Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap Malmö högskola 15 hp Hälsa och samhälle Biomedicinska analytikerprogrammet 205 06 Malmö Institutionen för biomedicinsk vetenskap 2016

EN KLINISK STUDIE AV

ANALYSEN CSV-

SPEKTROFOTOMETRI

EN JÄMFÖRELSE AV GLAS- OCH PLASTKYETTER FÖR SPEKTROFOTOMETRISK MÄTNING AV BILIRUBIN OCH DEOXIHEMOGLOBIN I CEREBROSPINALVÄTSKA

JONATAN CARLANDER

1

EN KLINISK STUDIE AV

ANALYSEN CSV-

SPEKTROFOTOMETRI

EN JÄMFÖRELSE AV GLAS- OCH PLASTKYETTER FÖR SPEKTROFOTOMETRISK MÄTNING AV BILIRUBIN OCH DEOXIHEMOGLOBIN I CEREBROSPINALVÄTSKA

JONATAN CARLANDER Carlander, J. En klinisk studie av CSV-spektrofotometri. Materialjämförelse

mellan olika kyvetter samt en hållbarhetsstudie för cerebrospinalprover.

Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö

högskola: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för biomedicinsk

vetenskap, 2016.

En subaraknoidalblödning (SAB) orsakas av ruptuerade aneurysmer mellan den

mjuka hjärnhinnan och spindelvävshinnan (arachnoidea). Symptomen för SAB är

allvarlig spontan huvudvärk, stelhet i nacken, kräkningar, förvirring och

svimning. Vid erhållna symptom görs en datortomografi (CT) av hjärnan för

påvisning av blod i subaraknoidalrummet. I 98 % av fallen påvisar CT blod om

undersökning görs inom 12 timmar från uppvisat symtom. Sannolikheten att

påvisa blod med CT minskar dock med tiden. Efter en vecka kan blod påvisas i

drygt 50 % av fallen. Vid symptom för en SAB men där CT inte påvisar blod görs

en lumbalpunktion för analys av cerebrospinalvätska (CSV). Provtagning bör ske

minst 12 timmar efter uppvisat symptom för bilirubin ska ha hunnit bildats från

oxihemoglobin via enzymatiska reaktioner. Spektrofotometri används vid 415 nm

för detektion av oxihemoglobin och vid 476 nm för detektion av bilirubin. Denna

studie kommer undersöka huruvida det finns någon skillnad i uppmätt absorbans

vid 415 nm respektive 476 nm mellan glas- och plastkyvetter samt undersöka hur

ett dygns extra förvaring av CSV-prover påverkar absorbansen vid 476 nm.

Resultatet för 20 CSV-prover visade på att det inte fanns någon statistiskt

signifikant skillnad mellan glas- och plastkyvetter (p=0,825 för 476 nm, p=0,632

för 415 nm) samt att absorbansen för 9 CSV-prover signifikant förändrades vid

476 nm efter ett dygns extra förvaring (p=0,01).

Nyckelord: Bilirubin, Cerebrospinalvätska, Kyvett, Spektrofotometri,

Subaraknoidalblödning.

2

A CLINICAL STUDY OF THE

ANALYSIS CSF-

SPECTROPHOTOMETRY

A COMPARISION BETWEEN GLASS AND PLASTIC CUVETTES FOR SPECTROPHOTOMETRIC MESURMENT OF BILIRUBIN AND DEOXYHEMOGLOBIN IN CEREBRALSPINAL FLUID JONATAN CARLANDER

Carlander, J. A clinical study of CSF-spectrophotometry. Material comparison

between different cuvettes and a durability analysis of cerebrospinal samples.

Degree project in biomedical science 15 credits. Malmö University: Faculty of

health and society, Department of biomedical science, 2016.

A subarachnoid haemorrhage (SAH) is caused by ruptured aneurysms between the

soft meninges and arachnoid (arachnoid). Symptoms of an SAH is severe

spontaneous headaches, stiff neck, vomiting, confusion and fainting. A computed

tomography (CT) of the brain is used, on patients sustaining symptoms, to detect

blood in the subarachnoid space. CT detects blood in 98% of the cases if

examination is made within 12 hours from the shown symptoms. However, the

probability of detecting blood with CT decreases with time. After a week, only 50

% of the CT-scans identifies blood. If patients suffers from typical symptoms but

no detection of blood using CT-scan, a lumbar puncture is performed to analyse

the cerebrospinal fluid (CSF). Sampling should be made at least 12 hours after

presented symptoms because of the time-dependent creation of bilirubin from

oxyhemoglobin via enzymatic reactions. Spectrophotometry is used in the

wavelengths 415 nm for the detection of oxyhemoglobin and at 476 nm for

detection of bilirubin. This study will examine whether there is any difference in

the absorbance measured at 415 nm and 476 nm between glass-and plastic

cuvettes as well as examine how 24 hours of extra storage of samples affect the

absorbance at 476 nm. The result for 20 CSF-samples showed that there was no

statistically significant difference between the glass and plastic cuvettes (p =

0,825 of 476 nm, p = 0,632 for 415 nm), and absorbance for 9 CSF-samples

significantly changed at 476 nm after 24 hours of extra storage (p = 0.01).

Keywords: Bilirubin, Cerebrospinal fluid, Cuvettes, Spectrophotometry

Subarachnoid Haemorrhage.

3

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

INTRODUKTION .............................................................................................. 4

Cerebrospinalvätska (CSV) .............................................................................. 4

Subaraknoidalblödning (SAB).......................................................................... 4

Bilirubin .............................................................................................................. 5

Cellräkning av Erytrocyter i CSV .................................................................... 5

Spektrofotometrisk analys av CSV .................................................................. 5

Syfte ..................................................................................................................... 6

MATERIAL OCH METOD .............................................................................. 6

Urval och provhantering ................................................................................... 6

Etisk bedömning ................................................................................................ 7

Spektrofotometrisk analys ................................................................................ 7

Bearbetning av data ........................................................................................... 7

RESULTAT .......................................................................................................... 7

Jämförelse mellan glas- och plastkyvetter ....................................................... 8

Hållbarhetsstudie ............................................................................................... 9

DISKUSSION ..................................................................................................... 9

Metoddiskussion ................................................................................................. 9

Resultatdiskussion ........................................................................................... 10

KONKLUSION ................................................................................................. 11

REFERENSER .................................................................................................. 13

4

INTRODUKTION

Cerebrospinalvätska (CSV)

I hjärnans ventriklar, kraniala- och subaraknoidala områden finns

cerebrospinalvätska, likvor, som omsluter hjärnan och ryggmärgen (Figur 1).

Vätskan, som är klar och färglös, bildas huvudsakligen av organet plexus

choroideus i hjärnans laterala ventriklar [1].

Figur 1: Anatomisk bild över hjärnan och det subaraknoidala området samt

plexus choroideus [2].

En mindre mängd CSV secerneras från ventriklarnas ependymala ytor,

interstitialvätskan, kärlnystan och hjärnparenkymet, i vilken det sker en filtration

av plasman likt den filtration som sker i glomeruli i njurarna.

CSVs huvuduppgifter är att agera som stötdämpare och skydd för hjärnan och

ryggmärgen samt eliminera restprodukter från hjärnans metabolism, t. ex

koldioxid och laktat. CSV har även en essentiell roll i homeostasen av cerebral

interstitialvätska genom att reglera elektrolytbalansen, transportera runt aktiva

molekyler och eliminera kataboliter [1, 3-4]. Subaraknoidalblödning (SAB)

Vid en subaraknoidalblödning är orsaken ruptuerade artärbråck (aneurysmer)

mellan den mjuka hjärnhinnan och spindelvävshinnan (arachnoidea). Enligt

definitionen är subaraknoidalblödning en hjärnblödning (hemoragi eller

hematom), vilket kan ge strokeliknande symptom [5]. Ett av tjugo strokefall beror

på blödning till subaraknoidalrummet. SAB är en skada som har liknande följder

som en hjärninfarkt, som orsakas intracerebral blödning eller emboli [6].

Blödningen kan inträffa i olika åldrar, med en dödlig utgång i 30-70 % av fallen.

De typiska symtomen brukar vara allvarlig huvudvärk som uppkommer plötsligt,

stelhet i nacken, kräkningar, förvirring och förlust av medvetande. Riskfaktorer

för SAB är hypertoni, rökning och alkoholkonsumtion. Dessa faktorer kan dubbla

risken för en SAB. I två av tre fall föreligger riskfaktorerna som en del av

patientens anamnes medan genetiska faktorer enbart förklarar ett av tio fall [7-8].

Patienter som inkommer med symptom genomgår en skiktröntgen av hjärnan

datortomografi (CT), för påvisning av blod i subaraknoidalrummet. I 98 % av

fallen där patienter haft en subaraknoidalblödning påvisar en CT blod om

undersökningen görs inom 12 timmar från det att patienten uppvisat symptom [9].

Dock minskar sannolikheten att påvisa blod med tiden och efter drygt en veckas

tid är det enbart 50 % av fallen där påvisning av blod kan ske. För de patienter

som erhåller symptom i vad som skulle kunna vara en subaraknoidalblödning men

5

att CT visar negativt resultat tas en lumbalpunktion för analys av CSV. Vid

lumbalpunktion förs en nål in mellan spinalutskotten L4/L5 eller L3/L4. Ibland

kan en stickblödning förekomma vid provtagning, vilket betyder att det uppstått

en kärlskada orsakad av nålen. Spektrofotometrisk analys av CSV ingår som

rutinanalys vid utredning av SAB eftersom den kan ge värdefull information för

att skilja blod i CSV-provet från stickblödning från provtagningen eller från en

SAB. Om CSV-provet centrifugeras inom 30 min från provtagningen och

supernatanten avskiljs elimineras förekomsten av hemoglobin från en

stickblödning, eftersom erytocyterna då inte har hunnit att hemolyseras [1, 3-8].

Bilirubin

Provtagning bör ske tidigast 12 timmar efter att patient uppvisat karaktäristiska

symptom. Efter 6-12 timmar bildas bilirubin av oxihemoglobin. Oxihemoglobin

bryts ned via enzymatiska reaktioner via makrofager till bilirubin. Vid SAB ses

således en ökning av bilirubin i CSV. Vid stickblödning ses dock ingen ökning av

bilirubin eftersom nedbrytningen av hemoglobin endast sker in vivo. Därför är det

viktigt att provtagningen inte sker tidigare än 12 timmar efter att patienten

uppvisat karakteristika symtom för en SAB.

CSV kan efter provtagning inspekteras visuellt för en karaktäristisk gul-orange

färg (xantochromia = grekiska för gul färg). Visuell analys anses dock vara

mindre känslig metod än spektrofotometrisk analys [9-10]. Ökad

bilirubinkoncentration i CSV kan även detekteras vid i blodet vid skada på blod-

hjärnbarriären då det föreligger ökad bilirubinkoncentration i blodet [9-11, 13].

Cellräkning av Erytrocyter i CSV

Erytrocyter finns normalt inte närvarande i CSV. Förekomst av erytrocyter kan

bero på intrakraniell blödning, vanligen subaraknoidalblödning. Cellräkning av

erytrocyter i CSV är en del i utredningen av SAB, men kan inte enbart användas

som ett underlag för att bekräfta eller utesluta SAB. I en studie av Perry et al [12]

beskrivs det att kärlskador inträffar i 10-30% av lumbalpunktioner. Studien tar

även upp en alternativ metod för utredning av SAB genom att via cellräkning av

erytrocyter kunna utesluta SAB om antalet erytrocyter är mindre än 2000*106/L

och ingen xantochromi är närvarande i CSV [9-10, 12].

Spektrofotometrisk analys av CSV

Vid den spektrofotometriska analysen mäts CSVs absorption av ljus vid

våglängder mellan 350-600 nm. Oxihemoglobin har en absorptionstopp vid 415

nm och bilirubin har en absorptionstopp vid 455 nm. Enligt reviderade brittiska

riktlinjer [11] mäts bilirubin dock vid 476 nm istället för 455 nm för att minska

eventuellt bidrag från oxihemoglobin. Enligt riktlinjerna som Region Skåne följer

används Chalmers metod [11] där en baslinje ritas mellan två punkter på kurvan i

våglängdsområdet 350-600 nm. Den första punkten är lokaliserad mellan 350-400

nm, beroende på vilket område som erhåller lägst absorbans. Punkt två är

lokaliserad mellan 430-530 nm på samma premisser som punkt ett. Vid

våglängderna 415 nm respektive 476 nm räknas nettoabsorbansen ut genom att

baslinjen subtraheras från bruttoabsorbansen för 415 nm respektive 476 nm (se

figur 2). Absorbansen beräknad vid 415 nm kallas Net oxyhaemoglobin

absorbance, NOA. Absorbansen vid 476 nm kallas Net bilirubin absorbance,

NBA, [10-11, 13].

6

Figur 2: Spektrofotometrisk analys av CSV i området 350-600 nm. Net

oxyhaemoglobin absorbance (NOA) och Net bilirubin absorbance (NBA) mäts i

absorbans (A) vid 415 nm respektive 476 nm. Hemoglobin (Hb) detekteras vid

415 nm [14].

Det är främst närvaron av bilirubin som är intressant för att skilja en SAB från

stickblödning. Stickblödning kan vid absorbansmätning ge en topp vid 415 nm

men ingen topp kan detekteras vid 476 nm. CSV-prover som tas vid misstänkt

SAB skall alltid ljusskyddas, helst skall folie lindas runt om provröret. Detta på

grund av att bilirubin är ljuskänsligt mot UV-strålarna i vanligt dagsljus som kan

bryta ned bilirubinet och orsaka falskt negativa resultat [10-11, 13].

Anledningen till att plast jämfördes mot glas var för att glaskyvetten är

rekommenderad att använda. Plastkyvetten är däremot lättare att använda,

tidsmässigt sparar den tid då det inte sker någon tvätt mellan analyser den och

risken för carry over-effekter minskar, vilket är när en volym från ett tidigare

CSV-prov är kvar i glaskyvetten på grund av otillräcklig tvätt. Detta kan ge

störningar av absorbansnivåer vid mätning av andra CSV-prover. Syfte

Syftet med undersökningen är att avgöra huruvida det finns någon signifikant

skillnad i uppmätta absorbansenheter (AU), vid våglängderna 415 nm respektive

476 nm, beroende på om användandet av glas- eller plastkyvetter samt att avgöra

huruvida ett extra dygns förvaring av CSV påverkar absorbansen vid 476 nm.

MATERIAL OCH METOD

I denna studie undersöktes huruvida det fanns skillnader i uppmätt absorbans, AU,

beroende på kyvettmaterialet samt vilken inverkan ett extra dygns förvaring av

CSV-prover har på absorbansen vid 476 nm.

Urval och provhantering

Provmaterialet bestod av 29 st CSV-prover som samlats, oberoende av patientens

anamnes eller kön, kontinuerligt under vecka 5-7 2016 på Klinisk kemi, Skånes

universitetssjukhus Lund.

CSV-provernas provtagningstid lagrades i ett datorsystem som Klinisk Kemi

Lund använder. Genom att utnyttja provrörets unika kombinationskod kunde

provtagningstiden erhållas. Enbart provtagningstid och CSV-provets autentiska

kombinationskod sparades. Inga personuppgifter behandlades i studien.

7

Urvalet av prover bestämdes efter hur stort utbud det fanns av färska prover samt

om de erhöll en volym som översteg 800 μl, då minsta provvolym var 800 μl.

CSV-proverna erhölls centrifugerade. Provmaterialet delades in i två grupper. En

grupp med 20 CSV-prover som användes i jämförelsen mellan glas- och

plastkyvetter och en grupp med 9 prover som utnyttjades i hållbarhetsstudien. I

jämförelsen mellan plast- och glaskyvetter inkluderades alla prov som hade en

uppmätt absorbans vid 415 nm på som mest 100 mAU då detta bedömdes vara

kliniskt relevant nivå. Resterande prover inkluderades i hållbarhetsstudien.

Etisk bedömning

CSV-prover samlats oberoende av patients anamnes, kön eller ålder samt att inga

personuppgifter sparades eller utnyttjades i undersökningen.

Spektrofotometrisk analys

Absorbansmätningarna utfördes i våglängdsområdet 350-600 nm med

spektrofotometern Aglient Cary 60 (Aglient Technologies, USA)CSV-Proverna

togs ut ur dess ljusskyddade behållare, som stått förvarad i kyl.

Alla 20 CSV-proverna analyserades först i glaskyvett (Hellma, Tyskland) och

därefter i plastkyvett (Sarstedt, Tyskland). Som blank användes NaCl, med en

koncentration 9 mg/ml (Fresenius Kabi, Norge). Vid absorbansmätning i

glaskyvett användes samma kyvett för alla mätningar, kyvetten tvättades med

ddH2O mellan varje mätning. Efter att alla prover analyserats en gång i glaskyvett

genomgick de samma analysprincip fast i plastkyvett där varje prov analyserades i

separat plastkyvett.

För de 9 prover som skulle genomgå en hållbarhetsanalys sparades de uppmätta

absorbansvärdena efter mätning i plastkyvett som tidpunkt t1. Därefter fortsatte

hållbarhetsanalysen då de 9 CSV-proverna analyserades i plastkyvett, efter

blankning, 24±2 timmar efter analys vid tidpunkten t1. Uppmätt absorbans

sparades som tidpunkt t2.

Bearbetning av data

Rådata från analysmomentet bearbetades i Microsoft Excel 2013 (Microsoft

Corporation, Redmond, Washington, USA). Boxplot (låddiagram där median,

kvartiler och outliers visas)- och Bland-Altman diagram (B & A-diagram, där

differens plottas mot medelvärde för att ta reda på mätfelet (bias) och påvisa

trender mellan olika variabler) gjordes i SPSS Statistics version 22 (IBM

Corporation, New York, USA). De olika gruppernas absorbansspridning

redovisades i form av Boxplot-diagram, en plot för plastkyvetter och en för

glaskyvetter. En del av jämförelsestudien mellan plast- och glaskyvetter för

respektive grupp visas med B & A-diagram diagram för att åskådliggöra

eventuella differenser mellan metoderna. Slutligen gjordes ett statistiskt One

sample t-test för jämförelse av medelvärden vid respektive våglängd. Även i

hållbarhetsstudien presenteras resultatet i B & A-diagram samt efterföljande t-test.

RESULTAT

Resultatet för undersökningen presenteras nedan i en jämförelse mellan glas- och

plastkyvetter vid 476 nm respektive 415 nm samt hållbarhetsstudien vid 476 nm.

8

Jämförelse mellan glas- och plastkyvetter

Resultatet grundar sig på 20 CSV-prover som analyserats med spektrofotometrisk

analys. Resultatet presenteras i en visualisering av provernas olika

absorbansspridning, i form av Boxplot-diagram samt B & A-diagram, vid 415 nm

respektive 476 nm. Dessutom presenteras ett statistiskt t-test för

medelabsorbansdata vid 415 nm respektive 476 nm.

Figur 3: A: Uppmätt absorbans i absorbansenheter (AU) vid 476 nm för glas- respektive

plastkyvett (N=20) Cirklarna utanför visar s.k. outliers. B: B & A-diagram diagram där differensen

plast-glas plottas mot medelvärdet plast och glas. Den röda linjen representerar y-värdet 0.

Medelabsorbansen vid 476 nm (se figur 3A) var vid mätning med plastkyvett

något högre än vid mätning med glaskyvett (0,0077 AU respektive 0,0075 AU)

men skillnaden var inte statistisk signifikant vid t-test (medeldifferens 0,00023

AU (se figur 3B), p=0,825).

Figur 4: A: Uppmätt absorbans i absorbansenheter (AU) vid 415 nm för glas- respektive

plastkyvett (N=20). Cirklarna utanför visar s.k. outliers. B: B & A-diagram där differensen mellan

plast och glas plottas mot medelvärdet för plast och glas. Den röda linjen representerar y-värdet 0.

Medelabsorbansen vid 415 nm (se figur 4A) var vid mätning med plastkyvetten

något högre än vid mätning med glaskyvett (0,0150 AU respektive 0,0145 AU)

men skillnaden var inte statistiskt signifikant vid t-test (medeldifferensen 0,00051

AU (se figur 4B), p=0,632).

3A 3B

4A 4B

9

Hållbarhetsstudie

Hållbarhetsstudien presenteras i ett B & A-diagram och ett statistiskt t-test av

medelabsorbansen vid 476 nm beräknas sedan.

Figur 5: Hållbarhetsstudien presenterad i form av ett B & A-diagram (N=9), där differensen är

uträknad genom absorbansvärden vid tidpunkten t2 – absorbansvärden vid tidpunkten t1.

Absorbansvärdena uppmättes vid 476 nm. Skillnaden mellan t1 och t2 är att t2 är analyserade

24±2 timmar efter t1. Samtliga prover är analyserade i plastkyvett.

Medelabsorbansen vid 476 nm var vid tidpunkten t2 högre än vid tidpunkten t1

(0,336 AU respektive 0,328 AU). Skillnaden var statistiskt signifikant vid t-test

(medeldifferensen = 0,0079 AU (se figur 5), p<0,05).

DISKUSSION

Diskussionen delas in i en separat metoddiskussion där arbetssättet och

handhavandet av CSV-prover utvärderas samt en resultatdiskussion bestående av

en del för jämförelsen mellan glas- och plastkyvetter samt en del tillhörande

hållbarhetsstudien.

Metoddiskussion

Proverna analyserades i två olika analysflöden, i serie och separat. Analysflödet i

serie inleddes med att ett blankprov analyserades i glaskyvett och en påföljande

tvättning av kyvetten i ddH2O. Efter tvättningen kördes första provet och därefter

tvättades kyvetten igen innan analys av nästa prov. Flödet byggde på tanken att

exempelvis 5 prover skulle körts i ordning först i en glaskyvett och sedan

analyserats i plastkyvett. Tanken var att det inte skulle vara för stora tidsintervall

mellan de olika analyserna. Provrören innehållande CSV stod ljusskyddat i en

behållare och togs ut när de skulle köras. Eventuell störning av omgivningens ljus

skulle ha varit då CSV-prov befann sig i kyvetten stående på bänken innan analys,

vilket inte borde varit mer än någon minut innan det pipetterades ner i dess

provrör igen. Endast ett fåtal prover analyserades via ett separat analysflöde. Det

separata analysflödet var tillskillnad från analys i serie en metod där varje prov

först genomgick analys i glaskyvett, efter blankning och tvätt av kyvett, och sedan

blankning samt analys i plastkyvett. Tyvärr fanns det inte tillräckligt med

underlag för en jämförelse mellan de två arbetsflödena för att se en eventuell

signifikant skillnad.

Under praktiska utförandet upptäcktes det att 800 μl var den minsta volym som

behövdes i kyvetten för att spektrofotometern skulle kunna analysera provet

tillförlitligt. Detta bestämdes genom att köra en känd kontroll vid olika volymer

för att se vilken volym som gav utslag. En annan sak som upptäcktes var att

10

instrumentet Agilent Cary 60 inte mäter linjärt vid absorbanser som överstiger ca

2300 mAbs, vilket gör att överstigna värden inte är pålitliga då de inte är linjärt

mätta.

Resultatdiskussion

Figur 3A visar distributionen för de 20 olika provernas absorbansvärde vid 476

nm. Medelabsorbansen för glas var 7,5 mAU och för plast 7,7 mAU (median 7,6

mAU resp. 5,7 mAU). Skillnaden i medelabsorbans (bias) var inte statistisk

signifikant (p=0,825) vilket betyder att slutsatsen inte kan vara att analys med en

plastkyvett generellt ger högre absorbansvärden än analys med glaskyvett. Hade

statistisk signifikans uppnåtts hade en skillnad på bråkdelar av en

milliabsorbansenhet ändå inte tolkats som kliniskt relevant. Spridningen av värden

för glas- respektive plastkyvetter är relativt lik. I figur 4A syns det att

absorbansvärdena har en liknande distribution. Medelabsorbansen för glas var

14,5 mAU och för plast 15,0 mAU (median 12,7 mAU resp. 11,8 mAU). Det

kunde inte heller påvisas någon signifikant skillnad i medelabsorbans vid 415 nm.

Trots uppmätta minimala skillnader mellan glas- och plastkyvetter blir slutsatsen

ändå att absorbansmätning vid 415 nm respektive 476 nm är oberoende av

kyvettmaterialet.

För jämförelsen mellan glas- och plastkyvetter plottades två olika variabler mot

varandra, den ena var differensen mellan glas- och plastkyvetter mot respektive

provs medelvärde. Absorbansdifferensen mellan glas- och plastkyvetter för de 20

proverna vid 476 nm respektive 415 nm beräknades genom att subtrahera

respektive provs absorbansdata för plast med respektive provs absorbansdata för

glas, då glaskyvetten är referensmaterialet. Differensen sattes mot medelvärdet för

respektive provs absorbansdata för glas- och plastkyvetten i ett B & A-diagram

[15].

Som ett resultat av den uträknade differensen plottad mot medelvärdet är den

första tolkningen av B & A-diagrammet hur stort bias, mätfelet, är. Anledningen

till att bias bestäms är på grund av att alla variabler indikerar alltid ett visst fel vid

mätningar. Bias, som är detsamma som medeldifferensen, för B & A-diagrammet

vid 476 nm var 0,2 mAU. Vid 415 nm låg bias på 0,5 mAU. Bias tolkas i

respektive fall som kliniskt accepterat mätfel. Bedömningen av huruvida något är

klinisk accepterat eller inte bestäms av någon som är medicinskt ansvarig. Även

om medeldifferensen mellan glas-respektive plastkyvetter är låg finns det enskilda

prover som uppvisat differenser som ligger runt 10 mAU, både vid 415 nm och

476 nm. Anledningen till detta tycks inte vara systematiskt relaterad till

kyvettmaterialet, utan är snarare slumpmässiga resultat (imprecision). Vad gäller

variationen i respektive diagram tycks det inte vara någon trend, differensen tycks

varken öka eller minska vid högre nivå utan sprids oberoende av nivå.

Det fanns inga signifikanta skillnader mellan glas- och plastkyvetter vid

absorbansmätning av bilirubin (vid 476 nm) och oxihemoglobin (vid 415 nm) i

CSV. Detta eftersom p–värdet var större än 0,05, vilket gjorde att nollhypotesen

inte kunde förkastas. Nollhypotesen formulerades till att ingen skillnad i

medelabsorbans mellan glas- och plastkyvetter skulle föreligga. Vad som skall

finnas i åtanke är att p-värdet för 476 nm respektive 415 nm (0,825 respektive

0,632) var långt över 0,05, vilket innebär att risken är väldigt stor för fel om vid

påstående om att det finns en skillnad mellan glas- och plastkyvetter. Det ideala

11

hade varit ett p-värde som i respektive fall närmat sig 0,05 för att kunna erhålla en

stor statistisk säkerhet.

Följaktligen hade en eventuell spekulering kunnat göras om hur spridningen av

uppmätt absorbans sett ut ifall urvalet av prover varit större. I studien användes

som sagt 20 CSV-prover men hade urvalet istället legat på 100 eller 500 CSV-

prover hade det vid beräknat statistiskt t-test kunnat vara möjligt uppnå statistisk

signifikans.

De 9 prover som testades i hållbarhetsanalysen vid 476 nm presenterades i B & A-

diagram där medeldifferensen, bias, var 7,9 mAU. Differensen beräknades mellan

tidpunkten t2 och tidpunkten t1 och plottades mot medelvärdet beräknat för

respektive prov vid tidpunkt t2 och t1. Differensen tycks öka ju högre

medelvärdet (nivån) är. T-test visade på att en signifikant differens (p=0,01)

mellan tidpunkterna t2 och t1 fanns. Nollhypotesen formulerades till att det inte

skulle vara någon statistisk skillnad för uppmätt absorbans mellan tidpunkt t1 och

t2. Det som dock var oväntat i sammanhanget var att 8 av 9 prover ökade i

absorbans vid tidpunkten t2, vilket var ca 24 timmar efter tidpunkten t1. Den

statistiska skillnaden visade alltså att prover analyserade vid tidpunkt t2 erhöll

högre absorbans än vid tidpunkt t1 (p=0,01).

Analys av bilirubin i CSV är tidsberoende på grund av att bilirubin bryts ned över

tiden, även ljusskyddat. Förklaring till varför istället bilirubinabsorbansen vid 476

nm ökade kunde lättare ha förklarats om fler mätningar gjorts mellan tidpunkterna

t1 och t2, även förlängt observationstiden och introducerat en ny tidpunkt för att

se den eventuella utvecklingen [16].

Slutligen inför framtida studier kan en idé vara att utföra flera mätningar av ett

CSV-prov flera gånger i respektive kyvett. Detta för att se hur pass stor

spridningen på absorbansdatan blir. Eventuellt kan ett medelvärde beräknas som

sedan jämförs i liknande diagram som presenterats ovan. För att säkerställa att det

laborativa utförandet går korrekt till kan man eventuellt använda sig av kontroller

med känd koncentration. Eftersom mätningarna utförs vid olika tidpunkter finns

möjligheten att ha kontroller för respektive mätning. Jämförelsen mellan plast-

och glaskyvetter hade kunnat byggas på genom att jämföra värdena för NOA och

NBA för respektive kyvett för att finna möjlig signifikant skillnad där. För

hållbarhetsanalysen kan det vara lämpligt att erhålla fler mätningar för att kunna

göra ett eventuellt diagram där absorbansen är på y-axeln och tiden på x-axeln.

Det hade även varit intressant att utföra en hållbarhetsstudie på fler våglängder,

t.ex. 455 nm.

KONKLUSION

Konklusionen kan initieras med att redogöra att ingen signifikant skillnad, baserat

på det resultat som erhölls, finns mellan användandet av glas- och plastkyvetter

vid utförandet av analysen CSV-spektrofotometri. Det är dock rekommenderat att

göra vidare studier med större urval av prover för att erhålla en större statistisk

säkerhet.

Glaskyvetten är ett gold-standard alternativ, ekonomisk och mer positiv ur

miljösynvinkel, dock är det någorlunda tidskrävande att konstant behöva rengöra

kyvetten efter respektive körning. Plastkyvetten har fördelen att den enbart är en

12

engångskyvett, vilket gör att analysprocessen blir mindre kostsamt ur en

tidssynpunkt. Valet mellan glas och plast är troligtvis ett subjektivt val.

För hållbarhetsstudien behövs det ytterligare undersökningar, med större urval av

CSV-prover och fler analystidpunkter. Enligt undersökningen så fanns det en

signifikant ökning (p=0,01) av bilirubin efter 24 timmars förvaring av CSV

ljusskyddat i kyl. Dock, stämmer inte resultatet med teorin, då bilirubin bör

minska över tiden.

13

REFERENSER

1. Blennow K, Zetterberg H (2012) Sjukdomar i centrala nervsystemet. I:

Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E (Red) Laurells

Klinisk kemi i praktisk medicin (9:e upplagan) Lund: Studentlitteratur, s

555-560

2. Dr. Mohamed Baranek (2012) Brain ventricular system

>http://abcradiology.blogspot.se/2012/01/brain-ventricular-system.html<

(160316)

3. L Sakka, G Coll, J Chazal. Anatomie et physiologie du liquid

cerebrospinal. Annales françaises d’Oto-rhino-laryngologie et de

Pathologie Cervico-faciale. 2011;128(6):359-66

4. Van Gijn J, Rinkel GJ E, Kerr S R. Subarachnoid haemorrhage. Lancet

2007; 369: 306-18.

5. Veronica Murray (2012) Stroke: en skrift om slaganfall och TIA

>https://www.hjart-lungfonden.se/Sjukdomar/Hjartsjukdomar/Stroke/<

(160316)

6. Johnston SC, Selvin S, Gress DR. The burden, trends, and demographics

of mortality from subarachnoid haemorrhage. Neurology 1998; 50: 1413-

18

7. Feigin VL, Rinkel GJE, Lawes CM, Algra A, Bennett D, Van Gijn J,

Anderson C S. Risk factors for subarachnoid hemorrhage: an updated

systematic review of epidemiological studies. Stroke 2005; 36:2773-80

8. Ruigrok YM, Buskens E, Rinkel GJ E. Attributable risk of common and

rare determinants of subarachnoid hemorrhage. Stroke 2001; 32: 1173-75

9. Nagy K, Skagervik I, Tumani H, Brettschnneider J, Otto M, Petzold A,

Wick M, Kühn H-J, Uhr M, Regeniter A, Kraus J, Deisenhammer F,

Lautner R, Blennow K, Zetterberg H, Mattsson N, Shaw L. Cerebrospinal

fluid analyses for the diagnosis of subarachnoid haemorrhage and

experience from a Swedish study. What method is preferable when

diagnosing a subarachnoid haemorrage? Clin Chem Lab Med 2013;

51(11): 2073-2086.

10. Chalmers AH, Kiley M. Detection of xanthochromia in cerebrospinal

fluid. Clin Chem Lab Med 1998;44:1740-2

11. Cruickshank A, Auld P, Beetham R, Burrows G, Egner W, Holbrook I,

Keir G, Lewis E, Patel D, Watson I, White P. Revised national guidelines

for analysis of cerebrospinal fluid in suspected subarachnoid haemorrhage.

Annals of Clinical Biochemistry 2008; 45: 238-244.

12. Perry J J, Alyahya B, Sivilotti LA M, Bullard J M, Émond M, Sutherland

J, Worster A, Hohl C, Lee S J, Eisenhauer A M, Paulus M, Lesiuh H,

14

Wells A G, Stiell G I. Differentiation between traumatic tap and

aneurysmal subarachnoid hemorrhage: prospective cohort study. BMJ

2015; 350: h568

13. Beetham R. CSF spectrophotometry for bilirubin – why and how? The

Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation. 2009; 69:1-

7

14. Labmedicin Skåne, klinisk kemi (2016). Metodbeskrivning: CSV-

spektrofotometri

>http://www.skane.se/Upload/Webbplatser/Labmedicin/Verksamhetsomr

%C3%A5den/Klinisk%20kemi/Analyser/Skane/Csv-

Spektrofotometri.pdf< (160316)

15. Giavarina D. Understandning Bland Altman analysis. Biochemia Medica

2015;25(2):141-51

16. Foroughi M, Parikh D, Wassell J, Hatfield R. Influence of light and time

on bilirubin degradiation in CSF spectrophotometry for subarachnoid

haemorrhage. British Journal of Neurosurgery. 2010; 24(4): 401-404