cd - cinÉtica enzimÁtica
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Enzimas
• Catálise é fundamental para a vida
• Enzimas catalisadores biológicos
• Reduzem a energia de ativação das reações
• Alta especificidade
• Importância clínica e industrial
Cinética enzimática
- Quantidade de produto formado
- Quantidade de substrato transformado (por unidade de tempo)
- Métodos de detecção geralmente espectroscópicos
Pode ser medida por:
• Estudo da velocidade das reações
Cinética enzimática
•Fatores que afetam a velocidade das reações:
- Concentração da enzima
- Estrutura da enzima
- Concentração de substrato
- Moduladores (inibidores, ativadores)
Cinética enzimática
• Importância dos estudos cinéticos:
- Informações sobre o mecanismo enzimático
- Prever a atividade da enzima em diferentes [S]
- Mecanismos de regulação e inibição
- Comparar eficiências de catálise
Efeito do pH e temperatura
Aminoácidos sítio ativo
Enzima desnaturada
Enzima nativa
Sítio ativo
Temperatura
Vel
ocid
ade
da
rea ç
ã oV
eloc
idad
e d
a re
a çã o
Vel
ocid
ade
da
rea ç
ã oPepsina Amilase Fosfatase
alqualina
• Enzima simples – 1 sítio, 1 substrato
Efeito da concentração de substrato
k1
k-1
k2E + S ES E + P
k-2
• Como estudar o efeito da [S] se S é consumido na
reação?• Determinação da velocidade inicial (Vo)
Tempos curtos de reação e [S] >> [E]
[S] constante
Efeito da Concentração de Substrato
k1
k-1
k2E + S ES E + P
V0 = k2 [ES], passo limitante
[S]
Vo Vmax
Em Vo k-2 é insignificante e pode ser negligênciada
Conceito do Estado Estacionário
k1
k-1
k2E + S ES E + P
•No estado estacionário [ES] constante
•Determinação de Vo = cinética do estado
estacionário
Km + [S]
Vmax[S]Vo =
Cinética Michaelis-Menten
Relação [S] vs velocidade de reação
Km + [S]
Vmax[S]Vo =
Note que quando, Vo = Vmax/2, Km = [S]
Cinética Michaelis-Menten
Km + [S]
Vmax[S]Vo =
O gráfico duplo-recíproco
Km1 =Vo Vmax
1 [S]
+ 1 Vmax
Inclinação Quando x = 0
1/Vo = 1/Vmax
Quando y = 0
1/[S] = -1/Km
O significado de Km e Vmax
k1
k-1
k2E + S ES E + P
K-1 + K2Km = Se K2 << K-1 , Km = K-1/K1
K1
Se k2 limitante, Vmax = k2[Et]
Em algumas situações K2 é importante !!!
• Para algumas enzimas outros passos podem ser limitantes
k1
k-1
k2E + S ES EP E + P
k3
k-2
Se k3 limitante, Vmax = k3[Et]
O significado de Km e Vmax
Constante catalítica (Kcat)
Kcat = constante do passo limitante, se K2 limitante Kcat = K2
Constante catalítica Kcat
•Número de renovação
Número de S transformado em P por 1 molécula de
enzima
Enzima Substrato Kcat (s-1)
Proteína RecA (ATPase)
Anidrase carbônica
Fumarase
Catalase H2O2
HCO3-
Fumarato
ATP
40.000.000
400.000
800
0,4
Constante catalítica Kcat• CConstante específica: Relação Kcat / Km
Enzima
Anidrase carbônica
Acetilcolinesterase
-Lactamase
Substrato Kcat (s-1)
HCO3-
CO2
Aceticolina
FumaratoMalato
1,4 x 104
1 x 106
4 x 105
8 x 108
9 x 102
2,0 x 103
Km (M)
Kcat/Km (M-1s-1)
Benzilpenicilina
9 x 10-5 1,6 x 108
8,3 x 107
1,5 x 107
1,2 x 10-2
2,6 x 10-2
5 x 10-6
2,5 x 10-5
1,6 x 108
3,6 x 107
2 x 10-5 1 x 108
Fumarase
Cinética de enzimas com mais de um substrato
ATP + Glucose ADP + glucose-6Phexoquinase
Hexoquinase (cérebro)
Hexoquinase IV (fígado)
Enzima Substrato Km (mM)
ATPD-Glucose
D-Glucose
0,40,05
10
Concentração de glucose no plasma 4-5mM
a) Reação enzimática envolvendo um complexo ternário
Ordem ao acaso:
Ordenado:
b) Reação enzimática na qual não se forma o complexo ternário
Cinética de enzimas com mais de um substrato
Aumentando
A intersecção das linhas indica que um complexo ternário está sendo formado.
Gráfico duplo recíproco para complexo ternário
• Diferentes [S2] em resposta a variações na [S1]
Aumentando
As linhas paralelas indicam
um mecanismo pingue-pongue
Gráfico duplo recíproco para mecanismo ping-pong
•Diferentes [S2] em resposta a variações na [S1]
Inibição enzimática
• Inibidores : reduzem velocidade de reação
- Grande importância prática
- Grupos de inibidores :
- Irreversíveis- Reversíveis (competitivo, incompetitivo, misto)
Inibição competitiva
Km + [S]
Vmax[S]Vo = = 1 + [I]
Ki
Vmax, Et = ES, se [S] >> [I], toda enzima ES, Vmax não
altera
Km aparente
Gráfico duplo-recíproco para inibição competitiva
Inclinação
Sem inibidor
Intoxicação por Metanol
MetanolÁlcool
desidrogenase
Causa lesãotecidual
cegueria
Etanol
URINA formaldeído/
acetaldeído
Uso prático da inibição competitiva
Inibição incompetitiva
Vmax, Et = ES, mesmo se [S] >> [I], Vmax altera pois parte
da enzima está na forma improdutiva ESI
Km + ’[S]
Vmax[S]Vo =
’ = 1 + [I]
Ki’
Note que quando Km >> [S], o inibidor é pouco efetivo
Gráfico duplo-recíproco para inibição incompetitiva
Inibição mista
Km + ’[S]
Vmax[S]Vo =
Este tipo de inibidor é eficaz em qualquer [S]
Sem inibidor
Gráfico duplo-recíproco para inibição mista
Enzimas regulatórias
• Enzimas chave do metabolismo são controladas
- Enzimas regulatórias, cinética distinta
• Principais mecanismos:
- Alostérica (homotrópica ou heterotrópica)
- Covalente
- Localização celular
- Proteólise
Enzimas alostéricas homotrópicas
• Homotrópicas
- O substrato é o modulador
- A ligação de um substrato altera a conformação de outro sítio
ativo
•
Cinética de enzimas alostéricas homotrópicas
Vo
( [P
] / t
emp
o )
[S]
Vmax
Ligação de substrato aumenta a afinidade dos outros sítiosBaixa
afinidade
K0,5
Enzimas alostéricas heterotrópicas
• Heterotrópicas:
- Outro composto age como modulador
Modulador positivo
Substrato
Enzima menos ativa
Enzima mais ativa
Complexo
enzima-substrato ativo
Modulador positivo
Substrato
Enzima menos ativa
Enzima mais ativa
Complexo
enzima-substrato ativo
Cinética de enzimas alostéricas heterotrópicas
K0,5 alterado Vmax alterada
Pontos importantes da aula !!!
• Enzimas simples apresentam uma cinética padrão
• Alguns fatores podem alterar a velocidade de reações
• Cinética como ferramenta no estudo de enzimas
• Enzimas regulatórias apresentam cinética complexa