UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR

CURSO DE FARMÁCIA - UNIDADE UNIVERSITÁRIA TOLEDO

CARLA INDIANARA BONETTI

PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO

EXTRATO DE Echinodorus grandiflorus

TOLEDO - PARANÁ

NOVEMBRO - 2018

CARLA INDIANARA BONETTI

PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO

EXTRATO DE Echinodorus grandiflorus

Trabalho de Conclusão do Curso apresentado à Banca

Examinadora do Curso de Graduação em Farmácia -

Universidade Paranaense - Unidade Universitária de Toledo,

como requisito parcial para a obtenção do título de

Farmacêutica, sob orientação do Prof. Me. Douglas Rossi

Jesus.

TOLEDO - PARANÁ

NOVEMBRO – 2018

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PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO

EXTRATO DE Echinodorus grandiflorus

Carla Indianara Bonetti1

Douglas Rossi Jesus2

1Acadêmica do Curso de Farmácia da Universidade Paranaense (UNIPAR) - Unidade Universitária

de Toledo. Endereço para correspondência: Rua Guaíra, 3676, Jardim La Salle, CEP: 85.902-220,

Toledo, Paraná, Brasil.

E-mail: carlaabonetti@gmail.com

Telefone: (45) 988347746

2Professor adjunto do curso de Farmácia da Universidade Paranaense (UNIPAR) - Unidade

Universitária Toledo. Endereço para correspondência: Avenida Parigot de Souza, 3636, Jardim

Prada, CEP: 85.903-170, Toledo, Paraná, Brasil.

Email: rossi@prof.unipar.br

Telefone: (45) 3277-8500

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me dado forças para superar todos os obstáculos que me foram

propostos neste ano.

Agradeço aos meus pais José e Edeleide as minhas irmãs Luzia e Sula e aos meus sobrinhos

Thales e agora o pequeno Rafael que sempre estiveram comigo, me dando forças e incentivando a

seguir em frente mesmo diante das dificuldades.

Agradeço aos meus orientadores, Douglas Rossi Jesus, Juliana Cristhina Friedrich e

Emerson Luiz Botelho Lourenço pela paciência e dedicação que tiveram comigo me guiando no

decorrer do trabalho e dando todo o suporte necessário.

Agradeço a minha amiga Mariana por ter me ajudado com as análises laboratoriais com

muito animo e incentivo.

Por fim agradeço a todas as pessoas que me ajudaram de forma direta ou indiretamente a

concluir este trabalho e que fizeram parte da minha formação.

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PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO

EXTRATO DE Echinodorus grandiflorus

Fitoquímica e atividade antimicrobiana de Echinodorus grandiflorus

RESUMO Echinodorus grandiflorus conhecida como chapéu-de-couro apresenta em decorrência de seu

metabolismo secundário propriedades farmacológicas como anti-inflamatório, antioxidante,

diurética, analgésica, antirreumática, anti-hipertensiva e com efeitos cardioprotetores. Desse modo,

o objetivo deste estudo foi determinar o perfil fitoquímico e avaliar a atividade antimicrobiana do

extrato de Echinodorus grandiflorus. Na análise do perfil fitoquímico, foram realizados testes

qualitativos simples para a identificação de taninos, alcaloides, flavonoides, antraquinonas,

esteroides, triterpenos, saponinas, polissacarídeos e cumarinas. Foi analisado também a

quantificação de taninos totais e flavonoides totais. Os testes antimicrobianos foram realizados

empregando o método de difusão em disco e concentração inibitória mínima (CIM) em microplacas

com 96 poços, utilizando extrato etanólico e hidroalcoólico obtido por maceração nas proporções

1:5 e 1:10. As cepas avaliadas foram Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

Lactobacillus casei, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida

albicans. Nos testes fitoquímicos detectou-se a presença de taninos, alcaloides, flavonoides e

saponinas. O Melhor rendimento foi observado para a extração por maceração 1:5

(3,2567±0,93531). A atividade antimicrobiana não foi comprovada frente aos organismos testados.

A fim de encontrar melhores resultados, novos estudos devem ser realizados, buscando o

isolamento de compostos fitoquímicos presentes na planta.

Palavras-chave: Chapéu-de-couro. Triagem fotoquímica. Atividade antimicrobiana.

PHYCHOCHEMICAL PROFILE AND EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL

ACTIVITY OF THE EXTRACT OF Echinodorus grandiflorus

Phytochemistry and antimicrobial activity of Echinodorus grandiflorus

ABSTRACT

Echinodorus grandiflorus known as leather-hat presents as a result of its secondary metabolism

pharmacological properties as anti-inflammatory, antioxidant, diuretic, analgesic, antirheumatic,

antihypertensive and with cardioprotective effects. Thus, the objective of this work was to

investigate the presence of flavonoids and total tannins and the antimicrobial activity of

Echinodorus grandiflorus. In the phytochemical profile analysis, simple qualitative tests were

performed for the identification of tannins, alkaloids, flavonoids, anthraquinones, steroids,

triterpenes, saponins, polysaccharides and coumarins. Quantification of total tannins and total

flavonoids was also analyzed. The antimicrobial tests were carried out using the method of disc

diffusion and minimum inhibitory concentration (MIC) in 96-well microplates using ethanolic and

hydroalcoholic extracts obtained by maceration in proportions 1: 5 and 1:10. The strains evaluated

were Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus casei, Bacillus cereus,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans. In the phytochemical tests the

presence of tannins, alkaloids, flavonoids and saponins was detected. The best yield was observed

for extraction by maceration 1: 5 (3.2567 ± 0.93531). The antimicrobial activity was not proven

against the organisms tested. In order to find better results, further studies should be performed,

seeking the isolation of phytochemical compounds present in the plant.

Keywords: Leather Hat. Photochemical screening. Antimicrobian activity.

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INTRODUÇÃO

O uso de plantas com a finalidade terapêutica vem desde as antigas civilizações. O

conhecimento empírico aprofundou-se, proporcionando a utilização de plantas na prevenção e cura

de doenças e seus sintomas. Porém, com o desenvolvimento científico e tecnológico, foi possível

realizar o estudo e a caracterização fitoquímica de plantas medicinais (SANTOS et al., 2016).

A necessidade de se conhecer os constituintes químicos da planta proporcionou estudos

voltados à biologia vegetal, que demonstrou a presença de metabólitos primários e secundários em

plantas (LÔBO et al., 2010; VALDEVINO et al., 2013).

O metabolismo primário é composto de um processo pouco variável à grande parte dos

vegetais e que leva à síntese de celulose, lignina, carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucleicos.

Em contrapartida, os metabólitos secundários apresentam-se em baixas concentrações e ficam

estocados em células específicas do vegetal. O que permite sua adaptação e probabilidade de

sobrevivência no meio ambiente (PENÃ et al., 2016; PEREIRA; CARDOSO, 2012).

A classificação dos metabólitos secundários se dá a partir da rota biossintética onde são

produzidos, sendo divididas em três principais grupos de moléculas: os compostos fenólicos,

terpênicos e esteróides, e os alcaloides (FUMAGALI et al., 2008). Os metabólitos secundários

vegetais destacam-se na área da farmacologia devido a seus efeitos biológicos sobre a saúde da

espécie humana, podendo possuir atividade antimicrobiana, anti-inflamatório, antioxidante,

diurética, analgésica, antirreumática, anti-hipertensiva e anticolesterolêmica (PEREIRA;

CARDOSO, 2012).

Os métodos extrativos para obtenção de metabólitos secundários incluem maceração,

infusão, percolação, decocção, extração contínua quente (Soxhlet), extração em contra-corrente,

extração assistida por micro-ondas, ultra-som, fluido supercrítico e turbólise. Além dos métodos

extrativos, são diversos os fatores que influenciam na extração, como a parte do material vegetal

utilizada, a origem deste, o grau de processamento, o tamanho da partícula, o solvente utilizado, o

tempo de extração, temperatura, polaridade e concentração do solvente. O solvente utilizado e a

polaridade podem afetar a transferência de elétrons e de átomos de hidrogênio, que é aspecto

importante na extração de polifenóis (OLIVEIRA et al., 2016).

Estudos têm demonstrado a atividade antimicrobiana de extratos vegetais de diferentes

espécies de plantas. A fitoterapia está inserida como uma das principais alternativas devido à maior

facilidade de acesso pela população, uso disseminado, custo não oneroso e eficácia comparável aos

medicamentos sintéticos. Os extratos vegetais podem revelar grande potencial contra doenças pela

ação sinérgica ou individual de compostos provenientes de seu metabolismo secundário, como os

flavonoides, os taninos, os carotenoides, os glicosídeos, os alcaloides e outros (BAPTISTA, 2012).

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O grande interesse por medicamentos fitoterápicos é explicado em parte pelo uso

indiscriminado de antibióticos que tem selecionado microrganismos multirresistentes e

consequentemente, a necessidade de se buscar novas substâncias antimicrobianas (ROZATTO,

2012).

A resistência antimicrobiana é considerada um problema de saúde global, que compromete a

efetividade dos antibióticos inviabilizando o tratamento de infecções comuns, pode estar

relacionada ao abuso na utilização de fármacos com ação bactericida, bacteriostática ou antifúngica,

onde a falta de conhecimento e a automedicação promovem a indução desse fator (OLIVEIRA et

al., 2013).

A resistência ocorre quando microrganismos sofrem mutação genética ao serem expostos a

drogas antimicrobianas, recebendo o nome de “superbactérias” (FRACAROLLI et al., 2017).

Durante o fenômeno de mutação as bactérias estão protegidas dos efeitos antimicrobianos, pois

alteram os seus sítios receptores de captação dos fármacos, bem como produzem enzimas e

proteínas que impedem a ação dos antimicrobianos, isso irá ocasionar uma multiplicação bacteriana

e impedirá o tratamento e cura de doenças (PEREIRA; CARDOSO, 2012; FRACAROLLI et al.,

2017).

Dentre os principais microrganismos que sofrem resistência a antibióticos, têm-se o

Staphylococcus aureus resistente à meticilina, Streptococcus pneumoniae não susceptível à

penicilina, Enterococcus resistente à vancomicina, Enterobacteriaceae produtoras de beta-

lactamase de amplo espectro, Pseudomonas aeruginosa resistente à macrolídeos e Escherichia coli

resistente à estreptograminas (COSTA; SILVA JUNIOR, 2017).

Estudos recentes têm demonstrado a atividade antimicrobiana de diferentes extratos

vegetais. Entre eles, os extratos de Echinodorus grandiflorus (Alismataceae), popularmente

conhecida como “chapéu de couro”, cresce em vários solos úmidos como cobertura vegetativa de

apoio. As partes utilizadas da planta são as folhas que habitualmente são administradas via oral por

infusão aquosa. Atividades farmacológicas descritas na literatura apontam sua eficácia como anti-

inflamatório, antioxidante, diurética, analgésica, antirreumática, anti-hipertensiva e com efeitos

cardioprotetores (PRANDO et al; 2015).

Estudos utilizando as folhas de Echinodorus grandiflorus tem evidenciado baixo potencial

antimicrobiano da espécie, atuando sobre algumas cepas de microrganismos. Foi relatado atividade

do extrato aquoso para Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella tyfhimurium. Em

relação ao extrato metanólico apresentou atividade para Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e

Micrococcus luteu, isto se deve ao fato de que as folhas possuem quantidades relevantes de taninos

e polifenóis (BRUGIOLO, 2010). Porém, poucos estudos têm sido relatados quanto à atividade

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antimicrobiana de suas folhas. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo determinar o perfil

fitoquímico e avaliar a atividade antimicrobiana do extrato de Echinodorus grandiflorus.

MATERIAL E MÉTODO

Coleta e preparo da amostra vegetal

O material botânico foi coletado no Horto de Plantas Medicinais da UNIPAR (Universidade

Paranaense), campus Umuarama (Brasil) a 430 m de altitude em relação ao nível do mar

(S23º47’55-W53º18’48). As folhas foram coletadas de setembro a dezembro de 2017.

O material vegetal foi seco em estufas com circulação forçada de ar à ± 37ºC por cinco dias.

Após a secagem, o material foi submetido à trituração. A pulverização foi realizada em trituradores

industriais, e, em seguida, o material foi acondicionado em sacos duplos, de polietileno na parte

interna e de papel Kraft na parte externa, até o preparo dos extratos brutos.

Um exemplar da espécie em estudo, foi identificada e catalogada sob número 2230 no

herbário do Horto de Plantas Medicinais da UNIPAR campus Umuarama – PR.

Triagem fitoquímica

Os testes fitoquímicos consistiram em reações químicas qualitativas simples, executadas em

triplicata, que demonstraram a presença de compostos orgânicos. As análises para a determinação

de taninos, alcaloides, flavonoides, antraquinonas, saponinas, esteroides e triterpenos, foram

baseadas na metodologia descrita pela Sociedade Brasileira de Farmacognosia (2009), com

alterações. Para o teste de polissacarídeos, foi empregada a técnica relatada por Teixeira et al.

(2012), para a determinação de cumarinas, utilizou-se o protocolo citado por Gonçalves e Lima

(2016). E para a determinação de flavonoides totais foi utilizado método espectrométrico proposto

por Woisky e Salatino (1998).

Taninos

Em um béquer, ferveu-se 5 g de Echinodorus grandiflorus em pó juntamente a 50 mL de

água destilada, por 15 minutos. Este filtrado em seguida foi dividido em quatro tubos de ensaio

devidamente identificados, sendo que no primeiro e segundo tubos, foram inseridos 2 mL do extrato

bruto hidroalcoólico, e no terceiro e quarto tubos, foram inseridos 5 mL do extrato. No primeiro

tubo, foram adicionadas 2 gotas de ácido clorídrico (HCl) diluído e solução de gelatina a 2,5% gota

a gota. O resultado positivo se deu por meio da formação de precipitado. No segundo tubo, foram

inseridos 10 mL de água destilada e 2 a 3 gotas de cloreto férrico (FeCl3) a 1% em metanol. O

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resultado se deu através da coloração, onde a cor azul determinou a presença de taninos

hidrolisáveis ou gálico e a cor verde, taninos condensados ou catéquico. No terceiro tubo, foram

acrescentados 10 mL de solução de ácido acético (C2H4O2) a 10% e 5 mL de solução de acetato de

chumbo [Pb(C2H3O2)2] a 10%. A presença de taninos hidrolisáveis se deu pela formação de

precipitado esbranquiçado. O quarto tubo foi utilizado como controle.

Saponinas

Em um béquer, ferveu-se 2 g de Echinodorus grandiflorus em pó com 20 mL de água

destilada por 2 minutos. Após resfriada, a mistura foi filtrada e transferiu-se 15 mL do filtrado para

um tubo de ensaio. Do primeiro tubo retirou-se 5 mL do extrato, sendo transferido para um segundo

tubo, acrescentando 5 mL de água destilada. Do segundo tubo, foram retirados 5 mL e colocados

em um terceiro tubo, acrescentando 5 ml de água destilada. Em seguida, agitou-se rapidamente os

três tubos por 15 segundos. A formação de espuma por mais de 15 minutos confirmou a presença de

saponinas.

Esteroides/Triterpenos

Em um béquer, contendo 2 g de Echinodorus grandiflorus em pó adicionaram-se 20 mL de

etanol 70%, foi realizada a fervura durante 2 minutos, posteriormente foi efetuada a filtração por

algodão e transferidos 5 mL do extrato para um cadinho. Em seguida, evaporou-se o extrato em

banho-maria (FISATOM, modelo 550), até obtenção de resíduo seco, onde foi adicionado 0,5 mL

de anidrido acético [(CH3CO)2O], agitando com um bastão, seguido da adição de 0,5 mL de ácido

sulfúrico concentrado (H2SO4). Após foi observado a coloração, sendo azul ou verde para esteroides

e lilás, púrpura ou castanha-avermelhada para triterpenos.

Alcaloides

A pesquisa destes compostos baseou-se no método de precipitação utilizando os Reativos

Gerais de Alcaloides (RGA): Bertrand, Bouchardat, Dragendorff e Mayer, verificando a formação

de precipitado insolúvel e floculoso. Em um béquer, contendo 2 g do pó de Echinodorus

grandiflorus foram adicionados 20 mL de ácido clorídrico (HCl) a 1%, em seguida foi realizado o

aquecimento da mistura por 2 minutos, seguida da filtração por algodão. O filtrado foi distribuído

em 4 tubos de ensaio (3 mL por tubo), então foram adicionadas 2 gotas de cada RGA, observando a

ocorrência de precipitado.

Flavonoides

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Em um béquer, aqueceram-se em banho-maria (FISATOM, modelo 550), 1 g de

Echinodorus grandiflorus em pó com 10 mL de solução de etanol a 70%, por 2 minutos, logo após

realizou-se a filtração por algodão. Em seguida, em um tubo de ensaio, contendo 2 mL do extrato

alcoólico, adicionou-se seis fragmentos de magnésio metálico. Após foi adicionado 1 mL de ácido

clorídrico concentrado. Na presença destes compostos foi observado o aparecimento da coloração

rósea a vermelha.

Flavonoides Totais

Transferiu-se 150 µL do extrato fracionado para um tubo de ensaio embrulhado em papel

alumínio contendo 3.850 µL de álcool metílico e 1.000 µL de solução metanólica de Cloreto de

Alumínio a 5%. Após 30 minutos no escuro foi realizada a leitura em espectrofotômetro Pró-

Análise (UV-1600/1800) a 425 nm frente ao branco. Os flavonoides totais foram quantificados

utilizando-se curva padrão de Quercetina. As amostras foram avaliadas em triplicata e os valores

expressos em média ± desvio padrão.

Curva de padrão de quercetina

Pesou-se 10 mg de quercetina em balão volumétrico de 100 mL e completou-se o volume

com metanol. Desta solução-mãe, pegou-se balões de 10 mL onde foram realizadas 5 diluições.

Sendo que foram retiradas respectivamente as seguintes concentração: 0,25%, 0,5%, 1%, 2% e 4%.

Todas estas diluições foram completadas em balão volumétrico de 10 mL com metanol até

completar o menisco e posteriormente pegou-se 4 mL da solução + 1 mL de cloreto de alumínio 5%

e realizada a leitura em espectrofotômetro Pró-Análise (UV-1600/1800) a 425 nm frente ao branco.

Antraquinonas

Em um béquer, contendo 0,2 g de Echinodorus grandiflorus em pó foi adicionado 10 mL de

ácido sulfúrico 2 Normal (N), e ferveu-se durante 2 minutos. Após resfriado o extrato foi filtrado

para um funil de separação. Em seguida foram adicionados 10 mL de éter etílico, fez-se a agitação e

separação da camada etérea para um tubo de ensaio. A coloração amarela sugeriu a presença de

antraquinonas. Posteriormente foram adicionados 2 mL de solução aquosa de hidróxido de sódio 2N

e agitado. Após a separação das fases, observou-se a presença de uma camada rósea ou vermelha, e

a etérea incolor, confirmando a presença de antraquinonas.

Polissacarídeos

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Na pesquisa adicionaram-se 2 mL do extrato bruto hidroalcoólico em um tubo de ensaio,

acrescentando 2 mL de Lugol. O surgimento de coloração azulada indicou a presença de

polissacarídeos.

Cumarinas

Foram inseridos 2 mL do extrato bruto hidroalcoólico em um tubo de ensaio, sendo este

posteriormente vedado com papel filtro impregnado com solução de hidróxido de sódio (NaOH) a

10%. O tubo foi levado ao banho-maria a 100ºC por 10 minutos. O papel filtro foi removido do

tubo e examinado por meio de luz ultravioleta (UV) a 100 nm de comprimento de onda. A presença

de cumarinas foi identificada pela fluorescência amarela ou verde.

Métodos de extração

Preparo dos Extratos Vegetais

Seguindo a metodologia de Oliveira et al. (2016), para os cinco métodos extrativos

propostos foi utilizado a mesma proporção da droga vegetal com o solvente extrator a qual foi de 10

g para 100,00 mL. Foram utilizados dois solventes diferentes nas extrações, o primeiro utilizando

etanol 90% e o segundo utilizando solvente hidroalcoólico 70% e todos os 10 extratos vegetais

foram filtrados e concentrados em rota-evaporador.

Métodos a frio

Turbólise

O extrato bruto por turbólise foi preparado utilizando equipamento liquidificador (Britânia)

por um período de 10 minutos a 4000 rpm em temperatura ambiente.

Maceração

O extrato bruto obtido por maceração foi preparado utilizando frascos ambares fechados

hermeticamente por um período de 7 dias sem iluminação agitando-se uma vez ao dia.

Métodos a quente

Decocção

O extrato bruto por decocção foi elaborado utilizando frascos ambares em banho-maria a

90°C por um período de 15 minutos. Garantindo a ebulição do solvente utilizado.

Infusão

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Para estas extrações, os solventes foram levados até a temperatura de ebulição, e, após este

processo, foram vertidos em frascos âmbares que continham o material vegetal e tampados por 30

minutos.

Soxhlet

Para elaboração do extrato bruto obtido por Soxhlet foi observado a limpidez do solvente

extrator, o que caracterizou como a extração total, totalizando aproximadamente 8 horas de

extração.

Determinação do resíduo seco

1,00 mL de cada extrato foi exatamente medido e transferido para cápsulas de porcelana,

previamente taradas. As cápsulas foram colocadas em estufa sob temperatura de 105 °C, até a

secura e peso constante. As cápsulas foram novamente pesadas e calculados o teor de sólidos em 10

g da droga vegetal e o desvio padrão.

Análise estatística

Todos os ensaios seguiram o delineamento inteiramente casualizado, conduzidos em

triplicata. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as diferenças

significativas entre as médias (p≤0,05) determinadas pelo teste de Scott-Knott com auxílio do

software SISVAR – DEX – UFLA.

Microrganismos

Os microrganismos utilizados nos testes foram as bactérias Gram-positivas Staphylococcus

aureus, Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus casei e Bacillus cereus e Gram-negativas

Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa e a levedura Candida albicans. Para os testes

realizados, os microrganismos foram cultivados separadamente em placas contendo caldo Müeller

Hinton para as bactérias e ágar Sabouraud para o fungo, sendo incubados em estufa a 36ºC por 24

horas. Após este período, preparou-se uma suspensão padrão de cada espécie dos microrganismos

em fase logarítmica de crescimento (LOG), utilizando solução salina estéril a 0,9%, comparando a

turvação da suspensão com a escala 0,5 de Mac Farland.

Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Seguindo a metodologia descrita por Colacite (2015), com modificações, utilizou-se

microplaca com 96 poços, sendo adicionado em cada um dos poços 100 µL de caldo Müller Hinton.

Nos primeiros poços, adicionaram-se 100 µL das soluções estoque de 40000 µg/mL do extrato e

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frações, obtendo a concentração de 20000 µg/mL. Procedeu-se a diluição seriada nos oito poços

consecutivos, retirando 100 µL do poço de maior concentração para o poço seguinte, até atingir a

concentração de 39,06 µg/mL. A partir das suspensões padrão das espécies bacterianas empregadas

no estudo, realizou-se uma diluição 1:10 e pipetaram-se o equivalente a 5 µL em cada um dos

poços. Para o controle negativo, em um dos poços, foram adicionados 100 µL do caldo Müller

Hinton e 100 µL do extrato na maior concentração. E para o controle positivo, foram pipetados 100

µL do caldo Müller Hinton, e 5 µL da suspensão bacteriana. As placas, devidamente identificadas,

foram incubadas em estufa a 36ºC por 24 horas. A CIM foi determinada pela maior diluição que

inibiu o crescimento microbiano, sendo caracterizado pela ausência de turvação no respectivo poço.

Os testes foram realizados em duplicata.

Atividade antifúngica

De acordo com o método descrito por Desoti et al. (2011), com modificações, utilizaram-se

placas contendo ágar Sabouraud, sendo adicionados sobre as placas, com o auxílio de alça de

Drigalski, cerca de 100 µL da suspensão padrão da espécie fúngica. Foram aplicados sobre o ágar,

discos brancos e rosas estéreis com diâmetro de 6 mm, de forma equidistante. A partir da solução

estoque de 40000 µg/mL do extrato, foi realizada uma diluição seriada, obtendo as concentrações

de 20000 µg/mL, 10,000 µg/mL, 5000 µg/mL, 2500 µg/mL, 1250 µg/mL, 625 µg/mL, 312,5

µg/mL, 156,25 µg/mL, 78,12 µg/mL e 39,06 µg/mL. Em um dos discos foram pipetados 10 µL de

solução salina estéril a 0,9% como controle negativo. Para o controle positivo, utilizaram-se 10 µL

do extrato na maior concentração. Nos demais discos, foram pipetados 10 µL do extrato bruto

diluídos nas diferentes concentrações. As placas foram incubadas em estufa a 27ºC por 24 horas e a

determinação da atividade antifúngica dos extratos foi verificada pela medida dos halos de inibição

formados em milímetros (mm), utilizando um paquímetro. Os testes foram realizados em triplicata.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os metabólitos secundários são exemplos de compostos que são produzidos em resposta a

diversos fatores ambientais. Estes apresentam distribuição restrita, alguns são exclusivos a uma

espécie ou a um grupo de espécies relacionadas, a formação desses dá-se por vias de biossíntese que

derivam do metabolismo primário do carbono, via os intermediários principais, o ácido chiquímico

e o acetato (ROCKENBACH et al., 2018).

Os testes fitoquímicos foram realizados por meio de análise qualitativa simples. A partir de

folhas secas trituradas foi realizado um extrato hidroalcoólico de Echinodorus grandiflorus, foram

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obtidos resultados positivos para taninos, saponinas, flavonoides e alcaloides, conforme apresentado

na Tabela 1. Esses achados condizem com os resultados encontrados por Brugiolo (2010), que

mostram a presença de alcaloides, flavonoides, saponinas, taninos, além de glicídios, terpenos,

triterpenos e glicosídeos cardiotônicos.

Brito (2014) em uma análise fitoquímica utilizou extrato hidroalcoólico das folhas de

Echinodorus grandiflorus e detectou a presença de taninos, flavonas, xantonas, chalconas, auronas,

saponinas e alcaloides. Já Gasparotto et al., (2018) detectaram a presença de diferentes classes de

metabolitos secundários, incluindo alcaloides, taninos, terpenoides e saponinas. Esses achados

corroboram com os resultados encontrados na pesquisa.

Tabela 1: Triagem fitoquímica do extrato hidroalcoólico de folhas de Echinodorus grandiflorus.

Classe de compostos fitoquímicos Resultados

Taninos Gelatina

Cloreto Férrico

Acetato de Chumbo

++

++

+++

Alcaloides Bertrand

Bouchardat

Dragendorff

Mayer

++

++

++

+

Flavonoides Magnésio metálico

HCl concentrado

++

Antraquinonas Álcool etílico

Hidróxido de sódio 2N

-

Esteroides -

Triterpenos -

Saponinas +++

Polissacarídeos -

Cumarinas -

O sinal (+) indica a presença do composto fitoquímico, sendo (+++) Muito; (++) Médio; (+) Pouco; (-)

Ausente.

Para identificação em cruzes foi utilizado padrões de comparação, no qual se utilizou os

seguintes: Taninos: Barbatimão (Stryphnodendron adstringens); Alcaloides: Guaraná (Paullinia

cupana); Flavonoides: Faveiro (Dimorphandra mollis); Saponinas: Erva-Mate (Ilex

paraguariensis).

Taninos:

Divididos em dois grupos estruturais, os taninos podem ser classificados em hidrolisáveis e

condensados. São polifenóis sintetizados por plantas, e possuem a capacidade de precipitar

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proteínas (ALESSANDRO et al., 2018). Farmacologicamente, os taninos possuem propriedades

anti-inflamatórias, antialérgicas, antioxidantes, antimicrobianas, antitrombóticas e cardiovasculares

(SIQUEIRA, 2011). Os taninos hidrolisáveis apresentam ligações ésteres e possuem maior

capacidade de se ligarem às proteínas, eles podem ser degradados por hidrólise química ou

enzimática em várias unidades estruturais que os compõem, diminuindo ou eliminando a

capacidade de ligação com proteínas. Já os taninos condensados não são degradados pelos

processos enzimáticos naturais e seu alto peso molecular diminui sua capacidade de ligação com as

proteínas, promovem coloração vermelha em diversas plantas (MEZZOMO et al., 2015). A

presença de taninos foi constatada no estudo fitoquímico, conforme apresentado na Figura 1.

Figura 1: Determinação fitoquímica de

taninos. Tubo 1 (extrato + solução de gelatina

a 2,5%), Tubo 2 (extrato + água destilada +

solução de cloreto férrico a 1% em metanol),

Tubo 3 (extrato + solução de ácido acético a

10% + solução de acetato de chumbo a 10%),

Tubo 4 (extrato puro).

Flavonoides:

Considerado um dos grupos mais importantes de compostos orgânicos obtidos a partir do

metabolismo secundário de plantas, os flavonoides são majoritários na Echinodorus e agem na

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proteção do vegetal contra a ação de agentes oxidantes, radiação ultravioleta (UV), microrganismos

e inibição enzimática (FLAMBÓ, 2013). Além de auxiliarem o vegetal, os flavonoides apresentam

ainda potencial para atividades farmacológicas como antioxidantes, antimicrobiana,

anticarcinogênica, cardiovascular e anti-inflamatória (TORRES, 2018). A Figura 2 indica a

presença deste composto devido à formação de coloração rósea avermelhada.

Figura 2: Determinação fitoquímica de flavonoides.

Tubo 1: Controle; Tubo 2, 3 e 4: Presença de flavonoides

realizado em triplicata.

Flavonóides totais:

O teor de Flavonóides Totais foi obtido por espectrometria a λ = 425 nm (Woyski; Salatino,

1998), a curva padrão obtida foi y = 3,5195 x-0,0051 - R² = 1.

Os flavonoides totais foram quantificados utilizando-se curva padrão da Quercetina, onde se

obteve 1,20 ± 0,001% de flavonoides (Tabela 2). As amostras foram avaliadas em triplicata.

Tabela 2: Resultados para a determinação de flavonoides totais expressos em quercitina no extrato etanólico

de Echinodorus grandiflorus.

Abs [] mg/mL Diluição mg %

1.1 2,124 0,604944 10 6,049439 1,209888

1.2 2,125 0,605228 10 6,05228 1,210456

1.3 2,12 0,603807 10 6,038074 1,207615

Média 1,20932

DP 0,001503

Não há estudos sobre a quantificação de flavonoides na Echinodorus grandiflorus, porém a

Vitex megapotamica é considerada uma planta padrão para flavonoides estando presentes derivados

de flavonoides primários como casticina, orientina e isovitexina, esses são encontrados nas folhas,

frutos e flores, a mesma possui em torno de 4% de flavonoides totais (BRUM, 2012).

15

Alcaloides:

Os alcaloides são compostos nitrogenados ativos farmacologicamente e são encontrados

principalmente em angiospermas, na sua grande maioria, possuem caráter alcalino (SANTOS;

MELLO, 2010). Tem sido observado que muitas plantas que produzem alcaloides são evitadas por

animais e insetos em sua dieta, isso certamente devido à sua toxicidade ou ao fato de a maioria dos

alcaloides ter gosto amargo (LIMA, 2011). Biologicamente, alcaloides agem nos sistemas

neurotransmissores opiáceos. Estes são usados amplamente na hipotensão, vasoconstrição, ativador

respiratório, anestesia, sedativo e relaxante muscular. Além disso, são responsáveis pelos efeitos

alucinógenos do tabaco (OLIVEIRA; ALMEIDA, 2016). De acordo com a Figura 3, foi confirmada

a presença de alcaloides pela formação de precipitado.

Figura 3: Determinação fitoquímica de alcaloides

Saponinas:

As saponinas são compostos glicosídicos formados por agliconas ligadas a moléculas de

açúcar (REBELO, 2011). Estas substâncias possuem a característica de formar espuma quando

agitadas em água, sendo este um dos processos empregados em sua identificação (SOCIEDADE

BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA, 2009). As saponinas são essenciais para a proteção das

plantas, desempenhando também propriedades farmacológicas, pois possuem capacidade de

complexar com esteroides por isso são utilizadas como anti-inflamatória, diurética, expectorante,

hipocolesterolemiante e antiviral (CASTEJON, 2011). A Figura 4 demonstra a presença de

saponinas, caracterizada pela formação de espuma abundante e duradoura, tendo em média 3,1 cm

após 15 minutos.

16

Figura 4: Determinação fitoquímica de

saponina

Métodos extrativos:

A extração tem como objetivo a retirada de constituintes a partir de uma matéria prima

natural, sendo realizada constantemente com solventes líquidos. É uma operação físico-química de

transferência de massa, onde os sólidos solúveis e voláteis podem ser extraídos por manter-se

contato entre o solvente e os sólidos (SIMÕES et al., 2017).

O rendimento das extrações das folhas previamente secas e trituradas está disposto na figura

5. Considerando os resultados, pode ser visto que o método extrativo influência diretamente nos

rendimentos dos extratos e que, além do método utilizado, o solvente também influencia no

conteúdo final da extração.

Espuma

17

Figura 5: Rendimento de diferentes métodos extrativos

Estatisticamente maceração na proporção 1:5 demonstrou melhor resultado com solvente

etanólico a 90% e solvente hidroalcoólico a 70%. Isso se deve a uma maior proporção de extrato e

uma menor quantidade de solvente comparado aos outros métodos de extração. Levando em

consideração ambos os solventes utilizados na extração, observa-se que o solvente hidroalcoólico a

70% possui melhor rendimento em praticamente todos os métodos extrativos, exceto maceração

1:10 e 1:5.

Este fator demonstra que o solvente hidroalcoólico é mais seletivo para a extração dos

metabólitos presentes nas folhas de Echinodorus grandiflorus. Oliveira et al., (2016) identificaram a

presença de taninos e flavonoides grupos de metabolismo secundário com caráter mais polar.

O menor rendimento das extrações a quente pode ser devido a muitas substancias serem

termolábeis e outras podem sofrer modificações estruturais irreversíveis em altas temperaturas

(TIWARI et al., 2011).

Atividade antimicrobiana:

Para a atividade antimicrobiana utilizou-se a extração com maior rendimento sendo ela a

maceração 1:5 e posteriormente utilizou-se a maceração 1:10, ambas foram ressuspensas com água.

No teste da CIM realizado em microplacas com 96 poços, verificou-se que não houve

inibição do crescimento das bactérias testadas, ou seja, ocorreu turvação em todas as concentrações

analisadas conforme mostra a figura 6.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Infusão Decocção Soxhlet Turbólise Maceração

1:10

Maceração

1:5

Rendimento de diferentes métodos extrativos ultilizando solvente

etanólico a 90% e hidroalcoólico a 70%

Grau Alcoólico 90% Grau Alcoólico 70%

b

b b

b

b

b

a a a

a

a

a

18

Figura 6: Placa com 96 poços apresentando turvação.

Babiczet et al. (2006) através do teste de difusão em disco observou atividade

antimicrobiana de Echinodorus grandiflorus contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas,

com extrato aquoso e extrato metanólico das folhas obteve-se atividade sobre Staphylococcus

aureus. Observaram também atividade antimicrobiana no extrato acetônico de Echinodorus

grandiflorus.

Segundo Baptista (2013) em um estudo, não identificou atividade antimicrobiana de

Echinodorus grandiflorus. Segundo Teixeira (2014), ao analisar a atividade antimicrobiana do

extrato seco de Echinodorus grandiflorus verificou que não houve atividade para as bactérias

testadas.

Na avaliação da atividade antifúngica também não houve inibição do crescimento da

levedura Candida albicans, teve crescimento da mesma por toda a placa. Figura 7.

Figura 7: Crescimento de leveduras por toda a placa.

19

CONCLUSÃO:

Os resultados demonstram que o método de extração e o grau alcóolico do solvente

influenciam diretamente no rendimento da amostra, porém maiores rendimentos no processo de

extração não significam necessariamente maior eficiência. Em relação a triagem fitoquímica os

compostos obtidos do metabolismo vegetal condizem com as literaturas encontradas, sendo

identificados a presença de taninos, flavonoides, alcaloides e saponinas.

O extrato com maior rendimento não apresentou atividade antimicrobiana, porém novos

estudos devem ser realizados buscando o isolamento de compostos químicos para atividade

antimicrobiana de extrato de folhas de Echinodorus grandiflorus.

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