Safety

Cabinet Class II typeA/B3 (NUAIR); ตบมเพาะเลยงเชอควบคมอณหภม (New Brunswick Scientific); เครอง

ชงดจตอล ความละเอยดทศนยม 4 ต าแหนง (METTLER TOLEDO); เครองชงดจตอล ความละเอยดทศนยม 2

ต าแหนง (METTLER TOLEDO); UV cabinet (SPECTROLINE); Multichannel Pipette ขนาด 30-300

ไมโครลตร (CAPP); Autopipette ขนาด10, 200 และ 1,000 ไมโครลตร (eppendorf)

วสดและสารเคม

ขวดปราศจากเชอรปสเหลยมขนาด 30 มลลลตร (Sterile square media bottle 30 mL, NALGENE);

96-well culture plate ชนด flat bottom (Costar); filter tip ขนาด10, 200 และ 1,000 ไมโครลตร

(BioPointe Scientific); Thin layer Chromatography (TLC) plate (Kiesel gel 60F254 , Merck); อาหาร

เลยงเชอชนดเหลว 7H9 ( DifcoTM Middlebrook 7H9 Broth, BD); อาหารเลยงเชอชนดแขง 7H10 ( DifcoTM

Middlebrook 7H10 Agar, BD); glycerol (QRëCTM); Tween 80 (MERCK); OADC ( Middlebrook OADC

Enrichment, BBLTM); Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma); 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-

2H-tetrazolium bromide (MTT, USB); isoniazid (Fluka); ethanol (MERCK); chloroform (RCI

Labscan); methanol (Fisher Scientific)

ตวอยางพช

สมนไพรทน ามาทดลองเกบรวบรวมจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร ระหวางเดอนเมษายน 2553 ถง

กนยายน 2554 และไดเกบสารสกดตวอยางพรอมขอมลพนฐานและก าหนดหมายเลขตวอยางไวทหองปฏบตการ

ของศนยเทคโนโลยชวภาพดานการแพทยและสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย

การเตรยมสารสกดเอทานอลจากสมนไพร

ตดชนสวนของพชสดทน ามาทดลองใหมขนาดเลกและท าแหงทอณหภมหอง น าชนสวนพชแหงทไดมา

สกดดวยเอทานอล โดยหมกเปนระยะเวลาอยางนอย 1 คน จากนนน าสารสกดเอทานอลมาระเหยแหงภายใต

สญญากาศจนกระทงแหงด น าสารสกดหยาบทไดมาเตรยมใหอยในรปแบบทเหมาะสมกบการทดสอบฤทธตานเชอ

- 5 -

ไมโคแบคทเรยม โดยละลายสารสกดหยาบดวย DMSO ใหไดความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตรของสารสกด

ตวอยางแตละชนด และเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยสจนกวาน ามาทดสอบ (ตารางท 2)

ตารางท 2 ปรมาณของสารสกดหยาบทได

ชอวทยาศาสตร ชอไทย สวนทใช น าหนก (g) % Yield พชแหง สารสกด Abutilon indicum (L.) Sweet ครอบจกรวาล ตน 33.50 2.31 6.86 Acalypha indica Linn ต าแยแมว ตน 20.33 1.95 9.59 Acalypha indica Linn ต าแยแมว ราก 3.68 0.24 6.52 Achyranthes aspera L. พนง ตน 14.58 0.71 4.87 Ageratum conyzoides L. สาบแรงสาบกา ตน 2.52 0.31 12.30 Alpenia galanga (L.) Willd ขา ตน 4.26 0.30 7.04 Alpenia galanga (L.) Willd ขา เหงา 13.26 1.47 11.09 Alternanthera bettzickiana (Regal) Nichols.ผกเปดแดง ตน 14.96 0.77 5.15 Amaranthus virdis L. ผกขม ตน 4.89 0.31 6.34 Ananas comosus (Linn.) Merr. สบปะรด ใบ 4.23 0.46 10.87 Ananas comosus (Linn.) Merr. สบปะรด แกน 3.49 0.77 22.06 Ananas comosus (Linn.) Merr. สบปะรด เปลอก 7.53 1.20 15.94 Andrographis paniculata Wall. Ex Nees ฟาทะลายโจร ตน 8.40 1.07 12.74 Arundinaria suberecta Munro. ไผจน ตน 8.07 0.86 10.66 Azadirachta indica Juss. Var. siamensis Va สะเดา ใบ 13.65 1.58 11.58 Azolla caroliniana แหนแดง ตน 1.56 0.23 14.74 Bambusa sp. ไผหวาน ใบ 7.94 0.62 7.81 Bauhinia acuminate Linne กาหลง ใบ 8.96 2.07 23.10 Bauhinia acuminate Linne กาหลง ดอก 12.51 2.64 21.10 Boesenbergia pandurata (Roxb.) Holtt. กระชาย ตน 3.12 0.19 6.09 Boesenbergia pandurata (Roxb.) Holtt. กระชาย ราก 18.33 0.91 4.96 Bridelia ovate Decne มะกา ใบ 7.39 1.40 18.94 Calotropis gigantea (Linn.) R.Br.ex Ait.) รก ตน 7.24 0.83 11.46 Calotropis gigantea (Linn.) R.Br.ex Ait.) รก ดอก 7.14 0.82 11.48 Canna indica Linn. พทธรกษา ตน 6.80 0.73 10.74 Canna indica Linn. พทธรกษา เหงา 4.20 0.89 21.19 Capsicum frutescens Linn. พรกหอม ตน 4.78 0.32 6.69 Capsicum frutescens Linn. พรกหอม ผล 6.55 0.55 8.40

- 6 -

ชอวทยาศาสตร ชอไทย สวนทใช น าหนก (g) % Yield พชแหง สารสกด Carica papyya L. มะละกอ ใบ 5.37 0.88 16.39 Carica papyya L. มะละกอ ล าตน 11.27 1.00 8.87 Carissa caranda Linn มะมวงหาวมะนาวโห ใบ 5.77 0.88 15.25 Centella asiatica (L.) Urban บวบก ตน 1.47 0.23 15.64 Centratherum punctatum Cass. กระดมไพลน ตน 5.90 0.83 14.07 Citrus X hystrix L. มะกรด ใบ 10.04 0.57 5.68 Citrus X hystrix L. มะกรด น า 100 mL 14.07 14.07 w/v Citrus X hystrix L. มะกรด เปลอกผล 33.07 3.51 10.61 Citrus X hystrix L. มะกรด เมลด 5.42 0.78 14.39 Cleoma viscosa Linn. ผกเสยนผ ตน 5.50 0.60 10.91 Cleome gynandra Linn. ผกเสยน ตน 11.87 1.09 9.18 Cleome rutidosperma DC. ผกเสยนขน ตน 4.71 0.34 7.22 Clinacanthus natus (Burm.f) Lindau เสลดพงพอนตวเมย ตน 13.92 0.90 6.47 Clitovia ternatea L. อญชน เถา 6.19 0.80 12.92 Clitovia ternatea L. อญชน ดอก 3.35 0.20 5.97 Codiaeum variegatum Blume. โกสน ตน 14.09 1.03 7.31 Combretum quadrangulare Kurz. สะแก ตน 14.74 2.09 14.18 Combretum quadrangulare Kurz. สะแก ผล 8.24 1.37 16.63 Commelina benghalenis Linn ผกปราบ ตน 2.57 0.42 16.34 Cymbopogon citrates Stapf. ตะไคร ล าตน 3.08 0.30 7.85 Cymbopogon citrates Stapf. ตะไคร ใบ 3.82 0.24 6.28 Cyperus rotundus Linn. หญาแหวหม ตน 7.69 0.94 12.22 Cyperus rotundus Linn. หญาแหวหม หว 22.01 0.91 4.13 Dracaena fragrans Massangeana วาสนา ใบ 11.39 1.43 12.55 Dracaena fragrans Massangeana วาสนา ดอก 12.39 1.64 13.24 Dracaena sanderiana วานกวนอม ตน 2.58 0.25 9.69 Duranta erecta L. เทยนหยด ผล 76.51 9.53 12.46 Eleutherine emericana Merr. วานหอมแดง ตน 2.24 0.24 10.71 Eleutherine emericana Merr. วานหอมแดง หว 51.04 2.79 5.47 Eleutherine emericana Merr. วานหอมแดง ดอก 16.22 0.95 5.86 Eryngium foetidum L. ผกชฝรง ใบ 2.59 0.52 20.08 Eryngium foetidum L. ผกชฝรง ดอก 5.30 0.66 12.45 Eryngium foetidum L. ผกชฝรง ราก 2.42 0.32 13.22

- 7 -

ชอวทยาศาสตร ชอไทย สวนทใช น าหนก (g) % Yield พชแหง สารสกด Erythrina variegate Linn. ทองหลาง ใบ 10.70 1.87 17.20 Eupatorium odoratum L. สาบเสอ ตน 10.35 1.25 12.08 Eupatorium odoratum L. สาบเสอ ดอก 9.64 0.82 8.51 Euphobia hirta L. น านมราชสห ตน 14.25 0.86 6.04 Ficus racemosa Linn มะเดอ ตน 4.30 0.34 7.91 Ficus racemosa Linn มะเดอ เปลอกตน 3.15 0.24 7.62 Garcinia duleis Kurz มะพด ใบ 13.53 0.95 7.02 Garcinia duleis Kurz มะพด ผล 18.00 6.94 38.55 Garcinia duleis Kurz มะพด เมลด 22.51 3.84 17.06 Garcinia schomburgkiana Pierre. มะดน ใบ 8.68 1.60 18.43 Garcinia schomburgkiana Pierre. มะดน ผล 8.34 3.78 45.32 Gardenia jasminoides พด ดอก 7.14 1.31 18.35 Glinus oppositifolius (L.) A.DC. สะเดาดน ตน 20.28 1.98 9.76 Gomphrena celosioides Mart. บานไมรโรยปา ตน 6.71 0.41 6.11 Heliotropium indicum (Linn) R. Br. หญางวงชาง ตน 12.54 0.62 4.94 Heliotropium indicum (Linn) R. Br. หญางวงชาง ราก 1.65 0.24 14.54 Hibiscus sabdariffa L. กระเจยบแดง ตน 12.70 2.86 22.52 Hibiscus sabdariffa L. กระเจยบแดง กลบเลยง 5.50 2.46 44.73 Hibiscus sabdariffa L. กระเจยบแดง ผลดบ 10.10 0.45 4.46 Ipomoea aquatic Forsk. ผกบงไทย ตน 6.07 0.87 14.33 Ipomoea aquatic Forsk. ผกบงไทย ผล 8.57 0.58 6.77 Kaempferia parviflora Wall. Ex Baker กระชายด า ตน 2.19 0.23 10.50 Kaempferia parviflora Wall. Ex Baker กระชายด า ราก 4.71 0.13 2.76 Leea macrophylla Roxb. Ex Hornem. พญากาสก ใบ 8.00 0.81 10.12 Leea macrophylla Roxb. Ex Hornem. พญากาสก ดอก 7.80 0.36 4.62 Leea macrophylla Roxb. Ex Hornem. พญากาสก ผลดบ 17.63 2.76 15.66 Lepidanthes fruticosa (Roxb.) Leenh ช ามะเลยง ผล 17.75 6.52 36.73 Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit. กระถน ตน 6.13 0.44 7.18 Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit. กระถน ฝก 14.57 0.57 3.91 Mangifera indica Linn. มะมวง ใบ 18.51 2.74 14.80 Mangifera indica Linn. มะมวง ดอก 38.62 9.69 25.09 Mansoa alliacea (Lim.) A.H. Gentry กระเทยมเถา ตน 10.50 1.31 12.48 Mansoa alliacea (Lim.) A.H. Gentry กระเทยมเถา ดอก 6.00 2.37 39.50

- 8 -

ชอวทยาศาสตร ชอไทย สวนทใช น าหนก (g) % Yield พชแหง สารสกด Maytenus marcanii Dling hou หนามกานจาง ใบ 3.75 0.41 26.67 Maytenus marcanii Dling hou หนามกานจาง ผลดบ 14.43 1.14 7.90 Mimosa pudica L. hispida brenan. ไมยราพ ตน 7.70 0.37 4.81 Morinda eitrifolia L. ยอ ใบ 12.08 1.85 15.31 Morinda eitrifolia L. ยอ ผล 81.34 5.08 6.25 Moringa oleifera Lam มะรม ใบ 11.89 0.42 3.53 Moringa oleifera Lam มะรม ฝก 10.49 1.38 13.16 Moringa oleifera Lam มะรม เปลอกตน 9.57 0.40 4.18 Murraya paniculata (L.) Jack แกว ใบ 13.89 2.52 18.14 Murraya paniculata (L.) Jack แกว ดอก 8.89 1.24 13.95 Musa sapientum Linn. กลวย ใบ 6.72 0.95 14.14 Musa sapientum Linn. กลวย กลบเลยง 2.34 0.36 15.38 Musa sapientum Linn. กลวย ดอก 4.41 0.54 12.24 Musa sapientum Linn. กลวย ผลดบ 22.96 0.14 0.61 Musa sapientum Linn. กลวย เปลอกผลดบ 4.04 0.23 5.69 Nelumbo nucifera บวฉตรขาว ใบ 7.03 1.04 14.79 Nelumbo nucifera บวฉตรขาว กาน 2.06 0.43 20.87 Nelumbo nucifera บวฉตรขาว กลบดอก 3.45 0.37 10.72 Nelumbo nucifera บวฉตรขาว เกสรตวผ 1.41 0.13 9.22 Nymphaea stellata Wild. บวผน ใบ 4.69 0.54 11.51 Nymphaea stellata Wild. บวผน กาน 4.51 0.48 10.64 Nymphaea stellata Wild. บวผน ดอก 1.67 0.23 13.77 Nymphaea stellata Wild. บวผน ฝก 12.72 1.62 12.74 Ocimum basilicum L.f. citratum Back. แมงลก ตน 5.25 0.33 6.29 Ocimum basilicum L.f. citratum Back. แมงลก ดอก 5.84 0.34 5.82 Ocimum gratissimum ยหรา ตน 7.40 0.73 9.86 Ocimum gratissimum ยหรา ดอก 16.35 0.54 3.30 Ocimum sanctum L. กระเพรา ตน 3.5 0.52 14.86 Olax scandens Roxb. กะทกรก เถา 15.97 1.89 11.83 Orthosiphon grandiflorus Bolding หญาหนวดแมว ตน 10.70 1.18 11.03 Oxystelma esculentum Linn. F. Br. กระพงโหม ตน 5.65 0.82 14.51 Pandunus odorus Ridi. เตยหอม ใบ 7.80 0.93 11.92 Pandunus odorus Ridi. เตยหอม ล าตน 10.97 1.71 15.59

- 9 -

ชอวทยาศาสตร ชอไทย สวนทใช น าหนก (g) % Yield พชแหง สารสกด Pentalinon luteum จนทรกระจางฟา ใบ 6.85 0.75 10.95 Peperomia pellucid (L.) Humb Bonpl & Kunth กระสง ตน 3.04 0.40 13.16 Petrea volubilis L. พวงคราม ใบ 12.29 0.54 4.39 Petrea volubilis L. พวงคราม ดอก 8.46 0.63 7.43 Phyllanthus amarus Schum & Thonn. ลกใตใบ ตน 5.30 0.81 15.28 Phyllanthus pulcher Wallich ex Muell.-Arg.ธรณสาร ตน 7.77 1.59 20.46 Piper betle Linn. พล ตน 4.66 1.09 23.39 Piper sarmentosum Roxb. ชะพล ตน 2.56 0.24 9.38 Pluchea indica (L.) Less. ขล ตน 9.85 0.59 5.99 Punica granatum L. ทบทม ตน 10.10 1.28 12.67 Punica granatum L. ทบทม น าทบทม 100 mL 19.40 99.40 w/v Punica granatum L. ทบทม เมลด 14.41 1.10 7.63 Punica granatum L. ทบทม เปลอกผล 16.10 3.52 21.86 Quisqualis indica Linn. เลบมอนาง ใบ 7.84 1.09 13.90 Quisqualis indica Linn. เลบมอนาง ดอก 11.96 1.35 11.29 Rhinacanthus nasutus (Linn.) Kurz ทองพนชง ตน 11.23 1.17 10.42 Ruellia tuberose linn ตอยตง ตน 35.98 1.61 4.47 Ruellia tuberose linn ตอยตง ราก 20.22 0.46 2.27 Sauropus androgynus (L.) Merr. ผกหวานบาน ตน 6.56 0.84 12.80 Sauropus androgynus (L.) Merr. ผกหวานบาน ผล 7.04 0.81 11.51 Scheffera leucantha Vig หนมานประสานกาย ใบ 13.25 0.80 6.04 Senna tora (L.) Roxb. ชมเหดไทย ตน 26.50 1.17 4.42 Solanum trilobatum L. มะแวงเครอ ตน 6.69 1.14 17.04 Solidage caradensis สรอยทอง ตน 4.00 0.42 10.50 Syngonium podophyllum เงนไหล ตน 1.99 0.15 7.54 Syngonium podophyllum เงนไหล ดอก 9.23 0.40 4.33 Tagetes erecta L. ดาวเรอง ตน 1.71 0.26 15.20 Talinum paniculata (Jacq.) Gaertn. โสมไทย ตน 8.00 0.49 6.13 Talinum paniculata (Jacq.) Gaertn. โสมไทย ราก 4.43 0.35 4.43 Thevetia peruviana ร าเพย ใบ 12.52 1.94 15.50 Thryallis glauca Kuntz พวงทอง ตน 8.58 0.86 10.02 Thunbergia laurifolia Linn. รางจด ใบ 3.35 0.42 12.54 Tiliacora triandra Diels ยานาง ใบ 9.30 1.36 14.62

- 10 -

ชอวทยาศาสตร ชอไทย สวนทใช น าหนก (g) % Yield พชแหง สารสกด Trianthema portulacastrum Linn. ผกโขมหน ตน 32.07 1.30 4.05 Vernonia cinerea Less หญาหมอนอย ตน 4.32 0.42 9.72 Wrightia religiosa Benth. โมกบาน ตน 10.55 0.89 8.44 Zingiber ottensii Valeton ไพลด า ตน 8.00 0.93 11.63 Zingiber ottensii Valeton ไพลด า ดอก 2.50 0.37 14.80 Zingiber ottensii Valeton ไพลด า เหงา 9.00 1.52 16.89

เชอจลชพ

เชอ Mycobacterium smegmatis 6071 และ Mycobacterium bovis BCG Tokyo strain ถกเลยง

ในขวดปราศจากเชอรปสเหลยมบรรจอาหารเลยงเชอ Middlebrook 7H9 เตมดวย 0.2% กลเซอรอล 0.05%

Tween80 และ 10% OADC ท 37 °C จนกระทง late-log phase คอมคาการดดซบแสง (optical density) ท

600 นาโนเมตรเทากบ 0.8-1 (OD600 = 0.8 – 1)

การเตรยมเชอไมโคแบคทเรยทใชในการทดสอบ

น าเชอทอยในระยะ late-log phase (โดยประมาณ OD600 = 1 คดเปนความหนาแนนของเชอไมโค

แบคทเรย 1 108 เซลลตอมลลลตร) มาเตรยมใหเหมาะสมตอการทดสอบ โดยปรบความหนาแนนของเชอไมโค

แบคทเรยดวยอาหารเหลว Middlebrook 7H9 ใหมความเขมขนของเชอ 1 105 เซลลตอมลลลตร ส าหรบ M.

smegmatis และ 1 106 เซลลตอมลลลตร ส าหรบ M. bovis BCG กอนน าไปทดสอบ

การทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยโดยวธ Broth microdilution assay

การทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยใชวธการทดดแปลงมาจากวธ tetrazolium microplate assay (15) โดยเตมน าปราศจากเชอ 300 ไมโครลตร ลงในหลมรอบนอกของ 96-well culture plate ชนด flat bottom

(แถว A และ H, คอลมน 1 และ 12) ใสเชอทเตรยมไวส าหรบการทดสอบ (ดงอธบายขางตน) 100 ไมโครลตร ลง

ในแตละหลมทเหลอ ยกเวนแถว B ใหปรมาตรของเชอในหลมเทากบ 200 ไมโครลตร จากนนใสตวอยางของสาร

สกดสมนไพรทเตรยมไวแตละชนดลงในหลมทแถว B ใหมความเขมขนสดทายของสารสกดสมนไพร 200

ไมโครกรมตอมลลลตรโดยท าการทดสอบเปน 2 ซ าในตวอยางสารสกดสมนไพรแตละชนด ใช isoniazid ใสลงใน

หลม B10 ส าหรบ positive control และใช DMSO ในปรมาตรทเทากบตวอยางสารสกดใสลงในหลม B11

- 11 -

ส าหรบ vehicle control (ภาพท 1) จากนนเจอจางความเขมขนของสารสกดทท าการทดสอบจากแถว B แบบ

two-fold serial dilution อยางตอเนองไปจนถงแถว G แลวทงปรมาตรสวนเกน 100 ไมโครลตรจากทกหลมใน

แถว G น าถาดเพาะเลยงทเตรยมไดไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 36 ชวโมง ส าหรบเชอ M.

smegmatis และ 5 วน ส าหรบเชอ M. bovis BCG หลงจากบมเลยงทดลองเตมสารละลาย MTT 50 ไมโครลตร

( 0.05 % MTT, 50% absolute ethanol และ 5% Tween80) ลงในหลม B11 แลวน ากลบไปบมตอทอณหภม

37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 3 ชวโมง ส าหรบเชอ M. smegmatis และ 12 ชวโมง ส าหรบเชอ M. bovis BCG

เมอครบก าหนดการบมเลยงถาหลม B11 เปลยนเปนสมวง ใหเตมสารละลาย MTT ลงในหลมทเหลอทงหมด แลว

บมเลยงเพมเตมเปนเวลา 3 ชวโมงและ 12 ชวโมงส าหรบเชอ M. smegmatis และเชอ M. bovis BCG

ตามล าดบ หลงจากครบก าหนดการบมเลยงอานผลการทดสอบโดยตรวจวดคาการดดกลนแสงของแตละหลมท

560 นาโนเมตร โดยใชเครองอานปฏกรยาบนไมโครเพลท (microplate reader) คาความเขมขนต าสดทยบยง

การเจรญ (MIC) ตดสนจากหลมแรกทมการลดลงอยางมากของคาการดดกลนแสงเมอเทยบกบหลมทมความ

เขมขนต ากวาซงอยถดไป หรอสงเกตดสทเปลยนไปในแตละหลมของตวอยางดวยตาเปลา คา MIC ตดสนจากหลม

แรกทไมมการเปลยนสจากเหลองเปนมวง ในกรณทหลงจากเตมสารละลาย MTT ลงในหลม B11 แลว หลม

ดงกลาวยงคงเปนสเหลอง ใหบมเลยงตอแลวเตมสารละลาย MTT ลงในหลมถดไปบนคอลมน 11 (C11, D11,

E11, F11 และ G11 ตามล าดบ) ทกๆ 2 วนของการเพมระยะเวลาบมเลยง จนกวาหลมทเตมสารละลาย MTT จะ

เปลยนเปนสมวง แลวจงท าการอานผลดวยวธการดงอธบายขางตน

ภาพท 1 แผนภาพของ 96-well plate ทใชในการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรย

- 12 -

การแยกบรสทธสารทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากสารสกดเอทานอลของหววานหอมแดง

หววานหอมแดง (ภาพท 2) ถกเกบจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร เดอนเมษายน 2554 จากนนน ามา

ตดใหมขนาดเลกลง และท าแหงทอณหภมหอง

ภาพท 2 ตนวานหอมแดงและหววานหอมแดง

การแยกสารบรสทธด าเนนการตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยน าหววานหอมแดงแหง

ทตดเปนชนเลกๆ (280 กรม) มาสกดโดยการหมกดวยเอทานอล ไดสารสกดหยาบ 36 กรม จากนนสกดแยกดวย

ตวท าละลาย 2 ชนด คอ เอทลอะซเตทและน า ระเหยสารละลายในชนเอทลอะซเตทไดสารสกด 11.9 กรม แลว

น าไปสกดแยกตอดวยตวท าละลายเฮกเซนและ 90% เมทานอล น าสารสกดในชนเฮกเซน (4.2 กรม) มาแยก

บรสทธตอโดยใชคอลมนชนดซลกาเจล (SiO2 G60, 70-230 mesh) น าสวนทมฤทธดสดมาแยกบรสทธตอโดยใช

คอลมนชนดซลกาเจล (SiO2 G60, < 60 mesh) แลวน ามาท าใหบรสทธในขนตอนสดทายโดยใช preparative

HPLC (GROM-SIL 100 Si NP-1, 20 mm i.d. × 250 mm, 10 µm particle size) ไดสารบรสทธ (1) น าหนก

50.7 มลลกรม (ภาพท 3)

- 13 -

ผลกสน าตาลแดง (1)

Minimum Inhibitory Concentration (MIC) > 200 g/mL : - ภาพท 3 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากหววานหอมแดง

Crude extract (36 g) partitioned with EtOAc : H2O

EtOAc extract (11.9 g)

Aqueous phase (22.3 g)

partitioned with hexane : 90% MeOH

Hexane extract (5.4 g)

90% MeOH extract (7.9 g)

SiO2 hexane : EtOAc: MeOH

1 2 3 4 5 6 (310) (560) (495) (171) (385) (633) mg

7 8 9 10 11 12 (642) (478) (101) (345) (280) (334) mg

- - - 200 - 200 - - 100 100 100 100

200 200 - - - - 50 50 100 - - -

-

-

200 200 200 200

SiO2 hexane : CHCl3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 (2.5) (1.5) (3.2) (7.9) (32.7) (282.8) (76.2) (7.0) (51.9) mg 200 100 50 200 200 - - - - - - 50 50 50 50 12.5 100 -

1 2 3 4 5 6 (0.2) (50.7) (3.8) (3.0) (8.0) (1.2) mg

HPLC : SiO2 hexane : EtOAc

200 50 100 100 100 100 50 25 25 25 50 50

M. smegmatis

M. bovis BCG

Anti-mycobacterium activity MIC (g/mL)

- 14 -

การแยกบรสทธสารทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากสารสกดของเหงาขา

เหงาขา (ภาพท 4) เกบจากอ าเภอบางปลามา จงหวดสพรรณบร เดอนมกราคม 2553 จากนนน าเหงาขาสดน าหนก 2 กโลกรม มาลางดวยน าใหสะอาด หนเปนชนเลกๆ และอบใหแหงดวยตอบรอนไฟฟาทอณหภม 45-50 องศาเซลเซยส นานประมาณ 24 ชวโมง

ภาพท 4 ตนขาและเหงาขา

การแยกสารบรสทธด าเนนการโดยน าขาแหงไปบดเปนผงละเอยด ไดน าหนกแหง 230 กรม มาสกดดวย

วธเครองสกดสารแบบอตโนมต (supercritical fluid extractor (SFE)) โดยใชตวท าละลายคอ

คารบอนไดออกไซด (CO2) สกดเปนเวลาประมาณ 6 ชวโมง ทความดน 300 psi อณหภม 45 องศาเซลเซยส โดย

ใชระบบไดนามก ไดสารสกดน าหนก 12.5 กรม (คดเปนรอยละของผลผลต เทากบ 5.43 เมอเทยบกบน าหนก

ขาแหง) จากนนน าสารสกดน าหนก 5.25 กรมมาแยกดวยคอลมนโครมาโทรกราฟ (column chromatography)

ได 4 สวนสกดยอย (fraction, Fr.) และน ามาแยกหาองคประกอบทางเคมของสารบรสทธ แสดงดงภาพท 5

สารสกดขาน าหนก 5.25 กรม Acetone: methanol, Column chromatography Fr.1 Fr.2 Fr.3 Fr.4 น าหนก 2.13 กรม น าหนก 100 มลลกรม น าหนก 2.99 กรม น าหนก 0.02 กรม

สารบรสทธ (2)

ภาพท 5 การแยกสารบรสทธจากเหงาขา

- 15 -

การแยกบรสทธสารทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากสารสกดเอทานอลของตนฟาทะลายโจร

ตนฟาทะลายโจร (ภาพท 6) ถกเกบจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร เดอนมกราคม 2555 จากนนน ามา

ตดใหมขนาดเลกลง และท าแหงทอณหภมหอง

ภาพท 6 ตนฟาทะลายโจร

การแยกสารบรสทธด าเนนการตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยน าตนฟาทะลายโจรแหงน าหนก 480 กรมมาสกดดวยเอทานอล ไดสารสกดหยาบ 41 กรม จากนนน ามาสกดแยกดวยน าและเอทลอะซเตรท น าสวนทละลายในเอทลอะซเตรทน าหนก 13 กรมมาสกดแยกตอดวย เฮกเซนและ 90 % เมทานอล สวนทละลายในชน 90 % เมทานอล (7.4กรม) ซงแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยมถกน ามาแยกสารบรสทธตอโดยใช silica gel column chromatography, Sephadex LH20 column chromatography, และ recrystallization ดงภาพท 7 ได สารบรสทธ 2 ชนด คอ ผลกใสรปเขม (3) ประมาณ 120 มลลกรม และผลกใสรปเขม (4) ประมาณ 520 มลลกรม

- 16 -

ภาพท 7 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากตนฟาทะลายโจร

EtOAc extract (13g) partitioned with hexane : 90% MeOH

Hexane extract (4.8 g)

M. bovis BCG

50 >100

>100

Crude extract (41 g) Anti-mycobacterium activity MIC (g/mL)

SiO2 hexane : CHCl3: MeOH (- ; Minimum Inhibitory Concentration (MIC) >100 g/mL for M. bovis BCG)

1 2 3 4 5 6 (30) (100) (40) (130) (470) (310) mg

7 8 9 10 11 12 (410) (1730) (660) (560) (530) (1290) mg

Sephadex LH20 MeOH : CHCl3 , 1:1 (MIC > 100 g/mL for M. bovis BCG)

1 2 3 4 5 6 (17.4) (68.6) (537.8) (18.1) (6.2) (7.3) mg

recrystallization

25

90% MeOH extract (7.4 g)

- 100 50 100 - -

ผลกใสรปเขม (3) recrystallization

50

- - - 100 50 50

50 50 50 100 - -

520 mg ผลกใสรปเขม (4)

Aqueous phase

120 mg

- 17 -

การแยกบรสทธสารทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากสารสกดเอทานอลของใบพล

ใบพล (ภาพท 8) ถกเกบจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร เดอนกมภาพนธ 2555 จากนนน ามาตดใหม

ขนาดเลกลง และท าแหงทอณหภมหอง

ภาพท 8 ตนพล

การแยกสารบรสทธด าเนนการตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยน ำใบพลแหงน ำหนก

400 กรมมำสกดดวยเอทำนอล ไดสำรสกดหยำบ 50 กรม จำกน นน ำมำสกดแยกดวยน ำและเอทลอะซเตรท น ำ

สวนทละลำยในเอทลอะซเตรทน ำหนก 35.99 กรมมำสกดแยกตอดวย เฮกเซน (12.64 กรม) และ 90 % เม

ทำนอล (20.25 กรม) สวนทละลำยในช น 90 % เมทำนอล ถกน ำมำแยกสำรบรสทธตอโดยใช silica gel

column chromatography, SephadexLH20 และ prep TLC ได ของเหลวหนดสน ำตำลเขม (5) ซงแสดงฤทธ

ตำนเช อไมโคแบคทเรย 0.84 กรม และสวนทละลำยในช นเฮกเซนซงแสดงฤทธตำนเช อไมโคแบคทเรยถกน ำมำ

แยกสำรบรสทธตอโดยใช silica gel column chromatography, SephadexLH20 และ prep TLC ได

ของเหลวสน ำตำลออน (6) ซงแสดงฤทธตำนเช อไมโคแบคทเรย 0.99 กรม

- 18 -

Dried plant (400 g)

extracted with EtOH

Crude extract (50 g)

partitioned with EtOAc : H2O

EtOAc extract (35.9 g)

Aqueous phase

partitioned with hexane : 90% MeOH

Hexane extract (12.64 g)

90% MeOH extract (20.25 g)

Anti-mycobacterium activity MIC (g/mL)

M. smegmatis

M. bovis BCG

-

-

>200 >200 50 50

1 2 3 4 5 6 7 8 9 (218) (2504) (178) (437) (158) (175) (237) (131) (182) mg

SiO2 hexane : EtOAc: MeOH

100 25 25 50 50 >100 >100 >100 >100

Sephadex LH20 hexane : EtOAc

1 2 3 4 (99) (210) (262) (1951) mg

Preparative TLC Hexane : Acetone (2:1)

ของเหลวหนดสน าตาลเขม (5) (0.84 g)

>200 100 50 25

- 19 -

ภาพท 9 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากใบพล

SiO2 hexane : EtOAc: MeOH

1 2 3 4 5 6 (795) (235) (472) (2304) (1004) (3890) mg

7 8 9 10 11 12 (2535) (150) (78) (239) (122) (363)

200 200 100 100 >200 >200 50 50 50 >100 >100 >100

>200 >200 >200 >200 >200 >200 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Sephadex LH20 hexane : EtOAc

1 2 3 4 5 6 (117) (6) (43) (18) (220) (76) mg >200 >200 >200 100 100 100 >100 >100 >100 25 25 25

Preparative TLC Hexane : EtOAc (3:1)

ของเหลวสน าตาลออน (6) (0.99 g)

Hexane extract (12.64 g)

- 20 -

การแยกบรสทธสารทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากสารสกดเอทานอลของตนกระดมไพลน

ตนกระดมไพลน (ภาพท 10) ถกเกบจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร เดอนมนาคม 2554 จากนนน ามา

ตดใหมขนาดเลกลง และท าแหงทอณหภมหอง

ภาพท 10 ตนกระดมไพลน

การแยกสารบรสทธด าเนนการตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยน ำตนกระดมไพลน (รป

ท 1)แหงน ำหนก 500 กรมมำสกดดวยเอทำนอล ไดสำรสกดหยำบ 35 กรม จำกน นน ำมำสกดแยกดวยน ำและ

เอทลอะซเตรท น ำสวนทละลำยในเอทลอะซเตรทน ำหนก 18 กรมมำสกดแยกตอดวย เฮกเซนและ 90 % เม

ทำนอล สวนทละลำยในช น 90 % เมทำนอล (11 กรม) ซงแสดงฤทธตำนเช อไมโคแบคทเรยมถกน ำมำแยกสำร

บรสทธตอโดยใช silica gel column chromatography, Sephadex LH20 column chromatography, silica

gel column chromatography และ recrystallization ได ผลกใสรปเขม (7) ของสำรบรสทธซงแสดงฤทธตำน

เช อไมโคแบคทเรย 116 มลลกรม

- 21 -

ผลกใส (7) 116 mg ภาพท 11 การแยกสารตานไมโคแบคทเรยจากตนกระดมไพลน

Dried plant (500 g) extracted with EtOH

Crude extract (35 g) partitioned with EtOAc : H2O

EtOAc extract (18g) Aqueous phase partitioned with hexane : 90% MeOH

Hexane extract (5 g)

90% MeOH extract (11 g)

SiO2 hexane : CHCl3: MeOH (Minimum Inhibitory Concentration (MIC) > 200 g/mL)

Anti-mycobacterium activity MIC (g/mL)

M. smegmatis

M. bovis BCG

1 2 3 4 5 6 (210) (1845) (3880) (922) (1220) (528) mg 200 50 100 100 100 100 100 25 25 50 50 50

100 - 50 100

SephadexLH20 MeOH : CHCl3 , 1:1 (MIC > 100 g/mL)

1 2 3 4 5 6 7 (-) (22) (57) (108) (1324) (190) (25) mg

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (10) (42) (21) (133) (119) (350) (415) (118) (42) (57) mg

SiO2 hexane : acetone ( MIC > 200 g/mL)

recrystallization

- 200 50 50 50 50 50 50 50 50 - 100 50 25 25 25 25 25 50 50

50 25

200 200 - - - - 100 100 100 - - -

7 8 9 10 11 12 (699) (332) (492) (851) (578) (659) mg

- - 50 100 50 50 - - - 50 50 25 25 -

- 22 -

การทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารบรสทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรค (drug combination

effects)

การทดสอบฤทธ drug combination effects ท าโดยเตรยมยาตานวณโรคทตองการศกษาและสารออก

ฤทธตานวณโรคจากสมนไพรในอาหารเลยงเชอ 100 ไมโครลตร เตรยมทความเขมขนสงสด 8 เทาของคา MIC (8

x MIC) และความเขมขนลดลงแบบ two-fold serial dilution ตามล าดบ ในแถวแนวตงและนอนของ 96-well

culture plate ชนด flat bottom (ตามภาพท 12) ใสเชอ M. bovis BCG ทมความเขมขนของเชอ 2 x 106

เซลลตอมลลลตร ทเตรยมไวส าหรบการทดสอบ 100 ไมโครลตร ลงในแตละหลมของ 96-well culture plate

น าถาดเพาะเลยงทเตรยมไดไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 7 วน หลงจากบมเลยงทดลองเตม

สารละลาย MTT 50 ไมโครลตร ( 0.05 % MTT, 50% absolute ethanol และ 5% Tween80) ลงในหลม A12

แลวน ากลบไปบมตอทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 12 ชวโมง เมอครบก าหนดการบมเลยงถาหลม A12

เปลยนเปนสมวง ใหเตมสารละลาย MTT ลงในหลมทเหลอทงหมด แลวบมเลยงเพมเตมเปนเวลา 12 ชวโมง

หลงจากครบก าหนดการบมเลยงอานผลการทดสอบโดยตรวจวดคาการดดกลนแสงของแตละหลมท 560 นาโน

เมตรโดยใช เครองอานปฏกรยาบนไมโครเพลท (microplate reader) คาความเขมขนต าสดทยบยงการเจรญ

(MIC) ตดสนจากหลมแรกทมการลดลงอยางมากของคาการดดกลนแสงเมอเทยบกบหลมทมความเขมขนต ากวาซง

อยถดไป หรอสงเกตดสทเปลยนไปในแตละหลมของตวอยางดวยตาเปลา คา MIC ตดสนจากหลมแรกทไมมการ

เปลยนสจากเหลองเปนมวง ในกรณทหลงจากเตมสารละลาย MTT ลงในหลม A12 แลว หลมดงกลาวยงคงเปนส

เหลอง ใหบมเลยงตอแลวเตมสารละลาย MTT ลงในหลมถดไปบนคอลมน 12 (B12, C12, D12, E12, F12 และ

G12 ตามล าดบ ทกๆ 2 วนของการเพมระยะเวลาบมเลยง จนกวาหลมทเตมสารละลาย MTT จะเปลยนเปนสมวง

แลวจงท าการอานผลดวยวธการดงอธบายขางตน

การค าณวนผลการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารบรสทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรค ท าโดยค านวณคา Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC index) (16)

ตามสมการ ∑ FIC = FICA + FICB = ( CA/MICA) + (CB/MICB) - MICA and MICB are the MICs of drug A and drug B alone, respectively. - CA and CB are the concentrations of the drugs in combination, respectively.

- 23 -

ภาพท 12 แผนภาพของ 96-well plate ทใชในการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารบรสทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรค (drug combination effects)

การวเคราะหผลการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารบรสทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรควเคราะหผลตามตารางท 3

ตารางท 3 การวเคราะหคา Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI)

Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI) drug combination effects Less than or equal to 0.5 synergistic Greater than 0.5 less than or equal to 1.0 additive Greater than 1.0 less than or equal to 2.0 indifferent Greater than 2.0 antagonistic

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

- 24 -

ผลการทดลอง (Results)

การทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารสกดจากพชสมนไพร 100 ชนดโดยวธ Broth micro dilution method ในชวงความเขมขน 6.25 - 200 ไมโครกรมตอมลลลตร พบวาสมนไพร 14 ชนด แสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยมตอเชอ M. bovis BCG ทความเขมขนไมเกน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร (ตารางท 4) ตารางท 4 แสดงชนดของสมนไพรทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยท MIC < 100 µg /mL

ชอวทยาศาสตร ชอไทย สวนทใช % Yield MIC (µg/mL) M. smegmatis M.bovis BCG Isoniazid (INH) - - - 2.5 0.03 Abutilon indicum (L.) Sweet ครอบจกรวาล ตน 6.90 - 100 Centratherum punctatum Cass. กระดมไพลน ตน 14.07 - 50 Alpinia galanga Linn. ขา เหงา 11.06 50 25 Andrographis paniculata Wall. EX Neesฟาทะลายโจร ตน 12.74 200 50 Capsicum frutescens Linn. พรก ผล 8.40 - 100 Eleutherine americana Merr. วานหอมแดง หว 5.47 100 50 Garcinia duleis Kurz มะพด ใบ 7.02 100 100 Heliotropium indicum (Linn.) R. Br. หญางวงชาง ราก 14.55 200 50 Ocimum scanctum L. กระเพราแดง ตน 13.94 - 100 Piper betle Linn. พล ใบ 23.39 - 50 Quisqualis indica Linn. เลบมอนาง ดอก 11.29 200 50 Rhinacanthus nasutus (Linn.) Kurzทองพนชง ตน 10.42 200 100 Wrightia religiosa Benth. โมกบาน ตน 8.44 - 100 Zingiber ottensii Valeton. ไพลด า ตน 11.63 - 50

- ; MIC > 200 µg/mL

เบองตนพจารณาคดเลอกพช 5 ชนดทมฤทธด คอ หววานหอมแดง ตนฟาทะลายโจร เหงาขา ตนกระดมไพลน และใบพล มาศกษาเพอแยกสารออกฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยใหบรสทธตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยใชเทคนคทางโครมาโตกราฟ จากนนน าสารบรสทธทไดไปศกษาฤทธตานเชอวณโรคและวเคราะหโครงสรางทางเคมโดยใชขอมล 2-D NMR (Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy) (ตารางท 5)

- 25 -

ตารางท 5 สารบรสทธทมฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยจากสารสกดสมนไพร

ตวอยางพช

รหสของสารออกฤทธตานเชอไมโค

แบคทเรย

Anti-mycobacterial activities (MIC, µg/mL)

ผลการวเคราะห โครงสรางทางเคม

M. smegmatis

M. bovis BCG

M. tuberculosis

H37Raa หววานหอมแดง

27C1 (ผลกสน าตาลแดง)

50 25 50

Isoeleutherin (1) ตนฟาทะลายโจร 45C1

(ผลกไมมส)

45C2 (ผลกไมมส)

>100

>100

50

25

>100

12.5

14-deoxy-11,12-didehydro

andrographolide (2)

andrographolide (3) เหงาขา TNK101

(ผลกไมมส)

nd nd 12.5 1’acetoxychavicol acetate

(4)

O

O

O

O

H

OH

O

O

HO

O

O

OH

HO

H

HO

O

O

O

O

- 26 -

ตวอยางพช

รหสของสารออกฤทธตานเชอไมโค

แบคทเรย

Anti-mycobacterial activities (MIC, µg/mL)

ผลการวเคราะห โครงสรางทางเคม

M. smegmatis

M. bovis BCG

M. tuberculosis

H37Raa ใบพล 10PL81-MP

10PL81-HP

100

nd

25

25

25

>100

hydroxychavicol (5)

chavibetol (6)

ตนกระดมไพลน 150C1

50 25 12.5

isocentratherin (7)

a : tested by Bioassay Laboratory, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Thailand nd: not determined

การศกษาฤทธของสารบรสทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรค (drug combination effects) โดยคดเลอกสารออกฤทธตานวณโรคทแยกในการศกษาน 4 ชนดคอ isoeleutherin (1) andrographolide (3) hydroxychavicol (5) และ isocentratherin (7) เปนตวแทนส าหรบศกษาฤทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรคทมใชอยในปจจบนเชน isoniazid (INH), rifampicin (RMP), streptomycin (STM), และ ethambutol (EMB) โดยวเคราะหจากคา Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI) พบวา isoeleutherin (1) และ

O

O

O

O

O

O

OH

HO

HO

O

HO

- 27 -

andrographolide (3) ใหผลเปน indifferent กบยาทง 4 ชนดทท าการศกษา ในขณะท isocentratherin (7) ใหผลเปน antagonistic กบ rifampicin (RMP) และ ethambutol (EMB) นอกจากนพบวา hydroxychavicol (5) ใหผลเปน additive กบ rifampicin (RMP) (ตารางท 6)

ตารางท 6 ฤทธของสารบรสทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรค (drug combination effects)

combination FICI

effects active compounds anti-TB drugs

isoeleutherin (1)

INH > 1.0-2.0 indifferent RMP > 1.0-1.25 indifferent STM > 1.0-2.0 indifferent EMB > 1.0-2.0 indifferent

andrographolide (3)

INH > 1.0-1.25 indifferent RMP > 1.0-2.0 indifferent STM > 1.0-1.25 indifferent EMB > 1.0-2.0 indifferent

hydroxychavicol (5)

INH > 1.0-2.0 indifferent RMP 0.625-1.0 additive STM > 1.0-1.25 indifferent EMB > 1.0-2.0 indifferent

isocentratherin (7)

INH > 1.0-2.0 indifferent RMP > 2.0 antagonistic STM > 1.0-2.0 indifferent EMB > 2.0 antagonistic

isoniazid (INH), rifampicin (RMP), streptomycin (STM), และ ethambutol (EMB)

- 28 -

วจารณผลการทดลอง (Discussion)

การวจยเพอคนหาสารออกฤทธตานวณโรคนน มวธการทดสอบฤทธเบองตนทนยมใชอยหลายวธดวยกน

เชน Nitrate reduction assay(17), Rasazurin microtiter assay(18), Microplate alamar blue assay(19) และ

Tetrazolium microplate assay(15) ซงในแตละวธนนมขอจ ากดทแตกตางกนไป ในการศกษานเลอกใชวธ

Tetrazolium microplate assay ซงเปนวธการทประหยด และเหมาะส าหรบน ามาประยกตใชในหองปฏบตการ

โดยไดดดแปลงวธการจากเดมเลกนอยเพอใหเหมาะสมส าหรบการทดสอบเบองตนตอเชอทใชทดสอบ

การทดสอบฤทธใชเชอ M. smegmatis และ M. bovis BCG เปนตวแทนของเชอไมโคแบคทเรยส าหรบ

การทดสอบ เนองจากสามารถเพาะเลยงไดงาย ไมกอโรคในคน และไมตองการหองปฎบตการชนดพเศษส าหรบ

การศกษา ซงนบวาสะดวก ปลอดภย และประหยดกวาเมอเทยบกบการใชเชอ Mycobacterium tuberculosis

โดยตรง นอกจากนผลการทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของยาตานวณโรคทมใชอยในปจจบนตอเชอไมโค

แบคทเรยทงสามชนดนยงใหคา MIC ทใกลเคยงกนส าหรบเชอ M.tuberculosis กบ M. bovis BCG และแตกตาง

กนเพยงเลกนอยส าหรบเชอ M. smegmatis(20-21) จงนบไดวาการใชเชอ M. smegmatis และ M. bovis BCG ม

ความเหมาะสมส าหรบการทดสอบฤทธเบองตนเพอคนหาสารตานวณโรค

การทดสอบฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยของสารสกดจากพชสมนไพร พบวาสมนไพร 14 ชนดแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยมตอเชอ M. bovis BCG ทความเขมขนไมเกน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ซงสมนไพรบางชนดมการอางองถงสรรพคณทางยาเพอใชในการบ าบดรกษาโรคตาง ๆ รวมทงวณโรคปอดดวย เชน ตนครอบจกรวาล(12-

13) และตนทองพนชง(14) ผลการทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรเหลานจงเปนการยนยนถงประสทธผลของสมนไพรดงกลาวตอการน ามาใชในการรกษาวณโรค นอกจากนในพชบางชนดเคยมการรายงานผลการศกษาฤทธตานวณโรคของสารสกดจากพชดงกลาวมากอนแลว เชน เหงาขา(22) หญางวงชาง(23) และกระเพราแดง(24) ซงนบวาผลการศกษาครงนสอดคลองกบผลทเคยมรายงานมากอน การศกษานไดคดเลอกพช 5 ชนดทมฤทธด คอ หววานหอมแดง ตนฟาทะลายโจร เหงาขา ตนกระดมไพลน และใบพล มาศกษาเพอแยกสารออกฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยใหบรสทธตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยใชเทคนคทางโครมาโตกราฟ ซงจากการแยกบรสทธสารออกฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยในสารสกดหววานหอมแดงพบวา สารออกฤทธหลกคอ isoeleutherin (1) โดยมคณสมบตทางกายภาพและขอมลสเปคตรมเหมอนกบทเคยตพมพในผลงานวจยของ Hara H. และคณะ(25) isoeleutherin (1) เปนสารในกลม napthopyran ซงสารกลมนมรายงานฤทธทางเภสชวทยาทหลากหลายเชน anti-bacterial anti-fungal anti-

viral และ anti-tumor นอกจากนสาร isoeleutherin (1) ยงมฤทธทจ าเพาะในการกระตนการสราง IFN สงเสรมการท างานของ T helper cell ในระบบภมคมกนดวย(26) อยางไรกตามในขนตอนการแยกบรสทธพบวา

- 29 -

มแฟรกชนอนทมระดบความมขวแตกตางกนกบแฟรกชนทแยกบรสทธไดสาร isoeleutherin (1) และยงคงแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยอย แสดงใหเหนวาอาจมสารอนๆ ทแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยรวมอยในพชชนดนดวยเชนกน

การแยกสารออกฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยใหบรสทธจากสารสกดตนฟาทะลายโจรพบวา 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide (2) และ andrographolide (3) เปนสารออกฤทธในตนฟาทะลายโจร ซงสารเหลานอยในกลม diterpene lactone โดยเปนสารออกฤทธหลกในพชชนดน ตนฟาทะลายโจรเปนพชสมนไพรมการใชกนอยางแพรหลายแถบประเทศในทวปเอเซยเชน ไทย จน ฟลปปนส มาเลเซย อนโดนเซย และ อนเดย โดยใชเพอ แกไข ลดการอกเสบ รกษาการตดเชอ อจจาระรวง และเปนยาขมเจรญอาหาร นอกจากนมรายงานทหลายหลายเกยวกบฤทธทางเภสชวทยาของ สารสกดฟาทะลายโจร andrographolide (3) และสารอนพนธ เชน anti-inflammatory, antioxidant, antidiabetic, anti-diarrhoeal, anti-fertility, antivenom, anti-HIV, anti-malaria, antimicrobial, anti fungal และ hepatoprotective เปนตน (27-29) จากการทตนฟาทะลายโจรเปนพชสมนไพรพนบานทมการใชมาอยางแพรหลายและยาวนาน รวมถงผลการศกษาวจยทางวทยาศาสตรการแพทยเกยวกบฤทธทางเภสชวทยาทชดเจนและผลการศกษาความปลอดภยของการใช andrographolide (3) และสารสกดสมนไพรชนดน ท าใหทงสารสกดตนฟาทะลายโจรและ andrographolide (3) นาสนใจและเหมาะสมทจะสนบสนนการน าไปใชรกษาโรคตางๆ อยางจรงจง รวมถงการน าไปใชรวมกบยาทมอยปจจบนส าหรบรกษาผปวยวณโรคดวย

การแยกสารออกฤทธใหบรสทธจากสารสกดเหงาขาพบวา 1’acetoxychavicol acetate (4) เปนสารออกฤทธตานเชอวณโรคในพชนดน โดยผลการศกษาทไดตรงกบขอมลสทธบตรของ นพ. ประสทธ ผลตผลการพมพ และคณะ เรอง 1'-Acetoxychavicol acetate for tuberculosis treatment30 ขณะน 1’ acetoxychavicol acetate (4) อยในขนตอนการศกษากลไกการออกฤทธในเชอวณโรคโดย BIOTECH ซงความเขาใจเกยวกบกลไกการออกฤทธของสารนจะเปนประโยชนในการพฒนายาตานวณโรคไดในอนาคต31 นอกจากน 1’ acetoxychavicol acetate (4) แสดงฤทธยบยงการเพมจ านวนของเชอ human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) ในขน Rev transport โดยจบกบ chromosomal region maintenance 1 (CRM1) และขดขวางไมให full-length HIV-1 RNA ถกสงออกจาก nucleus ส cytoplasm ซงเปนผลใหไมเกดการเพมจ านวนของ HIV-1 ใน peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) และเสรมฤทธกบยาตาน HIV เชน didenosine (ddI) ดวย 32 การแยกสารออกฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยใหบรสทธจากสารสกดใบพลพบวา hydroxychavicol (5) และ chavibetol (6) เปนสารออกฤทธในใบพล ซงสารเหลานอยในกลม phenolic compounds โดย สารสกดจากใบพลซงมสารประกอบหลกเปน phenolic compounds มรายงานฤทธทางเภสชวทยา คอ antimicrobial activity ตอเชอหลายชนดดวยกน เชน Staphylococcus aureus, Escherichia coli, และ Malassezia

- 30 -

pachydermatis 33 นอกจากนในสวนของสารบรสทธ hydroxychavicol (5) มรายงานฤทธ antioxidant, anti-inflammatory และ antimicrobial activities ตอเชอในชองปากดวย โดย hydroxychavicol (5) แสดงฤทธ postantibiotic effect นานถง 6-7 ชวโมง ซงมความนาสนใจในการน าไปใชส าหรบพฒนาผลตภณฑดแลชองปากได34 การแยกสารออกฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยใหบรสทธจากสารสกดเอทานอลของตนกระดมไพลนพบวาisocentratherin (7) เปนสารออกฤทธหลก ขอมลการศกษาเกยวกบสารบรสทธทแสดงฤทธทางเภสชวทยาในพชชนดนมอยไมมากนก โดยมรายงานฤทธของสารสกดคอ antimicrobial, antioxidant และ cytotoxic 35-36 ส าหรบสาร isocentratherin (7) เปนสารในกลม sesquiterpene lactones ซงพบไดในพชหลายชนดดวยกนเชน Camchaya calcarea นอกจากนมรายงานถงฤทธในการยบยงการเจรญของเชอมาลาเรยของสารกลมนดวยดวย 37

เมอพจารณาเปรยบเทยบประเภทของสารออกฤทธตานวณโรคในการศกษานพบวา สารออกฤทธจากสารสกดเหงาขาและใบพลเปนสารในกลมเดยวกนคอ chavicol analogs โดยมโครงสรางหลกรวมกนดงภาพท 13 นอกจากนการศกษาฤทธของ hydroxychavicol (5) ซงไดเลอกใชเปนตวแทนของสารกลมนในการศกษาฤทธเมอใชรวมกบยาตานวณโรคในหลอดทดลอง พบวา hydroxychavicol (5) ใหผลเปน additive effect เมอใชรวมกบยา rifampicin และเปน indifferent effect เมอใชรวมกบยาอน ๆ ทท าการทดสอบ ซงผลการศกษาดงกลาวท าใหสารกลม chavicol analogs นาสนใจในการน าไปเปนสารตนแบบส าหรบการพฒนายาตานวณโรค

1’acetoxychavicol acetate (4) R1 = OAc , R2 = H , R3 = OAc Hydroxychavicol (5) R1 = OH , R2 = OH , R3 = H

Chavibetol (6) R1 = OCH3 , R2 = OH , R3 = H ภาพท 13 chavicol analogs

R1

R2

R3

- 31 -

สรปผลการวจย (conclusion)

การวจยและพฒนาสารตนแบบทางยาตานเชอวณโรคจากสมนไพร โดยคดเลอกพชพนบานและสมนไพรไทยอยางสม 100 ชนด มาท าการทดสอบพบวาสารสกดสมนไพร 14 ชนดไดแก ครอบจกรวาล กระดมไพลน ขา ฟาทะลายโจร พรก วานหอมแดง มะพด หญางวงชาง กระเพราแดง พล เลบมอนาง ทองพนชง โมกบาน และไพลด า แสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยมตอ M. bovis BCG ท MIC < 100 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยสมนไพรบางชนดนนมการกลาวอางสรรพคณเพอใชรกษาวณโรคดวย การทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรทไดนจงนบเปนการยนยนคณสมบตทางยาของสมนไพรดงกลาวส าหรบรกษาวณโรค และเปนหลกฐานทางวทยาศาสตรทจะสนบสนนการใชสมนไพรดงกลาวในต ารายาแผนโบราณ นอกจากนการคดเลอกพช 5 ชนด คอ หววานหอมแดง ตนฟาทะลายโจร เหงาขา ตนกระดมไพลน และ ใบพล มาสกดแยกเพอหาสารบรสทธทแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรย พบวา isoeleutherin (1) เปนหนงในสารออกฤทธหลกของหววานหอมแดง 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide (2) และ andrographolide (3) เปนสารออกฤทธในตนฟาทะลายโจร 1’ acetoxychavicol acetate (4) เปนสารออกฤทธในเหงาขา hydroxychavicol (5) และ chavibetol (6) เปนสารออกฤทธในใบพล และ isocentratherin (7) เปนสารออกฤทธหลกในตนกระดมไพลน ซงจากการศกษานพบวาพช 2 ชนด คอ เหงาขา และ ใบพล มสารออกฤทธตานวณโรคเปนสารกลมเดยวกนคอ chavicol analogs และเมอคดเลอกตวแทนของสารกลมนคอ hydroxychavicol (5) มาศกษาฤทธของสารเมอใชรวมกบยาตานวณโรคในหลอดทดลอง พบวาสารดงกลาวใหผลเปน additive effect เมอใชรวมกบยา rifampicin และไมรบกวนการแสดงฤทธตานเชอไมโคแบคทเรยมเมอใชรวมกบยาตานวณโรคอน ๆ ทท าการทดสอบ จากผลการศกษานท าใหสารกลม chavicol analogs นาสนใจในการน าไปเปนสารตนแบบส าหรบการพฒนายาตานวณโรคในล าดบตอไป

- 32 -

บรรณานกรม (References)

1. World Health Organization. Global tuberculosis control 2010. [Online]. 2010; [cited 2010 Dec 29]; [1 screen]. Available at URL: http://www.who.int/tb/publications/global_report/ 2010/en/index.html

2. World Health Organization. ANNEX 2 Global, regional and country-specific data for key indicator. [Online]. 2010; [cited 2010 Dec 29]; [148 page]. Available at URL: http://www.who.int/tb/ publications/global_report/2010/gtbr10_a2.pdf

3. Statistical Forecasting Bureau, National Statistical Office. Number of deaths by leading cause of death and sex whole kingdom : 2001-2008. [Online]. 2009; [cited 2010 Oct 22]; [1 screen]. Available at URL: http://service.nso.go.

4. International council of nurses. TB GUIDELINES for nurses in the care and control of tuberculosis and multi-drug resistant tuberculosis. 2nd Edition. [Online]. 2008; [cited 2010 Oct 22]; [1 screen].Available at URL: http:// www.inc.ch/tb/TB_MDRTB_Guideline.pdf, 2008

5. World Health Organization. Treatment of tuberculosis: guidelines 4th edition [Online]. 2010; [cited 2012 Oct 20]; [1 screen]. Available at URL: http://whqlibdoc.who.int/publications/ 2010/9789241547833_eng.pdf

6. Connolly LE, Edelstein PH, Ramakrishnan L. Why is long-term therapy required to cure tuberculosis? PLoS Med. 2007 ; 4 : 435-42.

7. Corbett EL, Watt CJ, Walker N, Maher D, Williams BG, Raviglione MC, et al. The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions with the HIV epidemic. Arch. Intern. Med. 2003 ; 163 : 1009-21.

8. scumdoctor.com. Herbal Plants Used For Tuberculosis Treatment. [Online]. 2006; [cited 2010 Dec 29]; [1 screen]. Available at URL: http://www.scumdoctor.com/disease-prevention/infectious-diseases/bacteria/tuberculosis/Herbal-Plants-Used-For-Tuberculosis -Treatment.html

9. Plants For A Future. TB: Plants used in the treatment of tuberculosis (54). [Online]. 2008; [cited 2010 Dec 29]; [1 screen]. Available at URL: http://server9.web-mania.com/users/ pfafardea/database/ search_use.php?K[]=TB

- 33 -

10. เงาธรรมทรรศน ว. ยาหมอ ท เขา ขมนชน หรอ วานชกมดลก ผสม อาจจะรกษาวณโรคดอยาไดด . [วรสารออนไลน]. 2552; [สบคน 29 ธนวาคม 2553]; [ 1 หนา]. เขาถงไดท URL: http://gotoknow.org/blog/9thai/281667

11. Chokevivat L, Chuthaputti A, Khumtrakul P. The Use of Traditional Medicine in the Thai Health Care System. [Online]. 2005; [cited 2011 May 29]; [1 screen] . Available at URL. http://www.searo.who. int/LinkFiles/Meetings_document09.pdf

12. Ahmed M, Amin S, Islam M, Takahashi M, Okuyama E, Hossain CF. Analgesic principle from Abutilon indicum. Pharmazie. 2000; 55:314-16.

13. Rajukar R, Jain R, Matake N, Aswar R, Khadbadi SS. Anti-inflammatory action of Abutilon indicum(L.) Sweet Leaves by HRBC membrane stabilixation Research J. Pharm. And Tech. 2009; 2: 415-16.

14. Nirmaladevi R, Padma PR, Kavitha D, Analyses of the methanolic extract of the leaves of Rhinacanthus nasutus. J. Med. Plant. Res. 2010; 4: 1554-60.

15. Caviedes L, Delgado J, Gilman RH. Tetrazolium Microplate Assay as a Rapid and Inexpensive Colorimetric Method for Determination of Antibiotic Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 2002 ; 40: 1873-74.

16. Hall MJ, Middleton RF, Westmacott D. The fractional inhibitory concentration (FIC) index as a measure of synergy. J. Antimicrob. Chemother. 1983; 11: 427-33.

17. Angeby KA, Klintz L, Hoffner SE. Nitrate Reductase Assay for Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis J. Clin. Microbiol. 2002 ; 40 : 553-55.

18. Palomino JC, Martin A, Camacho M, Guerra H, Swings J, Portaels F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2002 ; 46 :, 2720-22.

19. Franzblau SG, Witzig RS, McLaughlin JC, Torres P, Madico G, Hernandez A, et al. Rapid, low-technology MIC determination with clinical Mycobacterium tuberculosis isolates by using the microplate Alamar Blue assay. J. Clin. Microbiol. 1998 ; 36 : 362-66.

20. Taneja NK, Tyagi JS. Resazurin reduction assays for screening of anti-tubercular compounds against dormant and actively growing Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis. J. Antimicrob. Chemother. 2007; 60: 288-93.

- 34 -

21. Chung GAC, Aktar Z, Jackson S, Duncan K. High-Throughput Screen for Detecting Antimycobacterial Agents. Antimicrob. Agents Chemother. 1995 ; 39 : 2235-38.

22. Oonmetta-aree J, Suzuki T, Gasaluck P, Eumkeb G. Antimicrobial properties and action of galangal (Alpinia galangal Linn.) on Staphylococcus aureus. LWT 2006; 39; 1214-20.

23. Machan T, Korth J, Liaeruangrath B, Liawruangrath S, Pyne SG. Composition and antituberculosis activity of the bolatile oil of Heliotropium indicum Linn. Growing in Phisanulok Thailand. Flav. Prag. J. 2006; 21: 265-67.

24. Fariva TN, Fara AHM, Zahedani SS, Naderi M, Moud BS, Anti tuberculosis of Ocinum sanctum extract in in vitro and macrophage culture. J. Med. Sci. 2006; 6: 348-51.

25. Hara H, Mauyama N, Yamashita S, Hayashi Y, Lee KH, Bastow KF, Chairul, Marumoto R, Imakura Y. Elecanacin, a novel new naphthoquinone rom the bulb of Eleutherin americana. Chem. Pharm. Bull. 1997; 45:1714-16.

26. Hong JH, Yu ES, Han AR, Nam JW, Seo EK, Hwang ES. Isoeleutherin and eleutherinol, naturally occurring selective modulator Th cell-mediated immune responses. Biochem. Biophy. Res. Comm. 2008; 371:278-82.

27. สรรพคณ...สมนไพร. ฟาทะลายโจร. [วรสารออนไลน]. 2544; [สบคน 9 มกราคม 2554]; [ 1 หนา]. เขาถงไดท URL: http://www.rspg.or.th/plants_data/herbs/herbs_07_8.htm

28. Akbar S. Andrpgraphis paniculata: A review of pharmacological activities and clinical effects. Alt Med Rev. 2011; 16: 66-77.

29. Niranjan A, Tewari SK, Lehri A. Biological activities of Kalmegh (Andrographis paniculata Nees) and its active principles- A review. Indian J Nat Resour. 2010; 1(2): 125-35.

30. Palittapongarnpim P, Kirdmanee C, Kittakoop P, Ruksaree K. 1’-acetoxychavicol acetate for tuberculosis treatment. United States Patent application no. 2002192262.

31. Warit S. A wish list of new anti-tuberculous candidate agents. Sririraj Med J. 2009; 61: 34-6. 32. Ye Y, Li B. 1’S-1’-Acetoxychavicol acetate isolated from Alpinia galangal inhibits human

immunodeficiency virus type 1 replication by blocking Rev transport. J Gen virol. 2006; 87:2047-53.

33. Row LCM., Ho JC. The antimicrobial activity, mosquito larvicidal activity, antioxidant property and tyrosinase inhibition of Piper betle J. Chin. Chem Soc. 2009; 56: 653-58.

- 35 -

34. Sharma S., Khan IA., Ali I., et. al. Evaluation of the antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory activities of hydroxychavicol for its potential use as an oral care agent. Antimicrob. Agents. Chemother. 2009; 53: 216-22.

35. Arumugam N., Kumarpawar N. Leaf extract of Centratherum panctatum exhibits antimicrobial, antioxidant and anti proliferative properties. Asian J Pharm Clin Res. 2011; 4: 71-76.

36. Brindha P., Sivasubramanian R. In vitro cytotoxic, antioxidant and GC_MS studies on Centratherum punctatuc Cass. Int J Pharm Pharm Sci. 2013; 5: 364-67.

37. Bero J., Frederich M., Quetin-Leclercq J. Antimalaria compounds isolated from plants used in traditional medicine. J. Pharm. Phama. 2009; 61: 1401-33.