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BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN Lepidium peruvianum Chacón. “ MACA” Angela Renee Arias Ramírez. Derechos reservados conforme a Ley
Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM
CAPITULO III
ANTECEDENTES
III.1.- DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA.-
El género Lepidium incluye aproximadamente 175 especies, distribuidas en
prácticamente todos los continentes, excepto la Antártida, siendo uno de los más
grandes dentro de las crucíferas. Las especies de América del Norte, Australia y
Europa han sido estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las
especies endémicas Andinas (Quiros 1999).
Gloria Chacón (1990) menciona que en el Perú, de acuerdo a Ferreira
(1986), existían 11 especies clasificadas del género Lepidium a la que agrega
Lepidium peruvianum Chacón como una nueva especie.
De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue
domesticada hace cerca de 2000 años en San Blas, Junín. Siendo, según Bonnier
(1986, citado por Chacón 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el
Perú.
La maca parece haber jugado un papel importante en la economía
prehispánica, y durante los primeros cien años de la colonia formó parte de los
tributos exigidos por el Encomendador (Chacón, 1990).
III.1.1.- CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA.
DIVISION : ANGIOSPERMAE
CLASE : DICOTYLEDONEAE
SUBCLASE : ARCHICHLAMYDEAE
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ORDEN : PAPAVERALES
FAMILIA : BRASSICACEAE
GENERO : Lepidium
ESPECIE : Lepidium peruvianum Chacón. Sp. Nov. Antes L.
meyenii Walp.
NOMBRE COMUN : MACA, MACA-MACA, MAINO, AYAK CHICHIRA,
AYAC WILLKU, GINSENG PERUANO.
III.1. 2.- DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
La maca, según Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal
en la sierra alta, (no se tienen referencias respecto a su comportamiento en
menores altitudes) siendo autógama, cleistógama, con una fase reproductiva de
5 meses con una floración que dura dos meses. Las flores se abren en series
sucesivas, presentando cuatro etapas: flor cerrada con anteras sin dehiscencia,
flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor abierta con estructuras florales
en pleno desarrollo, flor abierta con estructuras florales entrando en
senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de 8
meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el
ensanchamiento de los hipocótilos. El cultivo de estas dos fases se da
generalmente entre los meses de setiembre y junio en dos años consecutivos
(Aliaga, 1999).
La raíz es napiforme (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998), descrita
como tubérculo hipocotíleo por Piñas (1994) recibiendo también el nombre de
hipocótilo (Aliaga 1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), según León
(1964), éste es un eje carnoso derivado del hipocótilo cuya parte superior
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termina en una superficie plana de la que brotan de 6 a 15 hojas; mientras la
inferior es cónica y se alarga en una raíz ancha y fuerte con dos áreas
irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas.
Los colores de maca más frecuentes son: amarillo, morado, medio
morado (la parte superior morada y la inferior blanca) y negro (León, 1964) pero
se pueden encontrar también maca de color rosado, crema-morado, amarillo-
negro, plomo, y raras veces morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por
los campesinos y el mercado es el color amarillo (León, 1964 y Aliaga, 1999).
El tallo es acaule, mientras las hojas son arrosetadas, pecioladas,
compuestas bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimórficas: En la fase
vegetativa son grandes (10 – 15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm)
en la fase reproductiva (Tello y colb. 1992 y Aliaga, 1999).
La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Piñas
1994), con el eje floral corto. Las flores, pequeñas y blancas, son perfectas, con
cuatro sépalos, cuatro pétalos, 2 estambres fértiles y cuatro estaminodios y un
ovario súpero bicarpelar y bilocular, con un óvulo en cada lóculo de
placentación axilar. Su fórmula floral es: K4C4A2-4G2 (León, 1964 y Aliaga,
1995).
El fruto es una silícula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides
de 2-3 mm de ancho y 4 – 5 mm de largo (Beltrán y colb. Citado por Obregón,
1998) el color de las semillas varía del amarillo-naranja al marrón oscuro (Aliaga,
1999).
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III.1.3.- NÚMERO DE CROMOSOMAS
Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8
con 54 – 56 cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en células
madres de plantas en floración, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la
maca es un poliploide disómico del número cromosómico básico del género: n
= 8, siendo así un octoploide: 2n x 8 = 64 cromosomas.
III.1.4.- DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e
inclusive en regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden
sobrevivir, altitudes que se encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes
(National Research Council. 1989); el cultivo de la maca (luego de la colonia),
estuvo restringido a los departamentos de Junín y Pasco, en las regiones suni y
puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de Junín; a altitudes
de 4100 – 4450 m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras localidades de
estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m.
Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la
distribución del cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el área de
cultivo de la planta disminuyó progresivamente hasta que entre 1777 y 1778,
Hipólito Ruiz lo circunscribe la región de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta
tendencia se mantuvo hasta la década de los ochenta, en la que el área de
cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999). En la década de los 90
esta tendencia se revirtió al crecer la demanda de la planta, y su cultivo se
extendió a otros departamentos del Perú, de tal manera que actualmente la
maca se está cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Huánuco y
Apurímac (Aliaga, 1999).
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III.1.5.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL
La maca es la única especie del género Lepidium cuya raíz es utilizada
como alimento, aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras
(National Research Council. 1989), además, dentro de los tubérculos y raíces
andinos, es una de las especies con mayor valor alimenticio; con un alto
contenido de aminoácidos esenciales, comparables con los recomendados por
la FAO – OMS, siendo altos sus valores de lisina, tirosina y fenilalanina. La
fracción grasa es rica en ácido linoleico utilizado por el organismo para la
biosíntesis de ácidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de minerales
de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver
apéndice)
III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS.
Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no
tienen una función reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiológicos
fundamentales de los organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991).
Entre las funciones que cumplen estos metabolitos están: proteger la planta
de los depredadores, competir ventajosamente con otras plantas, atraer
polinizadores y simbiontes y brindarles protección contra diferentes tipos de estrés a
los que se vean sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991).
Las evidencias de una estricta regulación metabólica de estos productos nos
indicaría que cumplen un rol importante en la sobrevivencia de las plantas
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III.2.1.- GLUCOSINOLATOS.
Los glucosinolatos son una clase tioglucósidos restringidos a las
dicotiledóneas limitados a pocas familias y en algunos casos a ciertos géneros y
especies (Kjaer, 1973), los que son almacenados en diferentes tejidos de la
planta, siendo una fuente significativa del contenido de azufre y minerales de la
planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981), se encuentran en muchos
cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la mirosinasa,
conforman un sistema que define fitoquímicamente al orden de las Capparales
(Hegnauer, 1986; citado por Bones y Rossiter, 1996); estando presente en
muchas brassicaceas económicamente importantes, como la mostaza,
calabazas, brócoli, nabo, etc. El daño mecánico, infecciones o ataque de pestes
produce, como una respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular
que exponen los glucosinolatos almacenados a la acción de las enzimas que los
degradan, las mirosinasas, produciendo isotiocianatos, nitrilos,
cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del pH y/u otros factores (Fig 1)
(Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad de las
hojas para herbívoros no específicos como aves y babosas, pero aumenta la
susceptibilidad del tejido a insectos específicos como los escarabajos alados,
(Mithen y col. 1995)
La primera revisión de la presencia de glucosinolatos en varias especies
fue hecha por Kjaer en 1960, con actualizaciones periódicas (Xenophon y colb.,
1981), en 1973, Kjaer puntualizó: “entre el vasto número de productos
secundarios vegetales, aquellos que presentan una distribución discontinua junto
con un llamado inmediato a los sentidos humanos (olor, sabor, color) han
adquirido, por razones obvias, una posición prominente en discusiones acerca
de los méritos de tales productos para propósitos de clasificación y, más
fundamentalmente, consideraciones filogenéticas. Los glucosinolatos ........
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constituyen un grupo con algunas de las características anteriores.”....... “La
complejidad sistemática de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por
ejemplo dentro de Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la
posición biológica e importancia de este grupo de constituyentes vegetales
químicamente bien definido y en constante crecimiento”.
Hace ya varias décadas, se ha deseado reducir el contenido de
tioglucósidos en Brassicáceas mediante métodos de cultivo, pues la presencia
de algunos de ellos son indeseables por algunos efectos tóxicos de los
productos de su degradación (Josefsson, 1967), tales como nitrilos,
isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas (Bones y
Rossiter, 1996), así como por su sabor; mientras que otros vienen siendo
estudiados por sus propiedades terapéuticas. Actualmente, la concentración de
glucosinolatos puede ser manipulada genéticamente, disminuyéndola para
mejorar la palatabilidad del cultivo, como en el caso de la colza, o,
aumentándola como se trata de hacer en brócoli con el glucosinolato
glucorafanina, que al hidrolizarse forma sulfurofano con actividad
anticancerígena (Quiros, 1999).
Las especies del género Lepidium son usualmente ricas en bencil
isotiocianatos (Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs
(1981), sugiere que las propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los
productos de los glucosinolatos de maca, los isotiocianatos aromáticos,
bencilisotiocianato y el p-metoxibencil isotiocianato, el último de los cuales
también se encuentra en mashua.
Químicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen
el mismo núcleo el cual consiste en un tioglucósido unido al carbón de una
oxima sulfonada y un grupo funcional R que deriva de aminoácidos siendo éste
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el carácter variable (Bones y Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la
actividad biológica del glucosinolato al determinar la naturaleza de los productos
resultantes del daño de los tejidos de la planta, (Mithen y colb., 1995). La
naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los glucosinolatos
aromáticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- metiltioalkenil) y los alifáticos
(bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades ácidas,
por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por
un catión, la glucosa y sus formas aniónicas, los hacen compuestos no volátiles
e hidrofílicos, se han identificado más de 100 glucosinolatos; todos ellos se
diferencian sólo en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran
número de glucosinolatos, se usan nombres semisistemáticos, en los que el
nombre de la cadena R es seguido por el sufijo “glucosinolato”,
Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los α- aminoácidos,
Valina, Alanina, Leucina, Isoleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer,
1973), en una serie de reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el
carbón α se transforma en el carbón central del glucosinolato (Larsen, 1981),
aunque solo siete corresponden a aminoácidos proteicos (antes mencionados),
los restantes derivan de modificaciones de la cadena lateral, que probablemente
a nivel de glucosinolato o derivan de aminoácidos no proteicos (Chapple, y colb.,
1994 y Larsen, 1981).
Para el aislamiento y análisis de los glucosinolatos se han desarrollado
muchas técnicas, como la cromatografía en papel Kjaer 1970, cromatografía de
capa fina, cromatografía de gases, además de procesos que involucra el estudio
de los productos de la degradación enzimática, aunque la gran variabilidad de
los productos de la degradación enzimática pueden causar resultados erróneos,
(Larsen, 1981).
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El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la
producción de α-D-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que
nuevamente pueden ser descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981)
Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en
vacuolas celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes
ricas en glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas
aún no se ha definido su localización celular (Rodman, 1981).
Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificación de crucíferas de
Argelia, de acuerdo a sus glucosinolatos, reclasificando el género Isatis y
reubicando el género Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el
valor taxonómico de estos compuestos.
III.2.1.1.- EL SISTEMA MIROSINASA – GLUCOSINOLATO
Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas
están invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer,
1973), así, sin excepción conocida, los glucosinolatos están acompañados en la
planta por esta enzima. Las mirosinasas se encuentran en idioblastos
especializados ricos en proteínas llamados células de mirosina (Rodman, 1981)
que se encuentran en el tejido parenquimático (Bonnes y Rossiter, 1996), éstos
se tiñen de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn, 1979; citado por
Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran
separados hasta que se produce daño tisular o autolisis, generando durante la
masticación los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000).
Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza,
(Kjaer, 1968) posteriormente fue encontrado en todas las Brassicáceas, y en la
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familias Caparaceae, Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se
ha encontrado en los hongos Aspergillus sydowi y Aspergillus niger , en la
bacteria Enterobacter cloacae, en tejidos de mamíferos y en los áfidos que
atacan crucíferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae. Pero estas enzimas
parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones y Rossiter,
1996).
S – Glu
R – C
NOSO3
H2O mirosinasa
S
R –C + D - Glu
NOSO3
Isotiocianatos nitrilos cianoepitioalcanos tiocianato
FIG. 1.- Hidrólisis de los glucosinolatos por la mirosinasa. (Fuente: Bonnes y
Rossiter. 1996. The Myrosinase – Glucosinolate System, its Organization and
Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97:194 -208 )
La degradación de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede
producir: a) isocianatos, cuando la hidrólisis se produce en un pH normal; b)
nitrilos, cuando la hidrólisis ocurre a pH ácido; c) cianoepitioalcanos, cuando la
mirosinasa se presenta con una pequeña proteína conocida como proteína
epitioespecificadora; d) tiocianatos, que son producidos solo por tres de los
glucosionatos que se dan en la naturaleza, los allyl, bencil, y 4-
(metiltio)butilglucosinolatos.
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MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel
separando varias isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de
Rhoeadales, cada especie tenia un patrón diferente con 1 a 4 bandas. También
encontraron que este patrón variaba de acuerdo a la parte de la planta de la cual
se hicieran los extractos.
Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrón de estas
enzimas puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino también de acuerdo
al órgano y edad de la planta, pero se sabe poco de la razón fisiológica de esta
diferencia.(Bonnes y Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas
particulares corresponden a condiciones endógenas encontradas en las plantas,
o al organismo blanco o a los glucosinolatos que predominan en el
tejido.(Bonnes y Rossiter, 1996).
III.2.2.- ALCALOIDES
Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos
secundarios de moléculas no relacionadas entre sí, siendo de gran importancia
económica debido a sus propiedades farmacológicas, las mismas que han sido
usadas desde la prehistoria hasta la actualidad. Son los metabolitos mas
frecuentes en el reino vegetal, habiéndose encontrado cerca de 10,000
alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con flores,
principalmente dicotiledóneas herbáceas (Hopkins, 1999).
Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias básicas con uno o
más átomos de nitrógeno en su sistema cíclico, que manifiestan actividad
farmacológica (Lock, 1994)
La mayoría de los alcaloides provienen del metabolismo de los
aminoácidos, principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque
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algunos alcaloides se encuentran en varios géneros o aún en una familia, la
mayoría de las especies presentan un patrón único, genéticamente
determinado. Por otro lado su distribución está restringida a determinados
órganos de la planta, como raíces, hojas o frutos jóvenes (Hopkins, 1999).
No se ha determinado aún cual es la función de los alcaloides en la
planta, aunque se le asignan rol defensivo, debido a que la mayoría son
amargos, lo cual es considerado universalmente como un carácter repelente.
Todos son biológicamente activos, muchos significativamente tóxicos y otros con
propiedades antibióticas. Frecuentemente los tejidos que acumulan alcaloides
son los más vulnerables, o son tejidos periféricos que pueden ser atacados por
herbívoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de las plantas no
contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los
organismos vivientes (Lock, 1994).
Para la extracción de alcaloides se aprovecha su carácter básico,
utilizando soluciones acuosas o alcohólicas ligeramente ácidas, para obtener el
extracto crudo de alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de
amoniaco y carbonato de sodio, para extraerlos luego con solventes
orgánicos.(Lock, 1994)
Las técnicas de separación de alcaloides más comunes son la
cromatografía de capa fina o delgada aunque en los noventa se generalizó el
uso de Sephadex LH-20 por elución y la cromatografía líquida de alta
perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son muy variados y el agente
revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya aplicación produce
manchas generalmente de color naranja (Lock 1994).
La Dra. Gloria Chacón, (1961, 1990) demostró la presencia de alcaloides
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en Lepidium peruvianum, para demostrar la acción fecundadora del extracto
alcaloideo de maca, lo inoculó en ratas obteniendo una marcada estimulación
de la maduración los folículos de Graaf y engrosamiento del endometrio.
Posteriormente Yllesca, (1994), en un estudio fitoquímico de la planta encontró
3 alcaloides en los extractos metanólico y butanólico de maca de los ecotipos
amarillo, rojo y negro. En 1993, Garró y col. obtuvieron cuatro fracciones de
alcaloides por cromatografía de capa fina. Por otro lado Dini y colb., (1994),
detectaron por cromatografía de capa fina de un extracto alcalino de polvo de
maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff.
Sin embargo la presencia de alcaloides en maca aún es discutida y no se ha
determinado su estructura.
III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS
El cultivo de tejidos como técnica consiste en aislar una porción de planta
y proporcionarle las condiciones apropiadas para que las células expresen su
potencial intrínseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas técnicas
mediante las cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se
cultiva asépticamente en un medio de composición definida y se incuba en
condiciones ambientales controladas. (Roca y Mroginski, 1991).
Los principios de esta técnica están contenidos en la teoría celular de
Schleiden y Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la
célula es capaz de tener autonomía y totipotencia, lo que fue demostrado en
células somáticas con la observación de la formación y cicatrización de callos en
áreas donde la planta sufre cortes (Gautheret, 1982).
Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron
realizados por el botánico alemán G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret
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1982), quien trabajó con células de palizada, pelos glandulares y pelos de
estambres de Tradescantia; pero aunque logró que las células sobrevivieran
entre 20 a 27 días, no tuvo crecimiento celular, probablemente debido a que
eligió nutrientes relativamente simples y a que eligió células altamente
diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recién en 1934, mucho después que en
1912 Carrel diseñara el método para cultivar células animales; que Gautheret
logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en
Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White
demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de raíces de tomate
(Dodds y Roberts 1982).
Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formación de
callos indiferenciados, que podían crecer ilimitadamente a través de subcultivos,
por lo que se puso mucho énfasis en la determinación de los requerimientos
nutricionales para el crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para
entonces ya se había descubierto la auxina IAA (Went, 1926, citado por
Gautheret, 1982) y en las décadas siguientes se estudiaron diversas sustancias
que favorecían el crecimiento celular de los tejidos cultivados in vitro (Gautheret
1982) se descubrió la kinetina y otras hormonas que recibieron el nombre de
citoquininas (Dodds y Roberts 1982) , hasta que en 1962, Murashigue y Skoog
propusieron una solución de minerales asociada a auxinas y citoquininas que
permite el crecimiento de la mayoría de tejidos (Gautheret 1982).
También se inició una serie de estudios en organogénesis e histogénesis,
que sentaron las bases de la micropropagación cuando Ball en 1946 descubrió el
principio de la propagación vegetativa determinando cuales eran los tipos de
meristemos que eran capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel
aplicó estos principios en la propagación clonal de orquídeas. (Gautheret 1982).
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Muir (1953 – 1954, citado por Dodds y Roberts 1982) encontró que los
callos que eran trasladados a un medio líquido se convertían en suspensiones
celulares, desarrollándose luego muchas técnicas de cultivo de células aisladas y
de otro tipo de cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y
cultivo de protoplastos y otros. (Dodds y Roberts 1982).
Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:
a) Estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines.
b) Bioconversión y producción de compuestos útiles.
c) Incremento de la variabilidad genética.
d) Obtención de plantas libres de patógenos.
e) Propagación de plantas.
f) Conservación e intercambio de germoplasma.
III.3.1.- CULTIVO DE CALLOS
El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante
usado, y la elección de éste dependerá del objetivo perseguido y la especie
vegetal utilizada. Para la obtención de callos se puede utilizar cualquier tipo de
explante que contenga células nucleadas, y éste se seleccionará en función a
razones prácticas como disponibilidad, facilidad de manipulación,
homogeneidad, baja contaminación, respuesta in vitro; esta respuesta puede
variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad ontogénica y
tamaño del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de
incubación empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa
amorfa desdiferenciada de células parenquimáticas de pared delgada (Dodds y
Roberts 1982), y sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en
otros desintegrándose a medida que el callo crece (Nuñez y Ochoa, 2000). Este
crecimiento depende de la relación entre la planta de origen, el medio de cultivo,
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las condiciones ambientales y el tiempo de incubación; algunos callos crecen
fuertemente lignificados y de textura dura, mientras otros se rompen fácilmente
en pequeños fragmentos, estos callos son llamados friables (Dodds y Roberts,
1995), estos callos son los mejores para la iniciación de cultivos celulares.
El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en
tres fases de desarrollo: Inducción, en la que el metabolismo es estimulado
antes de la mitosis; división celular en el que las células del explante revierten a
un estado meristemático; y por ultimo diferenciación celular y expresión de
algunas vías metabólicas que llevan a la formación de metabolitos secundarios
(Dodds y Roberts, 1995).
La formación de callos en plantas intactas, normalmente está controlada
por hormonas endógenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su
inducción in vitro en explantes vegetales sin causar estrés, depende de la
introducción de reguladores de crecimientos en el medio de cultivo (Nuñez y
Ochoa, 2000).
Los otros factores más importantes para el éxito de esta tecnología son:
el explante y el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y
opcionales que contenga. Los nutrientes esenciales consisten en las sales
inorgánicas, fuentes de carbono y energía, vitaminas y fitohormonas (Gamborg y
Shyluk, 1981). Otros componentes como compuestos nitrogenados, ácidos
orgánicos y sustancias complejas pueden ser importantes pero son opcionales.
Después de que el callo ha crecido por un tiempo en asociación con el
tejido original, es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en
el mismo medio por un tiempo prolongado lleva al agotamiento de los
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nutrientes, la gradual desecación del agente gelificante y a la acumulación de
metabolito que pueden resultar tóxicos para el callo (Dodds y Roberts, 1995).
Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis
semanas, con cultivos mantenidos en medio agar a 25°C o más, pero en
realidad este tiempo varía con la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts,
1995).
Carhuaz en 1997 (comunicación personal), indujo callos en maca,
utilizando un factorial de cuatro citoquininas (BAP, KIN, ZEA y 2ip) y cuatro
auxinas (IIA, IBA, NAA y 2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 ìM,
concluyendo que el 2,4-D en el rango de 0.1 – 10.0 ìM el regulador más
efectivo para promover la formación de callos, coincidiendo con Gamborg y colb.
(1981), quienes indican un rango óptimo de 1- 5 ìM para la acción del 2,4-D y
con Flick y colb. (1983), que también señalan al 2,4-D y a la kinetina como los
reguladores más efectivos para la inducción de callos en Brassicáceas.
III.3.2.- HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO
Se llama hormona o fitohormona a aquellas sustancias orgánicas
naturales que a bajas concentraciones ejercen una profunda influencia en los
procesos fisiológicos de la planta (Hopkins, 1999), mientras que las sustancias
sintéticas con las mismas propiedades son llamadas reguladores de crecimiento,
y no son consideradas como hormonas vegetales (Dodds y Roberts, 1995).
Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas,
ácido absícico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son
las mas usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con
poca frecuencia y generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual
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modo el ácido absícico y el etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y
Roberts, 1995).
En la familia Brassicaceae se encuentran muchas especies
económicamente importantes, en muchas de ellas se han inducido callos,
incluyendo a Brassica oleracea, B. napus y Arabidopsis thaliana, los
requerimientos para inducir callos en esta familia pueden ser cubiertos con
muchas hormonas, con un amplio rango de concentraciones, estas
concentraciones y la hormona a ser elegida, así como la respuesta de
crecimiento varía con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se
utiliza una auxina y una citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las
citoquininas la más usada es la Kinetina, mientras que la auxina utilizada con
más frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relación auxina:citoquinina más
eficiente para la inducción de callos es de 1 (Flick y colb. (1983).
III.3.2.1- AUXINAS
Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por
primera vez por Went en 1926, quien describió la acción elongadora del IAA en
coleóptidos de avena. Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las
cuales la más usada en cultivo de tejidos es el IAA, y otras sintéticas o
reguladores de crecimiento de las cuales las más usadas son el 2,4-D, el NAA y
el IBA (Krikorian, 1991).
Los efectos de las auxinas más importantes para el cultivo de tejidos son
el crecimiento celular y la elongación celular. Algunos tejidos sólo forman callos
en respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas
concentraciones de auxina para la iniciación del callo, aunque en el caso del 2,4-
D, se ha observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro.
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Este regulador es la auxina más efectiva para la proliferación de callos
usándose a concentraciones de 10-7 – 10-5 M y aún en ausencia de una
citoquinina exógena (Yeoman y Forche, 1980).
Además de inducir la proliferación celular, el 2,4-D tiende a suprimir la
morfogénesis del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de
diferenciación (Yeoman y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea
mas estudiada, la auxina mas usada en la obtención de callos en diferentes
explantes es el 2,4-D, sea junto a una citoquinina o a leche de coco (Morris y
Altmann, 1994).
III.3.2.2.- CITOCININAS
En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la
promoción de la citocinesis, el que se formaba por la descomposición parcial de
ADN, llamándolo cinetina (Kinetina, KIN) y propusieron el término cinina para
denominar las sustancias naturales y sintéticas que presentaban el mismo tipo
de actividad biológica. Posteriormente para evitar confusiones con la sustancia
usada en cultivo de tejidos animales, se optó por el nombre citocinina para
estas sustancias (Krikorian, 1991).
Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la división
celular en el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la división celular sincrónica a
las 18 h (Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la
formación de brotes e inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995).
Las citoquininas mas usadas son la kinetina y la zeatina, siendo
compuestos sintéticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y
Roberts, 1995).
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Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, así
algunos cultivos no requieren de una auxina exógena y otros requieren de una
auxina y no de una citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado
además que en todos los casos las citoquininas a altas concentraciones (10 –25
mg/l) inhiben la formación de callos (Yeoman y Forche, 1980).
En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicación personal) utilizó
un factorial de medios con cuatro auxinas (IAA, IBA, NAA, y 2,4-D) y cuatro
citoquininas ( BAP, KIN, ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100
µM, utilizando como explantes, la raíz, hoja, peciolo e hipocótilo.
III.3.3.- EL EXPLANTE
Los requerimientos hormonales para la iniciación del callo dependen del
origen del tejido aislado (explante), los explantes que contienen células del
cambium pueden formar callos sin adición de reguladores de crecimiento; pero
la mayoría de los explantes requiere de uno o más reguladores de crecimiento
para iniciar la formación de callos (Dodds y Roberts, 1995). Esta respuesta
también depende del estado fisiológico del tejido y del tiempo de escisión,
(Yeoman y Forche, 1980).
Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos
exógenos de la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y
citoquininas 4) extractos naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995).
III.3.4.- CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS
Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos
secundarios, pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a
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programas intensivos de mejoramiento genético y se presentan además
problemas técnicos y económicos para su cultivo (Dodds y Roberts, 1995).
El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos
secundarios cuya extracción a partir de las plantas que los producen puede
resultar difícil o económicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera
necesario, por el riesgo de sobreexplotación al que se expone el cultivo; por las
pequeñas cantidades de compuesto presente en la planta o por los controles a
los que se someten a las plantas productoras (Robert y colb., 1991). Por otro
lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar el cultivo de estas
plantas (Dodds y Roberts, 1995).
La noción de que una línea celular altamente productiva podía ser
seleccionada para generar compuestos útiles fue introducida en la década de
1970, en la década de los ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en
cooperación con la industria privada, produjeron shikonina de Lithospermum
erythrorhyzon y saponinas de ginseng respectivamente (Hara, 1996).
La producción de shikonina, un pigmento que se extrae de las raíces de la
planta asiática Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del
uso del cultivo de tejidos vegetales en la producción de metabolitos secundarios.
En la planta el rendimiento de shikonina, además de ser muy bajo, depende de
la distribución geográfica y el clima, habiendo sufrido una rápida disminución en
su población. Luego de establecer una estrategia de producción in vitro, la
empresa petroquímica Mitsui del Japón logró la primera producción industrial del
compuesto, vendiendo a 4000 dólares el kilo de shikonina producida in vitro
(Robert y colb., 1991).
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En la década de los noventa el número de compuestos producidos por
cultivo de tejidos aumentó y la mejora de la tecnología Hara permitió obtener
compuestos raros en los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta
tecnología es la producción comercial, por Kao, de un polisacárido tuberoso
usado en cosméticos (Hara, 1996).
Actualmente existen al menos tres programas de búsqueda de
compuestos con actividad biológica, llevados a cabo por las industrias
farmacéuticas, cada año varios cientos de plantas son colectados y se intenta en
ellas la inducción de callos, con un éxito de cerca al 50%. Cerca del 10% de los
callos muestra alguna forma de actividad ( Schripsema, y colb., 1996).
Todo el proceso desde la colección hasta la obtención de un compuesto
puro es estimado entre los 2 y 4 años. Algunos resultados de estas búsquedas
han sido publicados y patentados, como el alcaloide jatrorrhizina y los
dehidrodiconiferil alcohol glucósidos aislados de cultivos celulares de
Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y colb., 1996).
La búsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de
reducir el número de cultivos de interés, muchas veces el paso de callos a
suspensiones celulares representa una reducción considerable de los niveles de
ciertos metabolitos secundarios, ocurriendo algunas veces la pérdida completa
de productividad para ciertos productos, lo que no significa que los cultivos
celulares no sean capaces de producir compuestos de interés, por el contrario,
Ruyter y Stöckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996) demostraron que
los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos.
Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la producción de
metabolitos secundarios son las siguientes:
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• Producción a escala industrial
• Producción de sustancias difíciles de obtener por extracción o por síntesis
química
• Reducción de los costos de producción a largo plazo
• Eliminación de la dependencia en materia de importación
• Producción continua y controlada de sustancias independiente- mente de los
factores del medio ambiente.
• Precios estables
• Posibilidad de realizar la producción cerca de las fábricas de procesamiento
final y de los mercados.
Se ha estudiado también la posibilidad de aumentar significativamente la
productividad del cultivo usando un medio de inducción (para la producción de
los metabolitos secundarios) (Becker, 1987).
III.4.- CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es la técnica analítica usada para la separación de
mezclas y sustancias, por adsorción selectiva (Microsoft® Encarta® Online
Encyclopedia 2001) y fue descubierta por el botánico ruso Michael Tswett en
1903, quien descubrió que los pigmentos de las plantas podían separarse al
filtrarlos con éter de petróleo a través de una columna de carbonato de calcio.
Pero el desarrollo de esta técnica empieza realmente en 1931, cuando,
posteriormente otros investigadores introducen otros materiales como las
columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968).
Actualmente se usa un amplio rango de técnicas cromatográficas de
acuerdo a los adsorbentes usados, la cromatografía de columna utiliza sílica,
alúmina y sílica gel; en la cromatografía de capa fina el adsorbente se encuentra
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sobre un vidrio o una película plástica, mientras que en la cromatografía de
papel, una muestra líquida fluye sobre el papel adsorbente. Otras técnicas
cromatográficas son: la cromatografía gas-líquida, que permite la separación de
sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografía iónica donde un gas
puede ser descompuesto en iones que interactúan con el adsorbente; la
cromatografía de permeación de gel usa un adsorbente con poros de tamaño
uniforme, y finalmente, la cromatografía líquida de alto perfomance (HPLC)
donde el adsorbente es líquido, esta técnica es ampliamente usada
actualmente (Microsoft® Encarta® Online Encyclopedia 2001).
III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL
La electroforesis en gel es un método de separación, en el que las
partículas cargadas migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia
de un campo eléctrico aplicado externamente. Este movimiento se realiza en
interacción con la matriz circundante, la cual actúa como un filtro molecular,
generándose como consecuencia, tasas diferenciales de migración para las
proteínas contenidas en una muestra (Garfin, 1990).
Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de
papel y acetato de celulosa, y se utilizaron principalmente para separar
aminoácidos, péptidos y mezclas proteicas mal separadas por cromatografía
(Freifelder, 1979), los soportes pueden ser relativamente inertes, como papel,
acetato de celulosa, silicagel, alúmina y celulosa y actuar como tamices
moleculares como son los geles de almidón, agarosa y poliacrilamida (Hames,
1981, citado por Gálvez, 1990).
El método más utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida
(PAGE), por proporcionar un tamaño de poro controlable, ser repetible y de alta
resolución (Garfin, 1990).
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Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero
de acrilamida y un co-monómero de ligamiento cruzado, la N,N’-metilen-
bisacrilamida. Esta polimerización es catalizada por un sistema generador de
radicales libres, compuesto por persulfato de amonio, que actúa como iniciador,
y un acelerador, el tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formación de
radicales libres a partir del persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la
polimerización del gel (Garfin, 1990). Otro agente donante de radicales libres es
la riboflavina, pero a diferencia del persulfato de amonio requiere de luz y
oxígeno, agentes que convierten la convierten a su forma leuco, la cual inicia la
polimerización (Gálvez, 1990).
Los poros se forman por la naturaleza del enlace cruzado entre la
acrilamida y la bisacrilamida, y su tamaño disminuye a medida que la
concentración de acrilamida aumenta, determinando sus propiedades como
tamiz.
La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños,
formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para
proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas
de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso
molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre
los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a
que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma
movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante
(SDS – PAGE)(Garfin, 1990).
La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños,
formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para
proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas
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de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso
molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre
los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a
que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma
movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante
(Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes iónicos como el SDS (sodium
dodecyl sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la proteína de tal forma
que las proteínas migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este
caso deben ser tratadas con SDS y un tiol, como el mercaptoetanol. (Gálvez,
1990).
El método más popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en
1970 (Garfin, 1990), el cual consiste en un método discontinuo con dos tipos de
geles: un gel de separación y uno de concentración, ambos geles tienen
diferentes porosidades y pH, sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo,
donde la muestra se apila antes de pasar al gel de separación que se halla
inmediatamente debajo y que posee un tamaño de poro más pequeño. Además,
se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos, esta discontinuidad
permite concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel de concentración,
resultando en una mejor resolución (Laemmli, 1970).