Capacidad de detección y caracterización de agentes patógenos por secuenciación de ácidos nucleicos

Dr. Ernesto RamírezBiología Molecular,

InDRE-Salud, Mexico

Caracterización Molecular del virus de la Influenza H7

http://www.patentlens.net/

Publicado por emulenews el 7 Mayo 2009

El genoma del Virus influenza A tiene un tamaño total de 13,588 bases, está contenido en ocho cadenas sencillas (no apareadas) de RNA que codifican diez proteínas:

ESTRUCTURA GENÓMICA

MARCADOR RESULTADOINF A POSH1SW NEGRP NEGH1 NEGH3 NEGH5 NEGH7 POS

MARCADOR INF A CT: 16.3

MARCADOR H7CT: 17.5

Resultado de la muestra procedente de ave

Diagnóstico molecular de influenza por qRT-PCR

http://www.patentlens.net/

38995 H1N1pdm

3665 ed 15 DIC H1N1

39587 H1N1pdm 38713 H1N1pdm

3814

4 H1N

1pdm

1048

9 H1

N1p

dm

1046

6 H

1N1p

dm10

459

H1N

1pdm

1043

7 H1

N1pd

m

A/go

ose/

Hun

gary

/282

3/2/

2007

(H5N

1)H

1gen

M 1

5 se

p

C1

H1N

1sea

s

C2 H1N1seas

C3 H1N1seas

11145 H3N2seas

4773 ed H3N2est

38567 H3N2seas

3244 H3N2seas

H3genM

15 sep

315422537|gb|CY078724.1(H10N59)

3362

8645

0|gb|J

N0870

83.1(

H3N6)

1679

9678

5|gb

|EU3

0125

2.1(

H3N8

)1M e

d

388595406|gb|CY120540.1(H7N3)

386643074|gb|CY116784.1(H2N9)343971741|gb|CY097302.1(H10N1)

340542003|gb|CY094446.1(H1N2)

194310608|gb|CY033423.1(H6N1)

0.005

Árbol Filogenético utilizando secuencias parciales del gen M de los Subtipos H1N1 estacional, H3N2, H1N1pdm y H5N1. El virus Influenza B carece de matriz (genM)

0000

000000

0000

0

H1N1 Estacional

H1N1 PandémicoH5N1

H3N2ORIGEN AVIAR

Gen de Matriz

ANALISIS CON BLASTn DE LA SECUENCIA LA HEMAGLUTININA. RESULTADO : SUBTIPO H7

Genotipificación de Hemaglutinina

H7A NA M13

H7N3 BritishColumbia Chicken 2004 AY650272.1

H7N3 NJ Chicken 1994 AY300950.1

H7N3 Chile chicken 2002 GU053047.1

H7N3 England Turkey 1963 AY207513.1

H7N3 Victoria Chicken 1992 CY025079.1

H7N3 Queensland Chicken 1994 CY022687.1

H7N3 Netherlands Mallard 2000 CY005846.1

H7N3 Pakistan Chicken 1995 FJ577512.1

H5N3 HongKong Duck 1977 CY005591.1

96

7177

95

88

34

29

0.02

Europa - Asia

América

Genotipificación de Neuraminidasa

CONCLUSIONES

HEMAGLUTININA: SUBTIPO H7

NEURAMINIDASA: SUBTIPO N3

MATRIZ: ORIGEN AVIAR

Tiempo de análisis: < 12 horas

Diagnóstico de Patógenos Desconocidos

Metagenómica

Secuenciación y análisis del contenido genómico de una mezcla compleja microbiana a partir de un ambiente

• Cribado de los diferentes microorganismos presentes en una muestra específica

• Sin conocimiento a priori de los mismos

• Sin necesidad de cultivarlos

• Análisis por secuenciación del material genético microbiano extraído directamente

Svraka, S., et al. (2010). Journal of General Virology 91: 2846-2856Edwards R. A. & Rohwer F. (2005).Nature Reviews Microbiology 3:504–510

Secuenciación de DNA: el método de Sanger Dideoxinucleótidos terminadores (ddNTP), marcados con 4 fluoróforos distintos, uno para cada nucleótido

Sanger F, at al. (1977) PNAS. 74:5463-5467

http://images.the-scientist.com/content/figures/

NGS Next Generation Sequencing Tecnologías de secuenciación de siguiente

generación

•Eliminan la necesidad de clonar fragmentos de DNA en bacterias

•Permiten la secuenciación masiva paralela: se generan cientos de miles de reacciones de secuencia en paralelo.

•Existen diversas plataformas para llevar a cabo este proceso.

Palacios, G., et al. New. Engl.J. of Med. 358: 991-98

Método de secuenciación masiva en paralelo

Estudio MetagenEstudio Metagenóómico de Patmico de Patóógenos en genos en Exudado FarExudado Farííngeo Mediante Secuenciacingeo Mediante Secuenciacióón n

Masiva ParalelaMasiva Paralela

PerlasPerlas y y reactivosreactivos de PCR en los de PCR en los microreactoresmicroreactores de de aguaagua y y aceiteaceite. en . en emulsiemulsióónn

EnriquecimientoEnriquecimiento de de perlasperlas..

AmplificaciAmplificacióón Clonaln Clonal

La La amplificaciamplificacióónn clonalclonal ocurreocurre en los en los microreactoresmicroreactores..

AnAnáálisis de lisis de SecuenciasSecuencias

PGM Ion TorrentPGM Ion Torrent

––

Ion Chip 314 Ion Chip 314

10 Mb10 Mb

Perlas de la genotecaPerlas de la genoteca 500, 598500, 598

NNúúmero total de basesmero total de bases 28.58Mpb28.58Mpb

NNúúmero de lecturasmero de lecturas 253,210253,210

Longitud PromedioLongitud Promedio 113pb113pb

Lecturas mLecturas máás largas larga 174pb174pb

Tabla: Resultados de secuenciaciTabla: Resultados de secuenciacióón plataforma Ion Torrentn plataforma Ion Torrent

Ensamble Ensamble de novo de novo BBúúsqueda de identidadsqueda de identidad

Estudio metagenómico de patógenos en líquido cefalorraquídeo de pacientes con meningoencefalitis

Obtención del genoma completo del Virus de Varicela-Zoster genotipo M4 mediante secuenciación masiva

paralela

Gracias