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Carte de restriction d’un fragment d’ADN

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Carte de restrictiond’un fragment d’ADN

Mar

queu

r II

I

Mar

queu

r II

I

Kb

Lad

der

non

coup

é

Eco

RV

Bam

HI +

Eco

RV

Bam

HI

21,2

5,054,25

1,951,61,37

0,830,95

Mar

queu

r II

I

Kb

Lad

der

10865432,521,5

10,8

Kb Kb

Figure 1a : Analyse de restriction du plasmide recombinant.Les fragments de restriction sont séparés par électrophorèsesur gel d’agarose à 1 % et révélés par coloration au BET.

Plas

mid

e no

n co

upé

Eco

RV

Bam

HI +

Eco

RV

Bam

HI

Figure 1b : Autoradiogramme du « Southern blot »hybridé par la sonde « insert » .

0,1

1

10

100

0 1 2 3 4 5

Distance de migration (cm)

Taill

e du

Fra

gmen

t (K

b)

TAILLE DES FRAGMENTS :

BamHI : 7 + 4,9EcoRV : 12BamHI + EcoRV : 7 + 3,2 + 1,7

BamHI

4,9 kb

EcoRV

BamHI

1,7 kb

7 kb

3,2 kb

PLASMIDE RECOMBINANT =11,9 Kb

Vecteur : 7 Kb+

Insert : 4,9 Kb

TaqI : 1,9 + 10 2 sites de coupure

TaqI + BamHI : 1 + 1,9 + 2 + 7 pas de site TaqI sur le vecteur

TaqI + BamHI + EcoRV : 0,7 + 1 + 1,2 + 2 + 71 site TaqI de part et d’autre de EcoRV

Taq de 1,9 = 0,7 + 1,2BamHI-EcoRV de 1,7 = 1 + 0,7EcoRV-BamHI de 3,2 = 1,2 + 2

BamHI

BamHI

TaqI

TaqI

EcoRV

1 0,7 1,2 2

COUPURES par TaqI

TaqI

BamHI

1 kb

4,9 kb

0,7 kb

7 kb

10 kb EcoRV

TaqI

1,2 kb

2 kb

BamHI

1,9 kb

PLASMIDERECOMBINANT

de 11,9 Kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9 11 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 9 11

Figure 2a : Coloration au BET des fragments de restriction du plasmide recombinant Figure 2b : Autoradiogramme du « Southern-blot » du « Profil 1 » après séparation par électrophorèse sur gel d’agarose à 1%. gel précédent hybridé par une sonde « vecteur ». Dépôts sur Gel d’agarose Taille des fragments visualisés (en Kb) 1 : Marqueur de taille 2 : Plasmide non coupé 3 : BamHI 6,1 + 3,9 4 : HindIII 3,6 + 2,9 + 0,55 5 : EcoRI ≈ 10 6 : EcoRV ≈ 10 7 : BamHI + EcoRI 6,1 + 3,9 8 : BamHI + EcoRV 6,1 + 3,9 9 : HindIII + BamHI 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,55 10 : HindIII + EcoRI 3,6 + 2,95 + 2,2 + 0,65 + 0,55 11 : EcoRI + EcoRV 6,1 + 3,9

Kb

10 8 6 5 4

3 2,5

2

1,5

1 0,8

0,6

0,4

3 - BamHI : 6,1 + 3,9 taille du plasmide recombinant = 10 Kbtaille du vecteur = 3,9 Kb

4 - HindIII : 3,6 + 2,9 + 0,55 = 7,05 !!! il manque ≅ 2,90 Kbsuperposition de 2 fragments d’environ 2,9 Kbdonc 4 sites HindIIIFragment de 3,6 Kb totalement inclus dansl’insert, donc 2 sites HindIII dans l’insert.

H

H

B

B

5 - EcoRI : ≅ 10 Kb 1 seul site EcoRI6 - EcoRV : ≅ 10 Kb 1 seul site EcoRV

H

H

B

BRV

RI

7 - BamHI + EcoRI : 6,1 + 3,9 EcoRI très proche d’1 site BamHI8 - BamHI + EcoRV : 6,1 + 3,9 EcoRV très proche d’1 site BamHI

11 - EcoRI + EcoRV : 6,1 + 3,9 EcoRI très proche d’1 site BamHIet EcoRV très proche du 2eme site BamHI

9 - HindIII + BamHI : 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,553,6 + 1,8 + 0,7 = 6,1 Kb = Insert 2,15 + 1,15 + 0,55 = 3,9 Kb = Vecteur

2 sites HindIII dans le vecteur

H

H

B

BRV

RI

H

H

Fragment HindIII de 0,55 Kb non coupé par BamHI ni par EcoRI.Fragment HindIII de 3,6 Kb non coupé par BamHI ni par EcoRI

H

H

B

BRV

RI

H

H

0,55

3,6

≅ 2,9

≅ 2,9

4 - HindIII : 3,6 + 2,9 (+ 2,95) + 0,559 - HindIII + BamHI : 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,55

10 - HindIII + EcoRI : 3,6 + 2,95 + 2,2 + 0,65 + 0,55

Insert = 6,1 Kb= 1,8 + 3,6 + 0,7

Vecteur = 3,9 Kb = 2,15 + 0,55 + 1,15

0,72,15

HBRI2,2 0,65

H HH

1er fragment Coupure N° 9 :HindIII de 2,85 Coupure N° 10 :

4 - HindIII : 3,6 + 2,9 (+ 2,9) + 0,559 - HindIII + BamHI : 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,55

2,15 + 0,7 = 2,851,15 + 1,8 = 2,95

10 - HindIII + EcoRI : 3,6 + 2,95 + 2,2 + 0,65 + 0,552,2 + 0,65 = 2,852,95 non coupé par EcoRI

1,15 1,82eme fragment Coupure N° 9 :HindIII de 2,95 Coupure N° 10 : H

BH HH2,95

BamHI

BamHI

0,70 kb

EcoRV

HindIII

EcoRI

HindIII

HindIII

HindIII

6,1 kb3,9 kb

2,15 kb

0,55 kb

1,15 kb

1,8 kb

3,6 kb

Plasmide recombinantde 10Kb

(profil N°1)

VecteurInsert

Réaliser unedouble coupureHindIII + EcoRVpour positionnerEcoRV / BamHI

Profil 2 - HindIII : 6,5 + 2,9 + 0,55 = 9,95donc 3 sites HindIII au lieu de 4fragment de 0,55 Kb conservé doncle site HindIII en moins est situé dans l’insert

ANALYSE DU PROFIL N°2

Profil 1 - HindIII + BamHI : 0,7 + 3,6 + 1,8 + 1,15 + 0,55 + 2,15Profil 2 - HindIII + BamHI : 4,3 + 1,8 + 1,15 + 0,55 + 2,15

HindIII + EcoRI : 4,25 + 2,95 + 0,55 + 2,20

disparition du site HindIII le plus proche de EcoRI

BamHI

BamHIEcoRV

EcoRI

HindIII

HindIII

HindIII

6,1 kb3,9 kb0,55 kb

1,15 kb

1,8 kb

6,5 kb

Plasmide recombinantde 10Kb

(profil N°2)

VecteurInsert

Présence d’unpolymorphisme

de restriction surle fragment d’ADNgénomique humain