Cariotipo umano

1956 Accertamento del no. di cromosomi, i 23 cromosomi dell’assetto aploide vengono suddivisi in 7 gruppi (A-G) sulla base delle dimensioni e della posizione del centromero

1970 Introduzione delle tecniche di bandeggio: diventa possibile individuare i singoli cromosomi

Braccio corto = p

Braccio lungo = q

Le bande vengono numerate con numeri progressivi dal centromero verso i telomeri

Cariotipo umano di un individuo di sesso maschile

Cariotipo umano di un individuo di sesso femminile

Bandeggio di un cromosoma umano a diversi livelli di risoluzione

UN PO’ DI NOMENCLATURA

46, XX cariotipo normale femminile46, XY cariotipo normale maschile

Anomalie di numero 45, X47, XX +2147, XXX

Anomalie di struttura

delezioni 46, XY, del(4)(p16.3)

46, XX, del(5)(q13q33)

inversioni 46, XY, inv(11)(p11p15)

duplicazioni 46,XX, dup(1)(q22q25)

inserzioni 46, XX, ins(2)(p13q21q31)

traslocazioni reciproche 46, XX, t(2;6)(q35;p21.3)

traslocazioni Robertsoniane 45, XY, der(14;21)

Genoma umano aploide

ca. 3000 Mb (= 3 x 109 bp)

Cromosoma X

ca. 155 Mb pari al 5% del genoma aploide, contiene più di 1000 geni molti dei quali housekeeping

Cromosoma Y

ca. 60 Mb pari al 2% del genoma aploide, contiene qualche decina di geni per lo più coinvolti nella formazione del testicolo e nella produzione di spermatozoi

Due zone di omologia X-Y poste alle due estremità dei cromosomi, vengono indicate con la sigla PAR (Pseudo Autosomal Region)

PAR1 (o primaria) estremità del braccio corto, è grande ca. 2.6 Mb

PAR2 (o secondaria) estremità del braccio lungo, è grande ca. 320 Kb

Queste due regioni, durante la meiosi maschile, si appaiano e vanno incontro a ricombinazionePAR1

PAR2

Perché si è ipotizzato l’esistenza di un meccanismo di compensazione del dosaggio genico (o più precisamente della differenza di dosaggio genico)?

1) Le aneuploidie dei cromosomi sessuali, a differenza di quelle a carico degli autosomi, sono compatibili con la vita, e, in alcuni casi, non comportano fenotipi anormali

47, XXX femmine normali, talvolta sterili

47, XXY (sindrome di Klinefelter) maschi sterili, talvolta con lieve ritardo mentale

45, X0 (sindrome di Turner), statura inferiore alla media, sterilità, altre anomalie di sviluppo generalmente non gravi

48, XXXX o XXXY sintomatologia più grave delle precedenti, ma comunque condizione compatibile con la vita

2) La quantità di prodotto genico di geni del cromosoma X è uguale in maschi e femmine, nonostante il fatto che i maschi abbiamo una sola copia del gene e le femmine due

Esempio attività enzimatica della G6PD (Glucosio-6-Fosfato Deidrogenasi)

Nei mammiferi, a differenza che in altri organismi (es.

Drosophila), la compensazione del dosaggio genico è

raggiunta attraverso l’inattivazione di uno cromosoma X

nelle cellule somatiche che ne contengono due

In cellule con aneuploidie dei cromosomi sessuali viene

mantenuto attivo un solo cromosoma X, questo spiega il

fenotipo pressoché normale di soggetti con cromosomi

sessuali in eccesso o in difetto

Agli inizi degli anni ’60 Mary Lyon ed Ernest Beutler sono

arrivati in modo indipendente a dimostrare l’esistenza

dell’inattivazione del cromosoma X

Beutler studio del gene Gd nell’uomo

Lyon studio di un gene che controlla il colore del

pelo nel topo

L’inattivazione è:

casuale (in media il 50% delle cellule inattiva l’X ereditato dal padre e il 50% quello ereditato dalla madre)

mantenuta clonalmente (le cellule figlie mantengono lo stesso pattern di inattivazione della cellula madre)

precoceCaratteristiche del cromosoma X trascrizionalmente inattivo:

mantiene attive alcune regioni (le due PAR ed altri geni

interspersi in regioni inattive)

assume un aspetto eterocromatico in interfase (corpo

di Barr)

acquista le caratteristiche del DNA inattivo

(metilazione dei residui di Citosina, ipoacetilazione degli

istoni, replicazione del DNA nella tarda fase S)

In cellule euploidi o con aneuploidie dei cromosomi sessuali, in interfase sono visibili 0, 1, 2 o 3 corpi di Barr a seconda del numero di cromosomi X presenti nella cellula

Il corpo di Barr è stato scoperto alla fine degli anni ’40 e, quando è stata scoperta l’inattivazione del cromosoma X, si è ipotizzato che potesse essere l’espressione morfologica dell’X inattivoCorpo di Barr struttura eterocromatica visibile in interfase addossato alla parete interna della membrana nucleare

Nucleo di una cellula in interfase con 1 corpo di Barr

Nucleo di una cellula in interfase con 3 corpi di Barr

Come avviene l’inattivazione?

Processo multi-step:

1) ‘conteggio’ dei cromosomi X presenti nella cellula (anche rispetto agli autosomi);

2) ‘scelta’ del(dei) cromosoma(i) X da inattivare, uno per ogni assetto diploide;

3) inizio dell’inattivazione;

4) sua diffusione alla quasi totalità del cromosoma;

5) mantenimento dello stato inattivo

l’inattivazione non è sequenza-specifica (sequenze autosomiche traslocate sull’X possono essere inattivate)

Tutte queste funzioni sono mediate da sequenze di DNA che si trovano nella

regione Xq13 e da loci autosomici

La regione Xq13 contiene quindi l’X-Inactivation Center (XIC), questa regione è stata suddivisa in sottoregioni coinvolte nei singoli step del processo di inattivazione

inizio anni ’90 identificazione del primo gene coinvolto nell’inattivazione

XIST (X Inactive Specific Transcript)

è l’unico gene espresso solo dal cromosoma X inattivo

codifica un RNA senza ORF di ca. 17 Kb che sembra rivestire il cromosoma X inattivo

Attualmente sono stati identificati altri geni necessari per il processo di inattivazione, ma le basi molecolari di questo fenomeno non sono

ancora completamente note

L’inattivazione è sempre casuale?

NO si osserva deviazione dalla casualità quando uno

dei cromosomi X della cellula porta una copia del

gene XIST (necessario per dare inizio

all’inattivazione) non funzionante

o quando si ha una traslocazione bilanciata X-

autosoma. In questi casi l’inattivazione è in origine

casuale, ma le cellule che inattivano l’X coinvolto

nella traslocazione inattiveranno anche geni

autosomali e questo le renderà selettivamente

svantaggiate rispetto alle altre cellule

Pattern di inattivazione nelle cellule della linea germinale: entrambi i cromosomi X degli oogoni

sono attivi, l’unico cromosoma X degli spermatogoni è inattivo

L’inattivazione del cromosoma X

è responsabile della grande

variabilità clinica delle malattie

dovute a geni che mappano su

questo cromosoma la gravità

del fenotipo clinico dipenderà

dalla proporzione di cellule che

hanno mantenuto attivo il

cromosoma X con l’allele mutante

Imprinting genetico

Espressione differenziale di materiale genetico a

seconda che esso sia stato trasmesso dal padre o

dalla madre. I geni soggetti a imprinting sono

presenti in duplice copia, ma di essi viene

espressa una sola copia

Espressione monoallelica di geni biallelici

Concetto contrario alle leggi di Mendel secondo le

quali l’origine materna o paterna di

un’informazione non ne influenza l’espressione

(equivalenza degli incroci reciproci)

Geni ‘imprintati’ nel padre sono silenziati durante la spermatogenesi la copia fornita dal padre non viene espressa, rimane attiva solo quella fornita dalla madre

Geni ‘imprintati’ nella madre sono silenziati durante la oogenesi la copia fornita dalla madre non viene espressa, rimane attiva solo quella fornita dal padre

pedigree di una malattia dovuta ad un gene soggetto a imprinting silenziato durante la oogenesi (è attiva solo la copia

fornita dal padre)

il rapporto maschi : femmine tra gli affetti è 1:1, una femmina malata non trasmette MAI la malattia, che può ricomparire però nei suoi nipoti (figli dei suoi figli maschi)

PROVE DELL’ESISTENZA DELL’IMPRINTINGesperimenti di trapianti di pronuclei nel topo: creazione di zigoti

androgenetici e ginogenetici

zigoti ginogenetici

2n cromosomi TUTTI di derivazione femminile

zigoti androgenetici

2n cromosomi TUTTI di derivazione maschile

embrioni abortivi – strutture extraembrionarie pressoché assenti, embrione quasi normale

embrioni abortivi – iperplasia del trofoblasto, embrione pressoché assente

CONTROLLI zigoti normali ottenuti con trasferimento di pronuclei

2n cromosomi, n forniti da un maschio e n da una femmina

embrioni normali – la manipolazione di per sé non impedisce il normale sviluppo

Esistono due patologie umane paragonabili agli zigoti ginogenetici e androgenetici:

teratomi, 2n cromosomi forniti SOLO dalla madre

mole idatiforme, 2n cromosomi forniti SOLO dal padre

I triploidi (3n cromosomi = 69) sono tutti abortivi, ma il fenotipo dei 2nP1nM è diverso da quello dei 2nM1nP, nei primi si osserva un’iperplasia delle strutture extraembrionarie e assenza dell’embrione vero e proprio, viceversa, nei secondi si hanno strutture extraembrionarie quasi assenti e embrione pressoché normale

Alcune disomie cromosomiche uniparentali (UPD) (entrambi i cromosomi di una coppia forniti dallo stesso genitore) hanno effetti fenotipici diversi dettati dal sesso del genitore che ha fornito la coppia di cromosomi

PROVE DELL’ESISTENZA DELL’IMPRINTING NELL’UOMO

Si stima che nell’uomo i geni soggetti a imprinting siano

dell’ordine di 200, si trovano sulle seguenti regioni cromosomiche:

6, 7q, 11p, 14q, 15q11-q13, 20

molto spesso i geni soggetti a imprinting sono

riuniti in cluster contenenti geni ‘imprintati’ nella

madre e geni ‘imprintati’ nel padre

i due cluster omologhi mostrano metilazione

differenziale (ma non sempre la metilazione è a carico

dell’allele non espresso)

nei cluster sono in genere presenti sia geni

strutturali (il loro prodotto finale è una catena

polipeptidica) sia geni che producono RNA non

codificanti

L’imprinting deve essere risettato ad ogni generazione

Sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) (1)

Malattia dovuta a un gene soggetto a imprinting nella madre (è attiva solo la copia fornita dal padre) causata da acquisizione di funzione. Il gene mappa in 11p15

P

M

P

M

P

M

Nei soggetti normali è espressa solo la copia paterna

La duplicazione sul cromosoma paterno ha come

conseguenza un raddoppiamento del prodotto

genico ed insorgenza della malattia

La duplicazione sul cromosoma materno è senza conseguenze perché la copia sovrannumeraria non viene

espressa

P

M

Sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) (2)

P

M

Una mutazione nel centro di imprinting impedisce il silenziamento del gene in cis

La mutazione è sul cromosoma paterno non si hanno conseguenze fenotipiche perché la copia che non può essere spenta è comunque destinata ad essere espressa

La mutazione è sul cromosoma materno l’individuo è malato perché ha due copie attive del gene

Sindrome di Prader-Willi (PWS) - malattia dovuta ad assenza della funzione del ‘gene’ PWS (si tratta di vari geni che per semplicità vengono qui considerati come un unico gene), ‘gene’ soggetto ad imprinting nella madre (è espressa solo la copia fornita dal padre) che mappa in 15q11-13

Sindrome di Angelman (AS) - malattia dovuta ad assenza della funzione del gene AS, gene soggetto ad imprinting nel padre (è espressa solo la copia fornita dalla madre) che mappa in 15q11-13, cioè nella STESSA regione del ‘gene’ PWS

Entrambe le malattie possono essere dovute a:

1. delezione dell’intera regione cromosomica 15q11-13;

2. disomia uniparentale (UPD) (materna nella PWS, paterna nella AS);

3. errore di imprinting;

4. solo per la sindrome di Angelman: mutazione nella copia materna del gene AS

PWS ASP

M

Pattern di espressione nel soggetto normale: sono espressi il ‘gene’ PWS del cromosoma paterno ed il gene AS del cromosoma materno

P

M

P

M

La delezione è sul cromosoma Paterno assenza della funzione del ‘gene’ PWS, si ha Sindrome di Prader-Willi

La delezione è sul cromosoma Materno assenza della funzione del gene AS, si ha Sindrome di Angelman

PWS ASP

P

Disomia Uniparentale (UPD) Paterna assenza funzionale del gene AS Sindrome di Angelman

PWS ASM

M

UPD Materna assenza funzionale del ‘gene’ PWS Sindrome di Prader-Willi

PWS ASP

M

mutazione nel centro di imprinting sul cromosoma P che non può essere risettato e viene trasmesso con un’impronta di tipo Materno assenza funzionale del gene PWS Sindrome di Prader-Willi

PWS AS

mutazione nel centro di imprinting sul cromosoma M che non può essere risettato e viene trasmesso con un’impronta di tipo Paterno assenza funzionale del gene AS Sindrome di Angelman

P

M

UPD = UniParental Disomy = disomia uniparentale entrambi gli omologhi di una coppia vengono ereditati dallo stesso genitore

Non si ha un’alterazione quantitativa rispetto al normale, ma per quel particolare cromosoma l’informazione genetica proviene da un solo genitore

Le UPD sono in genere dovute a recupero di una trisomia (un embrione trisomico che in una fase estremamente precoce dello sviluppo perde un membro della tripletta di omologhi)