cationi ic v7 - cnr irsa laboratorio di idrochimica

Cationi IC v7 27/07/2018 pag.

C.N.R. Istituto per lo Studio degli Ecosistemi – Lab Idrochimica Largo Tonolli, 50 I-28922 Verbania Pallanza Tel. 0323 518300

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Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto per lo Studio degli Ecosistemi

Verbania Pallanza Laboratorio di idrochimica - metodi analitici ad uso interno

a cura di Gabriele TARTARI

SODIO, POTASSIO, MAGNESIO, CALCIO ED AMMONIO

metodo in cromatografia liquida a scambio ionico con eluente acido metansolfonico

PRINCIPIO DEL METODO Un'aliquota di campione, iniettata nel flusso di eluente acido metansolfonico (MSA), viene pompata nella colonna di separazione contenente la resina a scambio cationico: qui i cationi si separano in base alla loro affinità con i siti attivi della resina. I cationi attraversano quindi il sistema di soppressione a micromembrana dove vengono convertiti nelle loro corrispondenti basi forti, contemporaneamente l’eluente MSA subisce lo scambio del metansolfonato con il gruppo OH- con formazione di acqua a bassa conducibilità. Il rivelatore conduttometrico, posto dopo il soppressore, permette l'identificazione delle diverse specie cationiche sulla base dei tempi di ritenzione, mentre la loro quantificazione si ottiene dall'area dei picchi, in seguito a una adeguata calibrazione. INTERVALLO ANALITICO, LIMITI DI RIVELABILITA’ E QUANTIFICAZIONE Intervalli analitici e limiti di rivelabilità (LOD) e quantificazione (LOQ) nell’analisi dei cationi con loop di iniezione da 200 µL (tra parentesi loop da 500 µL), utilizzando vari criteri di calcolo: IUPAC che utilizza tre e dieci volte la deviazione standard della soluzione standard a

concentrazione minore rispettivamente per LOD e LOQ; intervallo di predizione calcolato al 95 % dalle regressioni eseguite con i valori medi dei segnali

e riportate nel paragrafo relativo alle modalità di calibrazione; Valori di R.S.D. pari al 33 % per LOD e 10 % per LOQ ottenuti dall’equazione (y = a x –b)

riportata con le ripetibilità analitiche nei grafici seguenti.

Intervallo LOD ottenuto secondo: LOQ ottenuto secondo:

Analita (mg L-1) IUPAC Regressione R.S.D. IUPAC Regressione R.S.D.

Na+ 0,02 ÷ 5 0,010

(0,004) 0,010 0,004 0,033

(0,012) 0,012 0,059

N-NH4+ 0,05 ÷ 3 0,010 0,080 - 0,030 0,017 0,010

K+ 0,02 ÷ 5 0,015

(0,010) 0,020 0,017 0,050

(0,040) 0,025 0,172

Mg++ 0,02 ÷ 5 0,010

(0,003)

0,020

(0,008) - 0,030

(0,012)

0,030

(0,010) 0,004

Ca++ 0,1 ÷ 25 0,035

(0,020)

0,110

(0,040) - 0,120

(0,070)

0,152

(0,055) 0,084



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Nella tabella vengono riportati tra parentesi i valori di LOD e LOQ ottenuti con i metodi IUPAC e della regressione con loop da 500 µL; LOD e LOQ diminuiscono significativamente per magnesio e calcio; per sodio e potassio invece la variabilità introdotta dai possibili inquinamenti negli standard e nella preparazione, genera valori di LOD e LOQ simili al loop da 200 µL. Campioni a concentrazioni più elevate possono essere analizzati utilizzando loop di iniezione di minor volume (10-50 µL) ed una adeguata calibrazione o dopo diluizione con acqua ultrapura. RIPETIBILITÀ ANALITICA I valori di ripetibilità qui riportati sono stati ottenuti nel laboratorio di idrochimica del CNR-ISE dall’anno 1990 con la diversa strumentazione e colonne di separazione Dionex, alternatasi negli anni nella determinazione dei cationi. Il valore di deviazione standard relativa (R.S.D.) è ottenuto dalle analisi sulle carte di controllo a diverse concentrazioni per un periodo di 3-4 mesi in giorni diversi nelle condizioni qui descritte, per un totale di almeno 30÷50 determinazioni.

y = 2,876x-0,439

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 1 2 3 4 5

R.S.D.

mg L-1

Sodio

y = 3,313x-0,24

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

R.S.D.

mg N L-1

Azoto ammoniacale



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Andamento dei valori di ripetibilità ottenuti nel laboratorio di idrochimica del CNR-ISE dall’anno 1990 dalle analisi delle carte di controllo; ogni valore rappresentato è ottenuto da una serie di almeno 30 determinazioni eseguite in giorni diversi sullo stesso campione.

y = 3,999x-0,52

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5

R.S.D.

mg L-1

Potassio

y = 2,219x-0,266

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 5 10 15 20 25 30

R.S.D.

mg L-1

Magnesio

y = 4,532x-0,32

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 10 20 30 40 50

R.S.D.

mg L-1

Calcio



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DESCRIZIONE DELL’APPARECCHIATURA

Sistema cromatografico ICS3000 con autocampionatori AS AP per linea cationica (loop 200µL) e AS per linea anionica

Sistema cromatografico Dionex DX500 con autocampionatore AS3500 (loop 500 µL)

Attualmente vengono utilizzate due linee cromatografiche cationiche Thermo Fisher Scientific Dionex serie ICS3000 (anionica e cationica) composta da due pompe isocratiche, due rivelatori conduttometrici CDM (anioni e cationi) e un rivelatore UV-Visibile VWD utilizzato solo sulla linea anionica, vano cromatografico termostato porta colonne ed autocampionatore AS AP per linea cationica e AS per linea anionica. La seconda linea cationica in uso dal 1998 della serie DX500 con colonne da 4 mm ed autocampionatore AS3500. Entrambe le linee cationiche utilizzano la generazione automatica dell’eluente con cartuccia EGC-MSA per la produzione dell’eluente acido metansolfonico. Il sistema ICS3000 ha interfaccia di comunicazione con moduli cromatografici per personal computer compatibile con software Thermo Fisher Scientific Chromeleon 7.2 in ambiente Microsoft Windows 10, mentre il sistema DX500 utilizza il software Thermo Fisher Scientific Chromeleon 6.8 in ambiente Microsoft Windows XP. Per i dettagli riguardanti installazione, manutenzione ed eliminazione di inconvenienti, consultare i manuali delle singole parti strumentali e i manuali d’uso e manutenzione delle colonne di separazione e soppressione Thermo Fisher Scientific. COLONNE, ELUENTI E SOPPRESSIONE Colonne per separazione isocratica Thermo Fisher Scientific IonPac IonPac CG12A - CS12A diametro interno 4 mm. Soppressore dell'eluente di tipo elettrochimico a micromembrana Thermo Fisher Scientific CERS 500 utilizzato in auto rigenerazione continua. La generazione automatica dell’eluente acido metansolfonico (MSA) avviene tramite la cartuccia EGC-MSA con trappola cationica auto-rigenerante (CR-CTC) partendo da acqua deionizzata ultrapura filtrata a 0,22µm, generando così eluente ad elevato grado di purezza alla concentrazione compresa tra 0,1 e 100 mM per flussi compresi tra 0,1 e 3,0 ml min-1; la concentrazione qui utilizzata è di 20 mM. Il flusso di eluente consigliato per ottenere un buon compromesso tra separazione, velocità di analisi e ripetibilità è di 1,0 mL al minuto. Per la linea analitica DX500 con autosoppressione elettrochimica a micromembrana viene utilizzato l’alimentatore SC20 Suppressor Controller posizionato sul Range 0,25 A con CC SET a 6570 mA i valori risultanti di queste impostazioni sono di circa 30 volts e 68 mA; il Controller SSC20 del soppressore può essere acceso solo contemporaneamente all’attivazione del flusso della pompa e deve



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essere spento immediatamente dopo aver fermato il flusso dell'eluente. Si consiglia di rispettare questa sequenza in quanto gli elettrodi all'interno del soppressore vengono raffreddati dallo stesso flusso di eluente. Nella la linea analitica ICS3000 i valori vengono impostati da pannello di controllo per il soppressore CERS 500 a 20 mA. In queste condizioni la conducibilità risultante dell'eluente soppresso è solitamente compresa tra 0,2 e 0,5 µS cm-1. Nella fase di condizionamento appena dopo l’accensione delle linee analitiche, si consiglia di attivare la registrazione della linea di base al fine di verificarne il buon funzionamento e il raggiungimento della stabilità della linea di base.

Pannello di controllo (Home) della linea analitica ICS3000. Su ciascun modulo (DP, EG, DC) il cursore verde indica la corretta attivazione di flusso, concentrazione, soppressione, termostatazione. Nel grafico l’andamento della conducibilità soppressa indica che è stata raggiunta la stabilità.

Evitare il pompaggio prolungato in colonna di sola acqua ultrapura al posto dell’eluente, in quanto la resina a scambio ionico delle colonne CG12A e CS12A potrebbe subire dei danneggiamenti irreversibili; evitare anche di far passare eluente nel soppressore con il Controller SRS spento perché si può causare perdita di efficienza con possibile diminuzione della sensibilità analitica. Per l’eventuale preparazione manuale dell’eluente MSA si consiglia la preparazione di una soluzione concentrata 2 M da diluire nella misura di 50 ml in 5000 ml per ottenere l’eluente di lavoro. L’eluente concentrato è conservabile fino a 2-3 mesi, mentre l’eluente alla concentrazione di lavoro è utilizzabile per due settimane. Modalità di preparazione della soluzione MSA concentrata (2 M): 96,1 g di acido metansolfonico Fluka al 99% per analisi in 500 ml di acqua deionizzata ultrapura filtrata su 0,22 µm corrisponde alla concentrazione di 2 M. Eluente acido metansolfonico 20 mM: diluire 50 ml di soluzione concentrata a 5 litri di acqua deionizzata ultrapura filtrata a 0,22 µm.



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Esempio di cromatogramma ottenuto nell’analisi in cromatografia ionica con colonne cationiche Dionex CG12A - CS12A – CERS500 Per ogni catione viene riportato il tempo di ritenzione alle seguenti concentrazioni: sodio 1 mg L-1, ammonio 1 mg N L-1, potassio 1 mg L-1, magnesio 1 mg L-1 e calcio 5 mg L-1.

CONDIZIONI DI INTEGRAZIONE Le condizioni di integrazione vengono ottimizzate con il programma Chromeleon 7.2 o 6.8, per informazioni e chiarimenti sull’uso di questo software si consiglia di consultare il manuale d’uso. Nelle condizioni di lavoro qui indicate si ottengono cromatogrammi come quello riportato nella figura di esempio, dove i cationi vengono rilevati in 14 minuti ai seguenti tempi di ritenzione espressi in minuti e decimi di minuto: sodio 4,3, ammonio 4,9, potassio 6,1, magnesio 9,6 e calcio 12. I tempi di ritenzione qui riportati possono variare leggermente in funzione del sistema analitico e del suo volume morto o dell’invecchiamento delle colonne di separazione. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI I campioni devono essere preparati negli appositi vial per autocampionatore precedentemente lavati con acqua deionizzata; per il riempimento utilizzare una siringa in polietilene da 5 mL alla quale viene applicato un filtro a membrana da 0,8 µm, avvinare almeno due volte la siringa, l'apparato di filtrazione e il vial con il campione da analizzare. Per quanto riguarda l’uso dei vial in vetro bisogna sottolineare che il vetro, anche di buona qualità, può rilasciare sodio e potassio in elevate concentrazioni (0,2-0,5 mg L-1); pertanto nell’analisi dei cationi si consiglia l’uso di vial in materiale plastico (polietilene o polipropilene). In ogni caso è sempre meglio eseguire delle prove di rilascio, con acqua ultrapura per 24-48 ore, sui vial utilizzati per queste determinazioni. Per migliorare la quantificazione di calcio e magnesio nei campioni con pH neutro o alcalino, può essere vantaggioso acidificare il campione con acido metansolfonico a pH di circa 3-4. Per questo si consiglia l’aggiunta di 20 µL dell’eluente MSA 2 M direttamente nel vial contenente 1600 µL di campione.

-2

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

minuti

Seg

na

le c

on

du

tto

met

ric

o (

µS

)

Sodio4,3 Ammonio

4,9

Calcio12,0IC colonne Dionex

CG12A-CS12A 4 mm

Potassio6,1

Magnesio9,6



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STANDARD DI LAVORO Come tutte le determinazioni cromatografiche, anche la cromatografia ionica richiede almeno una calibrazione giornaliera. E’ indispensabile quindi aver sempre pronta una serie di standard rappresentativi dell'intervallo di concentrazioni dei campioni analizzati; a questo scopo si preparano delle soluzioni multielemento per l'uso più corrente (standard da n. 0 a n. 8). Quando si analizzano campioni aventi rapporti di concentrazione diversi dagli standard multielemento già pronti o concentrazioni tra loro molto simili, è buona norma preparare tre standard specifici a concentrazione molto vicina a quella dei campioni. La notevole sensibilità della metodica analitica impone l'utilizzo di sali ad alto grado di purezza (grado analitico) opportunamente essiccati in stufa per almeno 3 ore a 105 °C e conservati in essiccatore. Per la preparazione degli standard di calcio e magnesio si consigliano soluzioni a singolo elemento pronte per l'uso alla concentrazione di 1 mg mL-1 in genere utilizzate per le determinazioni in assorbimento atomico o ICP. Note operative: in tutte le fasi della preparazione bisogna prestare la massima attenzione ai possibili inquinamenti tra le diverse soluzioni madre; le pesate si eseguono separatamente utilizzando una bilancia analitica da laboratorio (risoluzione 0,00001 g). E' consigliabile utilizzare sempre lo stesso gruppo di pipette a volume fisso di classe A per ogni soluzione standard o pipette automatiche manuali o elettroniche periodicamente calibrate per pesata; i matracci tarati devono essere di classe A risciacquati di volta in volta solo con acqua deionizzata ultrapura. Ogni volta che si preparano nuovi standard, questi vanno confrontati con i precedenti per verificare che nella preparazione non siano stati commessi errori; sono accettabili differenze massime fra nuovi e vecchi standard nell’ordine di grandezza del 2-3%. Tutte le operazioni di diluizione si eseguono con acqua deionizzata ultrapura filtrata a 0,22 µm. SOLUZIONI MADRE MULTIELEMENTO A causa della limitata solubilità e dell’elevata idratazione dei sali di calcio e magnesio si consiglia l’uso di soluzioni standard a singolo elemento pronte per l'uso alla concentrazione di 1 mg mL-1 (standard per assorbimento atomico o ICP in HNO3 circa 0,5 M); per sodio e potassio vengogono invece utilizzati sali ultrapuri.

Na & K in matraccio da 1000 ml - conservabile da tre a quattro mesi 2,5421 g NaCl = 1000 mg Na L-1 1,9067 g KCl = 1000 mg K L-1

M in matraccio da 500 ml - conservabile da tre a quattro mesi.

5 ml standard Na & K = 10 mg Na L-1 10 mg K L-1

5 ml standard Mg = 10 mg Mg L-1

25 ml standard Ca = 50 mg Ca L-1

SOLUZIONI MADRE SINGOLO ELEMENTO

N in matraccio da 1000 ml - conservabile sei mesi a pH circa 3

0,76378 g NH4Cl in 1000 ml = 200 mg N-NH4 L-1

Per stabilizzare la soluzione madre N, prima di portare a volume, acidificare con 300 µl di acido cloridrico 30% per analisi; il pH finale deve essere di circa 3.



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STANDARD CATIONI MULTIELEMENTO Gli standard multielemento per la calibrazione dei cationi, vengono preparati partendo dalle soluzioni madre precedentemente descritte per diluizione in matraccio da 200 mL per gli standard 0, 6, 7 e 8 ed in matraccio da 100 mL per gli standard da 1 a 5; lo schema delle diluizioni è il seguente.

Diluizioni delle soluzioni standard multielemento

Soluzione in 200 mL in 100 mL

Madre st. 0 st. 1 st. 2 st. 3 st. 4 st. 5

M 500 µL 500 µL 1000 µL 3000 µL 5 mL 10 mL

N 50 µL 50 µL 100 µL 200 µL 400 µL 500 µL

Soluzione standard singolo elemento in 200 mL

pronte per l’uso st. 6 st. 7 st. 8

Na & K soluzione da 1 mg mL-1 400 µL 600 µL 1000 µL

NH4 soluzione da 1 mg N mL-1 2000 µL 2500 µL 3000 µL

Mg soluzione da 1 mg mL-1 400 µL 600 µL 1000 µL

Ca soluzione da 1 mg mL-1 2000 µL 3000 µL 5000 µL

Questi standard sono utilizzabili per una settimana e si conservano a temperatura ambiente in recipienti da 100 ml in policarbonato con tappo a vite e bocca larga di facile accesso alla siringa di prelievo; ogni recipiente ed ogni siringa verranno utilizzati sempre e solo per quello standard. La seguente tabella riassume le concentrazioni in mg L-1 degli standard multielemento.

Concentrazione in mg L-1 delle soluzioni standard multielemento

Variabile st. 0 st. 1 st. 2 st. 3 st. 4 st. 5 st. 6 st. 7 st. 8

Na+ 0,025 0,05 0,10 0,30 0,50 1,00 2,00 3,00 5,00

N-NH4+ 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 1,00 2,00 2,50 3,00

K+ 0,025 0,05 0,10 0,30 0,50 1,00 2,00 3,00 5,00

Mg++ 0,025 0,05 0,10 0,30 0,50 1,00 2,00 3,00 5,00

Ca++ 0,125 0,25 0,50 1,50 2,50 5,00 10,00 15,00 25,00



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Le soluzioni di calibrazione a concentrazione più bassa (st. 03) possono essere utilizzate per due tre giorni dalla preparazione, mentre le altre possono essere utilizzate per dieci giorni dalla data di preparazione. Si consiglia di predisporre una tabella sulla quale annotare la data di preparazione di ciascun soluzione standard. Il pH di questi standard preparati da soluzioni concentrate per assorbimento atomico o ICP ha caratteristiche acide, ed indicativamente è compreso tra pH 4,5 per lo standard 0 e pH 2 per lo standard 8. Questi elevati valori di acidità rendono questi standard molto stabili eliminando i possibili fenomeni di adsorbimento di Ca++ e Mg++ alle pareti dei recipienti o alle tubazioni del sistema analitico, ma nel contempo posso sensibilizzare eventuali parti metalliche o le pareti interne dei tubi di prelievo, pertanto si consiglia una regolare manutenzione e sostituzione. In alcuni casi per calcio e magnesio si sono notate differenze nella risposta analitica a causa della matrice molto diversa tra campioni naturali (pH alcalino) e standard (pH debolmente acido), pertanto in alcuni casi potrebbe essere corretto acidificare i campioni con MSA a pH di circa 4 prima dell’analisi. ANALISI Le seguenti note analitiche sono indicative e relative alla strumentazione precedentemente descritta, che si presuppone approfonditamente conosciuta dall'utilizzatore; per ulteriori informazioni tecniche vedere quindi gli specifici manuali relativi alle colonne e alla strumentazione Thermo Fisher Scientific Dionex e al software Chromeleon 7.2 e 6.8. Prima di iniziare un ciclo analitico, colonne di separazione e soppressore vanno equilibrati con il flusso degli eluenti per almeno un’ora, fino ad ottenere una linea di base stabile al range conduttometrico di lavoro (verificare la stabilizzazione controllando la linea di base iniettando alcuni standard a bassa concentrazione). L'analisi dei campioni viene eseguita iniettando standard e campioni in un loop a volume fisso (solitamente di 100 o 200 µL per colonne diametro 4 mm). Volendo migliorare la sensibilità senza diminuire il fondo scala di rivelazione conduttometrica, si possono utilizzare loop con capacità fino a 500 µL. Un ciclo di analisi è solitamente composto dalla sequenza di 5÷7 standard di calibrazione, almeno due carte di controllo a concentrazioni diverse ed un bianco di acqua ultrapura, seguiti da 20÷30 campioni; al termine dei campioni viene riletta la sequenza iniziale di standard, carte di controllo e bianchi. Stabilità della risposta strumentale La variabilità della risposta strumentale sulle concentrazioni degli standard (segnali in area ottenuti in un lungo periodo di tempo) espressa come deviazione standard relativa (R.S.D) per ogni analita, viene riportata nel grafico seguente. Questa variabilità, rappresentativa della stabilità della risposta strumentale e della preparazione ed iniezione degli standard, è contenuta entro il 5-10 % per tutti gli analiti con concentrazioni superiori 0,1 mg L-1, mentre tra 0,02 ÷ 0,1 mg L-1 varia tra 5 ÷ 20 %. L’utilizzo del loop da 500 µL migliora la ripetibilità di calcio, magnesio e sodio rispetto al loop da 200 µL; il potassio evidenzia una maggiore variabilità probabilmente per l’inquinamento introdotto dalle manipolazioni preparative nel laboratorio dove viene utilizzato l’eluente KOH per la determinazione degli anioni.



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Deviazione standard relativa (R.S.D) sul segnale in area ottenuto con colonne CG12A-CS12A-CERS500 da iniezioni degli standard di calibrazione dei cationi preparati ed utilizzati in giorni diversi. Per il periodo 3/2018 ÷ 10/2018 nella figura a sinistra i dati della linea analitica DX500-AS3500 con loop di iniezione da 500 µL e nella figura a destra i dati della linea analitica ICS3000-AS AP con loop di iniezione da 200 µL.

I dati riportati nel grafico e nelle seguenti tabelle si riferiscono al periodo 3/2018 ÷ 10/2018 e sono ottenuti da circa 30 calibrazioni eseguite in giorni diversi con le linee analitiche ICS3000 e DX500 rispettivamente con loop di iniezione da 500 e 200 µL. Nelle tabelle per ciascun standard oltre ai valori medi di area e alle variazioni percentuali R.S.D. vengono riportati i fattori d risposta (R.F. rapporto tra area e concentrazione); quando si ha la costanza dei valori di R.F. significa che l’analita ha un comportamento lineare nella calibrazione.

0

5

10

15

20

0,0 0,1 1,0 10,0 100,0

R.S

.D.

are

e d

ei p

icc

hi

Concentrazione degli standard (mg L-1)

Na K Mg Ca NH4Loop 500 µL

0

5

10

15

20

0,0 0,1 1,0 10,0 100,0

R.S

.D.

are

e d

ei

pic

ch

i

Concentrazione degli standard (mg L-1)

Loop 200 µL

Loop di iniezione da 500µL

Sodio mg L-1 0.025 0.050 0.10 0.30 1.00

Area media 0.14 0.27 0.54 1.56 5.17R.S.D. aree 5.3 4.2 3.9 1.8 1.1

R.F. 5.56 5.43 5.40 5.20 5.17

Potassio mg L-1 0.025 0.050 0.10 0.30 1.00


R.F. 4.37 4.08 3.96 3.58 3.42

Magnesio mg L-1 0.025 0.050 0.10 0.30 1.00


R.F. 9.94 9.74 9.54 9.53 9.44

Calcio mg L-1 0.125 0.250 0.50 1.50 5.00


R.F. 6.07 6.21 6.14 6.02 6.02

Azoto ammoniacale mg N L-1 0.050 0.100 0.20 0.40 1.00


R.F. 7.02 6.17 5.34 4.33 3.23



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Modalità di calibrazione Le calibrazioni si eseguono per regressione lineare o quadratica dell'area del picco con la concentrazione di ogni analita;, l’intercetta con l’origine deve essere calcolata controllando che non sia molto diversa da zero. La scelta delle modalità di calibrazione dipende dall’intervallo di concentrazioni che si vuole analizzare con una singola calibrazione; normalmente vengono scelti intervalli che vanno da un minimo di un ordine di grandezza (0,1-1) fino a tre ordini di grandezza (0,1-100). In queste condizioni si può lavorare fino a un ordine di grandezza con calibrazioni lineari aventi intercetta molto prossima all’origine. Per intervalli analitici più ampi si consigliano calibrazioni quadratiche con 5 o 7 livelli di concentrazione (standard da st. 0 a 7) come riportato nelle calibrazioni in seguito. La verifica statistica degli andamenti lineari riportata in seguito è stata eseguita con i valori medi delle aree riportati nella precedente tabella per ciascun standard utilizzato. Come già detto la costanza dei valori di RF evidenzia l’andamento lineare delle regressioni se vengono rispettati i limiti del 5% del suo valore medio. Dai valori delle aree medie ottenute con le linee analitiche ICS3000 e DX500 colonne CG12A-CS12A-CERS500 nel periodo marzo 2018 ÷ ottobre 2018 sono stati calcolati i parametri delle calibrazioni lineari (segnale in area = intercetta + pendenza x mg L-1). La verifica è stata eseguita con il test F di Fischer al 95 % di probabilità, confrontando le regressioni lineari con quelle quadratiche; i risultati ottenuti sono riportati nelle tabelle seguenti, dove viene valutata statisticamente per ciascun intervallo analitico la correttezza della regressione lineare. Come si può vedere l’andamento lineare è confermato solo per gli intervalli di concentrazioni più bassi utilizzando cinque standard con loop da 200 o 500 µL. Per concentrazioni più elevate (Na, K, Mg >1 mg L-1) la calibrazione quadratica è sempre la più adatta, come pure per intervalli analitici più ampi con sette standard; il calcio ha invece un andamento prevalentemente lineare. Per l’ammonio la calibrazione deve essere di tipo quadratico ed è inoltre consigliabile nella calibrazione l’utilizzo del punto intercetta zero impostabile in Chromeleon nel file.qnt del metodo con l’opzione alla cartella Peak table, Cal. Type “Add zero point (0,0) for curve fitting (0)” per la calibrazione quadratica con il punto zero.

Loop di iniezione da 200µL

Sodio mg L-1 0.025 0.05 0.1 0.3 1.00 2 5

Area media 0.06 0.11 0.22 0.64 2.13 4.26 9.56R.S.D. aree 14.6 9.6 4.5 1.3 1.6 1.4 2.0

R.F. 2.37 2.26 2.18 2.13 2.13 2.13 1.91

Potassio mg L-1 0.025 0.050 0.10 0.30 1.00 2 5


R.F. 1.56 1.50 1.49 1.38 1.37 1.38 1.25

Magnesio mg L-1 0.025 0.050 0.10 0.30 1.00 2 5


R.F. 4.64 4.02 3.92 3.90 3.92 3.88 3.48

Calcio mg L-1 0.125 0.25 0.50 1.50 5.0 10 25


R.F. 3.21 2.67 2.51 2.43 2.44 2.43 2.18

Azoto ammoniacale mg N L-1 0.050 0.10 0.2 0.4 1.00 2 3


R.F. 3.20 2.84 2.58 2.18 1.68 1.29 1.07



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Fcalcolata = F Fischer calcolata; Ftabulata = F Fischer tabulata al 95 % di probabilità

SSR = Somma scarti quadrati residui per n. dati

Regressione Na K Mg Ca N-NH4

Area = a + b mg L-1 0,025 - 1 mg/L 0,025 - 1 mg/L 0,025 - 1 mg/L 0,125 - 5 mg/L 0,050 - 1 mg/L

n° di standard 5 5 5 5 5Intercetta (a) 0.016 0.043 0.017 0.032 0.369Pendenza (b) 5.152 3.385 9.422 6.015 2.949

r 0.999996 0.999941 0.999998 0.999998 0.992162

R2 0.999993 0.999882 0.999995 0.999996 0.984385

Fcalcolata da SSR 1 3 6 1 19

Ftabulata 19 19 19 19 19Linearità:se Fc<Ft

LINEARITA' LINEARITA' LINEARITA' LINEARITA'NON

LINEARITA'Regressione consigliata

Lineare Lineare Lineare Lineare Quadratica

IC DX500 CG112A-CS12A loop 500 µL



n° di standard 5 5 5 5 5Intercetta (a) 0.005 0.007 0.006 -0.127 0.155Pendenza (b) 2.127 1.366 3.909 1.809 1.565

r 0.999997 0.999985 0.999987 0.998431 0.993785

R2 0.999994 0.999970 0.999973 0.996864 0.987608



LINEARITA' LINEARITA' LINEARITA' LINEARITA'NON


Lineare Lineare Lineare Lineare Quadratica

IC ICS3000 CG112A-CS12A loop 200 µL




r 0.998907 0.999036 0.998814 0.992836 0.986356

R2 0.997816 0.998073 0.997629 0.985724 0.972899



NON LINEARITA'

NON LINEARITA'

NON LINEARITA'

LINEARITA'NON


Quadratica Quadratica Quadratica Lineare Quadratica


Regressione Na K K Ca N-NH4

Area = a + b mg L-1 0,025 - 5 mg L-1 0,025 - 5 mg/L 0,025 - 5 mg/L 0,125 - 25 mg/L 0,050 - 3 mg/L


r 0.998961 0.999084 0.998869 0.994149 0.983603

R2 0.997924 0.998168 0.997740 0.988332 0.967475



NON LINEARITA'

NON LINEARITA'

NON LINEARITA'

LINEARITA'NON


Quadratica Quadratica Quadratica Lineare Quadratica




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L’andamento non lineare riscontrato è compensato dalla elevata stabilità della risposta analitica riscontrata (R.S.D. compresa tra 3 e 15 %), di conseguenza si consiglia di eseguire calibrazioni con frequenza ampia eseguite su cinque standard; ad esempio una calibrazione ogni 25-30 campioni, e comunque all’inizio ed alla fine della sequenza di almeno 15-20 campioni, oppure una sola calibrazione per sequenze più corte. Nello schema seguente si riassumono gli standard e le condizioni di calibrazione consigliate (standard 0÷5 e 2÷7) su cinque punti.

Loop 200 e 500 µL st. 0 st. 1 st. 2 st. 3 st. 5

Variabile Regressione Concentrazione in mg L-1

Na+ Lineare 0,025 0,05 0,10 0,30 1,00

N-NH4+ Quadratica + (0,0) 0,05 0,10 0,20 0,40 1,00

K+ Lineare 0,025 0,05 0,10 0,30 1,00

Mg++ Lineare 0,025 0,05 0,10 0,30 1,00

Ca++ Lineare 0,125 0,25 0,50 1,50 5,00

Loop 200 µL st. 2 st. 3 st. 5 st. 6 st. 8

Variabile Regressione Concentrazione in mg L-1

Na+ Quadratica 0,10 0,30 1,00 2,00 5,00

N-NH4+ Quadratica + (0,0) 0,20 0,40 1,00 2,00 3,00

K+ Quadratica 0,10 0,30 1,00 2,00 5,00

Mg++ Quadratica 0,10 0,30 1,00 2,00 5,00

Ca++ Lineare 0,50 1,50 5,00 10,00 25,00 La regressione quadratica: Segnale in area = a + b Concentrazione + c Concentrazione 2 dove: a = intercetta, b = pendenza. viene utilizzata anche quando è richiesta la copertura di un intervallo analitico ampio (2-3 ordini di grandezza) utilizzando ad esempio gli standard nell’intervallo (0÷8). Si sottolinea inoltre che utilizzando regressioni quadratiche non si possono estrapolare i risultati analitici per quei campioni con segnale in area superiore a quello dello standard più elevato utilizzato nella calibrazione; l’errore di estrapolazione potrebbe essere molto elevato, in questi casi è meglio diluire i campioni per farli rientrare nell’intervallo di calibrazione. Naturalmente dopo ogni calibrazione e al termine della sequenza di campioni, non si deve dimenticare di analizzare almeno una carta di controllo verificando la confrontabilità dei risultati ottenuti con quelli del periodo precedentemente considerato. Per campioni molto simili (ad esempio acque provenienti dallo stesso lago o fiume) è meglio utilizzare una regressione lineare ristretta a solo tre standard con concentrazioni molto prossime ai valori attesi (intervallo molto inferiore ad un ordine di grandezza). A questo scopo si possono utilizzare tre standard scelti tra quelli della serie st. 0-7 o prepararne tre partendo dalle madri singolo elemento come descritto nell’appendice dedicata all’analisi dei campioni (laghi, fiumi o piogge) comunemente analizzate nel laboratorio di idrochimica del CNR di Verbania. Nella stessa sequenza analitica è importante confrontare le calibrazioni al fine di verificare che il segnale ottenuto per ogni standard non sia più del 3 % differente dalle altre calibrazioni (derive strumentali o iniezioni anomale); il software Thermo Fisher Scientific Dionex Chromeleon 7.2 o 6.8 permette di costruire un’unica calibrazione con tutti gli standard utilizzati nella sequenza adottando nel metodo l’impostazione total alla cartella General.



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Si consiglia inoltre di predispone un file su foglio elettronico per l’archiviazione ed il confronto con una lunga serie di segnali in area relativi agli standard comunemente analizzati, al fine di controllare la stabilità strumentale e la ripetibilità nella preparazione delle soluzioni calibranti. Per approfondimenti riguardo le impostazioni di calibrazione, visualizzazione parametri, ecc. vedere il manuale d’uso di Chromeleon 7.2 o 6.8 e l’introduzione alla cromatografia ionica con accenni all’utilizzo di Chromeleon. Vengono qui riportati alcuni esempi relative alle analisi condotte con le modalità descritte.

Esempio di sequenza con particolare del report di tutti gli analiti e dettaglio della calibrazione del sodio. La calibrazione viene riportata con le linee rosse degli intervalli di confidenza al 99.5%

Cromatogramma con dettaglio della calibrazione del sodio con elenco degli analiti e informazioni relative alle calibrazioni: numero di punti, R.S.D., limite di determinazione secondo Hubaux-Vos al 95% (HV LoD 95%), fattore di risposta (RF), coefficiente di correlazione percentuale, intercetta (a = offset), pendenza (b = slope), c = curve.



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Dettaglio della calibrazione quadratica dell’ammonio con elenco degli analiti e informazioni sulle calibrazioni: numero di punti, R.S.D., limite di determinazione secondo Hubaux-Vos al 95% (HV LoD 95%), fattore di risposta (RF), coefficiente di correlazione percentuale, intercetta (a = offset), pendenza (b = slope), c = curve.

Elaborazione dei risultati analitici Al termine dell’analisi di una sequenza analitica si deve procedere ai seguenti controlli ed elaborazioni dei risultati ottenuti:

1. riconoscimento, acquisizione ed integrazione appropriata dei picchi degli analiti provvedendo ad eventuali ritocchi sulle linee di base;

2. controllo delle calibrazioni verificando la qualità della regressione attraverso la visualizzazione degli intervalli fiduciali al 95% ed il valore dell’intercetta prossimo allo zero;

3. verifica dell’accordo tra concentrazioni nominali degli standard e valori ottenuti dalle calibrazioni (iniziale e finale con impostazioni globali di calibrazione in modalità total), il software Chromeleon quando visualizza il report di uno standard, riporta le concentrazioni calcolate dalla regressione, questi valori devono essere in buon accordo con i valori nominali;

4. nel caso di letture discordanti sugli standard è possibile eliminare alcuni punti di calibrazione (1 o al massimo 2) per ciascun analita: prima di procedere all’eliminazione dei punti si consiglia di confrontare i valori dei segnali in area trasferendoli nell’archivio Excel delle aree per ciascun standard;

5. controllo dei valori ottenuti dall’analisi dei campioni di carte di controllo ed archiviazione su foglio di lavoro Excel, al fine di confrontare i dati ottenuti nella sequenza con i dati conseguiti nei periodo precedentemente considerato nella carta di controllo;

6. verifica dei valori ottenuti dall’analisi dei bianchi ed archiviazione su foglio di lavoro Excel al fine di confrontare i dati acquisiti nella sequenza con i dati precedentemente ottenuti;

7. controllo e trascrizioni dei valori di concentrazione ottenuti sui campioni prestando attenzione che la calibrazione utilizzata comprenda i valori riscontrati nei campioni; per le calibrazioni quadratiche bisogna controllare che il segnale in area o altezza (µS) dell’analita nel campione non oltrepassi il segnale in area o altezza dell’analita nello standard a concentrazione più elevata.



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Stampare i risultati della sequenza con il Report Designer e nella trascrizione dei risultati analitici si consiglia di riportare i valori in concentrazione con il numero di cifre significative come descritto nel seguente schema:

Intervallo di concentrazioni

Variabile 0-5 mg L-1 5-50 mg L-1

Na+ X,XX X,X

N-NH4+ X,XX -

K+ X,XX X,X

Mg++ X,XX X,X

Ca++ X,XX X,X Riferimenti bibliografici. APAT. IRSA-CNR. 2003. Metodi analitici per le acque. 3030 Determinazione di cationi (Sodio,

ammonio, potassio, magnesio, calcio) mediante cromatografia ionica. Vol. 1. 1153 pp Camusso, M., & S. Polesello. 2000. Determinazione di cationi (sodio, ammonio, potassio, magnesio

e calcio) mediante cromatografia ionica. Notiziario dei metodi analitici per le acque IRSA-CNR, febbraio 2000: 8-13.

Tartari, G.A. & R. Mosello. 1997. Metodologie analitiche e controlli di qualità nel laboratorio chimico dell’Istituto Italiano di Idrobiologia del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Documenta Ist. ital. Idrobiol., 60: 160 pp.

cationi ic v7 - cnr irsa laboratorio di idrochimica

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