1010 感染症学雑誌 第60巻 第9号

呼吸器感染症における組織内細菌の迅速診断法に関する研究

― 耐熱抗原 に よる基礎的検 討―

長崎大学医学部第2内 科(指 導:原 耕平)

藤 田 紀 代

(昭和61年3月7日 受付)

(昭和61年4月2日 受理)

Key words: Rapid identification, Immunofluorescent antibody staining Heat-killed antigen, Nosocomial pneumonia

要 旨

院内感染症あるいは未期感染症としてみられる肺炎の起炎菌の迅速診断あるいは剖検肺組織内の迅速

診断を目的として,起 炎菌としての頻度の高い大腸菌,肺 炎桿菌および緑膿菌各々10株を用い,そ の培

養炉液から得た耐熱抗原で家兎を免疫することにより抗血清を作成した.

特異性を高めるため各々の抗原(菌 株)に より吸収操作を加え,蛍 光抗体間接法を用いた免疫染色法

により,ま ず作成された抗血清の感度と特異性を検討した.

臨床材料由来の120株(3菌 種それぞれ40株)の うち,大 腸菌が抗大腸菌血清とのみ反応するいわゆる

正診断率は50%(20株)で あったが,抗 肺炎桿菌血清に反応するもの3株(7.5%),抗 緑膿菌血清に反

応するものはみられず,い わゆる誤診断率は7.5%を 示した.ま た,す べての抗血清に反応するものおよ

びいずれの抗血清にも反応しないものがそれぞれ6株(15%),11株(42.5%)存 在し,い わゆる診断不

能率は42.5%で あった.抗 肺炎桿菌血清および抗緑膿菌血清では,そ れぞれ正診断率47.5%,67.5%,

誤診断率0%,0%お よび診断不能率52.5%,32.5%の 成績が得られ,3種 の抗血清中抗緑膿菌血清が

最もすぐれた診断用血清であった.今 回作成した抗血清は主として菌体多糖体分画に対する抗体であっ

たため,感 度および特異性の面で直ちに臨床に応用できる程すぐれたものではなかったが,培 養結果が

判明するまでの補助的早期診断用血清として一応の評価が得られると思われた。

緒 言

近 年,感 染 症 の 起 炎 菌 の迅 速 診 断 法92)と して,

血 中 抗 体 価 の測 定 ― 糖 脂 質 部 分 を 用 い た 赤 血 球 凝

集 反 応,寒 天 ゲ ル 内 沈 降 反 応3),OEPを 抗 原 と した

間 接 血 球 凝 集 反 応4),indirect immunofluorescent

antibody test(IFA)5), microaggulination assay

(MA)6), passive hemagglutination(間 接 血 球 凝

集 反 応)4)7), enzyme-linked immunosorbent

assay(EHSA)8)9), radio immuno assay(RIA)

やgas-liquidchromatography10)に よ る 菌 代 謝 産

物 の 分 析 に よ る診 断,あ るい は 患 者 の 喀 痰 や 血 清

中あるいは髄液中に出現す る抗原 を検 出す る方

法11)～16)が盛んに検討 されつつある.ま た,臨 床材

料中あるいは病巣内の細菌を免疫学的手法を用い

て特異的に染色 し,菌 種の同定を行お うとする試

み も近年研究が進展 しつつあるが,現 時点では後

述するように限 られた感染症においてのみ実用化

されている17)～20).

著者は,近 年の呼吸器感染症,と くに種々の基

礎疾患を有する入院患者にみられるopportunis-

tic infectionと してのnosocomial pneumoniaに

おいて,起 炎菌 として も最 も頻度の高いE.coli,

K.pneumoniae,P.aeruginosa21)に 限定 して,そ

れぞれの耐熱抗原を用い,早 期診断のための検体

別刷請求先:(〒852)長 崎県長崎市坂本町7-1

長崎大学医学部第2内 科 原 耕平

昭和61年9月20日 1011

中あるいは組織内の細菌を同定することを最終 目

的 として,診 断用血清を作成することを試みた.

本稿では,こ れをすでに細菌学的に同定された菌

株に反応 させての蛍光抗体法により,その診断率,

誤診断率,診 断不能率について検討 し,さ らに菌

種間相互の交叉反応性についても検討を加 えたの

で報告する.

実験材料および方法

1. 抗血清の作成

使用菌株 とその処理:本 学中央検査部細菌室に

おいて肺炎および慢性気道感染症患者から検出さ

れ,臨 床的に起炎菌の可能性が高いと考えられた

Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas aerugi-

nosa(P.aemginosa)お よびKlebsliella pneumoniae

(K.pneumoniae)の 臨 床 分 離 株 の そ れ ぞ れ10株

(呼 吸器 由 来株)を 使 用 した.こ れ らの 菌 株 をTryp-

ticase soy agar(BBL)に て37℃ で 一 夜 培 養 し,

生 理 的 食 塩 水(生 食)に て そ れ ぞ れ 菌 浮 遊 液(直

径8.5cmの 寒 天 平 板 接 種 菌 を15mlの 食 塩 水 に浮

遊)を 作 製 し,100℃,60分 加 熱 後,4℃ 環 境 下 に

お い て10,000rpm, 30分 間 遠 沈 し た.こ の 上 清 を

0.45μmの ミ リポ ア フ ィル タ ー(日 本 ミ リポ ア リ

ミテ ッ ド,東 京)で 濾 過 し,こ の 濾 液 を粗 抗 原 液

と した.

抗 血 清 の 作 成:上 記 の 粗 抗 原 液 を 滅 菌 生 食 で10

倍 に 希 釈 し,市 販 の 白 色 家 兎(体 重1.5～1.8kg)

の耳 静 脈 に2日 間 隔 で,0.3rnl/kg,3回 お よ び0.6

m1/kg,2回 静 注 し,さ らに4週 間 後 全 血 を採 取 し

た 後,血 清 を分 離 し,こ れ を抗E.coli 1～10株,抗

K.pnenmoniae 1～10株 お よび抗P.aeruginosa 1～

10株 の 家 兎 免 疫 血 清 とし た.

抗 血 清 の 抗 体 価 の 測 定:得 られ た 免 液 血 清 の抗

体 価 を砂 川 ら22)の方 法 に準 じて 間 接 赤 血 球 凝 集 反

応 で 測 定 した.す な わ ち,新 鮮 ヒ ト0型 血 球 を 燐 酸

緩 衝 液(PBS, pH7.2)を 用 い て,2,000rpm 3分

間 洗 浄 を4回 繰 り返 し,さ らに3,000rpm 10分 間

遠 沈 し,こ れ をPacked cellと し,こ れ に抗 原 を

感 作 す る た め 上 述 の 抗 原 液 を 加 え(packedcell

0.05ml+抗 原 液0.1ml+PBS 4.9ml),37℃ で60分

感 作 した 後,PBSを 用 い て2,000rpm 5分 間 洗 浄

を5回 繰 り返 し,さ らに3,000rpm 10分 間 遠 沈 し,

これを感作血球液 とした.

この感作血球液0.05m1に3m1のPBSを 加 え,

2.5%の 血球浮遊液 とし,こ の0.025mlを 検体(家

兎免疫血清)の2倍 希釈系列各々0.025mlと 混合

し,マイクロミキサーを用いて均一に撹拌 した後,

室温にて2時 間,続 いて4℃ 冷蔵庫 に16時 間放置

した後,血 球の凝集の有無を観察した.明 らかな

凝集 が認められる血清の最高稀釈倍数値を抗体価

とした.

2. 混合血清の作成

上記の血球凝集反応による抗体価はそれぞれの

粗抗原液と抗血清 との間でばらつきがみられたの

で,こ れ らを選択的に混合することにより10種の

抗原の うちより多 くの抗原 と反応するように,各

抗血清の混合を行 った.次 にこの混合血清の特異

性を高めるため,対 応菌以外の20種 の粗抗原で吸

収処理を行った.吸 収処理は抗原液各々0.1m1ず

つ,計20mlに 同量の混合血清を加え,37℃,30分

間恒温槽 で反応 させた後3,000rpm,5分 間遠沈

し,上 清を最終的な抗血清(混 合血清)と した.

3. 蛍光抗体法による至適抗体価の決定

当初用いたE.coli,K.pneumoniae, P.aer-

uginosaの 各々10株 に新たな呼吸器由来株20株 を

加えたそれぞれの菌種30株,計90株 の菌塗沫標本

を作成 し,上 述の抗血清を抗体 としてFig.1に 示

した斉藤 らの方法19)23)に準じ,蛍 光抗体法によっ

て各菌株の抗体価を測定した。抗血清は3,9,

21,お よび32倍希釈について検討し,最 も感度が

よく特異性が高いものを以降の実験に用いる診断

用血清 とした.

4. 診断用免疫血清を用いての臨床分離株 に対

する反応性の検討 ・感度(sensitivity)と 特異性

(specificity)の 検討.

上記各々30株 に,新二たに呼吸・器由来株E.coli 10

株,K.pneumoniae 10株 およびP.aeruginosa 10

株を加えた計120株 について,菌 塗株標本 を作成

し,Fig.1に 示 したような手順で蛍光抗体法によ

り観察 した.判 定はCDCの 規準24)に準 じて,(++)

以上(グ ラム染色で見 られるより2～4倍 大 きく,

辺縁部が強い蛍光を有 し,中 心部はぬけた ように

観察されるもの,お よび菌体全体が特異蛍光を発

1012 感染症学雑誌 第60巻 第9号

Fig. 1 Method for indirect immunofluorescent

antibody staining.

Bacterial suspension

↓106 CFU/ml

Smear on non-fluorescent slide grass

↓

Fixing

↓37℃, 95% ethanol for 30 min.

Drying

↓37℃, for 30 min. (if necessery, store at 4•Ž)

Washing

↓4℃, staining buffer, overflow 10 times, thenvibrate for 20 min.

Staining

↓ antisera against E. coli, K. pneumoniae and P.

aeruginosa. 37•Ž for 30min. in the moist chamber

Washing

↓4•Ž staining buffer, overflow 10 times, then

vibrate for 20 min.

post-staining

↓ FITC-labeled anti-rabbit immunoglobulin (sheep

or goat) 37•Ž for 30 min. in the moist chamber

Washing

↓4•Ž staining buffer, overflow 10 times, then

vibrate for 20 min.

Shealing

↓glycelin buffer, pH 9.0

Fluoromicroscopic examination

し辺縁部が鮮明であるもの)を 陽性 とした.

3種 の診断用血清組み合せによる感度 と特異性

の検討:上 述の菌株が検出された一部の喀出痰お

よび新たに上述3菌 種が純培養状に検出された喀

出痰(そ れぞれ40検 体)の 塗沫標本(そ れぞれの

40枚,計120枚)を 作成し,3枚 組でrandamに 番

号を付 し,各 々を3種 の診断用血清で蛍光抗体染

色を行い,感 度 と特異性の検討を行なった.

5. 市販の各型別用抗血清を用いての検討

抗緑膿菌血清 として市販 されている緑膿菌O群

別用(混 合I～III)を さらに混合 したもの(デ ンカ

生研)と,抗 クレブシエラ血清 としては莢膜型別

用(1～6各 型)の 混合血清(東 芝化学)を,抗

大腸菌血清 としてはO.K混 合血清(1～3)の 混

合(東 芝化学)を 各々用い,上 述の喀痰沫標本を

新たに作成 して,そ の感度 と特異性について,著

者が作成 したそれぞれの診断用血清 と比較検討し

た。

実験成績

1. 抗血清の抗体価

間接血球集症反応 による成績をTable 1に示 し

た.測 定方法は砂川 と同様の方法で行い,血 球凝

集をおこす最高希釈倍数が32倍 以上を示 したのを

陽性 と判 定 した.成 熟 家兎ではE.coli,Sta-

phylococcus aureus,Enterocoms等 に対す る抗体

が存在するとされているが,免 疫前家兎血清では

E.coli K.pneumoniae, P.aeruginosaに 対する

抗体価が16倍 以上 になった ものはみ られ なかっ

た.E.coli, K.pneumoniae, P.aeruginosaの30

種の家兎免液血清において,対 応抗原に対する抗

体価が有意に上昇 していた ものはE.coli 1O株 中

6株,K.pneumoniaeで10株 中9株 お よびP.

aeruginosaで10株 中5株 であり,E.1.6, 7, 10, K

9, P-1, 4, 6, 7, 8の ように,ま った く抗体価の

上昇を認めなかったもの,あ るいは対応抗原以外

の抗体価の上昇を示 したもの,さ らに複数の抗原

に対して抗体価の上昇を示 した ものが存在 した。

2. 混合血清の反応性

Table 1に示 した抗体価を勘案 し,E.coli血 清

10種 の うち1, 5, 8お よび9を それぞれ0.05ml,

0.04m1,お よび0.1mlの 割合で混合 した.同 様の

考 え方から抗K.pneumoniae血 清4, 5, 7, 8,

10,抗P.aeruginosa血 清3, 4, 5, 9, 10を選び

混合 し,こ の混合血清の特異性を高めるために,

既述の吸収操作を加えた.得 られた混合血清につ

いての血球凝集反応による成績をTable2に 示 し

た.抗E.coli血 清ではE.coliの6/10株 に,抗K.

pnenmoniae血 清でK.pneumoniaeの7/10株 に,

P.aeruginosa血 清はP.aeruginosaの6/10株 に,

それぞれ32倍 以上の抗体価を示 した.

3. 蛍光抗体法による至適抗体価の決定

Table 3に は,Psendomonasを 例にとって,3

倍希釈,9倍 希釈,21倍 希釈の蛍光抗体法による

陽性率を示 した.3倍 希釈の場合P.aeruginosa

30株 に対 しての陽性率は27株(90%)と 高率であっ

たが,K.pneumoniae26株(85%),E.coli 24株

(80%)と 他の抗原にも反応を示 し,感 度は高いが

昭和61年9月20日 1013

Table 1 Haemagglutination titer of immune serum (rabbit) to each 10 strains of Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae and Psendononss aeruginosa

blank shows the titer(1:•…16)

特異性が低 い結果 であった.9倍 希釈で は,P

aeruginosa 23株(76%),K.pneumoniae 1株

(3%)E.coli 3株(10%)と なり,21倍 希釈で

は,P.aeruginosa 9株(30%)K.pneumoniae

0株(0%),E.coli 2株(6%)と なった.す

なわち感度 と特異性が反比例する結果であった.

以上の成績から,P.aeruginosaの 場合は9倍 希

釈を至適抗体力価 と決定 した.K.pneumoniaeと

E.coliに 関 しては,そ れぞれ9倍,21倍,32倍 希

釈を試みたが,両 者 とも感度 と特異性を加味して

21倍 希釈を至適濃度 と判定 した.す なわちP.aer-

uginosa混合血清には,9倍 希釈液を,K.pneumoniae

では21倍,E.coliで は21倍 希釈した抗血清を,以

下の実験に供するそれぞれの診断用血清 とした.

この診断用血清を用いたE.coli, K.pneumoniae

およびP.aeruginosaの それぞれ30株 に対す る蛍

光抗体染色では,抗E.coli血 清ではE.coliの4/10

株,抗K.pneumoniae血 清では8/10株 に,抗P

aeruginosa血 清では9/10株 に陽性を示 した.偽 陽

性例は抗P.aeruginosa血 清では見 られなかった

が,抗E.coli血 清 と抗K.pneumoniae血 清ではそれ

ぞれ2/20株(10%)に 認め られた.

4. 診断用血清の臨床分離株 に対する感度(sen-

sitivity)と 特異性(specificity)の 検討

各診断用血清別にみた感度 と特異性:こ れまで

述べてきた方法で最終的に作成された診断用血清

による反応性を,そ れぞれ単一の血清で検討 した

成績をTable 4に示 した.感 度に関してみると,E

coli診 断用血清ではE.coli塗 沫標本40株 中26株

(65%)で 陽性であ り,K.pneumoniae診 断用血清

では,K.pneumoniae塗 沫標本40株 中23株(57%),

P.aeruginosa診 断用血清で はP.aeruginosa塗

沫標本40株 中32株(80%)が 陽性で,P.aeruginosa

における診断用血清が撮 も感度が高 く,K.pneumo-

1014 感染症学雑誌 第60巻 第9号

Table 2 Haemagglutination titer of mixed

antiserum to each strain of Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae and Pseudomomas aer-

uginosa

Table 3 Positive strains (rate) for each diluted anti-Pseudonomas aeruginosa serum by indirect immunofluorescent antibody staining.

niaeに つ い て の 感 度 が 最 も低 い値 を 示 した.

次 に 特 異 性 を 他 の2菌 種 との 交 叉 反 応(cross

reaction)の 有 無 で み た とこ ろ,E.coli診 断 用 血

清 の 場 合,K.pneumoniaeに40株 中3株(7%),

P.aeruginosaに40株 中3株(7%)の い わ ゆ る偽

陽 性(false-positive)が み られ た.同 様 にK.pneu-

Table 4 Positive strains (rate) for diagnostic

antiserum to each 40 strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aer- uginosa by indirect immunofluorescent antibody

staining.

moniae診 断用血清では,E.coliに40株 中7株(17

%),P.aeruginosaに4株(10%),Paer卿nosa

診断用血清ではE.coliで40株 中1株(2%),K.

pnenmoniaeで1株(2%)に み られた.す なわち,

それぞれの診断用血清においては,感 度 と特異

性の両面からP.aeruginosa診 断用血清の感度が最

も高 く,且 つ特異性 も最も高い(cross reactionの

頻度が最 も低い)成 績が得られた.E.coli診 断用

血清では感度(65%)でK.pneumoniae診 断用血

清(感 度57%)よ りも優れ,且つ特異性(K.pneumo-

niaeに 対す るcross reaction 7%)はK.pneumo-

niae診 断用血清の特異性(E.coliに 対するcross

reaction 17%)に 優 る成績であった.

3種 の診断用血清組み合わせによる感度 と特異

性の検討:こ の3種 の診断用血清を同時に用いて

検体中の3種 の菌を染色 した場合の診断率を,感

度 と特異性の面から検討 した成績をTable 5に示

した.塗 抹標本中のE.coliがE.coli診 断血清に

のみ反応す るものは,40株 中20株(正 診 断率:

50%)で,K.pneumoniae診 断用血清にのみ反応

す るもの3株(誤 診断率:7.5%)が 存在 し,P

aeruginosa診 断用血清にのみ反応す るものは皆

無(誤 診断率:0%)で あった.さ らにEc協 診

断用血清に陽性を示す ものの他の2種 いずれかに

も陽性を示す もの(合 計6株,15%)お よびいず

れの診断用血清にも反応 しないもの(11株,27.5

%)は,い わゆる診断不能 と判定されるものであ

るが,こ れらが17株(42.5%)に み られ る結果 と

なった.同 様 にK.pneumoniae診 断用血清では,

昭和61年9月20日 1015

Table 5 Positive strains (rate) of clinical isolates (each 40 strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa) in the sputum for

diagnositic antiserum by indirect immunofluorescent antibody staining.

Table 6 Positive strains (rate) of clinical isolates (each 40 strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa) in the sputum for

commercial antiserum (use for serogroup determination) by indirect immunofluorescent antibody staining

正診断率47.5%,誤 診断率0%,診 断不能率52.5

%と,E.coli診 断用血清よ り診断率はやや落ちる

ものの誤診断率が極めて少ない とい う成績であっ

た.つ ぎにP.aeruginosa診 断用血清では,正 診断

率67.5%,誤 診断率0%,診 断不能率32.5%と3

種の血清中最 も優れた成績が得 られた.

以上をまとめると,著 者が作成 した診断用血清

では,E.coli, K.pneumoniaeの 腸内細菌群間の

交叉反応性はかな りの頻度にみ られたが,こ れ ら

とP.aeruginosaと の交叉反応性は極めて低 い成

績が得 られた.

5. 市販の型別抗血清を用いた成績

市販の型別用血清は菌種の同定後にこれを各血

清型 に細分す ることを 日的 として作成 されてお

り,本 研究の 目的 とする菌種の同定用 としては本

来作成 されていないものであるが,そ の多価血清

を用いて著者が作成した診断用血清 と同様の検討

を行 ってみた.そ の成績をTable 6に示したが,各

3種 の多価血清すべてが著者が作成 した診断用血

清に比較 し,診 断率が低 く,誤 診断率および診断

不能率とも高い結果で,こ れらの抗血清は本稿で

目的 としているような診断用血清 としては使用で

きない結果であった.

考 察

細菌感染症の病因診断は患者か ら得 られる検査

材料(検 体)か ら菌を分離,同 定 し,患 者の臨床

像 と照らし合わせて,検 出菌が病因菌であるかど

うかを判定す ることが一般的であるが,あ る種の

1016 感染症学雑誌 第60巻 第9号

細菌,例 えば赤痢菌,チ フス菌,ジ フテ リア菌,

結核菌などでは,こ れらの菌が病的材料から検出

されれば直ちに診断が確定す るものも存在する.

今 日の細菌感染症の多 くは,Kochの 原則が成

立 し難いよ うなものがみられ,原 因菌は私達の生

活環境や健康人の体内に高い頻度で分布 している

ものもあ り,こ れ らによる感染症は特異的病像を

呈しない場合が多い.す なわち,患 者の病巣由来

物から菌を分離しても,そ れが血液,胸 水,髄 液

など通常無菌とされている部位からのものでなけ

れば,検 出菌に病原的意義をもたせるのに困難を

感 じる場合が少なくない.特 に呼吸器感染症では

この傾向が強 く,喀 出痰の検査結果か ら検出され

た細菌の病原的意義を判定することは至難のこと

である.

呼吸器感染症の起炎菌を決定す る方法 として従

来から,喀 出痰を用いる方法 として,喀 痰性状別

比較培養法25),洗浄培養法26)27),定量培養法38)～30),

さらに経気管吸引法(transtracheal aspiration,

TTA)31)～33),気 管支内採痰法3姦)～36),あるいは経皮

的肺吸引法37)などが試み られ,そ れな りの評価が

得 られてきた。近年では臨床側からの感染症早期

診断の要望が強 くな り,免 疫血清学的研究の進歩

に相俟って,こ れ らを応用 した抗体測定法,あ る

いは抗原の証明による迅速な診断法が急速に進歩

しつつある1)2).

従来 ウイルスや マイコプラズマに専 ら用 い ら

れ,細 菌感染症ではチフスや溶連菌感染症に限 ら

れていた抗体の測定 も,緑 膿菌感染(OEP抗 体)4)

やレジオネラ感染(間 接蛍光抗体法)23)をはじめ と

し多 くの細菌について検討されるようになってき

た.一 方,細 菌抗原の検出は,菌 そのものを病巣

由来物内で特異的に染色する方法17)～20)と血液,髄

液,胸 水,尿 などに存在する可溶性抗原を検出し

ようとする試みとに分けられる11)～16).いずれも特

異抗血清を用いて これにFITCあ るいは種 々の

酵素をラベルして菌体や菌体抗原に作用させ,そ

の結果 として菌種の決定を同時に行お うとするも

ので,そ の精度は如何に優れた特異抗血清を作製

す るかにかかっている.

喀出痰中の細菌がはた して病巣由来かどうかを

判定す るために,病 巣中では細菌が宿主の免疫 グ

ロブリンに被覆されている(antibody coatedbacte-

ria, ACB)と の考 え方か ら喀痰中の細菌を抗 ヒ

ト免疫グロブリン(FITC標 識)で 染色 し,染 色 さ

れた細菌に病原的意義を もたせようとの試みがあ

る.こ れもやはり免疫血清学的手法であ り,Tho-

masら の報告38)以来,呼 吸器感染症に関 しては当

教室で研究が開始 されたが,本 法は常在菌が混入

する検体においてその中に存在する細菌の病原的

意義を検討することを主たる目的 としているため,

病原菌の早期確認は優れているものの,観 察 され

た菌種の同定までには至 らない欠点を有する鋤.

病巣中であれ,病 巣由来物であれ,そ の中に存

在する細菌を分離培養する以前に特異抗体を用い

て これを染色 し,菌 種の同定 まで行 う方法は,我

国は勿論欧米でも未だ一般的でないが,米 国CDC

(Centers for Disease Control)に おいてはある種

の細菌のFITC標 識特異抗血清が用意 されてい

る11).す なわちgroup A Streptococcus, E.coli,

Bordetella pertusis, H.influenzae, Legionella

pneumophillaな どであるが,E.coliは 主 として

小児の集団下痢症の早期診断に応用 されているも

ので,呼 吸器感染症領域では,こ の血清に反応す

るE.coliは 極めて低率であることから利用で き

ない.ま たH.influenzae type a～fは,呼 吸器

感染症の起炎菌 としてtype bが かな りの頻度に

存在するが,non typableの ものが圧倒的に多い

ことから呼吸器感染症への応用は今一つ実用的で

はない.上 記のBordetella pertusisを 含めBacter-

oides fragilisに対する抗血清は,米 国をはじめ,

我が国でもすでに市販 されるに至った.一方 ,近 年opportunistic infectionあ るいは

nosocomial infectionと しての肺炎の起炎菌 とし

ての頻度が高いE.coli, K.pneumoniae P.aer-

uginosaに 対 しては,す でにE.coliの 一部の血清

群に対 しての特異血清が作成 されているが,こ れ

はすでに述べた ように,主 として小児の集団下痢

症に対す る特殊の血清型によるもので呼吸器感染

症には応用できない.日 常臨床でみられる呼吸器

感染症をはじめ とす るこれ らの細菌感染症の病因

診断のための抗血清は,本 菌群間の抗原性に交叉

昭和61年9月20日 1017

性が強いことか らも,こ れまで検討された報告は

み られない.

著者は,院 内肺炎を中心に,呼 吸器感染症患者

から分離された上記3菌 種を用いて家兎による抗

血清を作成 し,さ らに市販のFITC標 識抗家兎 ヤ

ギまたは羊 γ-globulinを用いることによって,肺

組織内あるいは検体中の細菌の観察 と同定を最終

的 とする抗血清の作成を試みた.す でに述べたよ

うに,本 法においては特異性が高 く,且 つ感度の

良好な抗血清を作成す ることが最 も重要な事であ

るが,上 記3菌 種が含まれる検体では,検 体中の

Ecoあ の存在を正 しく診断で きる頻度(正 診断

率)は,50%,誤 診断率7.5%,診 断不能率42.5%,

K.pneumoniaeで は,そ れぞれ47.5%,0%お よ

び52.5%,P.aeruginosaで は,そ れぞれ67.5%,

0%,32.5%,と い う成績が得 られ,本 血清を用

いての早期診断は診断不能率が高いとはいえ誤診

率が低 く,培 養成績などが判明す るまでの早期化

学療法剤選択などの一助 として一応試み られ得 る

成績ではないかと思われた.

診断用血清の作成にあた り,多 くの報告を参考

にしたが,個 々の方法や手段に関しては,そ れぞ

れ研究者の独 自の方法が採用されてお り,著 者 も

初期の 目的に応 じて独 自の方法を採用した部分も

多かった.一 般的には,抗 原の抽出には,加 熱法,

磨砕,凍 結融解法,超 音波破砕等の物理的処理を

行 うことによ り得 られ るいわゆ るcrudeな 菌体

抗原を,酸 アルカリ,高 尿素,酵 素,有 機溶媒を

用いた方法によって糖製 し,リ ボ多糖体,Boivin

抗原,ア ルカ リ多糖体,degraded多 糖体などの抗

原作成がなされている40).

また細菌の型別血清は耐熱性抗原あるいは易熱

性抗原に対 しては,ホ ルマ リン死菌を抗原 として一般に作成 されている41).し かし,耐熱抗原におい

ても120℃90分 加熱菌体,100℃30分 加熱菌体で反

応の差があることが知 られてお り42)43),耐熱性抗

原の分類用型血清 も未だ充分確立しているとはい

えない.著 者が 目的 とする診断用血清は種特異性

を最 終 目的 と してい るため,当 初 は な るべ く

roughな 抗原で実験を開始 した.P.aeruginosaに

ついて行われている方法 に準 じて100℃60分 加熱

菌体を抗原 とすることとしたが,そ の内容は多糖

体分画であ り,こ れは赤血球に吸着 される感作抗

原 となるとされているものであった43).Indirect

hemaglutination(IHA)に よる免疫家兎血清の抗

体価の測定は,砂 川 らの方法22)に準じた.感 作血球

と検体(被 検血清)の 反応は,PBS(pH7.2)で

行 った場合,イ オン交換水 を使用す ると凝集の

end pointが 不明瞭 となったが,蒸 留水ではclear

なend pointが 得 られ,イ オン交換水に含まれ る

無機塩類が凝集に影響を及ぼす ことも考えられ,

Mgイ オン添加による反応性にも検討を加 えたが

明らかな関係は認め得なかった.次 に反応の温度,

判定時間に関しては,砂 川ら22)は37℃2時 間反応

後,16～24時 間室温 に放置する方法が最 もclear

にend pointが 得 られるとしたが,同 様の方法で

試みた ところ反応が進みすぎる傾向があ り,著 者

は常温3時 間放置後,4℃ にて16～24時 間にて判

定 した.こ れにより安定したend-pointを 得るこ

とができた.一 般に哺乳類の血清中には,特 定の

抗原刺激なしでみ られる,い わゆる正常抗体が存

在 し,こ れは多 くの毒素,各 種の細菌,あ るいは

それと共通原を有する他の細菌類による不顕性感

染により生 じるものと考 えられてお り,特 に家兎

にはE.coliに 対する高い抗対価の存在が認めら

れるとされているが,著 者の行 った血球凝集反応

による抗体価測定では,す べての8倍 以下で有意

な上昇は認めなかった.

蛍光抗体法の手技は,斉 藤 らの方法(間 接蛍光

抗体法)23)を採用した.家 兎の血中抗体価の測定は

IHAで 行い,そ れをもとに診断用血清を作成 し,

最終的には蛍光抗体法により菌の特異染色を行い

検討したわけであるが,今 回著者の用いた加熱抽

出抗原は,リ ポ多糖体を主 とし,こ れはすでに述

べた よ うに血球の感作抗原 となるものであるた

め,IHAと 蛍光抗体法 における抗原抗体反応 とは

ほぼ同様の反応を呈 したものと考えられた.

診断用血清の至適抗体価の決定は上述のように

感度 と特異性を勘案して決定 したが,こ れは必ず

しも特異的反応 と非特異的反応 との境界を示すも

のではな く,陽 性例の中にも真の意味での特異反

応 とは言い難 い部分が存在す るのは否定で きな

1018 感染症学雑誌 第60巻 第9号

い.今 後,特 異的,非 特異的反応の反応様式ある

いは結合部位の差などが明らかにされるであろ う

が,現 在のところは,数 量的に充分検討した上で

至適抗体価を決定する方法が最良と考 え,こ の方

法をとった.

共通抗原の問題は,血 清学的に反応をみる場合

どうしても避けられないものである.し かし,何

を抗原 とす るかで共通抗原の範 囲は大 き く異な

り,た とえば リポ多糖体はグラム陰性桿菌におい

てかな り広 く共通抗原 となると推定 され,OEPの

ような蛋白部分には比較的共通抗原が少ない と考

えられている42)43).共通抗原についてはいくつか

の報告がなされているが,Psendomonasと 他のグ

ラム陰性桿菌 との共通抗原の有無 については,

Burns and MayはPseudomonasとKlebsiella,

Haemophilus influenzaeと の間 にも共通 抗原 が

あ ることを示 し44)45),Crowder & White 46)も

Pm4omonas感 染症の患者血清の中に,E.coli,

Klebsiella, Enterobacterお よびSerratiaの 沈 降

素をみいだし,一 方,他 のグラム陰性桿菌感染患

者の血清にPseudomonasの 沈降素 をみいだ して

い る.ま た,Hobbsら47)はPseudomonas属 と

Achromobacter, Vonroお よびAeromonas属 と

の間に共通抗原があることを指摘 している.一方,

抗原からみた検討では,Yqung & Armstrong

ら48)によ り超 音 波 破 砕 に よ りつ く られ た

Pseudomonas抗 原お よびEnterobacteriacae抗 原

に対する反応 とPseudomanasの リポ多糖体抗原

を使用 した反応 とは異な ることが報告 されてい

る.

今のところ,耐 熱性抗原による検討が多いが,

将来はpureな 蛋 白を抗原 とす ることによ り,共

通抗原の問題はかな り解決され るのではないか と

考えられる.今 後,血 清学的な手段を用いて細菌

の診断を可能 とするためには共通抗原の少ない抗

原成分の選択 と精製,そ れらによって得 られた抗

体の精製等がなされねばならないが,こ れを解決

す るもの として,近 年monoclonal抗 体の作成が

進んでいる.Monoclonal抗 体は抗体価 は極めて

高 く特異性も高い訳であるが,細 菌の属あるいは

種のレベルでの診断に用いる場合は,同 属あるい

は同種の多数の菌 との反応性には乏 しく,本 稿で

目的 とした抗血 清 と して の利 用 に は多 くの

monoclonal抗 体の作成 と整理が必要 となって く

る49).今 後この方面の研究が大きく進歩す ると思

われる.す でに述べたように,著 者が採用 した方

法 は比較 的crude抗 原 を作 成 して の抗体 で は

あったが,.E.coli 57%, K.pneumoniae 47.5%,

およびP.aeruginosa 67.5%の 診断率が得 られ,

一応の評価が得 られるものと思われる.現 在 さら

に感度 と特異性をさらに向上させるため菌体外膜

蛋 白抽出による抗体作成 と精製を検 討 している

が,こ れらの血清を用いての菌の同定は極めて短

時間でできるので感染症早期診断 と治療の一助 と

して利用 され得るものと考えている.

本研究の要旨は第55回日本感染症学会総会(1981)に お

いて報告した.終 始,御 指導御校閲を賜りました長崎大学

医学部第二内科学教室原 耕平教授に深感謝致します.ま

た,斉 藤 厚助教授をはじめ同教室感染症班の方々の多大

の御協力に改めて感謝致します.さ らに,有 益な御助言を

頂きました本学中央検査部山口恵三講師,菅 原和行技師な

らびに熱帯医学研究所病原細菌学部門,江 原雅彦医師に謝

意、を表します.

文 献

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昭和61年9月20日 1021

Rapid Identification of the Bacteria in Sputum and Lung Tissue in Nosocomial Pneumonia-Fundamental Study of Indirect Immunofluorescent

Staining by Antibody to Heat-Killed Antigens-

Kiyo FUJITA 2nd Department of Internal Medicine, Nagasaki University School of Medicine

The purpose of this study is to make rapid diagnosis of pathogens in sputum and autopsied lung in

pneumonia cases as nosocomial infection or terminal infection. Rabbits were immunized with heat stable antigens purified from culture filtrates of each 10 strains of E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa, which are most frequently isolated from sputum in nosocomial pneumonia. These antisera were ab-sorbed with various other bacterial antigens in order to elevate specificity. The specificity and sen-sitivity were evaluated by the method of indirect fluorescent assay.

Among 120 clinical isolates (each 40 strains in 3 species), 40 strains of E. coli were examined by this method. Twenty isolates were positive to E. coli antisera. Consequently, the correct diagnosis rate was confirmed to be 50%. Three out of 40 strains were positive to Klebsiella antisira and no isolate showed

positive to Pseudomonas antisira, those results showed that miss diagnosis rate was 7.5%. As six strains were positive to all three kinds of antisera and 11 strains were negative to these three

kinds of antisera, those resuts showed that undiagnosis rate was 42.5%. The correct diagnosis rates were 47.5% and 67.5%, miss diagnosis rates were 0% and 0%, and the undiagnosis rates were 52.5% and 32.5% to anti-Klebsiella antisera and anti-Pseudomonas antisera, respectively.

Among three antisera, anti-Pseudomonas antisera was the best for diagnosis with regard to

specificity. The specificity and sensitivity of these antisera are not satisfactory for clinical diagnosis, but these are valuable in supportive reagents for rapid indentification until bacterial data is confirmed.