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Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarías.
PRESENTA
CARLOS FRANCISCO MORENO CRUZ
CD. OBREGÓN, SONORA AGOSTO DE 2007
Estudios preliminares para la biorremoción de cromo y níquel en un sistema de cultivo continuo de la microalga Scenedesmus incrassatulus, en un fotobiorreactor “airlift”.
MEMORIA DE PROYECTO
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO BIOTECNÓLOGO
INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA
AGRADECIMIENTOS A Dios. A mis padres, Mario Moreno Caldelas y Esthela Cruz Higuera por verme dado la vida, su amor y por sus mas grandes consejos. Los quiero mucho y a ustedes dedico este trabajo. Gracias A mi hermana Alejandra Arlette Moreno, por ser como eres, gracias por tu gran cariño. A mi maestra Nora Méndez Bojorquez por brindarnos todos sus conocimientos sobre Biotecnología y sobre la vida. La naturaleza es sabia. A mi asesora Dr. Rosa Olivia Cañizares Villanueva por permitirme participar en su equipo de trabajo, ser un excelente ser humano y brindarme parte de su tiempo. Gracias Al M.C . Carlos Jácome Pilco, por toda su paciencia que tuvo conmigo, por brindarme su apoyo en el desarrollo de una parte de su proyecto Doctoral, sus conocimientos y explicaciones, por su tiempo. Gracias. A mi revisor Dr. Iram Mondaca por su confianza, orientación y brindarme parte de su tiempo. Gracias a todos mis maestros del ITSON por sus conocimientos enseñados en el aula por su entereza y sus ganas de enseñar, Maestra Lupita Aguilar, Maestro Luciano Castro, Maestra Laura Elissa Gassos, Maestra Cinthya Verdusco. A César Serrano por ser grandioso hijo y ser mi gran amigo. A todos mi amigos y compañeros de carrera: Mariela, Jóse Roberto, Nallely, la pao, mildred, shely, Ramón, el nacho, luli, Tania, Ericka, Faby, Sosa, el chapo,chio, Claudia, Patricia… y muchos más.
Este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología de Microalgas del Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del
CINVESTAV-IPN, bajo la supervisión de M.C. Carlos Jácome Pilco, CINVESTAV IPN, y como asesor la Dra. Rosa Olivia Cañizares
Villanueva, CINVESTAV IPN.
Av. Instituto Politécnico Nacional 2508 Col. San Pedro Zacatenco, 07360 México,
D.F. Apartado postal 14-740, 07000 México, D.F. Teléfonos: 5061 3800
ÍNDICE
RESUMEN
Página I.- INTRODUCCIÓN------------------------------------------------------------------------------1 1.1 Antecedentes---------------------------------------------------------------------------------1-9 1.2 Justificación------------------------------------------------------------------------------------10 1.3 Definición del problema---------------------------------------------------------------------10 1.4 Objetivo------------------------------------------------------------------------------------------11 II.- MATERIALES Y MÉTODO-------------------------------------------------------------12-15
• Microorganismo y medio de cultivo • Establecimiento del sistema de cultivo continúo
• Operación del cultivo continuo
Procedimientos analíticos
• Biomasa seca
• Pigmentos fotosintéticos
• Cuantificación de metales removidos
III.- RESULTADOS----------------------------------------------------------------------------16-24
IV.- CONCLUSIONES----------------------------------------------------------------------------25
V.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS-----------------------------------------------------26
RESUMEN La descarga de aguas residuales domésticas e industriales con elevados contenidos de metales pesados provoca severas alteraciones en sistemas acuáticos y organismos vivos, debido a su tendencia a bioacumularse y a sus propiedades carcinogénicas y mutagénicas. Los sistemas de tratamiento secundario logran una significativa remoción de metales, pero generalmente no alcanzan los niveles indicados en las normas de control ambiental. El uso de procesos físico-químicos como sistemas de tratamiento terciario para la remoción de metales pesados, a más de ser costosos y generar residuos tóxicos, son ineficientes a concentraciones de metales entre 1 a 100 mg/l. Las microalgas, debido a su capacidad de acumular en cierta medida cantidades de metales pesados de soluciones acuosas diluidas, tienen el potencial de proporcionar mejoras significativas frente a los problemas mundiales de la contaminación por metales. En este estudio realizado durante el periodo de verano en el 2006, en los laboratorios del CINVESTAV, se trabajó en un sistema de cultivo continuo de S. incrassatulus, en un fotobiorreactor tipo airlift para la remoción por de los metales pesados Cr(VI) y Ni(II) contenidos en un efluente sintético. El efecto de la alimentación continua de 1 mg Cr(VI)/l y 4 mg Ni(II)/l, sobre el crecimiento, pigmentos fotosintéticos y eficiencia de remoción de S. incrassatulus fueron estudiados. El Cr(VI) en S. incrassatulus provocó un incremento en la biomasa seca, en tanto que los pigmentos fotosintéticos decrementaron significativamente, presentando el siguiente orden de sensibilidad: clorofila b ≥ clorofila a > carotenoides. Los cenobios de la microalga cambiaron a formas predominantes unicelulares redondas de gran tamaño y formación de esporas. La eficiencia de remoción fue de 45%. Las células de S. incrassatulus, cultivadas continuamente y tratadas con Ni(II), comparadas con el control, mostraron decremento de la biomasa seca, disminución de los pigmentos fotosintéticos, con el siguiente orden de sensibilidad clorofila b > clorofila a >> carotenoides, los cenobios cambiaron a formas predominantes de células individuales irregulares de gran tamaño y se observaron pequeños agregados celulares. La eficiencia de remoción fue de 92 % de Ni. Los resultados alcanzados demuestran que el sistema implementado puede ser una interesante alternativa como proceso de tratamiento terciario para la remoción de bajas concentraciones de Cr(VI) y Ni(II) contenidos en medios acuosos.
Estudios preliminares para la biorremoción de cromo y níquel en un sistema de cultivo continuo de la microalga Scenedesmus incrassatulus, en un fotobiorreactor “airlift”. I. INTRODUCCIÓN 1.1 Antecedentes
Contaminación por metales pesados
El agua es indispensable para todos los aspectos de la vida, asegurar el
suministro suficiente y la calidad apropiada para cubrir las demandas de las
generaciones actuales y futuras es responsabilidad de todos los que habitamos el
planeta Tierra.
A partir del año 1950 la concentración de metales ha aumentado
considerablemente en el ambiente convirtiéndose en los principales
contaminantes del aire, agua y suelo (Cañizares, 2003), debido al uso de
combustibles fósiles y a la producción de residuos domésticos, además en los
últimos años la rápida industrialización y urbanización le han favorecido. Las
fuentes de metales que ingresan al ambiente se dividen en dos categorías
principales: las antropogénicas (que se originan de las actividades humanas) y las
que son de origen natural (que se encuentran en la corteza terrestre, depósitos de
piedra, acuíferos). (Liógon, 1997), (Cebrian et al., 2003), (Cañizares-Villanueva et
al., 2003).
Efecto de los metales pesados en el ambiente y la vida
Los metales pesados que se encuentran en la naturaleza y cuyo estudio resulta
de interés toxicológico y medioambiental, son principalmente el mercurio (Hg),
plomo (Pb), cadmio (Cd), cromo (Cr), zinc (Zn), níquel (Ni) además del metaloide
arsénico (As) (Liógon, 1997; García, 2000).
Los efectos de los metales sobre los organismos vivos, pueden ser beneficiosos,
pero también causar efectos tóxicos, dependiendo de su concentración. Por lo
que su cuantificación y caracterización en aguas naturales, tratadas y residuales,
es importante. La mayoría de los metales pesados llegan a concentrarse en los
seres humanos por la bioacumulación en la cadena trófica. Entre los efectos
causados por los metales en los seres vivos se pueden citar: Corrosión de tejidos
(Hg inorgánico), trastornos neurológicos (Hg y Pb orgánicos), inhibición de
hemoglobina, (Pb), porosidad en los huesos (Cd, Pb), carcinomas
bronquiogénicos (Cr), toxicidad a altas concentraciones (Zn, Ni) (Cañizares-
Villanueva et al., 2003).
Métodos físicos-químicos y biológicos para la remoción de metales pesados en
aguas residuales.
Los métodos físico-químicos convencionales para el tratamiento de aguas
residuales con metales, incluyen: precipitación, oxidación, reducción, intercambio
iónico, filtración, tratamiento electroquímico, tecnologías de membranas y
recuperación por evaporación, los cuales han sido ampliamente usados. La
desventaja de estos métodos es la remoción incompleta de los metales, el uso de
equipos muy costosos, altos requerimientos de energía, además de la disposición
final de los residuos. Estos tratamientos pueden ser ineficientes o
extremadamente caros cuando la concentración de metal en las aguas residuales
está en un intervalo de 10-100 mgL-1 (Cañizares-Villanueva et al., 2003; Mehta y
Gaur, 2005).
Los sistemas biológicos tienen el potencial de hacerlo mejor y a menor costo.
Los microorganismos suelen ser bioacumuladores en concentraciones bajas de
metales; una alternativa potencial a los métodos ya existentes para la
destoxificación y recuperación de los metales tóxicos o valiosos presentes en
aguas residuales (Cañizares-Villanueva 2000).
Los procesos de Biorremediación pueden clasificarse según Flores-Vásquez
(2001) en:
Bioacumulación: Basado en la absorción de las especies metálicas mediante los
mecanismos de acumulación al interior de las células vivas; varios estudios
incluyen el uso de bacterias Gram+, Gram-, algas marinas, etc.
Bioadsorción: Es el proceso de adsorción (fenómeno de superficie) que se realiza
sobre biomasas secas, a partir de residuos de cultivos de fermentación o de
derivados de organismos animales y vegetales. También se lleva a cabo en la
pared celular de microorganismos vivos.
Utilización de microalgas para la remoción de metales pesados
La depuración de las aguas residuales consta de tres distintos tratamientos:
primario, secundario y terciario, cada uno de estos se fundamenta en sistemas de
transferencia de masa, energía, diseño de reactores y operaciones unitarias que
determinan la eficiencia de los sistemas de depuración de aguas residuales. En el
tratamiento terciario el objetivo principal es la purificación del agua, eliminación de
compuestos tóxicos, o sustancias que provoquen desequilibrios ecológicos en
canales, mares, o al ser vertido para su reutilización.
Las microalgas, organismos fotoautótrofos constituidas celularmente por
cloroplastos que son los organelos que permiten la transformación de la luz solar
en energía química mediante la fotosíntesis oxigénica a partir de dióxido de
carbono como fuente de carbono, fueron utilizadas en los trabajos pioneros de
Oswald (1988) en California para el tratamiento de aguas residuales urbanas con
un contenido elevado en carbono orgánico disuelto, carga orgánica y minerales.
Los metales pesados que se estudian en el presente proyecto son el níquel (Ni) y
el cromo (Cr). Muchos de los compuestos de níquel se disuelven fácilmente en el
agua presentando un color verde característico. Las fuentes principales de níquel
son las plantas de energía que queman el petróleo, incineradoras, las pilas
recargables domésticas contienen el 22 % de níquel. Existen estudios que
demuestran que algunas plantas superiores pueden incorporar y acumular níquel
(Majid Ghaderian., et al 2000).
En animales expuestos a compuestos de níquel se han observado inflamación del
pulmón y daño de los senos nasales. La exposición a concentraciones de 10 mg
de níquel/m³ (en la forma de compuestos de níquel poco solubles como
subsulfuro de níquel); produce daño suficientemente grave como para afectar la
función pulmonar, provocar cáncer de pulmón. (ATSDR, 2003), (ATSDR, 2005).
El Cr (VI) es un metal pesado capaz de producir respuesta tóxica en la biota
acuática (Alayo et al ., 2004),, junto con el Cr (0) son producidos generalmente
por procesos industriales. La exposición baja a Cr (VI) puede irritar la piel y
causar su ulceración. La exposición a largo plazo puede causar daños en riñón e
hígado, problemas en el sistema circulatorio y el tejido fino nervioso. Se ha
determinado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos (DHHS) y la
Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) que ciertos
compuestos de cromo son carcinogénicos para los seres humanos. La biomasa
algal proporciona electrones para la reducción de Cr (VI) a Cr (III). (Jacome-Pilco
2006). Tiene una gran afinidad por las proteínas orgánicas, se fija también a los
eritrocitos, el Cr (VI) y Cr (III) es un desnaturalizador de proteínas y precipitante
de los ácidos nucleicos (Meléndrez 1998).
Scenedesmus incrassatulus, características y mecanismos para la remoción de
metales.
La figura 2, muestra las características de la microalga Scenedesmus
incrassatulus al microscopio óptico. Es posible observar que existen varias células
unidas entre si, lo que se denomina cenobio y se debe a que en la primera etapa
de la división celular, se divide solamente el núcleo y en una segunda etapa se
separa el citoplasma y se delimitan las células hijas lo que se denomina
cariocinesis. En este caso existe la formación de cenobios, no habiendo una
formación de células individuales manteniéndose unidas entre si por una
sustancia mucilaginosa, aunque si podemos encontrarlas como células
individuales sin formar cenobios.
Figura 2. Células de Scenedesmus incrassatulus. (A) Scenedesmus incrassatulus, (B) Scenedesmus antenmatus Tomada de Dzhambazon et al. (2003).
El género Scenedesmus pertenece al orden Chlorococcales de algas verdes
(Chlorophyceae), se encuentra ampliamente distribuido en agua dulce y suelos.
Scenedesmus incrassatulus, se caracteriza por crecer en colonias (cenobios) de
2-16 células siendo las más comunes aquellas de 2 y 4 células (Peña-Castro et
al., 2002). Se ha reportado presencia del género en cuerpos de agua
contaminados con metales pesados. (Jacome-Pilco, 2006).
Se ha señalado que la presencia de metales pesados en el ambiente acuático
ejerce una fuerte presión de selección sobre los organismos que allí habitan. Si la
descarga del contaminante es de carácter permanente, como sucede
habitualmente con los metales pesados, se produce una selección de aquellos
genotipos que pueden sobrellevar dicho estrés (Moraga, 2003).
En la figura 3; tenemos una representación esquemática de algunos mecanismos
de tolerancia a los metales, comunes en las algas, mismos que pueden ser tres
categorías. La primera comprende mecanismos que secuestran metales en
componentes extracelulares cuya función es reducir la biodisponibilidad del metal
entre los siguientes mecanismos (adsorción, intercambio iónico, unión covalente,
atrapamiento de partículas, reacciones redox y precipitación) entre la célula y la
concentración intracelular. El segundo mecanismo incrementa la salida de
metales de la célula y el tercero incluye varios tipos de desintoxicación celular. La
desintoxicación celular es un mecanismo que incluye atrapar o secuestrar en
A B
polifosfatos, fitoquelatinas y metalotioninas o por lazos con sustancias
fuertemente quelantes. La desintoxicación puede también llevarse a cabo por
oxidación y reducción de transición de los metales, quelación,
compartamentalización en organelos (vacuolas y mitocondrias), esto como una
respuesta rápida de la célula y la tensión constante del metal pesado, produciendo un estado menos tóxico o menos soluble. El estrés causado por el
efecto tóxico a que se ven sometidas algunas algas puede alterar la síntesis de
enzimas del metabolismo. (Gaur y Rai, 2001), (Cañizares-Villanueva et al., 2000),
(Perales-Vela 2005).
Figura 3. Formas en que los metales son enlazados en sitios específicos de la célula. Tomada de Mehta y Gaur (2005).
Cultivo continuo de microalgas para la remoción de metales pesados. El cultivo continuo, es una forma de cultivar células manteniendo constante un
flujo de ingreso de nutrientes (F) a un reactor donde se mantiene un volumen
constante de trabajo (V) a través de la salida de cultivo al mismo flujo (F) de
ingreso de nutrientes. La razón de ingreso de nutrientes (F) y el volumen de
trabajo (V) determinan la velocidad de dilución (D), cuyo inverso es el tiempo de
residencia (Tr). Las condiciones de cultivo. Como temperatura, pH, iluminación,
etc., pueden ser controladas de acuerdo a las necesidades experimentales
(Scragg 2002; Doran, M 2002).
En un sistema de cultivo la rapidez de crecimiento (µ), se determina por la rapidez
de suministro del medio (F), al mantener constante (F), el cultivo se puede
mantener en un estado estacionario de crecimiento indefinidamente lo que
permite fijar condiciones definidas de biosíntesis, metabolismo y regulación de la
célula. La aplicación de sistemas de cultivo continuo para el estudio de la
fisiología algal tiene mucha importancia, debido a la alta productividad de biomasa
que se puede alcanzar en un fotobiorreactor. Las variables más interesantes es el
estudio de la cinética de crecimiento, en relación con el estado estable del
sistema para incrementar la productividad celular. (Jacome-Pilco 2006),
Los fotobiorreactores “airlift” proveen mejor mezclado, sin agitación mecánica, son
usados en el cultivo de plantas, animales y células inmovilizadas. En la
configuración general de un reactor airlift, destacan: inyector de aire, canales de
flujo (que se dividen por un bafle) ascendente, y descendente. El aire es
esparcido solo por una parte (canal) del recipiente, provocando que el aire fluya,
disminuyendo la densidad por el movimiento hacia arriba del líquido, lo que
permite que existan dos tipos de flujos constantes del medio dentro del reactor,
logrando que el aire se distribuya a todas las células, así como los requerimientos
de iluminación y nutrientes. Estos sistemas han demostrado un funcionamiento
prometedor en el cultivo de microalgas (Sánchez- Mirón et al ., 2000; Doran, M
2002). (Peña-Castro et al., 2003). Reporta el uso de sistema de cultivo continuo
con Scenedesmus incrassatulus, en la biorremediación de cromo, los porcentajes
de remoción obtenidos son en un orden del 52.7%. Antecedentes de estudios de remoción de Ni y Cr (VI) en los últimos años.
En la Tabla 1 se presenta información de reportes recientes sobre la capacidad de
absorción de metales pesados por algunas algas.
Tabla 1. Antecedentes sobre la remoción de Ni y Cr(VI) por microalgas. Adaptada de Mehta y Gaur (2005).
Metal Alga Adsorción Referencia
(mmol g-1) (mg g-1)
Cr (VI) Padina sp 1.05 54.60 Sheng et al., 2004b
Pilayella littoralis 0.09 4.68 Carrillo y Gilbert,
2000
Sargassum sp. 0.61 31.72 Sheng et al, 2004 b
Ni Chorella miniata 0.0007 0.04 Chong, Wong y Tam,
2000
C. minimata 0.35 20.43 Lau et al., 1999
C. sorokiniana 0.002 0.12 Chong, Wong y Tam,
2000
C. vulgaris 0.17 10.09 Sandau, Sandau y
Puiz, 1996
C. vulgaris 0.002 0.12 Chong, Wong y Tam,
2000
C. vulgaris 0.21 12.04 Lau et al., 1999
C. vulgaris 0.02 1.29 Wong, Wong y Tam,
2000
C. vulgaris 1.02 59.70 Donmenz et al.,
1999
C. vulgaris 0.40 23.48 Mehta y Gaut, 2001ª
C. vulgaris 3.50 205.48 Mehta and Gaut,
2001b
C. vulgaris (tratada
con ácido)
7.46 437.98 Mehta, Singh, y
Gaur, 2002
C. vulgaris
(inmovilizada)
1.89 111.31 Mehta y Gaur, 2001c
Chlorella miniata 0.05 2.99 Wong, Wong y Tam,
2000
Lyngbya taylorii 0.65 38.16 Klimmek et al., 2001
Microcystis
aeruginosa
4.26 249.98 Pradhan et al , 1998
Padína pavonía 1.00 58.71 Ofer, Yerachmlel, y
Shmuel, 2003
Pílayella littoralls 0.39 22.89 Carrilho y Gilbert,
2000
S. quadricauda 0.0006 0.04 Chong, Wong y Tam,
2000
S. vulgaris 1.00 58.71 Ofer, Yerachmiel y
Shmuel, 2003
Sargassum sp. 3.08 180.83 Kalyanl, Rao, y
Krishnalah, 2004
Scenedesmus
oblíquus
0.51 30.18 Donmenz et al.,
1999
Sprírulina sp. 0.003 0.18 Chojnackl, y
Górecka, 2004
Synechococcus sp..
PCC 7942
0.05 3.17 Gardea-Torresdey et
al., 1998.
Synechocystis sp. 3.23 189.81 Donmenz et al.,
1999
Ulva reticulata 0.79 46.51 Vijayaraghavan et
al., 2005
1.2 Definición del problema
El rápido crecimiento urbano e industrial en estos últimos años, han incrementado
el consumo del agua y a la vez han generado grandes volúmenes de aguas
residuales de distintas características. Los metales pesados, principalmente
presentes en las aguas residuales industriales, son nocivos para la salud humana
aún a bajas concentraciones, debido a que tienden a bioacumularse y provocar
daños a los órganos vitales.
Los métodos físico-químicos, generalmente utilizados para remover metales
pesados de medios acuosos a más de ser costosos y generar residuos tóxicos,
son ineficientes aún a concentraciones. Esto hace necesario el desarrollo de
nuevos procesos y tecnologías, dentro de las cuales la biorremediación utilizando
las microalgas puede brindar algunas alternativas.
1.2 Justificación
Los tratamientos terciarios o avanzados permiten eliminar contaminantes
específicos como metales pesados. Los sistemas de tratamientos físico-químicos
para este objetivo resultan costosos e ineficientes.
La utilización de sistemas biológicos para la remoción de metales pesados de
sistemas acuosos es de gran interés. El estudio del efecto tóxico de metales
pesados sobre microalgas en sistemas de cultivo continuo con ingreso de
nutrientes y metales, se semeja a los procesos naturales. El conocimiento
generado de esta manera, podría aplicarse para desarrollar sistemas de
biorremediación de metales pesados.
1.3 Objetivos
Objetivo General
Determinar los porcentajes de remoción de los metales pesados para Niquel (Ni) y
Cromo (Cr VI), por la microalga Scenedesmus incrassatulus en un sistema de
cultivo continuo, a una velocidad de dilución constante.
Objetivos específicos
Determinar el efecto tóxico de los metales Cr(VI) y Ni sobre los parámetros
biomasa seca, pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b, clorofila total y
carotenoides).
Evaluar la remoción del Cr(VI) y Ni por la microalga S. incrassatulus.
II. MATERIALES Y METODO:
• Microorganismo y medio de cultivo
La cepa utilizada fue Scenesdemus incrassatulus (CLHE-Si01, obtenida del
Laboratorio de Hidrobiología Experimental ENCB-IPN, México), reactivada en
medio sólido basal de Bold y posteriormente resembrada en medio líquido PCG
(Perales et al., 2004). El medio mineral líquido PCG, fue esterilizado en autoclave
a 15 lb/plg2 durante 15 min.
• Establecimiento del sistema de cultivo continúo.
Se utilizaron dos fotobiorreactores tipo airlif para un volumen de trabajo de 1,800
ml., iluminados continuamente por los costados con lámparas fluorescentes a una
intensidad de luz aproximada de 220 µmol/m2s, aireación de 997 ml/min y una
temperatura de 25±20C. El pH se controló automáticamente a 8.9±0.2 con una
solución diluida de H2SO4 y la alimentación del medio se realizó con una bomba
peristáltica (Masterflex L/S, USA) (Fig. 4).
Figura 4. Sistema utilizado, reactor tipo airlift
Sistema utilizado:
(1) ingreso de aire,
(2) control del pH,
(3) sensor de pH,
(4) bomba peristáltica,
(5) controlador electrónico automático de pH,
(6) fuente de iluminación,
(7) matraz para medio de alimentación (PCG),
(8) probeta para H2SO4, usado en el control de pH,
(9) reactor tipo airlift, para volumen de operación de 1800 ml,
(10) alimentación del medio PCG.
• Operación del cultivo continuo
Se operaron dos reactores en paralelo, uno para el tratamiento con Ni y el otro
para el Cr(VI). Inicialmente se inocularon a cada uno de los rectores células de S.
incrassatulus creciendo en fase exponencial provenientes de un matraz semilla.
Los cultivos se mantuvieron en lote hasta alcanzar una densidad celular
aproximada de 6x105 cél/mL. Inmediatamente se procedió a alimentar
continuamente el medio mineral PCG sin metal (cultivo control) a flujos de 21.7 y
22.5 mL/h, respectivamente. Una vez alcanzado el estado estable, se mantuvo en
este estado al cultivo por 5 Tr (5 Tiempos de retención). Posteriormente se
adicionó en los reactores y al medio de alimentación cantidades suficientes de
solución preparada con estándar certificado de Ni (988 mg Ni/l, Sigma-Aldrich) y
de Cr(VI) (984 mg Cr(VI)/l, Sigma-Aldrich), hasta obtener una concentración de
4mg/L de Ni y 1 mg/L de Cr(VI). La concentración de los metales en el medio de
alimentación se verificó cada tres días por espectrometría de absorción atómica.
Tanto para el cultivo control como con tratamiento, se tomaron alícuotas del
cultivo de salida cada 48 horas para determinar los parámetros: biomasa seca,
pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b, clorofila total y carotenoides) y la
cuantificación del metal.
Procedimientos analíticos
Biomasa seca
Se filtraron 25 ml de suspensión algal a través de membranas Millipore® de 5.0
µm de tamaño de poro (previamente puestas a peso constante). Los filtros con la
biomasa se desecaron en estufa a 80 0C por 24 horas, hasta peso constante (de
la Noüe, 1988). Esta prueba se llevó a cabo por duplicado.
Pigmentos fotosintéticos
Las clorofilas y carotenoides fueron extraídos con metanol desde las células y
determinados por espectrofotometría. Sus concentraciones fueron calculadas
utilizando las fórmulas de Welburn (1994). Para cada muestra se realizó esta
prueba por cuadruplicado.
Fórmulas propuestas por Welburn (1994):
• Clorofila a = 15.65(A666) – 7.34 (A653) ;
• Clorofila b = 27.05 (A653) – 11.21 (A666) ;
• Carotenoides = 1000 (A 470) – 2.86 (Clorofila a) – 129.2 (Clorofila b) / 221
• Clorofila total = Clorofila + Clorofila b
Cuantificación de metales removidos
Se filtraron 25 ml de suspensión algal a través de membranas Millipore® de 5.0
µm de tamaño de poro, la fase líquida se recogió en envases de plástico
previamente tratados con ácido nítrico al 10 %, se le adicionó 25 µl de HNO3
concentrado y se guardó a 40C hasta el análisis de la concentración del metal. La
biomasa retenida en la membrana se digirió con 5 ml de HNO3 concentrado en
un digestor Kjeldahl, el digerido se guardó a 4°C hasta el análisis de la
concentración del metal. La concentración del Ni y Cr, se determinó por
espectrofotometría de absorción atómica, utilizando un equipo Varian Spectra
100/200 de acuerdo a lo recomendado por el fabricante del equipo, para el Cr se
utilizó una flama óxido nitroso-acetileno. Se calculo la eficiencia de remoción del
metal con base al contenido de metal residual en la fase líquida, mediante la
relación [SiCr(VI) – SsCr(VI)] / SiCr(VI), donde SiCr(VI), es la concentración del metal en
el medio de alimentación y SsCr(VI), es la concentración del metal en la fase líquida
a la salida del reactor. El resultado se expresó como % de remoción. La
capacidad de remoción se determinó por la cantidad de metal retenido en la
biomasa algal, expresada como mg Cr(VI)/g BS.
III. Resultados
Cultivo Testigo Cr(VI)
La figura 5, representa los resultados obtenidos de biomasa, en el cultivo testigo,
se alcanza un sistema de cultivo estable a partir del día 12 del experimento (T12)
al día 29 (T29), donde la concentración de biomasa tuvo un promedio de 271.25
mg/L.
Figura 5. Cultivo testigo. Biomasa seca de S. incrassatulus expresada en mg/L en un sistema de cultivo continuo.
En La figura 6, aparecen los resultados obtenidos de pigmentos (clorofila total,
clorofila a, clorofila b, carotenoides), se alcanzó cultivo estable del T12 al T29 los
promedios para clorofila a= 5.39 mg/L, Clorofila b=1.75 mg/L, Carotenoides= 1.46
mg/L, Clorofila total=7.16 mg/L.
Figura 6. Cultivo testigo, clorofila total, clorofila a, clorofila b, carotenoides de S. incrassatulus, en cultivo continuo.
Durante el periodo que se mantuvo en estado estable el cultivo, el contenido
específico de pigmentos en biomasa seca, fue el siguiente: para Cl a/ BS (19.1 -
20.7), Cl b/BS (6.2 - 6.7), Carot/BS (5.2 - 5.6), Cl T/ BS (25.6 – 27.4).
Influencia del Cr(VI)
En la figura 7. se puede observar que durante los primeros 7 días, el promedio
fue de 227 mg/L, a partir del (T7) al (T17) la biomasa incrementa su promedio a
268.5 mg/L, la biomasa se recupera alrededor de un 6 %.
La figura 8 muestra la disminución de los pigmentos, hasta un ( T7 ), los
promedios para Clorofila a= 4.00 mg/L, Clorofila b=1.33 mg/L, Carotenoides= 1.16
mg/L, Clorofila total=5.32 mg/L, los pigmentos aumentan a partir de (T7) al (T17).
Figura 8. Efecto del Cr(VI) con una concentración de 1mg/L , en los pigmentos de S. incrassatulus, en cultivo continuo.
Figura 7. Efecto del Cr(VI) con una concentración de 1mg/L , en la biomasa de S. incrassatulus, en cultivo continuo.
En la figura 9 la relación de la clorofila a/ Biomasa seca (Cl a/ BS), refleja el
envejecimiento (Irastorza et al., 1981) de la célula durante el tiempo. Como cultivo
testigo en estado estable del (T12) al (T29), y del (T30) al (T47) cultivo con Cr(VI)
a una concentración de 1 mg/L, donde la célula se ve afectada del (T31) a (T37).
Del (T37) al (T47), se ve la tendencia del cultivo a estado estable, estos
resultados son una parte del proyecto, el cual siguió su estudio donde se llego al
estado estable.
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (d)
rela
ción
Cl a
/BS
cultivo testigo Cl a/ BS
Cr(VI) 1mg/L Cl a/BS
En la Figura 10, se observa el porcentaje de remoción del Cr(VI), en (T1) al (T2),
el metal es removido en un 91 y 89 % respectivamente, se alcanza un estado
estable en los (T13) y (T18) del cultivo S. incrassatulus con un 1 mg/L de Cr(VI)
donde el porcentaje de remoción es alrededor de 49 – 45%.
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Tiempo (d)
% R
emoc
ión
% remoción de Cr (VI)
Figura 9. Relación de Cl a/ BS (clorofila a/ biomasa seca), durante el tiempo
Figura 10. Porcentaje de remoción de Cr(VI), por S. incrassatulus, en cultivo continuo.
En un periodo de 29 días, se logró obtener el cultivo testigo en estado estable
para la biomasa seca y pigmentos a partir del (T12); se mantuvo por 5Tr
aproximadamente 17 días, donde se trabajo con una velocidad de dilución de
0.289 d-1– 0.30 d-1, además las relaciones de pigmentos/biomasa seca,
comprobaron que el cultivo se mantuvo en estado estable debido a que este
cociente se conservo regularmente constante durante el (T12) al (T29) donde la
actividad celular es óptima figura 5 y 6. El cultivo testigo se mantuvo en estado
estable debido a que la velocidad de dilución es igual a la velocidad específica de
crecimiento característica del cultivo continuo además de conservarse por arriba
de 3 y 4 Tr (Peña Castro et al., 2003) , donde la concentración celular y la del
sustrato limitante permanecen constantes (Quintero Ramírez, 1981).
El efecto del Cr(VI) sobre la biomasa y pigmentos, provocan una desestabilización
en el sistema, disminuyendo la biomasa seca en 16.31% la clorofila a 34.8 %,
clorofila b 37.06 %, carotenoides 20.34 % y clorofila total 35.96 %. En el intervalo
de (T4) a (T10), se observa que la clorofila a tiene una baja a 3.051 mg/L (T7) y
los carotenoides presentan un pequeño incremento en el mismo (T7),
observándose que actúan como protectores de daños celulares (Madigan,
Martinko, Parker., 2004), esto debido a que las microalgas son muy sensibles a
los metales pesados y los carotenoides actúan cuando la célula se somete a un
estrés provocado por el cromo el cual inhibe la fotosíntesis en algunas algas por
lo cual se dio una baja principalmente en la clorofila a . Los efectos del Cr y otros
metales sobre la célula van a depender del tamaño de la célula, estructura de la
pared celular y reacciones redox, se debe considerar el tiempo de exposición.
(Alayo et al., 2004).
El porcentaje de remoción del Cr(VI), fue alrededor de 45 % - 49% ya que no se
establecieron 3Tr como mínimo para alcanzar el estado estable con el metal,
donde se compara con (Peña castro et al., 2004), que obtuvo un 52.7 % de
remoción de Cr(VI), con una concentración inicial de 1.2 mg/L de Cr(VI). Otra
razón pudo ver sido que el medio utilizado al contener EDTA, permiten ser mas
asimilable los metales por la microalga Scenedesmus incrassatulus por que
algunos complejos reducen la disponibilidad del metales y aumentan la de los
nutrientes. (Clair, Perry, Gene., 2001).
La capacidad de remoción para Cr (VI) es de 2 mg Cr(VI)/ g BS.
Cultivo Testigo Ni
En la figura # 11, podemos observar, que los primeros 10 días (T 10) tarda para
estabilizarse la biomasa, y a partir del (T13) al tiempo (T 29), se mantiene en
estado estable donde la concentración promedio de biomasa fue de 298.3 mg/L
en ese intervalo.
050
100
150200250300
350400
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (d)
Biom
asa
(mg/
L)
BMS mg/L
La figura 12, muestra los pigmentos donde los promedio son para Clorofila a=
6.195 mg/L, Clorofila b= 2.065 mg/L, Carotenoides = 1.69 mg/L, Clorofila Total=
8.24 mg/L, en estado estable a partir del día 13 (T13) hasta el día 29 (T 29).
Figura 11. Cultivo testigo. Biomasa seca de S. incrassatulus expresada en mg/L en un sistema de cultivo continuo.
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (d)
Clo
rofil
a a
(mg/
L)
Clo
rofil
a b
(mg/
L)
Car
oten
oide
s (m
g/L)
C
loro
fila
tota
l (m
g/L)
Clo a (mg/L) Clo b (mg/L)
Carot (mg/L) Cl T (mg/L)
Influencia del Ni
En la figura 13 se muestra que durante los primeros 11 días, el promedio fue de
267.83 mg/L, a partir del (T11) al (T17) la biomasa incrementa su promedio a
274.6 mg/L permaneciendo por debajo del cultivo testigo en 7.64 %.
240
250
260
270
280
290
300
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Tiempo (d)
Biom
asa
Ni m
g/L
BMS Ni
En la figura 14, se ve el efecto que tiene el Ni a 4 mg/L, durante 18 días, los
promedios para Clorofila a= 3.8 mg/L, Clorofila b=1.3 mg/L, Carotenoides= 1.2
mg/L, Clorofila total=5.1 mg/L, se percibe su estado estable a partir del (T13) al (T
17).
Figura 12. Cultivo testigo, clorofila total, clorofila a, clorofila b, carotenoides de S. incrassatulus, en cultivo continuo.
Figura 13. Efecto del Ni con una concentración de 4 mg/L, en la Biomasa seca de S. incrassatulus, en cultivo continuo.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Tiempo (d)
Clor
ofila
a (m
g/L)
Cl
orof
ila b
(mg/
L)
Caro
teno
ides
(mg/
L)
Clor
ofila
tota
l (m
g/L)
Cl "a" (mg/L) Clo "b" (mg/L)
Carot (mg/L) Cl T (mg/L)
En la figura 15 la relación de la clorofila a/ Biomasa seca (Cl a/ BMS), se hace
constar que se mantiene en cultivo testigo estable durante el periodo (T 11) al (T
29), el efecto de 4 mg/L de Ni se aprecia del (T29) al (T47), donde tiende a iniciar
el cultivo estable, pero no pudiéndose determinar (T 47), al finalizar el
experimento no se alcanzo un estado estable bien definido.
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50Tiempo (d)
Rem
oció
n Cl
a/ B
S
Cultivo testigo Ni relación Cl a/BS
4 mg/L Ni relación Cl a/BS"
Figura 14. Efecto del Ni con una concentración de 4 mg/L , en los pigmentos de S. incrassatulus, en cultivo continuo.
Figura 15. Relación de Cl a/ BS (clorofila a/ biomasa seca), durante el tiempo para Ni a 4 mg/L
En la Figura 16, Se observa que en un periodo de 17 días el metal es removido en
un porcentaje de 92.1 %, no se percibe el estado estable durante este periodo de
tiempo.
8284868890929496
0 5 10 15 20Tiempo (d)
% R
emoc
ión
% Remoción de Ni
Se mantuvo el cultivo testigo en estado estable por 4.5 Tr, a una velocidad de
dilución de (D= 2.9 d-1), donde la relación de pigmentos (Clorofila a/Biomasa seca)
permanecen dentro de un mismo intervalo de 24.6 – 20.1 Cl a/ BMS.
El Ni a una concentración de 4 mg/L, afecta la biomasa seca en 10.22 %, los
pigmentos se reducen en clorofila a 38.77 %, clorofila b 38.095 %, carotenoides
29.41 %, clorofila total 37.78 %.
A partir del (T 7) al (T17) los carotenoides aumenta su producción en relación a
los otros pigmentos que tienden a disminuir en ese intervalo de tiempo (ver figura
13).
El níquel fue removido entre un 90 - 93 % no presentándose un estado estable
bien definido, este porcentaje se mantuvo regularmente después del día 7 del
cultivo.
Se observo un fenómeno de floculación durante el experimento, donde el Níquel
produce floculación de la microalga Scenedesmus incrassatulus esto se debe a la
reacción de fosfatos (PO43) y Ca2+ induciendo a la autofloculación y la
producción de polisacáridos o polímeros extracelulares iniciaron la biofloculación,
siendo los polisacáridos quienes se producen en mayor cantidad y en forma
continua en el sistema de cultivo continuo a los cuales se les atribuye este efecto.
Figura 16. Porcentaje de remoción de Ni, por S. incrassatulus, en cultivo continuo.
(Lavoie, de la Noüe 1986), ( Sukenik, Shelef 1983). La floculación es el método
económicamente más viable para recuperar la biomasa (Mendez Bojorquez
1995), las algas filamentosas disminuyen las dificultades de la biomasa ejemplo:
Phormidium bohneri algal (Méndez Bojorquez 1995).
Se obtuvo una productividad de biomasa de 78.6 mg/Ld (3.275X10-3 gr/Lh-1) para
el cultivo testigo de Cr(VI) y de 88.50 mg/Ld (3.69X10-3 gr/Lh-1) cultivo testigo Ni,
una alta productividad va depender de mantener altas densidades celulares,
comparándola con la microalga Isochrysis galbana cultivada en batch donde se
comparan distintos medios de cultivo, con productividades de 0.89X103 gr/Lh-1
hasta 2.25 X103 gr/Lh-1 para los 8 medios estudiados (Sánchez., et al 2000).
La productividad de la clorofila a para el cultivo testigo Cr(VI) es de 1.563 mg/Ld y
para el cultivo testigo Ni de 1.79655 mg/Ld, superando al valor mas alto
presentado en un cultivo en semidiscuntinuo de la Cianobacteria Anabaena PCC
7120, el cual fue de 1.03 +/- 0.23 mg/Ld, con una renovación del medio del 20%..
(Loreto y Morales 2003).
Se consiguió una capacidad de remoción de 13.3 mg de Ni/ g BS.
IV.- CONCLUSIONES
S. incrasatulus creciendo en un sistema de cultivo continuo, bajo condiciones
controladas puede remover hasta el 45% de Cr(VI) iniciando con una
concentración de 1 mg/L.
S. incrasatulus creciendo en un sistema de cultivo continuo, bajo condiciones
controladas puede remover hasta el 93% de Ni iniciando con una concentración
de 4 mg/L.
S. incrassatulus alcanza una buena eficiencia en la remoción de Níquel y una
buena capacidad de remoción, además de sus propiedades de floculación que la
hacen ser más eficaz para los tratamientos terciarios de las aguas residuales.
La alimentación de medio de cultivo conteniendo 1 mg Cr(VI)/l, produjo un
aumento del 6% en la producción de biomasa seca. En cambio, la presencia de 4
mg Ni/l, produjo una disminución del 7% en el contenido de biomasa seca.
Los metales Cr(VI) y Ni afectaron negativamente el contenido de los pigmentos
fotosintéticos.
Recomendaciones:
Utilizar periodos de luz/oscuridad, para adaptar a la microalga a condiciones
ambientales naturales y facilitar su empleo en sistemas de tratamiento terciario de
agua residuales.
Repetir el experimento utilizando agua residual real y determinar las eficiencias
de remoción de nutrientes y de cromo y níquel.
V.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ATSDR, Department of Health and Human Services, Agency for Toxic Substances & Disease Registry. Agosto del 2005. Carlos Rodrigo Jácome Pilco, 2006 proyecto de tesis. Remoción continua de cromo y níquel empleando la microalga Scenedesmus incrassatulus. Departamento de Biotecnología Y Bioingeniería Laboratorio de Biotecnología de Microalgas Lab # 21. Cañizares Villanueva Rosa Olivia, Peña Castro Julián Mario y Martínez-Jerónimo Fernando. 2003. Efecto de metales pesados sobre las microalgas y sus implicaciones ambientales. CINVESTAMBIENTE 2003 Cañizares-Villanueva Rosa Olivia, 2000. Biosorción de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana., Departamento de Biotecnología y Bioingeniería. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Revista Latinoamericana 2000. Coral Contreras-Flores, Julián Mario Peña-Castro, Luis Bernardo Flores-Cotera y Rosa Olivia Cañizares-Villanueva. 2003. Avances en el diseño conceptual de fotobiorreactores para el cultivo de microalgas. INTERCIENCIA, Vol 28 No 28. Clair N. Sawyer, Perry L. McCarty, Gene F. Parkin 2001, Química para Ingeniería ambiental 4ta edición, McGrawHill. Dzhambazon Balik, Belkinova Detelina and Mladenov Rumen 2003. Karyotypic analyses of two algae species Scenedesmus incrassatulus Bohl. And Scenedesmus antennatus Breb. (Chlorophyta, Chlorococcales), Hereditas 139: 35–40. Lund, Sweden. ISSN 0018-0661. Liógon Rodríguez David Adrián, 1997. Determinación de metales pesados traza en aua sedimento y camarón blanco, procedente de la estanquería rústica del block 1517 Valle del yaqui. Tesis, ITSON; Cd. Obregón Sonora, México. Dr. Mariano Cebrian1, Dr. Fernando Díaz Barriga2, y Dra. Patricia Ostrosky-Wegman3 (CINVESTAV) 2 (UASLP), y 3 (UNAM). La toxicología ambiental en México, Memorias de las Jornadas de Toxicología, 6-7 de Noviembre 2003 (www.geocities.com/toxicologiamexico/I-Identificacion.pdf) , visitado 5 julio 2007 De la Noüe, J., and De Pauw, N. 1988. The potential of microalgal biotechnology: a review of production and uses of microalgae. Biotechnol. Adv. 6:725-770. García Sayazo Francisco, 2000, Monitorización de metales de interés medioambiental en la población de tarragona. niveles en tejidos de autopsia. Tesis Doctoral, Universitat rovira i virgili Tarragona, Barcelona, España. Visitada (www.tesisenxarxa.net/TESIS_URV/AVAILABLE/TDX-1016102-134358//Doc1FGS.pdf).
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