capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (salmon et al....

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Capacité an variations intr Maîtres Camille M ntioxydante chez les hélic raspécifiques et interspéc de stage : Jacqueline Russo et Luc Madec UMR 6553, équipe S.C.A. e LETELLIER Master 2 EFCE cidés : cifiques.

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Page 1: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

Capacité antioxydant

variations intraspécifiques

Maîtres de stage

Camille LETELLIER

Master 2 EFCE

antioxydante chez les hélicidés

intraspécifiques et interspécifiques

Maîtres de stage : Jacqueline Russo et Luc Madec

UMR 6553, équipe S.C.A.

Camille LETELLIER

Master 2 EFCE

e chez les hélicidés :

interspécifiques.

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1

Sommaire :

Remerciements…………………………………………………………………………………2

Introduction…………………………………………………………………………………….3

Matériel et méthodes…………………………………………………………………………...6

Matériel biologique…………………………………………………………………….6

Traitements……………………………………………………………………………..6

Prélèvement de l’hémolymphe…………………………………………………………7

Prélèvement de la glande digestive…………………………………………………….8

Mesure de la capacité antioxydante………………………………………………...…8

Analyses statistiques…………………………………………………………………...9

Résultats………………………………………………………………………………………10

Effets du traitement…………………………………………………………………..10

Comparaison intraspécifique………………………………………………………….11

Hémolymphe……………………………………………………………….…11

Glande digestive……………………………………………………………....13

Comparaison interspécifique………………………………………………………….14

Hémolymphe………………………………………………………………….14

Glande digestive………………………………………………………………15

Discussion……………………………………………………………………………………16

Bibliographie…………………………………………………………………………………23

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Remerciements

Pour ses corrections, ses conseils, son soutien, son sourire et son savoir faire, je tiens à

remercier Jacqueline Russo, sans qui le sens du mot semi-statique me serait encore inconnu !

Pour ses statistiques, ses conseils, ses corrections et bien sûr ses approvisionnements en

escargots, merci à Luc Madec, qui sait donner un sens aux tests de Tukey ! Il est difficile

d’imaginer un cocktail de maîtres de stages plus détonnant et plus décalé, et pourtant je leur

dois tout.

Je tiens à remercier Delphine, étudiante de master 1, qui, même si elle est « toute petite », m’a

apporté une grande aide pendant les manips, un grand soutien pendant la rédaction du rapport,

mais a également su remettre au goût du jour des chansons oubliées en les marmonnant dans

le labo à 9h le lundi matin, pour mon plus grand malheur. Mille mercis à la fille sans gants qui

parle à ses glandes digestives en les disséquant…

Merci à Jean-Sébastien Pierre pour son coup de main lorsque les tests ne voulaient plus tester,

à Valérie Briand pour son énergie toujours à disposition lorsqu’une publi est introuvable,

merci à Marie-André Esnault pour ses conseils précieux, et merci aux nombreuses personnes

qui m’ont prêté des cônes pour la multi-pipette lorsque tous les fournisseurs semblaient être

en rupture de stock ! Je remercie Armelle Ansart d’avoir réussi à nous supporter, Delphine et

moi, quand les vapeurs d’éthanol et la fièvre du labo s’étaient emparées de nous. Merci à

Christine qui se bat dans l’ombre pour tous les stagiaires du labo, et qui est toujours là pour

nous remonter le moral quand les manips ne marchent pas.

Merci à Amaury, Guillaume, Julia, Michel, Natacha, Pauline, Pop’s, Quentin et Thiago pour

les pauses et la bonne humeur tous les midis ou presque ! Merci pour les soirées entre deux

manips histoire de se sortir la tête de la paillasse.

Enfin, un grand merci à ceux sans qui aucune étude n’aurait été possible, les quelques 600

braves hélicidés, Cornu et Cepaea, les petits-gris et les gros roses, qui ont donné leur vies pour

que je fasse mon stage !

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Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ERO), produits normaux du métabolisme aérobie, sont à

l’origine de dommages cellulaires lorsqu’elles sont produites en quantité excessive et qu’elles

provoquent un stress oxydant. Selon Storey (1996), face à la cytotoxicité des espèces réactives

de l’oxygène, trois niveaux de protection sont envisageables : la prévention de la formation

d’ERO, la neutralisation des ERO par production de défenses antioxydantes et la réparation

des dommages cellulaires engendrés après le stress oxydant, cette dernière éventualité n’ayant

encore jamais été mise en évidence.

Pour lutter contre le stress oxydant, les organismes ont donc développé des défenses

antioxydantes. Ces défenses peuvent être enzymatiques, ce sont les enzymes antioxydantes

telles que la superoxyde dismutase, la catalase et les glutathion peroxydases qui ont pour rôle

d’interrompre les réactions en chaîne produites par les espèces réactives de l’oxygène. Elles

peuvent également être non enzymatiques, ce sont alors des piégeurs de radicaux qui agissent

comme réducteurs ou qui viennent renforcer l’action des enzymes antioxydantes. Ces

molécules sont les vitamines A, C et E, de loin l’antioxydant le plus largement distribué dans

la nature ; un autre piégeur de radicaux est le glutathion qui est présent majoritairement à

l’état réduit (GSH) dans les cellules mais dont la forme oxydée (GSSG) est indicative d’un

stress oxydant.

Les espèces réactives de l’oxygène sont impliquées, par le biais de la respiration dans toutes

les fonctions physiologiques chez les organismes aérobies. En effet, malgré leurs effets

délétères sur l’organisme, les ERO peuvent être utilisées par les animaux comme défenses

immunitaires et agissent notamment lors de la phagocytose des pathogènes (Adema et al.,

1991). Les espèces réactives de l’oxygène sont aussi impliquées dans des trade-offs. Ainsi

chez le criquet méditerranéen Gryllus bimaculatus, il a pu être démontré que l’investissement

de l’énergie dans la défense immunitaire se répercute sur la durée de développement et la

taille des individus (Rantala et Roff, 2005). Chez la drosophile, la reproduction entraîne une

susceptibilité accrue au stress oxydant, ce qui conduit à un trade-off entre reproduction et

défense antioxydante (Salmon et al., 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum, des trade-offs

entre défense immunitaire et croissance, maturité sexuelle et reproduction ont également été

mis en évidence (Février et al., 2009). En définitive, les ERO sont au centre d’un paradoxe

entre effets bénéfiques et effets délétères.

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Les facteurs pouvant entraîner une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène sont variés

et peuvent être d’origine biotique (pathogènes, compétition, etc.) ou abiotique (stress

hydrique, hyalin, anoxique, thermique, chimique). El-Gendy et al. (2009) ont montré chez

l’escargot Theba pisana que l’exposition à un pesticide à base de cuivre entraînait la

production d’espèces réactives de l’oxygène ainsi que l’augmentation de la production de

défenses antioxydantes. Les xénobiotiques (métaux lourds, pesticides) sont ainsi une des

causes majeures de stress oxydant. Chez les invertébrés, les mollusques marins ont été

largement utilisés comme modèle d’étude pour mettre en évidence des biomarqueurs de la

pollution environnementale. Ainsi, Borcovíc et al. (2005) ont montré que la production

d’enzymes antioxydantes chez la moule méditerranéenne Mytilus galloprovincialis était

influencée par la présence de polluants industriels dans l’environnement.

La mesure de l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPX) constitue donc un marqueur

du dérèglement des systèmes biologiques qui permet d’évaluer indirectement le statut

antioxydant d’un individu. Les mesures des activités non enzymatiques (vitamine E) mais

également d’expression des gènes sensibles sont également des marqueurs de ce statut

antioxydant.

Chez l’escargot petit-gris Cornu aspersum, Regoli et al. (2006) ont utilisé la capacité

antioxydante totale pour étudier les effets éco-toxicologiques de la pollution urbaine. Cette

mesure, visant à mettre en évidence la présence de molécules antioxydantes non-

enzymatiques dans l’organisme, a permis d’utiliser C. aspersum comme une espèce sentinelle

pour ce type de pollution.

En Europe, et notamment en France, l’escargot petit-gris est connu pour sa capacité à

coloniser les environnements anthropisés, des jardins urbains aux cultures intensives. Les

pesticides utilisés pour la plupart stimulent la production d’espèces réactives de l’oxygène.

L’escargot petit-gris vivant dans des environnements pollués, ne rentre pas dans la catégorie

des espèces évitant l’exposition au stress oxydant (Storey 1996) puisqu’il est constamment

contraint de s’exposer à la sécrétion d’ERO de par son habitat. Se pose donc la question de

savoir si l’escargot subit un stress oxydant en raison d’un déficit en antioxydants endogènes

ou exogènes (c’est-à-dire un déficit nutritionnel), ou s’il s’adapte par la mise en jeu de survie

cellulaire ou par la surexpression enzymatique. Une adaptation, ou tout au moins une forte

plasticité phénotypique, de la part de C. aspersum face à ces environnements pollués, devrait

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donc générer une forte production de défenses antioxydantes ou des capacités importantes de

réparations des dommages cellulaires.

Le but de cette étude est de comprendre comment ces escargots s’adaptent à la toxicité de

leur environnement, et si leur activité antioxydante fait partie des mécanismes physiologiques

spécifiques intervenant dans l’interaction organisme-environnement.

Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la capacité antioxydante des escargots de

deux espèces d’hélicidés vivant souvent en sympatrie : le petit-gris Cornu aspersum, dont les

échantillons proviennent de sites non pollués ou plus ou moins touchés par la pollution, et

l’escargot des haies Cepaea nemoralis également commun en Europe mais ne colonisant pas

les zones fortement anthropisées ou les sites agricoles. Le but de cette étude est de mettre en

évidence la présence ou l’absence de variations intra et interspécifiques de la capacité

antioxydante.

Les escargots étudiés ont un régime végétarien. Ils sont également en contact direct avec les

polluants présents sur le sol via leur pied. Les polluants entrent donc dans l’organisme par

différentes voies et sont finalement transportés par les cellules sanguines vers la glande

digestive, qui représente le principal organe cible pour les processus métaboliques et de

détoxification. Dans la glande digestive, peuvent avoir lieu des phénomènes d’accumulation

des métaux, surtout sur de longues périodes.

Chez les mollusques gastéropodes, dont le système circulatoire est ouvert, l’haemocœle forme

des lacunes et les cellules circulantes (hémocytes) ont bien d’autres fonctions que la défense

immunitaire. Les hémocytes participent à la défense de l'organisme par phagocytose et lyse

bactérienne mais aussi à la régulation métabolique par stockage et dégradation du glycogène,

aux processus de détoxification par accumulation d'éléments minéraux dans leurs lysosomes.

L’immobilisation des molécules xénobiotiques se fait aussi dans la fraction lysosomale des

hémocytes. Aussi l’étude de l’haemocœle est-elle importante dans la mesure où il peut

montrer une réponse cellulaire aux polluants, laquelle se présente comme un signal d’alerte

précoce, indiquant que l’environnement est en train de subir une détérioration.

Les mesures ont été effectuées sur trois populations de C. aspersum et une population de C.

nemoralis vivant en sympatrie avec C. aspersum dans le but de comparer la capacité

antioxydante des hélicidés au niveau intraspécifique et au niveau interspécifique.

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La capacité antioxydante totale non enzymatique des individus a été mesurée sur la glande

digestive et l’haemocœle par la méthode TEAC, il s’agit donc d’évaluer le potentiel

antioxydant des vitamines et du glutathion présents dans l’organisme.

I- Matériel et méthodes

1.1- Matériel biologique

Trois populations de Cornu aspersum ainsi qu’une population de Cepaea nemoralis ont été

échantillonnées durant le mois d’octobre 2009.

Tableau 1: Provenance des populations d'escargots utilisées lors des expériences.

Espèce Localisation Type d’habitat

Cepaea nemoralis Cornu aspersum Pacé

(Ille et Vilaine ; 48°08’ N, 1°46’ O) Suburbain

Cornu aspersum Mont St Michel

(Manche, 48°37’ N, 1°32’ O) Agrosystème

Cornu aspersum Saint Etienne la Thillaye

(Calvados ; 49°17’ N, 0°06’ E)

Prairie, sauvage

Les individus collectés ont été placés en chambre froide à 4°C jusqu’au début des expériences

(février 2010). La sortie de l’hibernation a été effectuée en augmentant progressivement la

température jusqu’à 12°C (3 jours) puis les animaux ont été placés à 20 °C dans leurs

enceintes d’élevage. Celles-ci contiennent une ration de farine alimentaire, une coupelle

d’eau et leur fond est tapissé d’une mousse synthétique humide. Au bout de 36 heures

maximum, les escargots sont réveillés mais sont laissés encore une semaine pour

acclimatation ; ils subissent un jeûne de 48h avant d’être soumis aux différents traitements.

1.2- Traitements

Le traitement au fomesafen (C13895000, 99,5% pureté 5-(2-chloro-4-tritfluoromethyl-

phenoxy)-N-methylsulfonyl-2-nitrobenzamide) a été appliqué :

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7

• par contact des individus avec l’herbicide en plaçant les animaux dans des boîtes

individuelles tapissées de papier filtre imbibé de fomesafen,

• par ingestion, les boîtes contenant une ration de nourriture mouillée de fomesafen.

La différence entre les poids moyens des deux espèces a conduit à une ration de nourriture de

250 mg de farine mouillée dans 500 µl de fomesafen pour les Cornu aspersum contre 125 mg

de farine mouillée dans 250 µl de fomesafen pour les Cepaea nemoralis.

L’influence de la durée d’exposition à ce traitement semi-statique a été testée au moyen d’un

traitement « court », durant lequel les escargots ont été intoxiqués pendant 24h, et un

traitement « long ». Celui-ci consiste en une exposition pendant 5 jours au fomesafen grâce au

renouvellement de la nourriture contaminée et l’humidification des parois de la boîte au bout

de trois jours.

Un lot témoin a également été constitué. Les individus de ce lot ont été placés pendant 24

heures ou 5 jours dans les mêmes conditions d’expérience, mais le pesticide a été remplacé

par de l’eau.

Les doses nominales croissantes de fomesafen qui ont été utilisées sont 0,001%, 0,003%,

0,009%, 0,02%, 0,03% et 0,04%.

Á l’issue des 24h ou des 5 jours, seuls les animaux ayant consommé l’intégralité de la

nourriture ont été analysés, soit une proportion d’environ 96,8% sur l’ensemble des

traitements.

1.3- Prélèvement de l’hémolymphe

L’escargot possède un appareil circulatoire ouvert avec lacunes (haemocœle), formé du

cœur d’où partent une artère antérieure qui va irriguer la cavité palléale et une artère

postérieure médiane qui se dirige vers les viscères. Le vaisseau antérieur est atteint après avoir

pratiqué une fenêtre dans la coquille, préalablement nettoyée à l’eau distillée, au niveau de

l’emplacement du cœur (Figure 1). L’hémolymphe est ensuite prélevée à l’aide d’un capillaire

biseauté.

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Figure 1 : Prise d’hémolymphe dans l’artère antérieure d’un escargot petit-gris (C. aspersum).

Le volume d’hémolymphe des Cepaea nemoralis étant très inférieur à celui de l’escargot

petit-gris, les échantillons de C. nemoralis testés contiennent en fait l’hémolymphe de deux

individus traités de façon identique.

1.4- Prélèvement de la glande digestive

Dans le même temps, le lobe hépatique accessoire des glandes digestives des escargots a été

prélevé (tampon PBS pH= 7,4 ; 0,2M) puis placé au congélateur à -80°C jusqu’à leur analyse.

Les glandes digestives encore congelées ont été broyées une minute puis centrifugées 30

minutes à 600 tours / minute à 0°C. Après récupération du surnageant, les échantillons ont été

de nouveau centrifugés 1 heure à 14 500 tours / minute à 0°C.

Les analyses de la capacité antioxydante totale et le dosage des protéines de la glande

digestive ont été effectuées à partir du surnageant de ces échantillons.

1.5- Mesure de la capacité antioxydante

Les capacités antioxydantes (CAO) de l’hémolymphe et de la glande digestive ont été

mesurées grâce à la méthode TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (Miller et al.,

1993).

Il s’agit de mesurer les antioxydants non enzymatiques qui agissent comme des piégeurs de

radicaux et qui viennent renforcer l’action des enzymes antioxydantes. Le trolox, équivalent

de la vitamine E sert de référence pour évaluer la CAO de l’extrait (Trolox (S65192-408) 6

hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchloroman-2-carboxylic acid ~97%).

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Les analyses consistent à mesurer au spectrophotomètre les changements colorimétriques

d’une solution radicalaire formée d’un mélange ABTS-persulfate de potassium en présence

d’un échantillon de capacité antioxydante inconnue ((A1888-SG) 2,2 Azino-bis(3-ethylbenzo-

thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt ~98%). La gamme étalon de trolox sert de

référence. La CAO exprimée en équivalent trolox (TEAC) correspond à la concentration de

trolox ayant la même activité que l’échantillon. Les résultats sont exprimés en milli-moles

d’équivalent trolox par ml d’hémolymphe ou g de protéines pour la glande digestive (méthode

de Bradford).

1.6- Analyses statistiques

Les résultats ont été analysés statistiquement grâce à une ANOVA sous le logiciel R. Lorsque

les résultats donnaient des différences significatives, un test HSD de Tukey était utilisé pour

faire des comparaisons deux à deux. Le nombre de réplicats utilisés durant les expériences

figure sur le tableau 2.

Tableau 2: Nombre de réplicats utilisés pour les différentes doses (µg/l) de fomesafen en fonction de la population.

C. aspersum Pacé

C. aspersum Mont Saint Michel

C. aspersum Saint Etienne la Thillaye

Cepaea nemoralis Pacé

hémolymphe

glande digestive

hémolymphe glande

digestive hémolymphe

glande digestive

hémolymphe glande

digestive

24

heu

res

Témoin 21 8 11 11 11 12 15 5

10 9 9 9 9 9 9 5 5

30 9 9 9 9 9 9 5 4

90 9 9 9 8 9 9 5 5

200 17 9 9 9 9 9 13 3

300 8 9 8 8 9 9 5 5

400 5 5 9 9 9 9 2 2

5 jo

urs

Témoin 16 6 10 10 11 10 15 7

10 3 3 9 9 9 8 4 4

30 5 5 8 9 9 8 5 7

90 5 5 8 8 9 9 5 5

200 15 5 9 8 8 9 12 3

300 5 5 9 9 9 9 2 2

400 5 5 9 9 7 7 4 4

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II- Résultats

2.1- Effets du traitement

D’une manière générale, il n’existe d’effet traitement que pour l’hémolymphe des populations

de Cornu aspersum et de Cepaea

différences significatives entre les témoins et les différentes doses de fomesafen.

En ce qui concerne les variations de la concentration d’herbicide, on n’observe jamais d’effet

dose-réponse. En revanche on peut observer un effet «

entre la dose 200 et la dose 300µg/l de fomesafen, et pour lequel la capacité

augmente par rapport aux autres doses. Toutefois, cette augmentation n’est statistiquem

vérifiée que pour l’espèce Cepaea nemoralis

pour l’hémolymphe et en traitement 5 jours pour la glande digestive (figures 2 et 3) (test de

Tukey, p<0,001).

L’augmentation de la durée du traitement entraîne

l’hémolymphe pour les populations de

Michel (test de Tukey, p<0,05).

Figure 2 : Capacité antioxydante de l'hémolymphe (mmol d’équivalent Cornu aspersum et Cepaea nemoralis. A: Population de de C. aspersum de Saint Etienne la Thillaye ; C: Population de nemoralis de Pacé. En blanc : traitement 24 heures, en gris

10

Effets du traitement

D’une manière générale, il n’existe d’effet traitement que pour l’hémolymphe des populations

Cepaea nemoralis de Pacé (Tukey, p<0,05) pour lesquelles on a des

différences significatives entre les témoins et les différentes doses de fomesafen.

En ce qui concerne les variations de la concentration d’herbicide, on n’observe jamais d’effet

evanche on peut observer un effet « seuil » situé chez toutes les populations

entre la dose 200 et la dose 300µg/l de fomesafen, et pour lequel la capacité

augmente par rapport aux autres doses. Toutefois, cette augmentation n’est statistiquem

Cepaea nemoralis et ce pour la dose de 200µg/l en traitement 24h

pour l’hémolymphe et en traitement 5 jours pour la glande digestive (figures 2 et 3) (test de

L’augmentation de la durée du traitement entraîne une diminution significative de la CAO de

l’hémolymphe pour les populations de C. aspersum de Pacé et de la baie du Mont Saint

Michel (test de Tukey, p<0,05).

e de l'hémolymphe (mmol d’équivalent trolox par ml) des différ. A: Population de C. aspersum de la baie du Mont Saint Michel

de Saint Etienne la Thillaye ; C: Population de C. aspersum de Pacé ; D : traitement 24 heures, en gris : traitement 5 jours.

D’une manière générale, il n’existe d’effet traitement que pour l’hémolymphe des populations

de Pacé (Tukey, p<0,05) pour lesquelles on a des

différences significatives entre les témoins et les différentes doses de fomesafen.

En ce qui concerne les variations de la concentration d’herbicide, on n’observe jamais d’effet

» situé chez toutes les populations

entre la dose 200 et la dose 300µg/l de fomesafen, et pour lequel la capacité antioxydante

augmente par rapport aux autres doses. Toutefois, cette augmentation n’est statistiquement

et ce pour la dose de 200µg/l en traitement 24h

pour l’hémolymphe et en traitement 5 jours pour la glande digestive (figures 2 et 3) (test de

une diminution significative de la CAO de

de Pacé et de la baie du Mont Saint

par ml) des différentes populations de de la baie du Mont Saint Michel ; B: Population

: Population de Cepaea

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Figure 3 : Capacité antioxydante de la glande digestive (mmol d’équivalent trolox par g de protéines) des différentes populations de Cornu aspersum et Cepaea nemoralisB: Population de C. aspersum de Saint Etienne la Thillaye ; C: Population de Cepaea nemoralis de Pacé. En blanc : traitement 24 heures, en gris

2.2- Comparaison intraspécifique

2.2-1. Hémolymphe

L’analyse de la CAO de l’hémolymphe a montré des différences entre populations

(F2,343=10,43 ; p <0,001), traitements (F

(F1,343=31,93 ; p <0,001). De plus, l’interactio

(F6,343=2,25 ; p <0,05) produit un effet significatif sur la capacité

l’hémolymphe.

Les analyses montrent également que la population de Pacé est significativement différente

des deux autres (test de Tukey, p<0,05) (figures 4 et 5).

11

e de la glande digestive (mmol d’équivalent trolox par g de protéines) des différentes Cepaea nemoralis. A: Population de C. aspersum de la baie du Mont Saint Michel

de Saint Etienne la Thillaye ; C: Population de C. aspersum de Pacé: traitement 24 heures, en gris : traitement 5 jours.

Comparaison intraspécifique

Hémolymphe

L’analyse de la CAO de l’hémolymphe a montré des différences entre populations

; p <0,001), traitements (F6,343=3,61 ; p<0,01) et durée du traitement

; p <0,001). De plus, l’interaction entre concentration x durée du traitement

; p <0,05) produit un effet significatif sur la capacité

Les analyses montrent également que la population de Pacé est significativement différente

de Tukey, p<0,05) (figures 4 et 5).

e de la glande digestive (mmol d’équivalent trolox par g de protéines) des différentes de la baie du Mont Saint Michel ;

de Pacé ; D : Population de

L’analyse de la CAO de l’hémolymphe a montré des différences entre populations

; p<0,01) et durée du traitement

n entre concentration x durée du traitement

; p <0,05) produit un effet significatif sur la capacité antioxydante de

Les analyses montrent également que la population de Pacé est significativement différente

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Figure 4 : Capacité antioxydante de l’hémolymphe de différentes populations de

croissantes de fomesafen pendant 24 heures (N = ±9, moyenne ± SE).

Figure 5 : Capacité antioxydante de l’hémolymphe de différentes populations de

croissantes de fomesafen pendant 5 jours (N = ±9, moyenne ± SE).

12

e de l’hémolymphe de différentes populations de Cornu aspersum

croissantes de fomesafen pendant 24 heures (N = ±9, moyenne ± SE).

e de l’hémolymphe de différentes populations de Cornu aspersum

croissantes de fomesafen pendant 5 jours (N = ±9, moyenne ± SE).

Cornu aspersum soumises à des doses

Cornu aspersum soumises à des doses

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2.2-2.

L’analyse de la capacité antioxydant

aspersum montre des différences significatives entre populations (F

un effet significatif de la durée de traitement (F

La population B (Saint Etienne la Thillaye) est différente des deux autres (p<0,05) (fig

et 7). Lors de l’intoxication de courte durée, la capacité

population B est significativement supérieure à celle des deux autres pour la dose 200µg/l et

supérieure à la A (Baie du Mont Saint Michel) pour les doses de 30,

fomesafen, ainsi que pour le témoin (test de Tukey, p<0,05).

Lors de l’intoxication longue, la capacité

supérieure à celle de la population de Pacé pour la dose 300µg/l et supérieure à celle de

population de la baie du Mont Saint Michel pour les doses de 10 et 300 µg/l de fomesafen

(test de Tukey, p<0,05).

Figure 6 : Capacité antioxydante de la glande digestive de différentes populations de

doses croissantes de fomesafen pendant 24 heures (N = ±9, moyenne ± SE).

13

Glande digestive

antioxydante de la glande digestive des trois populations de

montre des différences significatives entre populations (F2,304 =61,76; p<0,001), et

un effet significatif de la durée de traitement (F1,304=4,60 ; p=0,03).

La population B (Saint Etienne la Thillaye) est différente des deux autres (p<0,05) (fig

et 7). Lors de l’intoxication de courte durée, la capacité antioxydant

population B est significativement supérieure à celle des deux autres pour la dose 200µg/l et

supérieure à la A (Baie du Mont Saint Michel) pour les doses de 30, 200 et 300 µg/l de

fomesafen, ainsi que pour le témoin (test de Tukey, p<0,05).

Lors de l’intoxication longue, la capacité antioxydante moyenne de la population B est

supérieure à celle de la population de Pacé pour la dose 300µg/l et supérieure à celle de

population de la baie du Mont Saint Michel pour les doses de 10 et 300 µg/l de fomesafen

e de la glande digestive de différentes populations de Cornu aspersum

doses croissantes de fomesafen pendant 24 heures (N = ±9, moyenne ± SE).

e de la glande digestive des trois populations de C.

=61,76; p<0,001), et

La population B (Saint Etienne la Thillaye) est différente des deux autres (p<0,05) (figures 6

antioxydante moyenne de la

population B est significativement supérieure à celle des deux autres pour la dose 200µg/l et

200 et 300 µg/l de

e moyenne de la population B est

supérieure à celle de la population de Pacé pour la dose 300µg/l et supérieure à celle de la

population de la baie du Mont Saint Michel pour les doses de 10 et 300 µg/l de fomesafen

Cornu aspersum soumises à des

Page 15: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

Figure 7 : Capacité antioxydante de la glande digestive de différentes populations de

doses croissantes de fomesafen pendant 5 jours (N

2.3- Comparaison interspécifique

2.3-1. Hémolymphe

Lors de l’analyse des variations interspécifiques de la capacité

des escargots de Pacé, des différences significatives ont été enregistrées entre:

(F1,198 =21,52 ; p<0,001), traitement (F

p<0,001). De plus les interactions entre espèce x traitement (F

concentration x durée du traitement (F

(F6,198 =2,22; p<0,05) possèdent un effet significatif sur la CAO de l’hémolymphe.

Cepaea nemoralis a une activité

8) : après 24h pour la dose de 200µg/l ainsi qu’après cinq jours pour les

300µg/l (test de Tukey, p<0,05).

14

e de la glande digestive de différentes populations de Cornu aspersum

doses croissantes de fomesafen pendant 5 jours (N = ±9, moyenne ± SE).

Comparaison interspécifique

Hémolymphe

Lors de l’analyse des variations interspécifiques de la capacité antioxydant

des escargots de Pacé, des différences significatives ont été enregistrées entre:

21,52 ; p<0,001), traitement (F6,198 =2,51; p<0,05), durée du traitement (F

p<0,001). De plus les interactions entre espèce x traitement (F1,198

concentration x durée du traitement (F6,198 =5,17; p<0,01), concentration x durée

=2,22; p<0,05) possèdent un effet significatif sur la CAO de l’hémolymphe.

a une activité antioxydante supérieure à celle de Cornu aspersum

: après 24h pour la dose de 200µg/l ainsi qu’après cinq jours pour les doses 10, 90, 200 et

300µg/l (test de Tukey, p<0,05).

Cornu aspersum soumises à des

antioxydante de l’hémolymphe

des escargots de Pacé, des différences significatives ont été enregistrées entre: espèces

=2,51; p<0,05), durée du traitement (F1,198 =13,63;

1,198 =2,71; p<0,05),

=5,17; p<0,01), concentration x durée x espèce

=2,22; p<0,05) possèdent un effet significatif sur la CAO de l’hémolymphe.

Cornu aspersum (figure

doses 10, 90, 200 et

Page 16: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

Figure 8: Capacité antioxydante de l'hémolymphe de deux espèces sympatriques d'hélicidés soumises à des doses croissantes de fomesafen pendant 24h et 5 jours (N=±9, moyennes ±SE).

2.3-2. Glande digestive

L’analyse de la capacité antioxydant

de Pacé a montré des différences significatives entre

CAO de la glande digestive. Les interactions entre

concentration x espèce (F6,127

p<0,01) ont également un effet significatif sur la CAO de la glande digestive

15

e de l'hémolymphe de deux espèces sympatriques d'hélicidés soumises à des doses croissantes de fomesafen pendant 24h et 5 jours (N=±9, moyennes ±SE).

Glande digestive

antioxydante de la glande digestive des deux espèces sympatriques

de Pacé a montré des différences significatives entre espèce (F1,127 =21,48; p<0,001) sur la

CAO de la glande digestive. Les interactions entre : espèce x durée (F1,127

6,127 =3,77; p<0,01), concentration x durée x espèce (F

p<0,01) ont également un effet significatif sur la CAO de la glande digestive

e de l'hémolymphe de deux espèces sympatriques d'hélicidés soumises à des doses

e de la glande digestive des deux espèces sympatriques

=21,48; p<0,001) sur la

,127 =4,13; p<0,05),

=3,77; p<0,01), concentration x durée x espèce (F6,127 =3,83;

p<0,01) ont également un effet significatif sur la CAO de la glande digestive (figure 9).

Page 17: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

Figure 9: Capacité antioxydante de la glande croissantes de fomesafen pendant 24h et 5 jours (N=±9, moyennes ±SE).

III- Discussion

Le but de cette étude est de comprendre comment des organismes comme les escargots

s’adaptent à la toxicité de leur environnement et si les défenses

en œuvre sont caractéristiques de l’espèce ou de la population. La production d’espèces

réactives de l’oxygène étant considérée comme un facteur clé de la réponse adaptative ou de

la réaction à un évènement toxique, il s’agit de savoir si celle

augmentation des défenses antioxydant

animaux. Pour le déterminer, nous avons étudié la réponse d’escargots

l’exposition au fomesafen.

Ce travail a abordé deux axes de réflexion

par l’organisme lors d’une exposition à un pro

part l’étude des processus adaptatifs que subissent les organismes vivant pendant de longues

périodes en environnement pollué.

16

e de la glande digestive de deux espèces sympatriques d'hélicidés soumises à des doses croissantes de fomesafen pendant 24h et 5 jours (N=±9, moyennes ±SE).

Le but de cette étude est de comprendre comment des organismes comme les escargots

icité de leur environnement et si les défenses antioxydant

en œuvre sont caractéristiques de l’espèce ou de la population. La production d’espèces

réactives de l’oxygène étant considérée comme un facteur clé de la réponse adaptative ou de

la réaction à un évènement toxique, il s’agit de savoir si celle-ci est caractérisée par une

antioxydantes, c'est-à-dire de connaître le statut

animaux. Pour le déterminer, nous avons étudié la réponse d’escargots à un épisode toxique:

Ce travail a abordé deux axes de réflexion : d’une part l’analyse de la défense mise en place

par l’organisme lors d’une exposition à un pro-oxydant à court terme et à long terme

l’étude des processus adaptatifs que subissent les organismes vivant pendant de longues

périodes en environnement pollué.

digestive de deux espèces sympatriques d'hélicidés soumises à des doses

Le but de cette étude est de comprendre comment des organismes comme les escargots

antioxydantes qu’ils mettent

en œuvre sont caractéristiques de l’espèce ou de la population. La production d’espèces

réactives de l’oxygène étant considérée comme un facteur clé de la réponse adaptative ou de

ci est caractérisée par une

dire de connaître le statut antioxydant des

à un épisode toxique:

: d’une part l’analyse de la défense mise en place

oxydant à court terme et à long terme, d’autre

l’étude des processus adaptatifs que subissent les organismes vivant pendant de longues

Page 18: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

17

Les capacités antioxydantes de l’hémolymphe et de la glande digestive n’augmentent pas avec

la concentration de pesticide, il n’y donc pas d’effet dose-dépendance. En revanche un effet

seuil plus ou moins marqué a pu être mis en évidence à partir de 200µg/l. Cette observation

corrobore le fait que l’effet des pesticides en général, et du fomesafen en particulier, sur le

système antioxydant est connu pour être de type seuil, comme cela a pu être observé chez

d’autres mollusques comme la limnée (Russo et al., 2007). L’existence d’un seuil de réponse

au pesticide peut être expliquée par le fait que les espèces réactives de l’oxygène, produites

lors de l’intoxication au fomesafen, sont connues pour être impliquées dans l’expression de

nombreux gènes et pour constituer des signaux cellulaires (Allen et Tresini, 2000). En tant

que signal déclencheur, les ERO, lorsqu’ils atteignent un certain seuil, sont à l’origine de la

production de défenses antioxydantes. La concentration seuil de fomesafen serait alors la dose

pour laquelle la production d’espèces réactives de l’oxygène est suffisante pour provoquer

l’augmentation de la production de défenses antioxydantes.

Les doses nécessaires à la mesure d’une augmentation de la capacité antioxydante chez Cornu

aspersum et chez Cepaea nemoralis, situées entre 200 et 300 µg/l représentent des

concentrations beaucoup plus élevées de pesticides que celles que l’on pourrait rencontrer en

milieu naturel. A titre indicatif, la dose observée pour un autre herbicide, l’atrazine, est de 30

à 87µg/l dans les régions d’agriculture intensive (in Russo et al., 2009). De plus, ce seuil est

beaucoup plus haut que celui observé chez d’autres mollusques, puisque chez la limnée

stagnée Lymnea stagnalis, on observe une diminution de l’activité des hémocytes de par leur

nécrose et apoptose dès la dose de 30µg/l (Russo et al., 2007). Cette observation indique que

le seuil de tolérance à la production d’ERO de ces espèces est particulièrement élevé.

L’augmentation de la durée d’intoxication au fomesafen entraîne, toutes populations

confondues, une diminution de la capacité antioxydante. Cet effet est le plus marqué pour

l’hémolymphe des populations de Cornu aspersum de Pacé et de la baie du Mont Saint

Michel. Ce résultat peut être expliqué par le fait que dès l’exposition des escargots au

fomesafen, celui-ci va être véhiculé par le système circulatoire et être dans un premier temps

détoxifié par l’hémolymphe et ensuite seulement par la glande digestive. Cependant, la

capacité antioxydante peut être dépassée pour une durée trop importante d’intoxication et

provoquer une dépression des défenses antioxydantes. Ainsi, chez la moule méditerranéenne

Mytilus galloprovincialis, les polluants (tels que les métaux lourds) commencent à

s’accumuler dans les tissus de l’animal après seulement trois jours d’exposition (Regoli et al.,

2004). Les longues expositions aux polluants pourraient être à l’origine d’une diminution de

Page 19: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

18

la capacité antioxydante lorsque le système de détoxification est dépassé et insuffisant pour

palier au stress oxydant.

La comparaison de la sensibilité de l’hémolymphe et de la glande digestive des escargots au

pesticide montre des intensités de réaction différentes en fonction du tissu. Lorsqu’on étudie

par exemple la réaction des différents tissus de Cepaea nemoralis, la forte capacité

antioxydante de l’hémolymphe observée dès 24 heures pour la dose 200µg/l disparait ensuite

rapidement, tandis que le pic de capacité antioxydante n’intervient qu’après 5 jours

d’intoxication pour la glande digestive. Cette observation peut être expliquée par le fait que

l’hémolymphe est un transporteur de substances dans l’organisme, quelle que soit leur voie

d’entrée, qui peut certes jouer le rôle de détoxification, mais dans une moindre mesure que la

glande digestive. Ainsi, chez la moule brune Perna perna, la glande digestive est moins

sujette au stress oxydant que les autres tissus, tels que les branchies, grâce à la plus grande

activité de ses défenses antioxydantes (Almeida et al., 2005). On peut alors poser l’hypothèse

que la glande digestive prendrait le relais de l’haemocœle dans la détoxification de

l’organisme au bout d’un certain temps. Le fait que lorsque l’activité antioxydante d’un des

deux tissus diminue, celle de l’autre augmente, a été vérifié par Regoli et al. (2006) sur Cornu

aspersum. Ces auteurs ont testé l’efficacité des défenses antioxydantes de différents tissus et

ont montré que la glande digestive était la plus performante tandis que les hémocytes ont

pour rôle d’une part de détoxifier, et d’autre part de concentrer les polluants avant de les

transporter vers la glande digestive. Cette hypothèse est proche de la « mobile immune brain

hypothesis » énoncée par Ottaviani et al. (1993), qui proposent que face à un stress, les

hémocytes des invertébrés sont capables des mêmes réponses immunitaires et

neuroendocriniennes que le système hypothalamo-hypophysaire des mammifères.

Au niveau intraspécifique, des variations ont pu être mises en évidence aussi bien pour

l’hémolymphe que pour la glande digestive. La population de Pacé possède une meilleure

capacité antioxydante que les autres pour l’hémolymphe, tandis que c’est la population de

Saint Etienne la Thillaye qui possède la meilleure CAO lorsque l’on compare les glandes

digestives. Ces variations peuvent être expliquées par le fait que les trois populations n’ont

pas subi les mêmes épisodes toxiques dans leurs milieux naturels. Dans une étude sur le ver

polychète Laeonereis acuta, des différences dans les activités des enzymes antioxydantes ont

pu être observées selon que la population venait d’un site pollué ou sain (Geraticano et al.,

Page 20: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

19

2004). De plus, Borkovíc et al. (2005) ont montré chez Mytilus galloprovincialis que les

activités des enzymes antioxydantes pouvaient varier en fonction du type de pollution auquel

était exposée la population. Si la population de Saint Etienne la Thillaye provient d’un

environnement sain, la population de la baie du Mont Saint Michel quant à elle est exposée à

une pollution de type agricole (pesticides), et la population issue de Pacé subit non seulement

des épisodes toxiques provenant des cultures voisines, mais également les retombées de la

pollution urbaine (gaz d’échappement, métaux lourds). La pollution urbaine est de nature à

stimuler le système immunitaire, source de production massive d’ERO. De ce fait on peut

exprimer l’hypothèse selon laquelle les variations intraspécifiques observées chez Cornu

aspersum sont dues aux différences de nature du stress auquel les trois populations doivent

faire face dans leur milieu naturel.

De plus, le régime alimentaire pourrait influencer la capacité antioxydante, Cohen et al.

(2009) ont montré chez des oiseaux que la capacité antioxydante du sérum variait en fonction

du régime alimentaire des individus et en particulier qu’elle augmentait avec la consommation

d’aliments riches en vitamine E. Cette hypothèse pourrait être appliquée aux différences de

CAO entre populations de Cornu aspersum. En effet, les escargots de la commune de Saint

Etienne la Thillaye se nourrissent majoritairement de plantes aromatiques trouvées dans les

jardins (Allium schoenoprasum, Rosmarinus officinalis, Thymus vulgaris, etc.), et dont la

richesse en composés phénoliques leur confère de grandes propriétés antioxydantes (Zheng et

Wang, 2002), ce qui pourrait être la cause des fortes capacités antioxydantes de sa glande

digestive. En ce qui concerne la population de Pacé, la zone de prélèvement recelait du colza

dont les propriétés antioxydantes sont en cours de démonstration (M-A Esnault,

communication personnelle). Le régime alimentaire de la population de la baie du Mont Saint

Michel s’est avéré difficile à observer étant donné que leur environnement, composé de

cultures intensives, change régulièrement en fonction des légumes et céréales plantés (choux,

pommes de terre, oignons, carottes…). Il a pourtant pu être prouvé qu’un grand nombre

d’espèces de légumes possèdent des propriétés antioxydantes de part leur composition en

phénols, tanins et flavonoïdes (Amarowicz et Pegg, 2008). La faiblesse de la capacité

antioxydante de cette population en comparaison des autres ne pourrait donc pas être

expliquée par son régime alimentaire. La piste de l’influence de l’alimentation sur la capacité

antioxydante des végétaux mérite donc d’être approfondie et une étude détaillée de la

composition végétale des différents sites, ainsi que des habitudes alimentaires des trois

Page 21: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

20

populations associées à la connaissance des propriétés antioxydantes des plantes semble

souhaitable.

D’autres hypothèses peuvent être envisagées pour expliquer cette variation intraspécifique de

la capacité antioxydante. L’état de santé général peut être suggéré pour expliquer les faibles

performances des individus de la baie du Mont Saint Michel, mais une mesure précise de leur

état physiologique est bien évidemment nécessaire pour tester cette hypothèse. On peut

ajouter que des stratégies de détoxification différentes, basées sur une importance relative de

chaque tissu, pourraient être à l’origine des différences observées.

La différence entre capacité antioxydante de C. aspersum et celle de Cepaea nemoralis doit

être interprétée de façon prudente car elle n’est due qu’à la forte capacité antioxydante de C.

nemoralis pour la dose de 200µg/l. Si l’on considère que les deux espèces sont vraiment

différentes, on peut expliquer ce résultat par le régime alimentaire de l’espèce. En effet, les

deux espèces étant sympatriques, elles sont exposées aux mêmes polluants, qui ne peuvent

être à l’origine de la variation, mais leurs choix alimentaires peuvent être différents, ce qui

rend leur étude nécessaire pour C. nemoralis, sachant qu’elle a déjà été menée sur l’escargot

petit-gris (Chevalier, 2001).

L’analyse de la capacité antioxydante totale est un outil efficace pour évaluer le statut

antioxydant d’un individu. D’autres analyses sont toutefois nécessaires pour une comparaison

plus fine des différentes populations et espèces. L’analyse des activités des enzymes

antioxydantes est une étape supplémentaire pour étudier le statut antioxydant d’une espèce,

même si la capacité antioxydante non enzymatique représente 70% de la capacité

antioxydante totale (Regoli et Winston, 1999). De même, le glutathion étant au cœur des

défenses antioxydantes, il représente un biomarqueur de choix dans l’analyse du stress

oxydant (Doyotte et al., 1997). Ainsi une analyse des enzymes antioxydantes (glutathion

peroxydase et glutathion réductase) et des concentrations de glutathion est d’ores et déjà

programmée dans le cadre de cette étude.

Les différences observées entre les trois populations de Cornu aspersum peuvent être la

conséquence d’une plasticité phénotypique ou d’un processus adaptatif local, comme cela a

pu être mis en évidence chez certains mollusques marins (Lambert et al., 2007). Afin de tester

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21

ces hypothèses une expérience de transplantation des individus d’une population dans un

milieu différent devrait être réalisée (Regoli et Principato, 1995). En effet il serait alors

possible de savoir si la capacité antioxydante change en fonction du milieu dans lequel évolue

la population. Des manipulations visant à tester l’héritabilité de la capacité antioxydante sont

donc à envisager.

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Images de couverture:

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b4/Cepaea_nemoralis_on_moss.jpg

http://www.nhm.ac.uk/natureplus/servlet/JiveServlet/showImage/38-1138-1427/Schneckesnail1.jpg

http://domenicus.malleotus.free.fr/a/img/escargot_petit-gris_001_%28sur_eglantine,_cotes_de_clermont,_2007-05-18%29.jpg

http://spd.fotolog.com/photo/29/57/116/bio_pictures/1208701120_f.jpg

Page 26: Capacité antioxydant e chez les hélicidés variations ... · défense antioxydante (Salmon et al. , 2001). Chez l’escargot Cornu aspersum , des trade-offs entre défense immunitaire

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Résumé ─ Afin d’étudier les variations interspécifiques et intraspécifiques du statut antioxydant des

hélicidés, trois populations de Cornu aspersum provenant de sites plus ou moins pollués et une population

sympatrique de Cepaea nemoralis ont été exposées à des doses croissantes de fomesafen (10, 30, 90, 200,

300 et 400 µg/l), un herbicide pro-oxydant, pendant 24 heures et 5 jours. Les mesures de la capacité

antioxydante non enzymatique de la glande digestive et de l’hémolymphe ont été effectuées grâce à la

méthode TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity). Après analyse, il s’avère que les résultats

dépendent du tissu étudié. La comparaison intraspécifique montre que c’est la population de C. aspersum

en provenance du site soumis à la pollution urbaine qui présente la meilleure capacité antioxydante de

l’hémolymphe, ce qui s’explique par le rôle de transporteur et de concentration de particules

atmosphériques à potentialité inflammatoire de l’hémolymphe. La glande digestive de la population

provenant du site sain a une bonne capacité antioxydante, peut-être attribuable à son alimentation. La

comparaison interspécifique montre que Cepaea nemoralis semble avoir une meilleure capacité

antioxydante que Cornu aspersum. Les différences interspécifiques observées pourraient être attribuées

aux différences de choix alimentaire des deux espèces sympatriques. De nombreuses mesures restent à

faire afin de préciser ces résultats et dans le but de déterminer le potentiel évolutif de la variation chez les

deux taxa.

Mots clés : Hélicidé, capacité antioxydante, variabilité intraspécifique, variabilité interspécifique,

herbicide.

Abstract ─ To study intraspecific and interspecific variations of the antioxidant status of helicidae, three

populations of Cornu aspersum from polluted and unpolluted sites and a sympatric population of Cepaea

nemoralis were exposed to increasing doses of fomesafen(10, 30, 90, 200, 300 et 400 µg/l), which is a

pro-oxidant weed-killer, for 24 hours and 5 days. Measurements of the digestive gland and hemolymphe’s

non-enzymatic antioxidant capacity were done thanks to the TEAC method (trolox equivalent to (?)

antioxidant capacity). After analyses, it turned out that the results depended on the studied tissue.

Intraspecific comparison showed that the population subjected to urban pollution presented the best

hemolymphe antioxidant capacity, which can be explained by the carrier and atmospheric particles

concentration role of the hemolymphe. The digestive gland of the population from the unpolluted site had

a good antioxidant capacity, which may be due to its diet. Interspecific comparison showed that Cepaea

nemoralis seemed to have a better antioxidant capacity than Cornu aspersum. The interspecific

differences observed might be attributed to different diet choices of the two sympatric species. Many

measurements remain to be done to specify these results, and in order to determine the evolutive potential

of the variation in both taxa.

Key-words: Helicidae, antioxidant capacity, intraspecific variability, interspecific variability, weed-

killer.