cDNA-AFLP ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN RED RASPBERRY (Rubus idaeus L.) DURING WATER STRESS

 ANALIZA EXPRESIEI GENICE LA ZMEUR (Rubus idaeus L.) ÎN CONDIŢII DE STRES HIDRIC PRIN TEHNICA cDNA-AFLP

CIOBOTARI Gh.1, EFROSE Rodica Catalina1, BRINZA Maria1, SFICHI-DUKE Liliana1

1University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine of Iasi, Romania

INTRODUCTION

According  to  the  World  Atlas  of  Desertification,  UNEP  (United  Nations  Environment Programme), dry lands cover 40% of the world’s land surface (almost 5.1 billion ha), and they are  the  habitat  and  source  of  livelihood  for  about  1  billion  people.  With  the  growth  of population and the development of modern agro-industry and the other industries, extension of  the  dry  land  surfaces  becomes  a  growing  concern  all  over  the  world.  This  concern  is reflected  in  the  Convention  on  Biological  Diversity’s  dry  lands  work  program,  and  in  the establishment  of  the  UN  Convention  to  Combat  Desertification.  To  mitigate  the  effects  of drought,  it  is very  important first  to promote  the effective and efficient use of existing plant resources, second to investigate the physiological processes and mechanisms that help plants to acclimatize to the water deficiency conditions. It is assumed that molecules and compounds such as proline,  glycine betaine and  soluble  sugars etc.  synthesized and accumulated during desiccation play an important role in the protection of the plants from stress . However, at this time  the  molecular  basis  for  these  protective  mechanisms  is  almost  unknown.  In  this experiment,  the  screening  of  the  differentially  expressed  genes  in  water  deficiency  growth conditions was  accomplished  by means  of  the  high  reproductive  technique  (cDNA-AFLP).  By this method we identified in stressed plants multiple polymorphic transcript-derived fragments (TDFs) that highlight specific plant reactions on molecular level.

INTRODUCTION

According  to  the  World  Atlas  of  Desertification,  UNEP  (United  Nations  Environment Programme), dry lands cover 40% of the world’s land surface (almost 5.1 billion ha), and they are  the  habitat  and  source  of  livelihood  for  about  1  billion  people.  With  the  growth  of population and the development of modern agro-industry and the other industries, extension of  the  dry  land  surfaces  becomes  a  growing  concern  all  over  the  world.  This  concern  is reflected  in  the  Convention  on  Biological  Diversity’s  dry  lands  work  program,  and  in  the establishment  of  the  UN  Convention  to  Combat  Desertification.  To  mitigate  the  effects  of drought,  it  is very  important first  to promote  the effective and efficient use of existing plant resources, second to investigate the physiological processes and mechanisms that help plants to acclimatize to the water deficiency conditions. It is assumed that molecules and compounds such as proline,  glycine betaine and  soluble  sugars etc.  synthesized and accumulated during desiccation play an important role in the protection of the plants from stress . However, at this time  the  molecular  basis  for  these  protective  mechanisms  is  almost  unknown.  In  this experiment,  the  screening  of  the  differentially  expressed  genes  in  water  deficiency  growth conditions was  accomplished  by means  of  the  high  reproductive  technique  (cDNA-AFLP).  By this method we identified in stressed plants multiple polymorphic transcript-derived fragments (TDFs) that highlight specific plant reactions on molecular level.

MATERIAL AND METHODSMATERIAL AND METHODS

Plant materialRaspberry (Rubus idaeus L.) plants were grown in the greenhouse of the “V. Adavachi” Research Station (University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine of Iasi). Stressed plants were grown on the soil with 35% water hydration, and control plants were normal hydrated. Raspberry leaves were collected from mature greenhouse-grown plants and were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at −80 oC.

Plant materialRaspberry (Rubus idaeus L.) plants were grown in the greenhouse of the “V. Adavachi” Research Station (University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine of Iasi). Stressed plants were grown on the soil with 35% water hydration, and control plants were normal hydrated. Raspberry leaves were collected from mature greenhouse-grown plants and were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at −80 oC.

RNA extractionTotal RNA was isolated from raspberry very fine grinded leaves, in liquid nitrogen, with the SpectrumPlantTotal RNA Kit according to the manufacturer’s protocol. RNA quality was checked using Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano Kit that allow visualization of 18S and 28S subunits and calculation of RNA Integrity Number (RIN)

RNA extractionTotal RNA was isolated from raspberry very fine grinded leaves, in liquid nitrogen, with the SpectrumPlantTotal RNA Kit according to the manufacturer’s protocol. RNA quality was checked using Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano Kit that allow visualization of 18S and 28S subunits and calculation of RNA Integrity Number (RIN)

First-strand cDNA synthesisThe first-strand cDNA synthesis was accomplished with SuperScript II Reverse Transcriptase (RT) Kit that is an engineered version of MMLV RT with reduced RNase H activity and increased thermal stability. 

First-strand cDNA synthesisThe first-strand cDNA synthesis was accomplished with SuperScript II Reverse Transcriptase (RT) Kit that is an engineered version of MMLV RT with reduced RNase H activity and increased thermal stability. 

Second-strand cDNA synthesisThe second-strand cDNA synthesis was performed with the SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit that contains all of the reagents, except an oligo(dT) containing primer, necessary to make double-stranded cDNA from total RNA or poly A+ selected RNA (mRNA).

Second-strand cDNA synthesisThe second-strand cDNA synthesis was performed with the SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit that contains all of the reagents, except an oligo(dT) containing primer, necessary to make double-stranded cDNA from total RNA or poly A+ selected RNA (mRNA).

The next steps of cDNA-AFLP analysis were made with AFLP Analysis System I, AFLP Starter Primer Kit according to the manufacturer’s protocols.Restriction Endonuclease Digestion To prepare an AFLP template, cDNA is digested with two restriction endonucleases simultaneously. This step generates the required substrate for ligation and subsequent amplification. The restriction fragments for amplification are generated by two restriction endonucleases: EcoR I and Mse I. EcoR I has a 6-bp recognition site, and Mse I has a 4-bp recognition site. When used together, these enzymes generate small DNA fragments that will amplify well and are in the optimal size range (<1 kb) for separation on denaturing polyacrylamide gels. Due to primer design and amplification strategy, these EcoR I – Mse I fragments are preferentially amplified (rather than EcoR I – EcoR I or Mse I – Mse I fragments).

The next steps of cDNA-AFLP analysis were made with AFLP Analysis System I, AFLP Starter Primer Kit according to the manufacturer’s protocols.Restriction Endonuclease Digestion To prepare an AFLP template, cDNA is digested with two restriction endonucleases simultaneously. This step generates the required substrate for ligation and subsequent amplification. The restriction fragments for amplification are generated by two restriction endonucleases: EcoR I and Mse I. EcoR I has a 6-bp recognition site, and Mse I has a 4-bp recognition site. When used together, these enzymes generate small DNA fragments that will amplify well and are in the optimal size range (<1 kb) for separation on denaturing polyacrylamide gels. Due to primer design and amplification strategy, these EcoR I – Mse I fragments are preferentially amplified (rather than EcoR I – EcoR I or Mse I – Mse I fragments).

Ligation of AdaptersAfter heat inactivation of the restriction endonucleases, the cDNA fragments are ligated to EcoR I and Mse I adapters to generate template DNA for amplification. These common adapter sequences flanking variable cDNA sequences serve as primer binding sites on these restriction fragments. Using this strategy, it is possible to amplify many DNA fragments without having prior sequence knowledge.

Ligation of AdaptersAfter heat inactivation of the restriction endonucleases, the cDNA fragments are ligated to EcoR I and Mse I adapters to generate template DNA for amplification. These common adapter sequences flanking variable cDNA sequences serve as primer binding sites on these restriction fragments. Using this strategy, it is possible to amplify many DNA fragments without having prior sequence knowledge.

Amplification Reactions PCR was performed in two consecutive steps. In the first step, called preamplification, cDNAs are amplified with AFLP primers each having one selective nucleotide. The PCR products of the preamplification reaction was diluted and used as a template for the selective amplification using two AFLP primers (the EcoR I selective primer and Mse I selective primer), each containing three selective nucleotides. This two-step amplification strategy generated enough templates DNA for thousands of AFLP reactions. The selective primers in the AFLP Analysis System I contain three selective nucleotides. In practice, using the AFLP Analysis System I with plants having genomes ranging in size from 5 × 108 to 6 × 109 bp, the number of fragments amplified per sample per primer pair averages 50, but may range from as low as 10 to ~ 100 depending on the sequence context of the selective nucleotides, and the complexity of the genome.

Amplification Reactions PCR was performed in two consecutive steps. In the first step, called preamplification, cDNAs are amplified with AFLP primers each having one selective nucleotide. The PCR products of the preamplification reaction was diluted and used as a template for the selective amplification using two AFLP primers (the EcoR I selective primer and Mse I selective primer), each containing three selective nucleotides. This two-step amplification strategy generated enough templates DNA for thousands of AFLP reactions. The selective primers in the AFLP Analysis System I contain three selective nucleotides. In practice, using the AFLP Analysis System I with plants having genomes ranging in size from 5 × 108 to 6 × 109 bp, the number of fragments amplified per sample per primer pair averages 50, but may range from as low as 10 to ~ 100 depending on the sequence context of the selective nucleotides, and the complexity of the genome.

PCR preamplification reactions program performed 20 cycles at: 94oC for 30 s56oC for 60 s72oC for 60 s

PCR preamplification reactions program performed 20 cycles at: 94oC for 30 s56oC for 60 s72oC for 60 s

PCR selective amplification reactions program performed 33 cycles at:A. One cycle at 94°C for 30 s; 65°C for 30 s; and 72°C for 60 s;B. Lowered the annealing temperature each cycle 1°C during 9 cycles. This gives a touchdown phase of 10 cycles;C. The last 23 cycles at:94°C for 30 s;56°C for 30 s;72°C for 60 s.

PCR selective amplification reactions program performed 33 cycles at:A. One cycle at 94°C for 30 s; 65°C for 30 s; and 72°C for 60 s;B. Lowered the annealing temperature each cycle 1°C during 9 cycles. This gives a touchdown phase of 10 cycles;C. The last 23 cycles at:94°C for 30 s;56°C for 30 s;72°C for 60 s.

Separation of Amplified Fragments on Denaturing Polyacrylamide GelsProducts from the selective amplification was separated on a 4% agarose gel. The resultant banding pattern was manually analyzed for polymorphic transcript-derived fragments (TDFs).

Separation of Amplified Fragments on Denaturing Polyacrylamide GelsProducts from the selective amplification was separated on a 4% agarose gel. The resultant banding pattern was manually analyzed for polymorphic transcript-derived fragments (TDFs).

06.10.2011/Amplificare Selectiva probele 109 si 11535% hidratare (109-stres, 115 -martor) – Opal - sol/turba

0 Ladder

1 109E-ACC / M-CAG

2 115

3 109E-ACC / M-CAC

4 115

5 109E-ACC / M-CAT

6 115

7 109E-ACC / M-CTT

8 115

9 109E-ACC / M-CTG

10 115

11 109E-ACT / M-CAA

12 115

13 109E-ACT / M-CAC

14 115

0 Ladder

15 109E-ACT / M-CTA

16 115

17 109E-ACT / M-CAT

18 115

19 109E-ACT / M-CTC

20 115

21 109E-ACT / M-CTG

22 115

23 109E-ACT / M-CAG

24 115

25 109E-AAG / M-CAG

26 115

27 109E-AAG / M-CAA

28 115

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

0 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

RESULTSRESULTS

0 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

0 43 44 45 46 47 48 49 50

06.10.2011/Amplificare Selectiva probele 109 si 11535% hidratare (109-stres, 115 -martor) – Opal - sol/turba

0 Ladder

29 109E-AAG / M-CAC

30 115

31 109E-AAG / M-CAT

32 115

33 109E-AAG / M-CTC

34 115

35 109E-AAG / M-CTT

36 115

37 109E-AGG / M-CAT

38 115

39 109E-AGG / M-CAA

40 115

41 109E-AGG / M-CTA

42 115

0 Ladder

43 109E-AGG / M-CTC

44 115

45 109E-AGG / M-CTT

46 115

47 109E-ACA / M-CTA

48 115

49 109E-ACA / M-CAT

50 115

07.10.2011/Amplificare Selectiva probele 136 si 13735% hidratare (136-stres, 137-martor) – Cayuga - sol/turba

0 Ladder

1 136E-ACC / M-CAG

2 137

3 136E-ACC / M-CAC

4 137

5 136E-ACC / M-CAT

6 137

7 136E-ACC / M-CTT

8 137

9 136E-ACC / M-CTG

10 137

11 136E-ACT / M-CAA

12 137

13 136E-ACT / M-CAC

14 137

0 Ladder

15 136E-ACT / M-CTA

16 137

17 136E-ACT / M-CAT

18 137

19 136E-ACT / M-CTC

20 137

21 136E-ACT / M-CTG

22 137

23 136E-ACT / M-CAG

24 137

25 136E-AAG / M-CAG

26 137

27 136E-AAG / M-CAA

28 137

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

0 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

07.10.2011/Amplificare Selectiva probele 136 si 13735% hidratare (136-martor, 137-stres) – Cayuga - sol/turba

0 Ladder

29 136E-AAG / M-CAC

30 137

31 136E-AAG / M-CAT

32 137

33 136E-AAG / M-CTC

34 137

35 136E-AAG / M-CTT

36 137

37 136E-AGG / M-CAT

38 137

39 136E-AGG / M-CAA

40 137

41 136E-AGG / M-CTA

42 137

0 Ladder

43 136E-AGG / M-CTC

44 137

45 136E-AGG / M-CTT

46 137

47 136E-ACA / M-CTA

48 137

49 136E-ACA / M-CAT

50 137

0 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

0 43 44 45 46 47 48 49 50

CONCLUSIONSCONCLUSIONS

Screening 64 primer combinations identified multiple transcript-derived fragments (TDFs) that are differentially expressed in water stress conditions. The differences between control and stressed plants were qualitative when TDFs were either present or absent or quantitative when TDFs showed different levels of expression. The results show that cDNA-AFLP is a valuable technique for studying expression patterns of genes involved in sensitivity/tolerance mechanisms to water stress in red raspberry

Screening 64 primer combinations identified multiple transcript-derived fragments (TDFs) that are differentially expressed in water stress conditions. The differences between control and stressed plants were qualitative when TDFs were either present or absent or quantitative when TDFs showed different levels of expression. The results show that cDNA-AFLP is a valuable technique for studying expression patterns of genes involved in sensitivity/tolerance mechanisms to water stress in red raspberry

THANK THANK YOUYOU

THANK THANK YOUYOU

AcknowledgmentsThis study has been financed by the National Authority for Scientific Research, Operational Program POSCCE, ID 524, contract no. 151/2010, project title “The significance of the relationship among genomic response, phenylpropanoid 

metabolism and photosynthesis for the optimization of biosynthetic potential of raspberry and blackberry cultivars in abiotic stress conditions”

AcknowledgmentsThis study has been financed by the National Authority for Scientific Research, Operational Program POSCCE, ID 524, contract no. 151/2010, project title “The significance of the relationship among genomic response, phenylpropanoid 

metabolism and photosynthesis for the optimization of biosynthetic potential of raspberry and blackberry cultivars in abiotic stress conditions”

thompson-morgan.com