Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Mikrobiel dechlorering af TCE - molekylære teknikker til bestemmelse af tilstedeværelse

og aktivitet af specifikke nedbrydere

Carsten Suhr Jacobsen, GEUSJacob Bælum, GEUS

Charlotte Scheutz, DTU MiljøMette Broholm, DTU Miljø

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Om at gå sukkerkold

• Mikrobielle populationer i naturlige jord og grundvands miljøer er som regel sultne..

• Sultne bakterier i disse miljøer kan antage forskellige former eller aktivitetsniveauer…

• Levende og aktive bakterier i jord og grundvandssedimenter kan detekteres både med teknikker til at måle dyrkbare bakterier som med DNA baserede teknikker – inaktive bakterier kan ofte kun findes med DNA..

• Ved anaerob deklorering eller halorespiration tilsætter vi store mængder af en kulstof kilde og tvinger på den måde redox forholdende ned..

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Om at trække vejret på klor

• Mikrobiel deklorering af TCE/PCE/cisDCE/VC drives af bakterier, der trækker vejret på klor.

• Klor i form af PCE/TCE er ikke den værste elektronacceptor.

• Men der sker først den ønskede deklorering når redox forholdende er tilstrækkeligt lave.

• Mange bakterier kan trække vejret på forskellige måder – f.eks. Pseudomonas fluorescens er også i stand til at denitrificere

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Tælling af Dehalococcoides sp. i grundvandssedimenter

• DNA baseret kvantificering af antallet af bakterier i en miljøprøve foretages på baggrund af 16S rRNA generne

• Primere til PCR er fundet så de er specifikke for Dehalloccoides sp. eller Dehalobacter sp.

• Man kan på den samme prøve som der bestemmes specifikke bakterier vælge at analyserer for total antal bakterier ved at bruge generelle primere

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Jensen’s Autoværksted

cDCE

+ Sukker

DNA ekstraktion

500 ml vand (eller mindre) filtreres gennem 0,22 µm filtre og DNA ekstraheres.

Real-time PCR kvantificering af Dehalococcoides sp. bakterier.

Real-time PCR kvantificering af total antal bakterier

Renhedskontrol af DNA

Real-time PCR kvantificering af gener kodende for vinyl klorid reductase enzymer.

Vand prøver

10 L DNA ekstrakt

+ intern kontroll (gfp

gen)

Real-time PCR med gfp specifikke primers

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Tælling af antal specifikke nedbryder gener (vcrA)

• Ikke alle Dehalococcoides sp. har det sidste trin i nedbrydningsvejen men stopper ved cis-DCE - eller værre VC.

• Det er heller ikke sikkert, at alle der kan nedbryde cisDCE eller VC er i familie med Dehalococcoides sp.

• To kendte gener findes typisk i de prøver vi har kigget på: vcrA eller bvcA

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Treatabillity forsøg med fokus på KB1• Tre forskellige koncentrationer af TCE• Tre forskellige koncentrationer af KB-1• Total 27 serumflasker• 100 g sediment fra Rugårdsvej• 200 ml sterilt hanevand• Tilsætning af laktat ~6 mM

KB-1TM (celler/ml) 0 105-106 106-107

TCE (µg/l)

0 0 0

1000 1000 1000

10000 10000 10000

The analyses Klorerede ethener Fede syre Anioner Methan DNA og RNA

ekstraction

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Treatabillity forsøg – kan vi spare på KB1?• Ingen KB1 tilsætning i Rugårdvej sediment gav dannelse af VC• 105 KB1 celler giver ok resultat ved 1000 µg TCE men forsinket dannelse af VC og

ethen ved 10.000 µg. 107 celler altid hurtigst (og viser ingen samlet vækst)• Ved 105 KB1 celler ses overraskende vækst af Dhc og vcrA uden TCE – måske

kan visse Dehalococcoides sp. trække vejret på andet end klor….

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

vcrA og bvcA gener viser ikke samme mønster

• bvcA gener opformeres fra de naturlige populationer i sedimentet fra Rugårdsvej

• bvcA gener opformeres ikke når den kommercielle kultur KB1 har ”magten”

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Hvad viser vores DNA baserede kvantificeringer

• Sammenhæng mellem antal Dehalococcoides sp og vcrA gener og hvor hurtigt nedbrydningen går fra TCE til ethen under de redoxforhold vi fik etableret.

• bvcA gener vokser kun i naturlige prøver men ikke i prøver tilsat KB1, samtidig med naturlig vækst af bvcA gener - vokser også vcrA.

• Når KB1 podes til ca. 107 celler per ml sker der ikke yderligere vækst.

• Når KB1 podes med 1% (105 celler) sker der vækst på den tilsatte laktat – også selv om der ikke er målbare mængder af TCE og cisDCE

• Hvis man kan leve med en senere nedbrydning af cisDCE kan man pode med mindre KB1

• Samlet set højere signal fra vcrA og bvcA end fra Dehalococcoides sp 16S gener.

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Kan de DNA baserede metoder direkte overføres til feltskala ?

• Ja - hvis prøven er repræsentativ….

• Men ofte strømmer vandet – nyt stof frigives osv. så det er vanskeligt at vurdere om de tælletal man får er udtryk for aktivitet.

• I stedet kan man kvantificerer mRNA direkte i vandprøven.

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Jensen’s Autoværksted

cDCE

+ Sukker

DNA ekstraktion

1. 500 ml vand (eller mindre) filtreres gennem 0,22 µm filtre; nedfryses på flydende kvælstof; RNA og DNA ekstraheres.

2. Revers transcriptase enzym omdanner mRNA til cDNA

3. Real-time PCR kvantificering af gener (DNA) samt transcripter (mRNA) kodende for vinyl klorid reductase enzymer.

Vand prøver

Revers transcriptase

Real-time PCR

RNA ekstraktion

- 80°C

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Kvantificering af mRNA

• Prøver fra samme forsøg (10.000 µg TCE/ml og 107 celler KB1/ml) er oprindeligt frosset ned på flydende kvælstof.

• Kvantificering af DNA prøver viser at antallet af gener stiger.

• Kvantificering af mRNA/DNA er dog et meget stærkt mål for aktivitet.

• Aktiviteten peak’er samtidig med vinylklorid dannes og forsvinder.

• Tilsyneladende er aktiviteten af vcrA høj sammenlignet med Jacobs tfdA gen hvilket giver håb for detektionsniveauet.

Time, days

0 100 200 300 400 500 600

vcrA

mR

NA

/vcr

A g

enes

0,01

0,1

1

10 vcrA mRNA vs.vcrA genes

Bottle 25-27µm

ol b

ottle

-1

0

5

10

15

20

25

30mRNA vs DNAcis-DCEVCEthene

vcrA

gen

es m

l-1

1e+4

1e+5

1e+6 vcrA genes

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Opsummering

• Det er muligt at kvantificere dels tilstedeværelsen af bakterier som Dehalococcoides sp. og Dehalobacter sp. – såvel som total bakterier ud fra samme DNA prøve.

• Det er fornuftigt at analyserer også for bvcA gener (ud over vcrA) hvis man ønsker at fastslå potentialet for dekorering.

• Analyse for mRNA/DNA for nedbryder gener som vcrA og bvcA burde kunne blive standard.

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Tak til:

• Christine Mosegaard Jensen• Rikke Brockmann • Pia Bach Jakobsen• Jens Schaarup Sørensen• Det Strategiske Forskningsråd

gennem REMTEC centeret for ekstern finansiering

Mikrobiel deklorering af TCE - molekylære teknikker

Tilgængelighed

• GEUS har valgt at tilbyde vore molekylærbiologiske analyser på ITV vilkår.

• Dette gælder både de nu nævnte analyser for nedbrydning af chlorerede opløsningsmidler – såvel som olieprodukter og pesticider.

• mRNA analyser er endnu ikke prisfastsat, men ekstraktion, renhedskontrol og kvantificering af vcrA og Dehalococcoides 16S gener i DNA prøver fra 500 ml vand har kostet 1200 kr. i et stykke tid.

• Vi stiller gerne protokoller til rådighed…