centrifugation at 105,000 g for 1hendonuclease

Cultured animal cell lineTissue, E. Coli, yeast..

washing with low salt buffer

grounded mechanically under liquid nitrogenpassing through a syringe needle sonication Dounce homogenization

urea (7 M), thiourea (2M), CHAPS (4% w/v) DTT (15 mM) protease inhibitor cocktail

Tris (40 mM) GSH (1 mM) EDTA (0.5 Mm)protease inhibitor cocktail

or

Serum

Diluted with separation media final protein concentration of 0.5~6.0 mg/ml

FFE 1500V, 25 mA, ~33 minmax. 70 fractions (pH 2.5~11)

1D PAGE

1. 샘플은 1.0~6.0 mg protein 으로 건조되어있는 상태이거나 low salt buffer 에

녹여있는 상태이어야 하며 샘플 당 전체 volume 이 0.1 ml 을 넘지 않도록

해야 합니다 .

2. 최대 5 개 sample 까지 한번에 running 가능하며 , sample 이 예를 들어 7

개인경우에는 2 개 , 5 개 로 나눠 맡기셔야 합니다 . 같은 종류의 샘플도 0.1

ml 또는 전체 단백질량이 6 mg 을 넘을 경우 에는 두개의 샘플로 간주됩니

다 . 자세한 조건은 샘플 의뢰 전에 문의하시기 바랍니다 .

3. Serum 은 전 처리없이 그냥 가져오시면 됩니다 .

4. 모든 샘플은 urea 가 있을 때와 없을 때 둘 다 running 가능합니다 . Running p

rotocol 은 urea 가 들어가는 조건에서는 Low UHGP 을 권장합니다 . Urea 가

들어가지 않는 조건에서는 High HGP 를 사용하는 것이 좋고 , glycerol 이

후처리에 있어서 문제가 되는 경우 protocol MP 를 사용하게되나 , High HGP

에 비해 separation 효율은 좀 떨어집니다 .

5. Fraction 은 최소 14 개에서 최대 70 개까지 얻을 수 있으며 14, 28, 42, 56,

70 개 중에서 선택할 수 있으나 , 56 또는 70 개를 권장합니다 .

6. Focusing range 는 이론상 pH 2.5~11 까지 가능하고 , acidic 또는 basic regi

on 만 선별하여 running 할 수 있으나 , pH 3~10 range 조건을 권장합니다 .

7. Fraction 은 well 당 0.6~0.7 ml 정도 얻어지고 그 농도는 running 한 protein

이 모든 well 로 골고루 퍼졌다고 계산할 때 0.04~0.08 g/l 입니다 . Protei

n 회수율은 ~90% 정도입니다 .

8. Fraction 은 deep well plate(1ml) 에 담아서 드리고 그 중 몇 개 fraction 을

4-12% Bis-Tris 12 well small gels 한 장에 걸어서 첨부하여 드립니다 .

9. Sample preparation 과정은 제시된 비용에 포함되어 있지 않습니다 .

10. Sample preparation 과정에서의 buffer 조성 (urea, salt 농도 , detergent) 은

의뢰 전에 반드시 문의하시기 바랍니다 .

FEE sample running

Media Inlet

Anodic stabilization med.

Separation medium 1

Separation medium 2

Separation medium 3

Cathodic stabilization med.

Counter flow

Running condition

Voltage 1500 V

Current mA

Temperature 10 °C

Media Pump Flow rate ml/h

Sample Pump Flow rate ml/h

Title

Date:

Sample

Sample preparation

method

inlet I

Dilution media Separation medium

Dilution factorDissolved Total precipitate with Separation medium

Diluted with Separation medium

Concentration mg/ml

Total amount ml

Amount per well ml

Protocol Sample No.

Protocol (urea M 농도 , 다른시약 % 농도 ),

MP Mannitol 4.56 Prolyte 25

MGP Mannitol 4.56 Glycerol 25 Prolyte 25

UMP Urea 8 Mannitol 4.0 Prolyte 25

High HP HPMC 0.2 Prolyte16.6

High HGP HPMC 0.2 Glycerol 25 Prolyte16.6

High UHGP Urea 8 HPMC 0.12 Glycerol 14.5 Prolyte 14.5

Low HGP HPMC 0.05 Glycerol 25 Prolyte16.6

Low UHGP Urea 8 HPMC 0.03 Glycerol 14.5 Prolyte 14.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

NuPAGE (invitrogen 4-12% Bis-Tris gel)