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CANTHAXANTHIN AS A LIPID SOLUBLE ANTIOXIDANT IN AN OXYMYOGLOBIN LIPOSOME MODEL SYSTEM T.H. CLARK, C.L. FAUSTMAN, J.W. RIESEN, W.K.M. CHAN AND H.C. FURRD e p t , o f A n i m a l S c i e n c e , U n i v . o f C t . , S t o r r s , C T , 0 6 2 6 9 , U S A

KEYWORDS: a n t i o x i d a n t , c a r o t e n o i d s , c a n t h a x a n t h i n , l i p o s o m e

BACKGROUND: C a n t h a x a n t h i n , a l i p i d - s o l u b l e c a r o t e n o i d , h a s b e e n s h o w n t o f u n c t i o n a s a c h a i n - b r e a k i n g a n t i o x i d a n t i n a l i p o s o m e m o d e l s y s t e m ( L im e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n m e a t , b o t h o x y m y o g l o b i n a n d l i p i d o x i d i z e o v e r t i m e r e s u l t i n g i n d i s c o l o r a t i o n , a n d d e v e l o p m e n t o f o f f f l a v o r s a n d u n d e s i r a b l e o d o r s , r e s p e c t i v e l y ( G r e e n e , 1 9 6 9 ; K a n n e r a n d H a r e l , 1 9 8 5 ) . V i t a m i n E , l i k e c a n t h a x a n t h i n i s l i p i d - s o l u b l e , a n d h a s b e e n s h o w n t o b e a p o t e n t a n t i o x i d a n t i n m e a t a n d m e a t - r e l a t e d s y s t e m s ( F a u s t m a n , 1 9 9 3 ) . C a r o t e n o i d s a r e t y p i c a l l y u s e d f o r p i g m e n t a t i o n o f m u s c le - b a s e d f o o d s ( e . g . s a l m o n i d s ) ; t h e i r p o t e n t i a l e f f i c a c y f o r d e l a y i n g o x i d a t i o n o f o x y m y o g l o b i n a n d l i p i d i n m u s c le f o o d s i s u n c l e a r .

OBJECTIVES: T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t i v e n e s s o f c a n t h a x a n t h i n a s a n a n t i o x i d a n t i n a n o x y m y o g l o b i n - l i p o s o m e m o d e l .

METHODS . , , ,Liposome Preparation C a n t h a x a n t h i n (C X ) a n d e g g y o l k p h o s p h a t i d y l c h o l i n e (P C ) w e r e o b t a i n e d c o m m e r c i a l l y . L ip o s o m e s w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o N e w ( 1 9 9 0 ) i n c h l o r o f o r m / m e t h a n o l ( 2 : 1 ; v / v ) . T h r e e m g d i c e t y l p h o s p h a t e a n d 1 2 m g c h o l e s t e r o l w e r e d i s s o l v e d i n a r o u n d b o t t o m f l a s k c o n t a i n i n g 3 0 m g P C , t h e a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n o t C X , a n d 5 m L s o l v e n t . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d u n d e r n i t r o g e n w i t h a r o t a r y e v a p o r a t o r t o

f o r m a t h i n l i p i d f i l m . . ^ _ , „ , . QOxymyoglobin Preparation O x y m y o g l o b i n (O x y M b ) w a s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o B r o w n a n d M e b m e ( 1 9 6 9 ) . M e t m y o g lo b i n (M e tM b ) w a s p r e p a r e d i n 1 0 m L s o d iu m c i t r a t e b u f f e r (5 0 mM, p H 5 . 6 )

a n d c h e m i c a l l y r e d u c e d w i t h s o d iu m h y d r o s u l f i t e . T h e O x y M b s o l u t i o n w a s o x y g e n a t e d , a n d r e s i d u a l h y d r o s u l f i t e r e m o v e d b y m i x e d - b e d i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . T h e c o n c e n t r a t i o n o f O x y M b w a s a d j u s t e d t o 2 . 5 m g /m L (E 525 = 7 . 6 m M ^ c m "1) . T h e O x y M b p r e p a r a t i o n o r s o d iu m c i t r a t e ( c o n t r o l ) w a s a d d e d t o t h e p r e v i o u s l y p r e p a r e d l i p i d f i l m s . W i t h o n e m g g l a s s b e a d s (1 mm d i a . ) . O x y M b - l i p o s o m e s w e r e f o r m e d b y m e c h a n i c a l s h a k i n g a t 5 °C f o r 2 0 m m o n a t a b l e t o p s h a k e r a n d a l l o w e d t o s t a n d f o r 2 0 m in b e f o r e o x i d a t i o n m e a s u r e m e n t s . Measurement of OxyMB-Liposome Oxidation A l l a s s a y s w e r e i n c u b a t e d a t 3 0 °C f o r a m a x im u m p e r i o d o f 5 h r s . A l i q u o t s ( lm L ) w e r e r e m o v e d f r o m e a c h a s s a y h o u r l y a n d o x i d a t i o n o f O x y M b a n d l i p i d d e t e r m i n e d . T h e K r z y w i c k i ( 1 9 8 2 ) m e t h o d w a s u s e d t o d e t e r m i n e m e t m y o g lo b i n f o r m a t i o n a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( Y i n a n d F a u s t m a n , 1 9 9 3 ) . F o r l i p i d o x i d a t i o n , t h e TB A R S a s s a y o f S c h m e d e s a n d H o lm e r ( 1 9 8 9 ) w a s u s e d . B r i e f l y , 1 m L m y o g l o b i n - l i p o s o m e s o l u t i o n w a s c o m b in e d w i t h 2 m L 20% t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . T h e r e s u l t i n g s o l u t i o n w a s c e n t r i f u g e d a t 2 0 0 0 g f o r 1 0 m in a t 4 ° C . O n e m L o f t h e s u p e r n a t a n w a s a d d e d t o 1 m L 2 0 mM a q u e o u s t h i o b a r b i t u r i c a c i d a n d i n c u b a t e d a t 2 5 °C f o r 2 0 h r s . T h e a b s o r b a n c e a t 5 3 2 nm w a s r e c o r d e d a n d r e p o r t e d a s T B A R S .Statistical Analysis D a t a w e r e t r e a t e d b y a n a l y s i s o f v a r i a n c e (A N O V A ) a n d c o m p u t e d u s i n g t h e S AS G e n e r a l L i n e a r M o d e l (G LM ) p r o c e d u r e (S A S , 1 9 8 5 ) .

RESULTS AND DISCUSSIONT r i p l i c a t e a s s a y s o f e a c h t r e a t m e n t w e r e a n a l y z e d o n t h r e e d i f f e r e n t d a y s . T r e a t m e n

e f f e c t s a r e d e s c r i b e d b e l o w . T h e r e w e r e n o d i f f e r e n c e s f o u n d b e t w e e n d a y s ( p > 0 . 0 5 ) . T h e r e f o r e , t h e f i g u r e s p r e s e n t e d a r e a s i n g l e d a y ' s r e s u l t s r e p r e s e n t a t i v e o f o b s e r v e d

b e h a v i o r . „ , , _ „F i g u r e s 1 a n d 2 i l l u s t r a t e a t y p i c a l o x i d a t i o n s e q u e n c e o f c o n t r o l a n d 2 uM L X

t r e a t m e n t . A t 2 u M , CX t r e a t m e n t r e s u l t e d i n a r e d u c t i o n i n o v e r a l l M e tM b f o r m a t i o n b e t w e e n h o u r s 2 a n d 3 o f i n c u b a t i o n a t 3 0 °C ( p < 0 . 0 5 ; F i g . 1 ) . A t h o u r s 2 a n d 3 , t h e p e r c e n t M e tM b i n t h e CX a s s a y s w a s 9% a n d 6 % l e s s t h a n i n t h e c o n t r o l , r e s p e c t i v e l y . T h e i n d u c t i o n p e r i o d w a s p r o l o n g e d i n l i p i d o x i d a t i o n ( p < 0 . 0 5 ; F i g . 2 ) . T h e r e a p p e a r e d t o b e a s t r o n g e r a n t i o x i d a n t e f f e c t o f C X o n l i p i d o x i d a t i o n t h a n o n i n h i b i t i o n o f M e tM b f o r m a t i o n . P a l o z z a a n d K r i n s k y ( 1 9 9 2 ) a l s o s h o w e d t h a t CX w a s e f f e c t i v e a s a n a n t i o x i d a n t o n c h e m i c a l l y i n i t i a t e d l i p i d p e r o x i d a t i o n i n r a t l i v e r m ic r o s o m e s a s m o n i t o r e d b ym a lo n a l d e h y d e (M D A ) p r o d u c t i o n . . . . . =T._

T h e e f f e c t o f CX a t v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o n M e tM b f o r m a t i o n a n d l i p i d o x i d a t i o n a r p r e s e n t e d i n F i g u r e s 3 a n d 4 , r e s p e c t i v e l y . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f CX w a s v a r i e d f r o m 2 t o 1 0 u M , i t s a n t i o x i d a n t a c t i v i t y w a s i n c r e a s e d ( p < 0 . 0 5 ) . A t h o u r s 2 a n d 3 , t h e ̂a n t i o x i d a n t a c t i v i t y w a s c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t (2 uM < 5 uM < 1 0 u M ) . T h e r e w a s 18% a n 12% p e r c e n t l o w e r M e tM b a t h o u r s 2 a n d 3 , r e s p e c t i v e l y , o b s e r v e d w i t h 1 0 uM C X t h a n w i t h t h e c o n t r o l ( F i g . 3 ) . A g a i n , CX a p p e a r e d t o h a v e a s t r o n g e r e f f e c t i n i n h i b i t i n g l i p i d o x i d a t i o n ( F i g . 4 ) . T h e r e w a s a p p r o x i m a t e l y a 4 - f o l d d e c r e a s e i n TB A R S a t h o u r 2 ; a n d a t h o u r 3 , a 2 . 5 - f o l d d e c r e a s e i n t h e 1 0 uM CX t r e a t m e n t w h e n c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l . T h e e f f e c t s o f CX a g r e e w i t h r e s u l t s o f M a y n e a n d P a r k e r ( 1 9 8 9 ) w h i c h s h o w e d t h a t CX w a s e f f e c t i v e i n p r o t e c t i n g a g a i n s t l i p i d o x i d a t i o n i n c h i c k s s u p p l e m e n t e d w i t h C X . T h e a u t h o r s u s e d c h e m i c a l l y i n t i a t e d p e r o x i d i z e d l i v e r h o m o g e n a t e s a n d m e a s u r e d o x i d a t i o n a t v a r y i n g p a r t i a l o x y g e n p r e s s u r e s ; n o a t t e n t i o n w a s g i v e n t o h e m e p r o t e i n o x i d a t i o n .

CONCLUSIONS _ , „ , , . .I n a m y o g l o b i n l i p o s o m e m o d e l s y s t e m , C X d e l a y e d o x i d a t i o n o f O x y M b a n d l i p i d . W h e n

i n c u b a t e d a t 3 0 °C a t v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s , CX w a s m o r e e f f e c t i v e a t 1 0 uM t h a n a t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s d u r i n g t h e s e c o n d a n d t h i r d h o u r o f i n c u b a t i o n .

400

Referencesr ° Wn W .D . a n d M e b in e L . B . 1 9 6 9 . A u t o x i d a t i o n o f o x y m y o g l o b i n . J . B i o l . C h e m . 2 4 4 : 6 6 9 6 -

Pa 6 7 0 1 •u s tm a n C . 1 9 9 3 . F o o d f r o m s u p p l e m e n t - f e d a n i m a l s . C h . 8 . I n T e c h n o lo g y o f R edu ced -

q A d d i t i v e Foods, J . S m i t h ( E d . ) , p . 1 6 0 - 1 9 4 . B l a c k i e P u b l . , L o n d o n . e e n e B . E . 1 9 6 9 . L i p i d o x i d a t i o n a n d p i g m e n t c h a n g e s i n r a w b e e f . J . F o o d S c i . 3 4 : 1 1 0 -

K 113 •an n e r j . a n d H a r e l S . 1 9 8 5 . I n i t i a t i o n o f m e m b r a n a l l i p i d p e r o x i d a t i o n b y a c t i v a t e d

j. m e t m y o g lo b i n a n d m e t h e m o g l o b i n . A r c h . B io c h e m . B i o p h y s . 2 3 7 : 3 1 4 - 3 2 1 .z y w i c k i K . 1 9 8 2 . T h e d e t e r m i n a t i o n o f h a e m p i g m e n t s i n m e a t . M e a t S c i . 7 : 2 9 - 3 6 . m B - P . , N a g a o A . , T e r a o J . , T a n a k a K . ( S u z u k i T . a n d T a k a m a K . 1 9 9 2 . A n t i o x i d a n t

a c t i v i t y o f x a n t h o p h y l l s o n p e r o x y l r a d i c a l - m e d i a t e d p h o s p h o l i p i d p e r o x i d a t i o n , w E i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 1 1 2 6 : 1 7 8 - 1 8 4 .

V ne S . T . a n d P a r k e r R . S . 1 9 8 9 . A n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f d i e t a r y c a n t h a x a n t h i n . N u t r .(j C a n e . 1 2 : 2 2 5 - 2 3 6 .

w R . R . C . 1 9 9 0 . P r e p a r a t i o n o f l i p o s o m e s . C h . 2 . I n L ip o so m es , R . R . C . N e w ( E d . ) , p . 3 3 - p . 1 0 4 . I R L P r e s s , N e w Y o r k .

0 z z a P . a n d K r i n s k y N . I . 1 9 9 2 . A s t a x a n t h i n a n d c a n t h a x a n t h i n a r e p o t e n t a n t i o x i d a n t s i n s m e m b ra n e m o d e l . A r c h . B io c h e m . B i o p h y s . 2 9 7 : 2 9 1 - 2 9 5 .

u m e d e s A . a n d H o lm e r G . 1 9 8 9 . A n e w t h i o b a r b i t u r i c a c i d (T B A ) m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f f r e e m a lo n a l d e h y d e (M D A ) a n d h y d r o p e r o x i d e s s e l e c t i v e l y a s a m e a s u r e o f l i p i d P e r o x i d a t i o n . J . A m . O i l . C h e m . S o c . 6 6 : 8 1 3 - 8 1 7 .

M . a n d F a u s t m a n C . 1 9 9 3 . I n f l u e n c e o f t e m p e r a t u r e , p H , a n d p h o s p h o l i p i d c o m p o s i t i o n u p o n t h e s t a b i l i t y o f m y o g l o b i n a n d p h o s p h o l i p i d : A l i p o s o m e m o d e l . J . A g r i . F o o d C h e m . 4 1 : 8 5 3 - 8 5 7 .

1 • T h e e f f e c t o f 2 uM c a n t h a x a n t h i n ( C x ) o n M e tM b f o r m a t i o n i n a l i p o s o m e m o d e l y s t em i n c u b a t e d a t 3 0 ° C , p H 5 . 6 .

Ficrj 2 . T h e e f f e c t o f 2 uM C x o n l i p i d o x i d a t i o n i n a l i p o s o m e m o d e l s y s t e m f o l l o w i n g l t l c U b a t i o n a t 3 0 ° C , p H 5 .6 .

i n 53' , 3 ’ T ' l e e f f e c t s o f 0 , 2 , 5 , a n d 1 0 uM C X o n M e tM b f o r m a t i o n a t h o u r s 2 a n d 3 o f 3 0 °C n c u b a t i o n , p H 5 . 6 .

i n H \ ^ ‘ e f f e c t s o f 0 , 2 , 5 , a n d 1 0 uM C X o n l i p i d o x i d a t i o n a t h o u r s 2 a n d 3 o f 3 0 °CCub a t i o n , p H 5 . 6 .

Fi9 - 3 Time(hr) F'9 4 Time(hr)