Genetika: cvi čení č. 1-2DNA, RNA, replikace, transkripce, translace a genetický kód, mutace

KBI/GENEMgr. Zbyn ěk Houdek

Témata cvi čení1. DNA, RNA, replikace, transkripce, translace, geneti cký kód,

centrální dogma mol. bio.2. Mutace – souvislost s gen. kódem (m. nem ěníci smysl , m ěnící

smysl, tichá, nesmyslná m. , substituce, inzerce …) .3. Mitóza, chromozómy, karyotyp, genomové mutace …4. Meióza5. Mendelovy zákony – monohybridismus, generace PF 1 F2, úplná

a neúplná dominance, št ěpné pom ěry, dihybridismus, polyhybridismus, rozv ětvovací metoda.

6. Genové interakce (reciproká interakce, dominantní e pistáze, recesivní epistáze, inhibice, komplementarita, komp enzace), letální geny.

7. Dědičnost a pohlaví.8. Genová vazba.9. Dědičnost kvantitativních znak ů (polygeny, prost ředí),

heritabilita (míra uplatn ění genotypu na znaku).10. HW zákon – frekvence genotyp ů a fenotyp ů.11. Dědičnost krevních skupin, HLA systém, mnohotný alelismu s.12. Rodokmeny, výpo čty prognóz, typy d ědičnosti u člověka.

Doporu čená lit.:

• Alberts, B. a kol.: Základy bun ěčné biologie (1998)• Kočárek, E.: Genetika (2008)• Kubišta, V.: Bun ěčné základy životních d ějů (1998)• Otová, B. a kol.: Léka řská biologie a genetika (I. díl – 2008)• Pritchard, D., J. & Korf, B., J.: Základy léka řské genetiky

(2007)• Reischig, J.: Genetická praktika (1989)• Reischig, J.: Obecná genetika. Praktická cvi čení (2003)• Rosypal, S.: Úvod do molekulární biologie (2003)• Rosypal, S. a kol.: Nový p řehled biologie (2003)

Genetická informace

• Genetická informace je obsažena ve sledu (pořadí) nukleotidů (nukleotidových sekvencí určitých funkčních typů NK).

DNA-deoxyribonukleová kys.

• skládá ze 4 typů deoxyribonukleotidů (adenin – A, guanin – G, thymin – T, cytosin – C).

• DNA je tvořena 2 vlákny, která jsou spojena ve dvoušroubovici, tak že proti A je navázáno (vodíkové můstky) T a proti G – C.

• Na povrchu dvoušroubovice DNA se vytvářejí 2 nestejné žlábky (velký a malý), kam se váží bílkoviny. V páteři DNA jsou deoxyribózy, na kterou jsou navázány 2 fosfátové zbytky (1. na 3´C a 2. na 5´C). 1 řetězec DNA má tedy 2 konce, kde 1. začíná 3´C hydroxylem a 2. končí 5´C fosfátem.

• 5´GAATTC 3´3´CTTAAG 5´

A - T

C - G

Prostorová struktura DNA

RNA-ribonukleová kys.

• RNA-ribonukleová kys., která obsahuje A, G, C a U (uracilje chemicky podobný T v DNA).

• RNA se v b. vyskytuje jako malý polynukleotidovýřetězec.

Přenos genetické informace

• Tento proces je zformulován v centrálním dogmatu molekulární biologie, což je postulát, který říká, že přenos je jedin ě možný z NK do NK nebo z NK do proteinu (Crick 1957/58).

Replikace DNA

• Replikace (obecně) – tvorba kopií molekul NK zajišťující přenos GI z DNA do DNA a z RNA do RNA.

• K existujícímu řetězci DNA se na základě komplementarity bází přikládají odpovídající nukleotidy a postupně se spojují v nový řetězec, který je komplementární k původnímu.

• Vznikají tedy podle staré dvoušroubovice dvě zcela identické dvoušroubovice, z nichž žádná není celá nová, ale obsahuje 1 nový a 1 starý řetězec (semikonzervativní ).

• Tuto reakci katalyzuje enzymový komplex DNA-polymeráza.• Replikační komplex – replikon – postupuje po řetězci DNA,

dvoušroubovice se rozvíjí a vzniká tzv. replika ční vidli čka. • V každé replikační vidličce se tedy kopírují vedoucí řetězec,

který se kopíruje plynule a druhý zpožďující se řetězec, který se kopíruje jako původní nesouvislý soubor fragmentů (Okazakihofragmenty).

• V replikačních počátcích se typicky vyskytují sekvence s vysokým obsahem A a T.

Obr. replikace DNA• Dalším proteinem potřebným při replikaci pro rozvití

dvoušroubovice a vytvoření jednořetězcové úseku DNA (za štěpení ATP)

je helikáza.

• Během replikace dochází ve šroubovici ke pnutí, které je uvolňováno topoizomerázou, která pracuje před replikačnívidličkou, tak že přeruší jeden z řetězců dvoušroubovice a tím se o jeden závit rozvine a následně se tento přerušený řetězec spojí.

• RNA-primáza katalyzuje syntézu RNA-primeru, od jehož 3´konce se syntetizuje Okazakiho fragment.

Transkripce• Přepisování GI z DNA do RNA jako primárního transkriptu.• Dochází při ní k syntéze RNA, která je komplementární k DNA

(gen). • Geny rozdělujeme na strukturní (jejich přepisem vzniká mRNA )

a geny pro RNA proteosyntetického aparátu. • Tento přepis je katalyzován enzymovým komplexem RNA-

polymerázou.• RNA polymeráza se váže na DNA v místě promotoru.• Dvoušroubovice DNA se rozvine a vznikne transkrip ční bublina.• Přepisem vzniká mRNA, která je jednovláknová.• Především na konci molekuly se vytvoří 2 úseky navzájem

komplementární, které vytvoří úzkou smyčku, kterou tvoří několikU a tím ukončí transkripci – terminátor.

• Molekuly tRNA (<100 bází), rRNA (100-1000) mají definovanou i terciární strukturu (také dvoušroubovicové úseky).

• Negativní DNA řetězec (-DNA = kódující vlákno) slouží jako matrice pro syntézu RNA.

• Pozitivní DNA řetězec (+DNA= templát) – je 2. ř. DNA o stejné sekvenci nukleotidů jako RNA, která je syntetizována na negativním ř. DNA.

Translace

• Syntéza molekuly bílkoviny využívající informace obsažené v molekule mRNA.

• Probíhá na ribozomech (20 x 30 nm), které jsou tvořeny malou a velkou podjednotkou, které se spojují po navázání mRNA ve funkční ribozom.

• „Překladatel“ z jazyka nukleotidů do jazyka aminokys. je tvořen 2 složkami, 1. je soubor molekul tRNA, které nesou antikodónkomplementární s příslušným kodónem mRNA a na 2. konci váže příslušnou aminokys. • 2. složkou je soubor enzymů aminoacyl-tRNA syntetáza ,

který dovede rozpoznat určitou aminokys. a k ní příslušnou tRNA a spojit je makroergní vazbou. Nukleotidová sekvence obsahuje informaci o primární struktuře proteinu a nazývá se kódující nukleotidová sekvence.

Translace

Genetický kód

- terminační kodón

- iniciační kodón

GlyGGGGluGAGAlaGCGValGUG

GlyGGAGluGAAAlaGCAValGUA

GlyGGCAspGACAlaGCCValGUC

GlyGGUAspGAUAlaGCUValGUU

ArgAGGLysAAGThrACGMetAUG

ArgAGALysAAAThrACAIleAUA

SerAGCAsnAACThrACCIleAUC

SerAGUAsnAAUThrACUIleAUU

ArgCGGGlnCAGProCCGLeuCUG

ArgCGAGlnCAAProCCALeuCUA

ArgCGCHisCACProCCCLeuCUC

ArgCGUHisCAUProCCULeuCUU

TrpUGGSTOPUAGSerUCGLeuUUG

STOPUGASTOPUAASerUCALeuUUA

CysUGCTyrUACSerUCCPheUUC

CysUGUTyrUAUSerUCUPheUUU

významkódvýznamkódvýznamkódvýznamkód

UGA - někdy slouží pro zařazení selenocysteinu (Sec)

Chemické vlastnosti aminokyselin v proteinech

tvorba Se-Se můstkůSelenocystein - Sec

tvorba S-S můstkůCystein - Cys

Methionin - MetGlycin - Gly

Tryptofan - TryProlin - Pro

Izoleucin - IleLeucin - Leu

Valin - Val

Fenylalanin - PheAlanin - Ala

aminokyselinyHydrofóbní nepolární

Hydrofilní polární aminokys.

Tyrosin - Tyr

- GluThreonin - Thr

Histidin - HisKys. glutamováSerin - Ser

Arginin - Arg- AspGlutamin - Gln

Lysin - LysKys. asparágová

Asparagin - Asn

AlkalickéKyseléNeutrální

Struktura aminokys.• Aminokyseliny s alifatickým postranním řetězcem Glycin Gly (G), Alanin Ala (A), Valin Val (V), Leucin Leu (L), Isoleucin

Ile (I) • S karboxylovou nebo amidovou skupinou na postranním řetězci

(kyselé skupiny) Kyselina asparagová Asp (D) , Asparagin Asn (N), Kyselina glutamová

Glu (E), Glutamin Gln (Q) • S aminovou skupinou na postranním řetězci (basické skupiny) Arginin Arg (R), Lysin Lys (K) • S aromatickým jádrem nebo hydroxylovou skupinou na postranním řetězci

Histidin His (H), Fenylalanin Phe (F), Serin Ser (S), Threonin Thr (T), Tyrozin Tyr (Y), Tryptofan Trp (W)

• Se sírou v postranním řetězci Methionin Met (M), Cystein Cys (C) • IminokyselinyProlin Pro (P)

Gen

• Základní jednotka genetické funkce (g. informace) vyznačující se fenotypovým projevem.

• Formy genu: úsek DNA- nebo RNA- řetězce (jen u RNA-virů), který kóduje primární strukturu polypeptidu jako translačního produktu (strukturní gen).

• Jako úsek DNA-řetězce přepisovaný do primární struktury tRNA, a dalších druhů RNA, které nejsou určeny k translaci.

• Jako úsek DNA- nebo RNA-řetězce plnící regulační fci, který je rozeznáván specifickým proteinem signalizujícím zahájení nebo zastavení určitého molekulárního děje (např. transkripce nebo translace).

Alela

• Varianta genu o určité unikátní nukleotidové sekvenci.

• Dominantní a. svou funkcí potlačuje projev jiné recesivní a. téhož genu.

• Standardní a. je alela genu převládájícív přírodní populaci.

• Mutantní a. je alela změněná mutací.

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

• PCR (Polymerase chain reaction) byla vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii (Saiki a Mullis v roce 1986 Nobelova cena).

• Jedná se o enzymatickou amplifikaci DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (Saiki et al., 1988; Schutzbank et al., 1993; White et al., 1992).

• 1. DNA je nejprve denaturována (95 °C / 15-60 s) na dvě jednovláknové templátové (matricové) molekuly DNA. Nukleotidovásekvence cílové DNA nemusí být známa, ale musí být známé alespoňsekvence krátkých úseků na obou koncích cílové amplifikované DNA.

• 2. Oligonukleotidové sondy (primery), které hybridizují (obvykle mezi 50°C a 55°C) na obou stranách cílové DNA (annealing ). Nadbytek primerů a přítomnost všech čtyř deoxyribonukleosidtrifosfátů.

• 3. Primery řídí syntézu nových vláken (70 - 74°C, 30-60 s). • Jejich syntézu katalyzuje termostabilní DNA polymeráza (například Taq

z bakterie Thermus aquaticus) od 5’ konce ke 3’ konci vždy začínající od primerů. Během prvního cyklu syntéza nového vlákna pokračuje dále až za sledovanou sekvenci, ale následné cykly již amplifikujípřevážně pouze úsek mezi dvěma vybranými sondami (primery).

• Počet cyklů se obvykle pohybuje v rozmezí 15 – 30, přičemž se v každém cyklu množství molekul oproti předcházejícímu cyklu zdvojnásobí.

Princip polymerázové řetězové reakce

Pomocí PCR můžeme získat jak kopii genomové DNA, cDNA (analyzovaný vzorek může být DNA i RNA). Nejdostupnější metodou detekce produktů PCR je elektroforéza v agarosovém gelu (barvivo Ethidium bromid). Na úrovni lidské DNA lze např. identifikovat sekvence (mutantní úseky DNA) podmiňující vznik dědičných onemocnění, určovat genetickou identitu jedinců, paternitu neboli rodičovství, prokazovat původ biologického materiálu v soudním lékařství apod. Dále se používá pro identifikaci různých druhů mikroorganizmů (patogenů).

Úkoly:Napište komplementární řetězec k uvedenému řetězci DNA:5´CGTACGGTTCGATGCACTGTACTGC 3´

3´GCATGCCAAGCTACGTGACATGACG 5´

Napište vlákno mRNA vzniklé transkripcí molekuly DNA, pokud antikódující řetězec (matrice, negativní) je ten uvedený, ne doplněný:

GCAUGCCAAGCUACGUGACAUGACG

Najděte iniciační a kodon a ukončení translace na uvedeném vlákně:

GCAUGCCAAGCUACGUGACAUGACG

Napište pořadí aminokys., které budou v peptidovém řetězci vzniklém translací mRNA:

Met, Pro, Ser, Tyr, Val, Thr

Úkoly:

Pokud je v daném úseku molekuly DNA 287 A a 351 C, kolik tam bude ostatních bází? Kolik tam bude purinů a kolik pyrimidinů?

287 T, 351 GPurinů (A, G) 638Pyrimidinů (C, T) 638

Jak bude vypadat úsek vzniklý transkripcí dané části DNA?-2-1+1+2+3+4A G T G A T

A C U A

Mutace

• Mutace jsou změny v genotypu organismu oproti normálu. • Velká většina mutací je naprosto náhodných, cílená mutageneze se

používá téměř výhradně pro vědecké účely. • Pravděpodobnost jedné takovéto chyby se pohybuje v řádech asi 10-7

(spontánní mutace).• Pravděpodobnost vzniku mutace se zvyšuje působením některých

fyzikálních nebo chemických činitelů (mutagenů – záření, silná oxidačního činidla).

• Genové mutace jsou změny v genetické informaci, které proběhly vjednom genu a nenarušily stavbu chromozómu (změna fenotypovévlastnosti-nádorová onemocnění).

• Chromozómové mutace vedou ke zlomům a k přestavbám struktury chromozómů (větší skupiny genů, jsou pozorovatelné mikroskopem).

• Genomové mutace jsou změny v počtu chromozómů (aneuploidie –ztráta nebo nadbytečná přítomnost některých jednotlivých chromozómů – monozomie, trizomie – u čl. Downům syndrom; polyploidie – početní změny sad chromozómů.

• Organismy jsou do jisté míry schopny mutace v DNA opravit.

Mutace genové

• Transice je záměna purinového nukleotidu za purinový a pyrimidinového za pyrimidinový.

• Transverze je záměna purinového nukleotidu za pyrimidový a naopak.• Mutace nem ěníci smysl (samesense mutation), kdy je i přes mutaci

zařazena stejná aminokyselina. Jsou způsobeny substitucemi na třetí pozici kodonu.

• Tichá mutace (silent mutation) se změnou v kodonu, která se neprojevuje ve funkci polypeptidového řetězce.

• Mutace m ěnící smysl (missense mutation), které mění smysl polypeptidového vlákna, které způsobí zařazení odlišné aminokyseliny při proteosyntéze.

• Nesmyslné mutace (nonsense mutation), které zapříčiní vznik předčasného terminačního kodonu v sekvenci DNA. Výsledkem je zcela nefunkční protein.

• Substituce je náhrada báze původní sekvence bází jinou.• U delece jde o ztrátu jednoho nebo více nukleotidů původní sekvence. • Adice (inzerce) -zařazení jednoho nebo více nadbytečných

nukleotidových párů.

Úkoly:V 1. řádku je sekvence normální alely, ve 2. ř. je stejná sekvence

poškozená mutací. O jakou mutaci se jedná?TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACCTGT TTA ATA CCG GGT TTG ACC

substituce

TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACCTGT GTA ATA CGG GTT TGA CC

delece s posunem čtecího rámce

TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACCTGT GTA ATA GGT TTG ACC

delece celého tripletu bez posunu čtecího rámce

TGT GTA ATA CCG GGT TTG ACCTGT GTA ATA CCG GGT ATT GAC C

inzerce s posunem čtecího rámce

Úkoly:• Původní sekvence:

- DNA: GCG TAC CAC TCC AGG TAG AAT + DNA: CGC ATG GTG AGG TCC ATC TTA

RNA: CGC AUG GUG AGG UCC AUC UUAAminokys.: Arg Met Val Arg Ser Ile Leu

zač.Mutované sekvence:

Del InzDNA: GGT ACC ACT CCA GGT CAG AAT

+ DNA: CCA TGG TGA GGT CCA GTC TTARNA: CCA UGG UGA GGU CCA GUC UUA

Aminokys.: Pro Trp stop Gly Pro Val Leu

Opravy mutací• Organismy jsou do jisté míry schopny mutace v

DNA opravit: enzymové komplexy k těmto biochemickým reakcím.• Fotoreaktivace – opravy poškození způsobeného

UV zářením � v 2-řetězcové DNA kovalentnívazby mezi pyrimidiny (tyminy), opravný enzym se aktivuje denním světlem – rozpojení a oprava DNA do původní struktury.

• Excisní oprava – vystřižení poškozeného úseku a nahrazením správného úseku DNA (nukleázy, polymerázy a ligázy).

• Rekombinační oprava (málo probádaná) –rekombinační výměna poškozených oblastí mezi 2 mol. DNA � 1 opravená mol. a 1 mol. s kumulovanými poškozenými oblastmi.

Sekvenování NK• Určení sekvence (pořadí) nukleotidů úseků DNA a RNA o několika

stech bazí se provádí nejčastěji na principu konvenční Sangerovymetody (dideo-xynukleotidová, ddNTP reakce) nebo nověji pomocí cyklického sekvenování na termocykleru bez nutnosti alkalické denaturace. Označené produkty sekvenační reakce se rozdělí a detekují na sekvenačním gelu pomocí elektroforézy. Původní metoda vyžadovala 4 samostatné sekvenační reakce a také samostatné dělení při elektroforéze pro každý jednotlivý nukleotid. Metoda má čtyři fáze: přiložení primeru k analyzovanému fragmentu DNA, označení primeru, prodlužování primeru o další komplementární baze syntézou pomocí T7 DNA polymerasy, ukončení reakce inkorporací dideoxynukleotidu. Značení primerů se provádělo pomocí radioizotopů.

• Moderní sekvenování je plně automatizováno. Místo radioaktivního značení se používá značení fluoresceinem, místo značení primerů se používá značení terminátorů reakce (ddNTP), reakce se provádí na termocykleru pomocí Taq DNA polymerasy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku. Laserová detekce emise čtyř různých fluorescenčních barev se provádí pomocí fotonásobiče a velmi citlivého detektoru přímo z gelu. Počítačem je řízený posuv, fokusace, optimální laserový paprsek a vyhodnocení získaných dat. K dispozici je specializovaný software.

Jak vlastn ě Sangerovosekvenování funguje?

• 1. Připrava směsi fragmentů z původní DNA molekuly, které se liší v délce vždy o jediný nukleotid (např. z DNA o délce 100 nukleotidů je nutné generovat řetězce dlouhé 99, 98, 97, 96, 95. Třeba tak, že se DNA vhodným enzymem „nahlodá“ od jednoho konce).

• Sangerovo vylepšení PCR procedury spočívá v tom, že přimíchal do reakční směsi malé množství modifikovaných dideoxynukleotid ů (ochromeny tím, že jim chybí vazebná skupina - po jejich zabudování do řetězce nemá polymeráza kam připojit následující nukleotid je pravděpodobné, že řetězec DNA bude v určité fázi syntézy předčasně ukončen).

• Takto generované různě dlouhé fragmenty je poté třeba analyzovat. K tomu se používá nejčastěji elektroforéza. Fragmenty DNA nesoucí náboj (obsahují přece kyselinu fosforečnou) migrují směrem k příslušné elektrodě gelovou matricí, která funguje jako molekulové síto. Krátké fragmenty se prodírají gelem rychleji než ty dlouhé, čímž dochází k separaci.

• Když je DNA separována, zbývá už jen číst sekvenci. Sanger použil další trik -flurorescenčního značení.

• Fluorescenční detektor zaznamenává fluorescenci, jejíž barva je určena jediným terminálním dideoxynukleotidem. A to nejdůležitější - terminální dideoxynukleotid je zabudován do fragmentu na základě komplementarity k původní sekvenované DNA.

• Příklad: Při separaci vypadne z kolony první fragment označený zeleně (A), pak detekujeme fragment označený červeně (T), modrým (C) a černým (G). Tak lze ze znalosti pořadí (délky) DNA fragmentů a barvy jejich fluorescence bezchybně vyvodit celou původní sekvenci.

• Jestliže se stejná změna vyskytuje v populaci systematicky ve větší frekvenci než jedno procento, nazývá se to DNA polymorfismus.

• Prvním hmatatelným výsledkem sekvenování DNA je možnost porovnat individuální DNA vzhledem k průměrné populaci, nebo lépe řečeno, zařadit ji do příslušných genotypů.