Caractérisation de l’écosystème broncho-pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose : Structure et

Dynamique du microbiote pulmonaire dans l’évolution clinique de la mucoviscidose

1BDEEP-EA4547, CIIL – Institut Pasteur Institute de Lille, CHRU - Faculté de Pharmacie, Lille ; 2LMGE-ULCO Laboratoire d'Océanologie et de Géoscience, Wimereux, 3CHRU de Lille, 4CHU de Nice,

5Département de microbiologie, APHP Créteil - France.

L. Delhaes1-3, M. Chabé1, S. Monchy2, J. Salleron3, S. Leroy3-4, A. Prévotat3, B.Wallaert3, E. Dei-Cas1-3, E. Viscogliosi1, F Botterel5

Introduction

Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique- Troubles respiratoires: 1er motif de consultation dans le monde- BPCO: 4ème cause de décès dans le monde en 2030 selon l’OMS

- Asthme: constante augmentation [↑ prévalence de 7,3% à 8,4% - 2001-10 aux USA] - Mucoviscidose: Maladie génétique la + fréquente chez les caucasiens

(CHU de Rouen)

Rabe et al. « The year of the lung ». Lancet 2010 Akinbami et al. NCHS Data Brief , 94 -May 2012

-Diversité microbienne au niveau pulmonaire = Microbiote [Beck et al. 2012; Erb-Downward et al. 2011; Huang et al. 2011]

-Dans la mucoviscidose, cette communauté poly-microbienne semble être un élément clé dans l’évolution de la fonction respiratoire [Goddard et al. 2012; Madan et al. 2012; Fodor et al. 2012; Maughan et al. 2012; Guss et al. 2011; van der Gast et al. 2011; Rogers et al. 2010; Armougom et al. 2009; Bittar et al. 2008; Sibley et al. 2008; Tunney et al. 2008; Harris et al. 2007]

Fonction respiratoire : Enjeu de demain en santé publique- Troubles respiratoires: 1er motif de consultation dans le monde- BPCO: 4ème cause de décès dans le monde en 2030 selon l’OMS

- Asthme: constante augmentation [↑ prévalence de 7,3% à 8,4% - 2001-10 aux USA] - Mucoviscidose: Maladie génétique la + fréquente chez les caucasiens

Introduction

(CHU de Rouen)

Rabe et al. « The year of the lung ». Lancet 2010 Akinbami et al. NCHS Data Brief , 94 -May 2012

Quel(s) champignon(s) à l’étage pulmonaire ?

Mucoviscidose:

Introduction

Notion de co-colonisationco-infection pulmonaire

Objectif : Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?- Micromycètes+++- BactériesLe microbiote pulmonaire d’un patient

CF est-il stable dans le temps ?

La diversité et la richesse du microbiote pulmonaire est-elle associée à l’état

clinique du patient CF ? …⇒ Déterminer la structure/composition de la communauté microbienne

en utilisant les approches de séquençage haut-débit

Quel(s) champignon(s) à l’étage pulmonaire ?

Extraction d’ADN dépendante de la matrice

PCR ciblant des gènes conservés pour amplifier des espèces phylétiquement éloignées

(V3 du 16s rDNA – ITS2)

Séquençage massif (multi-parallélisé) - obtention de plusieurs centaines de milliers de séquences

Analyse bio-informatique Identification par comparaison à 2 banques de données

(BLASTN ≠ Silva SSU rRNA database release 102 et ≠ ITS2dbScreen (création de novo)

Assignement et regroupement des séquences (attribution à espèce/genre)

Permettant une interprétation biologique (comparaison de diversité grâce au logiciel MEGAN)

Stratégie méthodologique

Mucoviscidose Expectoration

- Pyroséquençage (454 FLX)

-326 277 pyroséquences /450-500 bp (93%) [V3 du 16s rDNA] -133 317 pyroséquences /300-450 bp (85%) [ITS2]

-Courbes de raréfaction ayant une distribution en plateau = bonne représen-tativité de la composition bactérienne et fongique

Résultats et Discussion

- 8 expectorations - 4 patients

Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?

Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?

Résultats et Discussion

Diversité bactérienne

Diversité fongique

Relation entre communauté microbienne / évolution clinique

Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?

Résultats et Discussion

Diversité bactérienne

Patient 2Mars 2008

Mars 2009

Confirmation la diversité bactérienne récemment décrite:

- Importance des anaérobies, des Pseudomonas, Streptococcus, Haemophilus, = genres majoritaires

Médiane [IQ] du nombre de bactéries = 6.5 [5; 13.5] (espèces/genres)

[Goddard et al. 2012; Madan et al. 2012; Fodor et al. 2012; Maughan et al. 2012; Guss et al. 2011; van der Gast et al. 2011; Rogers et al. 2010; Armougom et al. 2009; Bittar et al. 2008; Sibley et al. 2008; Tunney et al. 2008; Harris et al. 2007; Rogers et al. 2004].

Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?

Résultats et Discussion

Diversité fongiquePatient 2

Parmi les 24 espèces /genres de micromycètes identifiés par pyroséquençage, seuls 4 étaient aussi isolés en culture.

Mars 2008

Mars 2009

Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?

Résultats et Discussion

Diversité fongiquePatient 2

Mars 2008

Mars 2009

Médiane [IQ] du nombre de champignons par expectoration = 3.5 [3; 7.5] (espèces/genres) [Bouchara et al. 2009]

Patients 2

Pat. 3 (09/2007)

Patient 1 (01/2008)

Patient 4 (10/2008)

Pat. 3 (09/2008)

Patient 1 (01/2009)

Patient 4 (08/2008)

Richesse fongique (Chao1 index)

Richesse Bactérienne(Chao1 index)

S-K score= Score de Shwachman-Kulczycki

Indice de Masse corporelle (kg/m2)

Corrélation entre indexes de Chao1 (fongiques / bactériens) et S-K score et BMI (p<0.05).

Conforme aux données publiées pour les bactéries [van der Gast et al. 2011; Klepas-Ceraj et al. 2010].

Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?

Résultats et Discussion

Relation entre communauté microbienne / évolution clinique

% Capacité Ventilatoire Forcée (CVF)

VEMS1

Pat. 3 (09/2007)

Pat. 3 (09/2008)

Patient 1 (01/2008)Patient 1 (01/2009)

Patient 4 (10/2008)Patient 4 (08/2008)

Patients 2 (03/2008)

Patients 2 (03/2009)

Association entre indexes de Chao1 fongiques & bactériens et VEMS1, CVF (p<0.05)

Quel microbiote pour quel patient dans la mucoviscidose ?

Résultats et Discussion

Relation entre communauté microbienne / évolution clinique

Etude modeste (8 expectorations) mais prometteuse

Conclusion et Perspectives

Delhaes et al. PloS One 2012 ; 7 (4): e36313

⇒ Dans la mucoviscidose, composition du mucus = conditions favorables pour des co-infections chroniques :- Réduction de la tension en O2 favorise la croissance de P. aeruginosa, des anaérobies dont SMG, mais aussi de C. albicans et A. fumigatus-Capacité à former des biofilms, avec des interaction entre microorganismes

[Rybtke et al. 2011; Bandara et al. 2010; Mowat et al. 010; Sibley et al. 2008; Alvarez-Ortega et al. 2007; Dimitru et al. 2007; Semighini et al. 2006]

⇒ Microbiote (F/B) = évènement dynamique, indicateur de l’état clinique du patient ?

⇒ «Ecologie et dynamique des communautés microbiennes dans les expectorations des patients atteints de mucoviscidose sous ATB-thérapie: étude prospective multicentrique française par séquençage à haut débit » Projet C20120600697- F Botterel & L Delhaes -2013-14

Institut Pasteur-Lille / Université de Lille 2• Dr. Laurence Delhaes (laurence.delhaes@pasteur-lille.fr)• Dr. Eric Viscogliosi • Dr. Emilie Fréalle• Dr. Eduardo Dei-Cas• Dr. Magali Chabé

Université Littoral Côte d’Opale

• Dr. Sébastien Monchy

• Dr. Christine Hubans• Dr. Stéphanie Ferreira

Faculté de Médecine de Lille

• Dr. Julia Salleron• Dr. Sylvie Leroy• Dr. Anne Prévotat•Dr. Fréderic Wallet•Dr. Benoit Wallaert

• Dr. Télesphore Sime-Ngando

Université Blaise-Pascal-Clermont-ferrand

Société Genoscreen-Lille

Remerciements